Artykuł metodologiczny

Kontrolowane półautomatyczne urazy indukowane laserem do badania regeneracji rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63259

⸱

22 listopada 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh Medical School: Biomedical Sciences, 2Center for Regenerative Therapies at the TU Dresden

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje metodę wywoływania specyficznych tkankowo i wysoce powtarzalnych urazów u larw danio pręgowanego za pomocą laserowego systemu uszkodzeń połączonego z automatyczną platformą mikroprzepływową do obsługi larw.

Streszczenie

Larwy danio pręgowanego posiadają w pełni funkcjonalny centralny układ nerwowy (OUN) o wysokiej zdolności regeneracyjnej zaledwie kilka dni po zapłodnieniu. To sprawia, że ten model zwierzęcy jest bardzo przydatny do badania urazów i regeneracji rdzenia kręgowego. Standardowym protokołem wywoływania takich zmian jest ręczna transekcja grzbietowej części tułowia. Jednak ta technika wymaga intensywnego treningu i uszkadza dodatkowe tkanki. Aby obejść te ograniczenia, opracowano protokół dla zmian wywołanych laserem, co pozwala na wysoką odtwarzalność i kompletność przecięcia rdzenia kręgowego u wielu zwierząt i między różnymi sesjami, nawet dla nieprzeszkolonego operatora. Co więcej, uszkodzenie tkanek ogranicza się głównie do samego rdzenia kręgowego, co zmniejsza mylące skutki uszkodzenia różnych tkanek, np. skóry, mięśni i OUN. Ponadto możliwe są uszkodzenia połowicze rdzenia kręgowego. Lepsze zachowanie integralności tkanek po urazie laserowym ułatwia dalsze sekcje potrzebne do dodatkowych analiz, takich jak elektrofizjologia. W związku z tym metoda ta zapewnia precyzyjną kontrolę zakresu urazu, który jest nieosiągalny ręcznie. Pozwala to w przyszłości na nowe paradygmaty eksperymentalne w tym potężnym modelu.

Wprowadzenie

W przeciwieństwie do ssaków, danio pręgowany (Danio rerio) może naprawić swój centralny układ nerwowy (OUN) po urazie1. Wykorzystanie larw danio pręgowanego jako modelu regeneracji rdzenia kręgowego jest stosunkowo nowe. Okazało się to cenne w badaniu komórkowych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw naprawy2. Wynika to z łatwości manipulacji, krótkiego cyklu eksperymentalnego (nowe larwy co tydzień), optycznej przezroczystości tkanek i niewielkich rozmiarów larw, idealnie nadających się do mikroskopii fluorescencyjnej in vivo.

W przypadku regeneracji rdzenia kręgowego, dwie dodatkowe zalety korzystania z larw to szybkość rekonwalescencji, kilka dni w porównaniu do kilku tygodni u dorosłych, oraz łatwość wywoływania urazów przy użyciu technik manualnych. Zostało to z powodzeniem wykorzystane w wielu badaniach3,4,5, w tym w ostatnich badaniach6,7. Ogólnie rzecz biorąc, prowadzi to do zwiększenia produkcji znaczących danych, wysokiej zdolności adaptacyjnej protokołów eksperymentalnych i zmniejszenia kosztów eksperymentalnych. Wykorzystanie larw młodszych niż 5 dni po zapłodnieniu również zmniejsza wykorzystanie zwierząt zgodnie z zasadami 3R w badaniach na zwierzętach8.

Po urazie rdzenia kręgowego u larw danio pręgowanego zachodzi wiele procesów biologicznych, w tym reakcja zapalna, proliferacja komórek, neurogeneza, migracja ocalałych lub nowo powstałych komórek, reformacja funkcjonalnych aksonów oraz globalna przebudowa obwodów procesów nerwowych i tkanek kręgosłupa6,7,9,10. Aby procesy te mogły być skutecznie zaaranżowane, obejmują precyzyjnie regulowaną interakcję między szeregiem typów komórek, składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej i sygnałami biochemicznymi11,12. Odkrycie szczegółów tej znaczącej reorganizacji złożonej tkanki, takiej jak rdzeń kręgowy, wymaga zastosowania i opracowania precyzyjnych i kontrolowanych podejść eksperymentalnych.

Podstawowym eksperymentalnym paradygmatem używanym do badania regeneracji rdzenia kręgowego u ryb pręgowanych jest użycie środków chirurgicznych do wywołania uszkodzenia tkanek przez resekcję, dźgnięcie lub kriouraz3,13. Podejścia te mają tę wadę, że wymagają specjalnego szkolenia w zakresie umiejętności mikrochirurgicznych, co jest czasochłonne dla każdego nowego operatora i może uniemożliwić ich wykorzystanie w krótkoterminowych projektach. Ponadto zwykle wywołują uszkodzenia otaczających tkanek, co może wpływać na regenerację.

Innym podejściem jest chemiczne wywołanie uszkodzenia komórek14 lub za pomocą manipulacji genetycznych15. To ostatnie pozwala na zadawanie wysoce ukierunkowanych obrażeń. Jednak taka technika wymaga długich prac przygotowawczych, aby wygenerować nowe transgeniczne ryby przed przeprowadzeniem jakiegokolwiek eksperymentu, odnawiane za każdym razem, gdy celem jest unikalny typ komórek.

Istnieje zatem potrzeba metody pozwalającej na celowane, ale wszechstronne zmiany chorobowe, odpowiednie do różnych badań nad regeneracją. Rozwiązaniem jest użycie lasera do wywołania miejscowego uszkodzenia w tkance będącej przedmiotem zainteresowania16,17,18,19,20. Rzeczywiście, zastosowanie uszkodzeń tkanek wywołanych laserem stanowi solidne podejście do generowania uszkodzeń rdzenia kręgowego z wieloma zaletami. Mikroskopy wyposażone w takie moduły do manipulacji laserowej pozwalają na określenie niestandardowego kształtu obszaru, w którym nastąpi ablacja komórek, z dodatkową korzyścią w postaci kontroli czasowej. W ten sposób można dostosować wielkość i położenie zmiany do odpowiedzi na wszelkie pytania.

Brakującą cechą większości laserowych systemów do wykrywania uszkodzeń jest możliwość wywoływania urazów w wysoce powtarzalny sposób dla serii larw. Tutaj opisano oryginalny protokół wykorzystujący laser UV do indukowania półautomatycznych, precyzyjnych i kontrolowanych zmian u larw danio pręgowanego w oparciu o platformę mikroprzepływową zaprojektowaną do automatycznego obchodzenia się z larwami21. Co więcej, w prezentowanym tutaj systemie larwy są umieszczane w szklanej kapilarze, która umożliwia swobodne obracanie się zwierzęcia wokół jego osi ogonowej. Użytkownik może wybrać, którą stronę larwy zaprezentuje laserowi, jednocześnie umożliwiając obrazowanie fluorescencyjne w celu precyzyjnego wycelowania w wiązkę laserową i oceny uszkodzeń po zmianie.

Opisany tutaj protokół jest używany z półautomatycznym systemem obrazowania larw danio pręgowanego połączonym z wirującym dyskiem wyposażonym w laser UV (zwanym dalej systemem VAST). Jednak główne punkty protokołu i większość twierdzeń dotyczących tej techniki są ważne dla każdego systemu wyposażonego w laser zdolny do ablacji komórek, w tym dwufotonowych laserowych mikroskopów skaningowych, mikroskopów z wirującym dyskiem wyposażonych w laser UV (moduł FRAP) lub wideomikroskopów z modułem laserowym do obróbki zdjęć. Jedną z głównych różnic między systemem VAST a konwencjonalną obsługą próbek będzie to, że w przypadku tych drugich wymagane będzie umieszczenie larw w agarozie o niskiej temperaturze topnienia na szklanych szkiełkach nakrywkowych/szalkach Petriego ze szklanym dnem zamiast umieszczania ich na 96-dołkowej płytce.

Korzyści oferowane przez tę metodę otwierają możliwości dla innowacyjnych badań nad mechanizmami komórkowymi i molekularnymi podczas procesu regeneracji. Co więcej, wysoka jakość danych pozwala na prowadzenie badań ilościowych w kontekście multidyscyplinarnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych i zgodnie z jego przepisami, na podstawie licencji projektu PP8160052. Projekt został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Edynburgu. Do analiz eksperymentalnych wykorzystano larwy danio pręgowanego w wieku do 5 dni obu płci z następujących dostępnych linii transgenicznych: Tg(Xla.Tubb:DsRed; mpeg1:GFP), Tg(Xla.Tubb:DsRed), Tg(betaaktyna:utrofina-mCherry), Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) i Tg(mnx1:gfp) (patrz Plik Uzupełniający 1 dotyczący generowania transgenicznych linii do danio pręgowanego). Schemat protokołu wykorzystującego zautomatyzowaną platformę do obsługi larw danio pręgowanego pokazano na Rysunek 1. Wszystkie niestandardowe oprogramowanie, skrypty i szczegółowe protokoły eksperymentalne użyte w tej pracy są dostępne na stronie https://github.com/jasonjearly/micropointpy/.

1. Przygotowanie próbki

  1. Po 5 godzinach od zapłodnienia posortuj zarodki pod kątem prawidłowego etapu rozwoju21. Wyrzuć martwe jaja oraz słabo rozwinięte i nadmiernie rozwinięte zarodki.
  2. Po 3 dniach od zapłodnienia (dpf) znieczulij larwy, dodając 2 ml 0,4% estru metylowego kwasu aminobenzoesowego do 50 ml wody z pomieszczenia rybnego na szalce Petriego o średnicy 90 mm. Należy używać zwierząt hodowanych z fenylotiomocznikiem (PTU) (patrz tabela materiałów), aby zapobiec pigmentacji skóry, jeśli stanowi ona problem, co nie ma miejsca w przypadku urazów rdzenia kręgowego u 3 larw dpf opisanych w niniejszym protokole.
    UWAGA: To stosunkowo wysokie stężenie środka znieczulającego służy do zapobiegania ruchom larw po uderzeniu lasera.
  3. Przebadać zarodki pod kątem fluorescencyjnej ekspresji reporterowej (plik uzupełniający 1).
    UWAGA: Reporter fluorescencyjny dla rdzenia kręgowego (lub innej struktury będącej przedmiotem zainteresowania) jest często wymagany do oceny skuteczności urazu. Zastosowanie tg(Xla.Tubb:DsRed) pomaga zidentyfikować rdzeń kręgowy.
  4. Przenieść wybrane larwy na 96-dołkową płytkę do wykorzystania w systemie VAST (patrz Tabela Materiałów) z 300 μl wody w pomieszczeniu dla ryb na studzienkę. Bezpośrednio użyć pożywki zawierającej środek znieczulający z płytki Petriego o średnicy 90 mm. Upewnij się, że masz tylko jedną larwę na studzienkę. Przygotować jedną dodatkową pustą płytkę 96-dołkową, aby zebrać zmienione larwy.
    UWAGA: W przypadku korzystania z innego laserowego systemu do usuwania uszkodzeń, zamontuj larwy w 1% żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia (LMP) w odpowiedniej komorze obserwacyjnej.

2. Przygotowanie mikroskopu

  1. Włącz wszystkie elementy systemu (VAST, mikroskop, laser, komputer), w tym laser do ablacji.
  2. Gdy sprzęt zostanie w pełni zainicjowany, uruchom oprogramowanie mikroskopu, ImageJ/Fiji, zintegrowane środowisko programistyczne (IDE) Pythona oraz oprogramowanie do automatycznego obrazowania danio pręgowanego (system VAST), jeśli korzystasz z tej platformy (patrz Spis materiałów).
  3. Skonfiguruj oprogramowanie VAST, wykonując poniższe czynności.
    1. Po uruchomieniu oprogramowania VAST wybierz opcję Plate w pierwszym oknie i kliknij przycisk Gotowe (Rysunek 2A). Pojawi się kolejne małe okienko z pytaniem, czy kapilara jest pusta i czysta. Sprawdź, patrząc na obraz kapilary, czy w środku nie ma pęcherzyków powietrza. Jeśli nie, kliknij Tak. Jeśli są jakieś bąbelki, kliknij Nie i postępuj zgodnie z krokami 2.3.2-2.3.3 (Rysunek 2B).
    2. W oknie Próbnik dużych cząstek (LP) kliknij Prime, aby usunąć pęcherzyki powietrza (Rysunek 2C).
    3. Przejdź do głównego okna oprogramowania (z obrazem kapilarnym) i kliknij obraz prawym przyciskiem myszy. Wybierz opcję Nagraj obraz pustej kapilary w menu podręcznym (Rysunek 2B).
    4. W oknie LP Sampler przejdź do menu Plik i wybierz opcję Otwórz skrypt. Wybierz plik zawierający skrypt odpowiadający eksperymentowi, który chcesz przeprowadzić.
    5. W oknie głównym oprogramowania VAST przejdź do Plik i wybierz Otwórz eksperyment. Wybierz plik eksperymentu odpowiadający planowanemu eksperymentowi.
      UWAGA: Upewnij się, że pola Automatyczny rozładunek i Zbiorcze wyjście do odpadów NIE są zaznaczone.
  4. Skonfiguruj oprogramowanie mikroskopu do obrazowania.
    1. Uruchom oprogramowanie do obrazowania mikroskopem (patrz Tabela materiałów), aby zainicjować sprzęt. Może to potrwać kilka minut, w zależności od systemu.
    2. Przejdź do ustawień akwizycji i ustaw mikroskop do obrazowania fluoroforu wyrażonego w larwach. Użyj obiektywu zanurzającego 10x NA 0,5 w wodzie, aby upewnić się, że objętość ogniskowej jest wystarczająco wydłużona wzdłuż osi optycznej, aby uszkodzić całą głębokość rdzenia kręgowego lub docelowej tkanki.
  5. Skonfiguruj ImageJ/Fiji pod kątem zmian laserowych.
    1. Przejdź do menu Plik, wybierz Nowy/Skrypt, aby otworzyć okno skryptu.
    2. W oknie Nowy przejdź do menu Plik i wybierz Otwórz, aby załadować skrypt zmiany laserowej (Manual_MP_Operation.ijm).
  6. Skonfiguruj środowisko IDE języka Python.
    1. Uruchom środowisko IDE języka Python.
    2. Przejdź do menu Plik i wybierz Otwórz plik, aby załadować skrypt do zarządzania laserem (Watch_for_ROIs_py3.py).
    3. Przejdź do menu Uruchom i wybierz polecenie Uruchom bez debugowania, aby uruchomić skrypt. Sprawdź, czy podczas inicjalizacji tłumika laserowego w panelu TERMINAL pojawia się sekwencja komunikatów wraz z pewnym szumem (Rysunek 2D).

3. Wykonywanie uszkodzeń laserowych w systemie VAST

  1. Wyśrodkuj kapilarnę względem obiektywu mikroskopu, przesuwając stolik, klikając przyciski strzałek w głównym oknie oprogramowania VAST (Rysunek 2B).
  2. Skoncentruj się na górnej części kapilary, patrząc przez okulary i używając światła przechodzącego mikroskopu.
    UWAGA: Kapilara jest bardzo delikatna i może pęknąć w przypadku dotknięcia obiektywem. Powoli przesuwaj pokrętłem mikroskopu podczas ustawiania ostrości do wewnątrz i na zewnątrz.
  3. Umieść 96-dołkowe płytki na uchwycie płytki próbnika LP systemu VAST. Umieść płytkę zawierającą larwy po lewej stronie, a płytkę do zbierania po prawej. Upewnij się, że płytki są prawidłowo zorientowane: studzienka A1 musi znajdować się w lewym przednim rogu uchwytu.
  4. W oprogramowaniu VAST, w oknie LP Sampler kliknij na przycisk Plate Template i zaznacz wszystkie studzienki zawierające larwy. Kliknij przycisk OK, aby zatwierdzić i zamknąć okno (Rysunek 2C).
  5. W oknie LP Sampler kliknij przycisk Run Plate, aby rozpocząć ładowanie larva.
    UWAGA: Po pewnym czasie larwa powinna być widoczna w kapilarze w pozycji (predefiniowanej w pliku definicji eksperymentu), co pozwala na uszkodzenie rdzenia kręgowego. Lampka tacki VAST wyłączy się po kilku obrotach, aby ustawić larwę boczną stroną skierowaną w stronę obiektywu mikroskopu.
  6. Przejdź do oprogramowania mikroskopu i kliknij przycisk Na żywo, aby zobrazować larwę.
  7. Przekręć pokrętło ostrości mikroskopu, aż widoczny będzie centralny kanał rdzenia kręgowego.
    UWAGA: Łatwiej jest najpierw ustawić ostrość za pomocą światła przechodzącego, a następnie udoskonalić za pomocą fluorescencji.
  8. Zrób migawkę we fluorescencji i zapisz obraz w dedykowanym folderze.
  9. Otwórz obraz w ImageJ i w razie potrzeby dostosuj kontrast (za pomocą opcji Obraz/Dostosuj/Jasność/Kontrast...w ImageJ).
  10. Kliknij narzędzie do wyznaczania linii obszaru zainteresowania (ROI) i narysuj krótką linię (20 μm) wyśrodkowaną na rdzeniu kręgowym (Rysunek 3A).
  11. Ustaw mikroskop w pozycji lustra w 100% odblaskowego.
  12. Załaduj skrypt ImageJ i kliknij przycisk Uruchom. Użyj następujących parametrów: Powtórzenie - 2; Próbka - 1; szerokość - 40 mikronów; Tłumienie - 89 (pełna moc lasera) (Rysunek 3C).
  13. Po zakończeniu sekwencji strzału laserowego przełącz się na obrazowanie fluorescencyjne w oprogramowaniu do obrazowania i w razie potrzeby dostosuj ostrość.
    UWAGA: Często obserwuje się przesunięcie ostrości z powodu przemieszczenia ogona podczas ekspozycji lasera.
  14. Zrób nową migawkę i zapisz ją.
  15. Otwórz ten nowy obraz w ImageJ i narysuj nową linię, która powinna być większa niż sam rdzeń kręgowy (~80 μm), zaczynając poniżej brzusznej strony rdzenia kręgowego w górnej części struny grzbietowej i biegnąc w kierunku strony grzbietowej, aby zakończyć się w przestrzeni między rdzeniem kręgowym a skórą (Rysunek 3B).
  16. Ustaw mikroskop w pozycji lustra w 100% odblaskowego.
  17. Przejdź do okna skryptu ImageJ i kliknij przycisk Uruchom. Użyj następujących parametrów: Powtórzenie - 2; Próbka - 1; szerokość - 40 mikronów; Tłumienie - 89 (pełna moc lasera).
  18. Po zakończeniu (dłuższej) sekwencji strzału laserowego sprawdź jakość przecięcia, obrazując fluorescencję i skupiając. Upewnij się, że żadna komórka lub aksony nie pozostały nienaruszone w miejscu uszkodzenia, które powinno wyglądać jako ciemny lub jako słaby i jednorodny obszar fluorescencyjny (Rysunek 3D, dolny panel).
  19. Zbierz uszkodzone larwy do pustej płytki 96-dołkowej (z tymi samymi współrzędnymi studzienki, co w oryginalnej studzience), przechodząc do głównego okna oprogramowania VAST i klikając przycisk Zbierz.
  20. Włącz ponownie podświetlenie systemu VAST, klikając pole wyboru Podświetlenie zasobnika w lewym dolnym rogu okna.
  21. Powtórz kroki 3.3-3.17 dla każdej nowej larwy, która ma zostać zraniona.

4. Postępowanie po zmianie chorobowej i dodatkowe eksperymenty

  1. Jak najszybciej wyjąć larwy z 96-dołkowej płytki i przenieść je na czystą szalkę Petriego ze świeżą wodą z pomieszczenia dla ryb, aby larwy mogły dojść do siebie po zmianie. Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze w temperaturze 28 °C.
    UWAGA: Uszkodzenie często kontynuuje rozprzestrzenianie się w ciągu pierwszej godziny po zmianie. Rzeczywisty zakres zmiany należy zatem ocenić za pomocą obrazowania fluorescencyjnego z opóźnieniem około 1 godziny.

5. Rozwiązywanie problemów

  1. Jeśli w rurkach i kapilarze systemu VAST znajdują się pęcherzyki powietrza, kliknij przycisk Prime w oknie LP Sampler, aby je usunąć.
  2. Należy wziąć pod uwagę nieudane zmiany chorobowe (oceniane na podstawie pozostałej fluorescencji w miejscu zmiany, poza oczekiwanym resztkowym i jednorodnym tłem), które mogą wynikać z kilku przyczyn wymienionych poniżej.
    1. Niska moc lasera: W takim przypadku spróbuj użyć wyższej wartości.
      UWAGA: System VAST wyposażony jest w laser barwnikowy. Oznacza to, że stężenie roztworu barwnika używanego do generowania światła laserowego może zmieniać się w czasie, prowadząc do spadku mocy lasera. Zastąpienie go nowym rozwiązaniem zwykle rozwiązuje problem22.
    2. Słaba kalibracja: W takim przypadku sprawdź kalibrację i moc systemu laserowego zgodnie z krokami 5.2.2.1-5.2.2.4. Jeśli nie zostanie prawidłowo skalibrowany, laser nie zostanie skierowany w pożądane miejsce, co prowadzi do nieudanych zmian lub niepożądanych uszkodzeń sąsiednich tkanek.
      1. Umieść szkiełko lustrzane na górze komory kapilarnej. Skoncentruj się na powlekanej stronie (powinna być skierowana w stronę obiektywu). Użyj poprzedniego ustawienia domyślnego na slajdzie, aby łatwiej ustawić ostrość.
      2. Zastosuj wzór ablacji laserowej za pomocą skryptu kalibracyjnego.
      3. Oceń jakość wzoru. Plamy lub linie powinny być ostre i nie rozmyte.
      4. Użyj rampy o rosnącej mocy, aby ocenić, czy moc lasera zmieniła się w porównaniu z poprzednimi sesjami.
    3. Przemieszczanie się larw podczas zmian chorobowych: Larwy różnie reagują na znieczulenie, dlatego zmiana laserowa może wywoływać ruchy ogona podczas procesu, uniemożliwiając w ten sposób udaną transsekcję. Kiedy tak się stanie, wykonaj dodatkową iterację kroków zmiany laserowej, aby ją zakończyć, unikając uszkodzenia otaczających tkanek.
    4. Złe skupienie: Kiedy tak się stanie, skup się na środku kanału centralnego, aby uzyskać najlepsze wyniki.
    5. Rysunek, pozycja i rozmiar ROI: Pozycja i rozmiar ROI mają kluczowe znaczenie dla udanych przecięć. Zwrot z inwestycji powinien być większy niż rdzeń kręgowy i wyśrodkowany na środku rdzenia kręgowego. Aby rozwiązać ten problem, zacznij rysować ROI od brzusznej strony rdzenia kręgowego i idź w górę w kierunku strony grzbietowej, aby uzyskać udaną transcięcję. Jest to prawdopodobnie spowodowane ruchami ogona wywołanymi sekwencją strzałów laserowych podczas procedury ablacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Walidacja przecięcia rdzenia kręgowego
Przeprowadzono badania strukturalne i funkcjonalne, aby ocenić, czy protokół umożliwia całkowite przecięcie rdzenia kręgowego.

Po pierwsze, aby zweryfikować, czy utrata fluorescencji w miejscu zmiany wynikała z uszkodzenia tkanki neuronalnej, a nie z fotowyblaknięcia fluorescencji wywołanego naświetlaniem laserem, przeprowadzono immunobarwienie z użyciem przeciwciała przeciwko tubulinie acetylowanej (patrz Tabela materiałów<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnieje pilna potrzeba głębszego zrozumienia procesów zachodzących podczas regeneracji u danio pręgowanego. Ten model zwierzęcy oferuje wiele korzyści dla badań biomedycznych, w szczególności w przypadku urazów rdzenia kręgowego1. Większość badań dotyczy zmian manualnych, które wymagają dobrze wyszkolonego operatora i wywołują uszkodzenia wielotkankowe. Przedstawiono tutaj protokół laserowego usuwania zmian, który pozwala na kontrolę charakterystyki zmiany i zmniejszenie uszkodzeń otaczających tk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez BBSRC (BB/S0001778/1). CR jest finansowany przez Program Stypendialny Badań Medycznych Princess Royal TENOVUS Scotland. Dziękujemy Davidowi Greenaldowi (CRH, Uniwersytet w Edynburgu) i Katy Reid (CDBS, Uniwersytet w Edynburgu) za miły dar w postaci transgenicznych ryb (Zobacz plik uzupełniający). Dziękujemy Danielowi Soongowi (CRH, Uniwersytet w Edynburgu) za uprzejmy dostęp do konfokalu 3i spinning-disk.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Software
Microscope Oprogramowanie Zen Blue 2.0Carl Zeiss
ImageJ/FIJIOpen-Source
Visual Studio CodeMicrosoft
Microscope i akcesoria
ApoTomemikroskopObiektyw do zanurzania Carl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0,5NA)Carl Zeiss
AxioCam 506 mCarl Zeiss
LSM880dysku Carl Zeiss
CSU-X1Yokogawa
Mikroskop pionowyAxio Examiner D1Carl Zeiss
Laser UVMicropoint
VAST BioImagerUnion Biometrica
Labware
90 mm szalka PetriegoThermo-Fisher101R20
96-dołkowa płytkaCorning3841
Chemicals
Zestaw do obrazowania Click-It EdUInvitrogenC10637
ester metylowy kwasu aminobenzoesowego (MS222)Sigma-AldrichA5040
fenylotiomocznik (PTU)Sigma-AldrichP7629
Przeciwciała
Donkey anty-kurczak Alexa Fluor 488Jackson703-545-155
Osioł anty-mysz Cy3Jackson715-165-150
Mysz anty-GFPAbcamAB13970
Mysie przeciwciało acetylowane antytubulinoweSigmaT6793
Transgeniczne linie danio pręgowanego
Tg(beta-aktyna:utrofina-mCherry)N/AZałożona przez Davida Greenhalda, Uniwersytet w Edynburgu
Tg(mnx1:gfp)N/A Poraz pierwszy opisany w [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed)N/APo raz pierwszy opisany w [Peri i Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed; mpeg1:GFP)N/AZałożona przez Katy Reid, Uniwersytet w Edynburgu
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)N/AZałożona przez Davida Greenhalda, Uniwersytet w Edynburgu
Podwójne kamery CCD Carl Zeiss Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny Moduł wirującego

Bibliografia

  1. Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
  2. Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
  3. Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
  4. Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
  5. Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
  6. Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
  7. Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
  8. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. , Available from: https://nc3rs.org.uk (2021).
  9. Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
  10. Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
  11. Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
  12. Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
  13. Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
  14. Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
  15. Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
  16. Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
  17. Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
  18. Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
  19. Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
  20. Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
  21. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  22. AndOr Micropoint Manual. , Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021).
  23. Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260(2017).
  24. Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
  25. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  26. Howell, D. Statistical methods for psychology. , Duxbury. 324-325 (2002).
  27. Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
  28. Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
  29. Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  30. Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 4/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.

The title was updated from:

Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

to:

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Tagi

Uraz wywo any laseremkontrolowana zmianao rodkowy uk ad nerwowyobrazowanie wapniaimmunohistochemiaelektrofizjologiaobrazowanie fluorescencyjnerekrutacja makrofag w

Powiązane artykuły