Artykuł metodologiczny

Bakteryjna ekspresja i oczyszczanie metaloproteinazy ludzkiej macierzy-3 za pomocą chromatografii powinowactwa

DOI:

10.3791/63263

⸱

30 marca 2022

 ,  , 
1Department of Chemical & Materials Engineering, University of Nevada, Reno

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczyszczanie, dializa i aktywacja znacznika his-tag są stosowane w celu zwiększenia wydajności rozpuszczalnej, aktywnej metaloproteinazy-3 domeny katalitycznej ekspresji białka u bakterii. Frakcje białkowe są analizowane za pomocą żeli SDS-PAGE.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metaloproteinazy macierzy (MMP) należą do rodziny proteaz metzinciny, które odgrywają kluczową rolę w degradacji i przebudowie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), a także wchodzą w interakcje z wieloma czynnikami wzrostu i cytokinami. Nadekspresja określonych MMP jest odpowiedzialna za kilka chorób, takich jak rak, choroby neurodegeneracyjne i choroby sercowo-naczyniowe. MMP znalazły się ostatnio w centrum uwagi jako cele w celu opracowania terapii, które mogą leczyć choroby skorelowane z nadekspresją MMP.

Aby zbadać mechanizm MMP w roztworze, potrzebne są łatwiejsze i bardziej wytrzymałe metody ekspresji i oczyszczania białek rekombinowanych do produkcji aktywnych, rozpuszczalnych MMP. Jednak domena katalityczna większości MMP nie może być wyrażona w Escherichia coli (E. coli) w postaci rozpuszczalnej z powodu braku maszynerii potranslacyjnej, podczas gdy systemy ekspresji ssaków są zwykle kosztowne i mają niższą wydajność. Ciała inkluzyjne MMP muszą przejść żmudny i pracochłonny proces intensywnego oczyszczania i ponownego fałdowania, co znacznie zmniejsza wydajność MMP w natywnej konformacji. W artykule przedstawiono protokół wykorzystujący komórki Rosetta2(DE3)pLysS (zwane dalej R2DP) do wytwarzania domeny katalitycznej metaloproteinazy-3 macierzy (MMP-3cd), która zawiera N-końcowy znacznik His, a następnie pro-domenę (Hisx6-pro-MMP-3cd) do stosowania w oczyszczaniu powinowactwa. Komórki R2DP zwiększają ekspresję białek eukariotycznych poprzez plazmid odporny na chloramfenikol zawierający kodony zwykle rzadkie w bakteryjnych systemach ekspresyjnych. W porównaniu z tradycyjną linią komórkową z wyboru do ekspresji białek rekombinowanych, BL21(DE3), oczyszczanie przy użyciu tego nowego szczepu poprawiło wydajność oczyszczonego Hisx6-pro-MMP-3cd. Po aktywacji i odsaleniu domena pro jest rozszczepiana wraz z N-końcowym znacznikiem His, zapewniając aktywny MMP-3cd do natychmiastowego użycia w niezliczonych zastosowaniach in vitro. Metoda ta nie wymaga drogiego sprzętu ani złożonych białek fuzyjnych i opisuje szybką produkcję rekombinowanych ludzkich MMP w bakteriach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość złożonych białek eukariotycznych ulega skomplikowanym modyfikacjom potranslacyjnym po ekspresji, co wymaga wysoce wspomaganego fałdowania białek i kofaktorów, aby działały1. Wytwarzanie dużych ilości rozpuszczalnego białka ludzkiego w bakteryjnym gospodarzu pozostaje poważnym wyzwaniem ze względu na wysokie koszty i brak solidnych metod ekspresji i oczyszczania, nawet w przypadku eksperymentów laboratoryjnych na mniejszą skalę2,3. MMP, ludzkie endopeptydazy o dużej masie cząsteczkowej, są zwykle wyrażane jako nierozpuszczalne ciała inkluzyjne, gdy są wyrażane w E. coli. Ekstrakcja rozpuszczalnych ludzkich MMP często prowadzi do pracochłonnego, czasochłonnego procesu rozpuszczania i ponownego fałdowania4.

MMP odgrywają kluczową rolę zarówno w procesach fizjologicznych, jak i patogennych. Ludzkie MMP to rodzina 23 endopeptydaz, skategoryzowanych według struktury i specyficzności substratu oraz wyrażanych w różny sposób pomimo wysoce konserwatywnej domeny katalitycznej5,6. MMP są wydzielane jako nieaktywne zymogeny, regulowane przez aktywację potranslacyjną i ich endogenne inhibitory, tkankowe inhibitory metaloproteinaz (TIMPs)7,8,9,10. Chociaż początkowo uznano je za rolę w obrocie ECM, MMP były również zaangażowane w rozwój, morfogenezę, naprawę tkanek i przebudowę8. Rozregulowanie MMP jest w szczególności powiązane z rakiem wraz z chorobami neurodegeneracyjnymi, sercowo-naczyniowymi i zwłóknieniowymi, między innymi5,7.

Rozwój solidnych metod produkcji MMP na dużą skalę jest kluczowy dla zapewnienia sukcesu przyszłych badań mechanizmów MMP poprzez testy biochemiczne i komórkowe. Różne MMP były wcześniej wyrażane w bacteria11, w tym MMP oznaczone tagiem Hisx6, bez zmiany aktywności MMP12,13,14,15. Jednak metody te obejmują żmudne, długie kroki, które mogą być trudne do powtórzenia.

Komórki ssaków mogą być również używane do ekspresji wielu różnych ludzkich białek, zapewniając jednocześnie odpowiednie modyfikacje potranslacyjne16. Chociaż system ekspresji ssaków jest idealnym wyborem do produkcji rekombinowanych białek ludzkich z odpowiednimi modyfikacjami potranslacyjnymi, głównymi wadami tej metody są początkowo niskie plony, kosztowne pożywki wzrostowe i odczynniki, długie terminy osiągania stabilnych linii ekspresyjnych oraz ryzyko zanieczyszczenia innymi gatunkami, takimi jak grzyby lub bakterie2,11. Co więcej, produkcja MMP w liniach komórkowych ssaków powoduje powstawanie zanieczyszczeń z powiązanych białek komórkowych, takich jak TIMP lub fibronektyny11. W przeciwieństwie do powolnego wzrostu komórek obserwowanego w komórkach ssaków, bakteryjny system ekspresji oferuje produkcję białek na dużą skalę w krótkim czasie, a także prostsze podłoże i wymagania dotyczące wzrostu. Jednak ze względu na brak innych powiązanych białek komórkowych (tj. TIMP) w bakteryjnych systemach ekspresyjnych, aktywne MMP w wyższych stężeniach podlegają degradacji w wyniku autoproteolizy, co skutkuje słabą wydajnością MMP17.

Ten artykuł opisuje szczegółową metodę ekspresji, oczyszczania i aktywacji bakterii rekombinowanego Hisx6-pro-MMP-3cd przy użyciu E. coli jako gospodarza ekspresji, ze względu na jego przystępność, prostotę i sukces w uzyskiwaniu wyższych plonów MMPs2,3,18. Ponieważ E. coli nie ma maszynerii do zwijania białek i przetwarzania potranslacyjnego wymaganego dla rekombinowanych MMP i innych złożonych białek, wiele szczepów E. coli zostało zaprojektowanych w celu przezwyciężenia tych ograniczeń, dzięki czemu E. coli jest bardziej odpowiednim gospodarzem do ekspresji rekombinowanego ludzkiego MMP-3cd,19,20. Na przykład szczep R2DP zastosowany w tym badaniu zwiększa ekspresję eukariotyczną, dostarczając plazmid odporny na chloramfenikol zawierający kodony rzadko stosowane w E. coli.

Jak opisano w tym protokole, po nadekspresji względnie czystych ciał inkluzyjnych z wektora pET-3a (Rysunek 1) w komórkach R2DP, białka domeny katalitycznej Hisx6-pro-MMP-3 (MMP-3cd) są ekstrahowane i denaturowane4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 został oczyszczony za pomocą chromatografii znaczników powinowactwa. Po ponownym złożeniu i dializie pro-MMP-3cd (zymogen) został aktywowany octanem 4-aminofenylortęci (APMA), a analiza SDS-PAGE służy do oceny wydajności i potrzeby dalszego oczyszczania5,21. Protokół ten opisuje ekspresję, oczyszczanie i aktywację rozpuszczalnego MMP-3cd jako przykład. Jednak może być również używany jako przewodnik do ekspresji innych MMP i ludzkich proteaz o podobnej ekspresji i mechanizmach aktywacji (Rysunek 2). W przypadku innych białek innych niż MMP-3cd, zaleca się, aby czytelnik określił optymalny skład buforowy i metody dla białka docelowego przed przystąpieniem do tego protokołu.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Mapa plazmidu plazmidu pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd. Wektor pET-3a zawiera gen oporności na ampicylinę. N-końcowa sekwencja znacznika Hisx6 jest klonowana do wektora opartego na pET-3a, w tym pro-MMP-3cd, w celu uzyskania konstruktu pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd pod kontrolą promotora T7 między miejscami ograniczeń BamHI i NdeI. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Bakteryjna ekspresja pro-MMP-3cd, oczyszczanie, ponowne fałdowanie i aktywacja. 1.1: plazmid pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd został przekształcony w komórki BL21(DE3) lub R2DP. 1.2: Ekspresję białka Pro-MMP-3cd indukowano za pomocą IPTG. 1.3: Liza chemiczna i sonikacja są stosowane do ekstrakcji białek Hisx6-pro-MMP-3cd, które są głównie nierozpuszczalne i znajdują się w ciałach inkluzyjnych. Mocznik stosowano do denaturacji i solubilizacji białka z ciał inkluzyjnych. 2.1. Denaturowane białko Hisx6-pro-MMP-3cd oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa. 3. Wymyty Hisx6-pro-MMP-3cd był powoli ponownie fałdowany podczas dializy poprzez stopniowe usuwanie mocznika z buforu. 4. Wreszcie, ponownie złożone białko MMP-3cd aktywowano za pomocą APMA poprzez usunięcie N-końcowej domeny pro-peptydowej. APMA jest później usuwany z roztworu poprzez odsalanie. Numery odpowiadają sekcjom protokołu opisującym te kroki. Skróty: MMP-3cd = domena katalityczna metaloproteinazy macierzy-3; APMA = octan 4-aminofenylortęci. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wyrażenie MMP

  1. Klonowanie i transformacja pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd w komórki R2DP
    1. Trawić plazmid pET-3a (patrz tabela materiałów) za pomocą enzymów restrykcyjnych NdeI i BamHI w buforze do trawienia (patrz tabela materiałów). W całkowitej objętości reakcji wynoszącej 40 μl dodać 4 μl buforu trawiącego, 33 μl plazmidu 100 ng/μl i 1,5 μl każdego enzymu restrykcyjnego i pozostawić reakcję do przebiegu przez ~2 godziny aż do zakończenia w temperaturze 37 °C.
    2. Wykonaj reakcję PCR na sekwencji MMP-3cd, aby wstawić N-końcowy znacznik His. Użyj 25 μl mieszanki PCR (patrz tabela materiałów), 2,5 μl starterów 10 μM (rysunek uzupełniający S1) i 1,25 μl sekwencji wstawiania 100 ng/μl. Dodać sterylną wodę do końcowej objętości reakcyjnej 50 μl.
    3. Uruchom produkt PCR i strawiony wektor na 1% żelu agarozowym. Oczyść opaski żelowe za pomocą zestawu do odzyskiwania żelu (patrz tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta.
    4. Sklonować amplifikowany produkt PCR do strawionego wektora między miejscami restrykcyjnymi NdeI i BamHI za pomocą mieszanki do składania DNA (patrz tabela materiałów). Skorzystaj z narzędzi online, aby określić wymaganą objętość płytki i wektora cięcia dla całkowitej objętości reakcji wynoszącej 15 μl.
    5. Rozmrozić 50 μl podwielokrotności ogniw o wysokiej wydajności przemian (patrz tabela materiałów) na lodzie do momentu rozmrożenia. Podgrzej pożywkę SOC (patrz tabela materiałów) do 37 °C i płytki LB-ampicyliny (LB Amp) (patrz tabela materiałów).
    6. Dodać 1-2 μl reakcji składania pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd do 50 μl podwielokrotności. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
    7. Szok termiczny komórek poprzez inkubację w temperaturze 42 °C przez 30 s. Inkubować na lodzie przez 2 minuty.
    8. Dodać 950 μl pożywki wzrostowej SOC do każdej mieszaniny transformatorów. Wytrząsać przez 1 godzinę przy 250 obr./min w temperaturze 37 °C.
    9. Umieścić 100 μl transformantów na płytkach LB Amp i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    10. Zaszczepić każdą izolowaną kolonię w 10 ml pożywki LB Amp. Wstrząsać przez noc w temperaturze 250 obr./min w temperaturze 37 °C.
    11. Wyodrębnij plazmidowe DNA zgodnie z protokołem producenta dla zestawu miniprep (patrz Tabela materiałów). Potwierdź sekwencję konstrukcji za pomocą starterów T7 do przodu i do tyłu (rysunek uzupełniający S1).
      UWAGA: DNA konstruktu pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd można przechowywać w temperaturze -20 °C. Gdy będziesz gotowy, przystąp do transformacji w komórki R2DP.
    12. Rozmrozić jedną 20 μl podwielokrotną porcję komórek R2DP (patrz tabela materiałów) na lodzie przez 2-5 minut. Podgrzej podłoże do wzrostu SOC do temperatury pokojowej i płytki LB Amp CamR do 37 °C (patrz tabela materiałów).
    13. Dodać 1 μl ze 100 ng/μl potwierdzone sekwencją pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd do podwielokrotności 50 μl. Delikatnie wymieszaj, aby wymieszać i zwróć probówkę do lodu.
    14. Inkubować probówkę na lodzie przez 5 minut.
    15. Wstrząs termiczny komórek poprzez inkubację w temperaturze 42 °C dokładnie przez 30 sekund. Nie potrząsać.
    16. Umieść komórki na lodzie na 2 minuty.
    17. Do mieszaniny transformatorów dodać 80 μl pożywki SOC o temperaturze pokojowej. Wytrząsać przez 1 godzinę przy 250 obr./min w temperaturze 37 °C.
    18. Umieścić transformanty na płytkach LB Amp CamR i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Wzrost i indukcja
    1. Zaszczepić pojedynczą, izolowaną kolonię transformantu R2DP pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd z płytki LB Amp CamR w 10 ml pożywki LB Amp CamR w temperaturze 37 °C. Wstrząsnąć z prędkością 250 obr./min przez noc (~16 h). Zachowaj porcje z każdej kultury i w razie potrzeby przygotuj 40% (v/v) zapasów glicerolu (patrz tabela materiałów).
    2. Na całonocną hodowlę zaszczepić 1 l kolbę zawierającą 500 ml pożywki LB Amp CamR do gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) 0,05-0,1,
      UWAGA: Powinno to przywrócić komórki do wzrostu logarytmicznego.
    3. Zmierz OD600 w kilku punktach czasowych, zwykle przez 3-4 godziny, aż spadnie między 0.4 a 0.6.
    4. Przed indukcją podwielokrotnić frakcję kultury do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml (patrz Tabela materiałów) i oznaczyć ją jako Frakcja nieindukowana. Przechowywać w temperaturze -80 °C do analizy żelu. Jeśli nie używasz żelu SDS-PAGE, pomiń ten krok i przejdź do kroku 1.2.5.
    5. Doprowadzić hodowle do końcowego stężenia 1 mM przy użyciu 1 M materiału wyjściowego z izopropylo-ß-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG) (patrz tabela materiałów). Kontynuować inkubację w wytrząsarce o temperaturze 37 °C przez dodatkowe 3-4 godziny
      UWAGA: Podczas odciągania należy określić optymalną wartość OD600 w momencie indukcji oraz stężenie IPTG. Jeśli wydajność znacznie spadnie po oczyszczeniu, stężenie imidazolu w oczyszczających może wymagać dostosowania lub może być konieczne dalsze sonikowanie osadu komórkowego
      6. .
    6. Przed odwirowaniem kultur należy przelać porcję kultury do drugiej probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i oznaczyć ją jako frakcję indukowaną. Przechowywać w temperaturze -80 °C do analizy żelu. Jeśli nie używasz żelu SDS-PAGE, pomiń ten krok i przejdź do kroku 1.2.7.
    7. Odwirować kulturę komórkową w stożkowych butelkach o pojemności 250 ml (patrz tabela materiałów) z maksymalną prędkością i w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
    8. Powtarzać krok 1.2.7, aż kultury zostaną całkowicie granulowane.
      UWAGA: PAUZA: Granulki komórkowe można zamrozić w temperaturze -80 °C i rozmrozić później w celu dalszego przetwarzania. W przeciwnym razie pomiń ten krok i przejdź do kroku 1.3.1.
  3. Ekstrakcja i solubilizacja ciała inkluzyjnego
    UWAGA: Przygotować świeży 10 M mocznik, najlepiej nie wcześniej niż jeden dzień wcześniej, dokładnie mieszając, aż do całkowitego rozpuszczenia. Nie podgrzewać ani nie autoklawować mocznika; Przechowuj go w temperaturze pokojowej.
    1. Zawiesić osad (od kroku 1.2.8) w buforze do lizy (patrz Tabela Materiałów). Na gram osadu dodać 3 ml buforu do lizy i ponownie zawiesić przez wirowanie lub pipetowanie. Wstrząsać przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Dodać 1,25 ml 10% (w/v) deoksycholanu sodu (patrz tabela materiałów) na 1 l kultury. Wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 30 minut przy 150 obr./min.
    3. Dodać 10 μl DNazy I (patrz tabela materiałów) na 1 l kultury. Wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 30 minut przy 150 obr./min.
    4. Wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 × g i temperaturze 4 °C.
    5. Odłóż na bok frakcję Lysed MMP do analizy żelu. Przechowywać w temperaturze -80 °C. Jeśli nie wykonujesz analizy żelu, przejdź do kroku 1.3.6.
      UWAGA: Po odwirowaniu osad może być żylasty i nie być zbity w gęsie, co sprawia, że wyrzucenie supernatantu jest ryzykowne. W takim przypadku pomiń krok 1.3.6 i przejdź do kroku 1.3.7.
    6. Odrzucić supernatant z odwirowanych próbek.
      UWAGA: W tym momencie protokół można wstrzymać, a granulki komórek zamrozić w temperaturze -80 °C i rozmrozić później. W przeciwnym razie pomiń ten krok i przejdź do kroku 1.3.7.
    7. Zawiesić osad w 100 ml/l kultury bufora inkluzyjnego (patrz Tabela Materiałów), pipetując w górę i w dół.
    8. Podczas sonikacji należy przechowywać próbki na lodzie, aby zapobiec przegrzaniu. Sonizuj każdą próbkę przez 6 cykli po 15 s, wyjście 5 i 50% impulsu. Odczekaj 15 sekund na schłodzenie między cyklami.
      UWAGA: W razie potrzeby przenieść próbki do stożkowych probówek o pojemności 50 ml w celu dalszego odwirowania (patrz Tabela materiałów). Wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 × g i temperaturze 4 °C.
    9. Odłóż na bok frakcję sonikowanego MMP do analizy żelu. Przechowywać w temperaturze -80 °C. Jeśli nie wykonujesz analizy żelu, przejdź do kroku 1.3.11.
    10. Sprawdź pellet. Jeśli jest żylasty, powtórz kroki 1.3.8-1.3.10. Jeśli osad jest zwarty, wyrzucić supernatant i przejść do kroku 1.3.12.
      UWAGA: Sonikacja w Inclusion Body Buffer może być powtarzana w celu odzyskania większej ilości białka z lizowanych szczątków komórkowych. Jednak zbyt duża sonikacja może powodować ścinanie, co szkodzi plonom MMP. Na tym etapie protokół można wstrzymać, a granulki komórek można zamrozić w temperaturze -80 °C i rozmrozić później.
    11. Zawiesić każdą osadkę z 1 l kultury w 5 ml buforu do solubilizacji (patrz tabela materiałów) przez pipetowanie. Inkubować przez co najmniej 30 minut na lodzie, aby umożliwić rozpuszczenie białek.
    12. Odłóż na bok frakcję rozpuszczonego MMP do analizy żelu. Przechowywać w temperaturze -80 °C. Jeśli nie wykonujesz analizy żelu, przejdź do kroku 1.3.14.
    13. Odwirować komórki przez 10 minut w temperaturze 13 000 × g i temperaturze 4 °C. NIE WYRZUCAĆ SUPERNATANTU.
    14. Jeśli po odwirowaniu tworzy się osad/pozostaje osad, wlać supernatant do oddzielnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Zawiesić osad w kolejnych 5 ml buforu do rozpuszczania (na 1 l kultury), pipetując w górę iw dół.
    15. Wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 × g i temperaturze 4 °C. NIE WYRZUCAĆ SUPERNATANTU.
    16. Powtarzaj kroki 1.3.13 i 1.3.14, aż po odwirowaniu nie utworzy się niewielka ilość osadu lub nie pozostanie tylko szary osad. Połączyć supernatanty. Wyrzucić lub przechowywać osad w temperaturze -80 °C w celu dodatkowej sonikacji.

2. Oczyszczanie i ponowne składanie MMP

  1. Oczyszczanie powinowactwa His-Tag (HT)
    1. Zgodnie z protokołem producenta, kolumnę grawitacyjną przepływową (patrz Tabela materiałów) dobrze wymieszaną żywicą Ni-NTA (patrz Tabela materiałów). Pozwól, aby żywica osiadła i oddzieliła się od bufora magazynującego, tak aby między dwiema warstwami utworzyła się wyraźna linia.
      UWAGA: Nigdy nie pozwól, aby żywica wyschła, ponieważ powietrze wniknie w żywicę i zaszkodzi wydajności białka. Pomiędzy użyciami należy przeprowadzić procedurę regeneracji żywicy opisaną w sekcji 2.2.
    2. Poczekaj, aż bufor magazynu zostanie opróżniony. Napełnij kolumnę dwiema objętościami buforu równoważącego HT w złożu żywicy.
    3. Opróżnij bufor równowagi HT i wyrzuć. Podczas opróżniania kolumny odwirować ekstrakt białkowy o stężeniu 13 000 × g przez 1 minutę i wysterylizować metodą filtracji za pomocą filtra 0,22 μm (patrz tabela materiałów).
    4. Zamień pojemnik na odpady na stożkową rurkę o pojemności 50 ml z oznaczeniem HT Flowthrough. Dodaj przygotowany ekstrakt białkowy do kolumny.
    5. Ponownie zastosuj przepływ, aby zmaksymalizować wiązanie.
    6. Odłóż na bok ułamek frakcji przepływowej do analizy żelu. Przechowywać w temperaturze -80 °C. Jeśli nie wykonujesz analizy żelu, przejdź do kroku 2.1.7.
    7. Natychmiast przemyć żywicę 15 ml buforu do płukania HT (patrz tabela materiałów). Zebrać przepływ w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml (patrz tabela materiałów) oznaczonych HT Wash.
      UWAGA: Wartości absorbancji przy 280 nm (A280) uzyskano za pomocą spektrofotometrii i użyto wraz z masą cząsteczkową i współczynnikiem ekstynkcji ε, do oszacowania stężeń białek. Dla denaturowanego Hisx6-pro-MMP-3cd masa cząsteczkowa wynosi 29,86 kDa, a ε 34,38 M-1 cm-1.
    8. Odślepiając w stosunku do bufora płuczącego HT, zmierz i zapisz A280. Powtórzyć kroki 2.1.7 i 2.1.8 z dodatkowymi frakcjami płuczącymi. Gdy A280 zbliży się do linii bazowej, a zanieczyszczenia zostaną zminimalizowane, przejdź do kroku 2.1.9.
    9. Odłóż na bok frakcję płuczącą do analizy żelu. Powtórz dla wielu frakcji prania. Frakcje przechowywać w temperaturze -80 °C. Jeśli nie wykonujesz analizy żelu, przejdź do kroku 2.1.10.
    10. Natychmiast wymyj białka znakowane przez His, dodając 5 ml buforu elucyjnego HT (patrz Tabela Materiałów). Zebrać przepływ w postaci frakcji 0,5-1 ml w probówkach do mikrofuge oznaczonych HT Elution.
    11. Odłóż na bok frakcję elucyjną do analizy żelu. Powtórzyć dla wielu frakcji elucyjnych. Frakcje przechowywać w temperaturze -80 °C. Jeśli nie wykonujesz analizy żelu, przejdź do kroku 2.1.12.
    12. Jeśli A280 wynosi >0,3 mg/ml, rozcieńczyć frakcję buforem równoważącym HT (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Frakcję eluowaną należy rozcieńczyć do A280 o stężeniu 0,3 mg/ml lub mniejszym, aby zapobiec wytrącaniu się osadu podczas dializy. W tym miejscu można wstrzymać protokół, a zebrane frakcje zamrozić w temperaturze -80 °C i później rozmrozić. W przeciwnym razie pomiń ten krok i przejdź do kroku 2.2.1.
  2. Regeneracja żywic
    1. Przemyć żywicę dziesięcioma objętościami złoża żywicy buforu regeneracyjnego HT (patrz Tabela Materiałów) i dziesięcioma objętościami złoża żywicy sterylnej wody.
    2. Żywicę należy przechowywać w postaci 50% zawiesiny w 20% (v/v) etanolu w wodzie.

3. Ponowne fałdowanie białek

UWAGA: W przypadku mniejszych objętości, kasety do dializy mogą być używane przy mniejszym ryzyku utraty próbki. Rurki do dializy są wymagane, jeśli używane są większe objętości (patrz Tabela materiałów).

  1. Dializa
    UWAGA: Optymalne stężenie białka do dializy wynosi ~0,3 mg/ml. Jeżeli podczas dializy wystąpi znaczne wytrącanie się, należy zmniejszyć gradient stężenia mocznika między każdą dializą przy użyciu metody dializy stopniowej i dodać więcej etapów pośrednich (np. z 6 M do 5 M, a następnie z 5 M do 4 M, zamiast pomijać etap 5 M). Ponieważ cykle zamrażania i rozmrażania uszkadzają strukturę komórkową i białkową, ważne jest, aby zminimalizować przerwy w protokole.
    1. Zgodnie z protokołem producenta należy użyć odpowiedniej ilości rurki do dializy w zależności od objętości próbek frakcji elucyjnej.
    2. Zanurzyć eluowane frakcje MMP w rurkach dializacyjnych w 1 l buforu dializacyjnego 1 (patrz tabela materiałów). Mieszać rurkę i jej zawartość na mieszadle magnetycznym przez co najmniej 8 godzin w temperaturze 4 °C.
    3. Przenieść do 1 l buforu dializacyjnego 2 (patrz tabela materiałów). Mieszać rurkę i jej zawartość na mieszadle magnetycznym przez co najmniej 8 godzin w temperaturze 4 °C.
    4. Przenieść do 1 l buforu dializacyjnego 3 (patrz tabela materiałów). Mieszać rurkę i jej zawartość na mieszadle magnetycznym przez co najmniej 8 godzin w temperaturze 4 °C.
    5. Przenieść próbkę do nowych stożkowych probówek o pojemności 50 ml i oznaczyć je jako Dializowany MMP.
    6. Zbadaj probówkę pod kątem osadów. Jeżeli utworzył się osad, odwirować próbkę przez 1 minutę w temperaturze 13 000 × g i temperaturze 4 °C.
    7. Przenieść supernatant do nowych stożkowych probówek o pojemności 15 ml i oznaczyć je jako ponownie złożone MMP.
    8. Odłóż frakcję na bok do analizy żelu i oznacz ją jako ponownie złożony MMP. Przechowywać w temperaturze -80 °C. Jeśli nie wykonujesz analizy żelu, przejdź do kroku 3.1.9.
      UWAGA: Jeśli wydajność jest niska, osad można rozpuścić w buforze równoważącym HT i powtórzyć czynności opisane w sekcji 3.1 za pomocą rurki do dializy. Jeżeli analiza żelu nie ma być wykonywana lub jeżeli protokół musi zostać wstrzymany w tym miejscu, należy zamrozić próbki w temperaturze -80 °C, a następnie je rozmrozić. Jeśli plony mieszczą się w pożądanym zakresie, przejdź do kroku 3.2.1.
  2. Rekoncentracja
    UWAGA: Oczekuje się, że współczynniki ekstynkcji dla ponownie złożonego i zdenaturowanego Hisx6-pro-MMP-3cd będą takie same; w związku z tym nie ma to wpływu na obliczenia A280.
    1. Ponownie zagęścić próbkę do 0,5 mg/ml. Użyć mieszanej kuwety o pojemności 400 ml (patrz tabela materiałów), aby zagęścić próbkę do 15 ml. Aby zapobiec pienieniu, w razie potrzeby użyj probówki do ponownego zagęszczania o pojemności 50 ml, aby jeszcze bardziej się zagęścić.
      UWAGA: Jeśli utworzy się osad, można go granulować i rozpuścić w buforze równoważącym HT. Następnie powtórz sekcje 3.1 i krok 3.2.1. W przeciwnym razie przejdź do kroku 3.2.2.
    2. Odłóż frakcję do analizy żelu i oznacz ją jako Skoncentrowany MMP.
      UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki zamrozić w temperaturze -80 °C i rozmrozić później.

4. Aktywacja

  1. Aktywacja octanu 4-aminofenylortęci (APMA)
    UWAGA: APMA jest wysoce toksyczny. Przed aktywacją przygotuj świeży roztwór podstawowy 20 mM APMA i zawsze pracuj pod wyciągiem podczas korzystania z APMA. Wyrzuć odpady APMA do pojemnika.
    1. Na 1 ml podwielokrotności MMP (1 mg/ml) dodać 50 μl 20 mM APMA (patrz tabela materiałów), aby osiągnąć końcowe stężenie APMA 1 mM. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    2. Jeśli utworzy się osad, należy go odwirować z maksymalną prędkością przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przechowywać supernatant w probówce do mikrodymowania o pojemności 1,5 ml oznaczonej jako Activated MMP. Wyrzucić osad do pojemnika oznaczonego jako odpady APMA.
    3. Odłóż frakcję do analizy żelu i oznacz ją jako Aktywowany MMP.
      UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki zamrozić w temperaturze -80 °C i rozmrozić później. Jeśli nie wykonujesz analizy żelu, przejdź do kroku 4.2.1. Po aktywacji masa cząsteczkowa i współczynnik ekstynkcji MMP-3cd wynoszą odpowiednio 19,40 kDa i 28,42 M-1 cm-1.
  2. Odsalania
    1. Usunąć APMA z aktywowanej próbki MMP-3cd za pomocą kolumny odsalającej o pojemności 2 ml (patrz tabela materiałów), postępując zgodnie z protokołem producenta.
    2. Odłóż frakcję do analizy żelu i oznacz ją jako odsolony MMP. Przechowywać w temperaturze -80 °C. Jeżeli nie przeprowadza się analizy żelu, należy przejść do sekcji 4.3 z pozostałymi próbkami.
      UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki zamrozić w temperaturze -80 °C i rozmrozić później.
  3. Uruchamianie żeli SDS-PAGE
    1. Uruchom wszystkie frakcje białkowe na żelach SDS-PAGE: Frakcja nieindukowana, Frakcja indukowana, Lizowany MMP, Sonizowany MMP, Rozpuszczony MMP, Frakcja przepływowa, Frakcja płuczka, Frakcja elucyjna, Ponownie złożony MMP, Zagęszczony MMP, Aktywowany MMP i Odsolony MMP.
  4. Długotrwałe przechowywanie MMP-3
    1. Dodać 0,05% (v/v) niejonowego środka powierzchniowo czynnego (patrz tabela materiałów) do odsolonych próbek MMP-3cd i przechowywać je w temperaturze -80 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas uruchamiania próbek na SDS-PAGE, ponieważ białko jest wyrażane w postaci nierozpuszczalnych ciał inkluzyjnych, frakcje lizowane i sonikowane powinny zawierać niewiele lub wcale ekstraktu Hisx6-pro-MMP-3cd, ponieważ białko nie zostało jeszcze rozpuszczone w moczniku. Rysunek 3 porównuje frakcje elucji oczyszczania Hisx6-pro-MMP-3cd z komórek BL21(DE3) i komórek R2DP. Frakcje elucyjne połączono oddzielnie zarówno dla komórek BL21(DE3), jak i R2DP przed dializą. Frakcje z każdego etapu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja na dużą skalę rozpuszczalnych, ludzkich, rekombinowanych MMP pozostaje trudnym zadaniem. Komórki ssaków mogą wyrażać funkcjonalne MMP przy wysokich kosztach i długim czasie oczekiwania, podczas gdy E. coli szybko wytwarzają duże ilości ciał inkluzyjnych MMP, które muszą zostać oczyszczone i ponownie złożone11,16. Ogniwa R2DP znacznie zwiększają wydajność ciał inkluzyjnych MMP, umożliwiając bardziej opłacalny i produktywny proces ponownego fałdo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować dr Evette Radisky i Alexandrze Hockla z Mayo Clinic w Jacksonville na Florydzie za dostarczenie plazmidu pET-3a-pro-MMP-3cd jako szablonu do klonowania genu Hisx6pro-MMP-3cd, oraz ich komentarze, a także dr Paulowi Hartleyowi z Nevada Genomics Center na University of Nevada, Reno, za sekwencjonowanie DNA. Autorzy chcieliby również podziękować Cassandrze Hergenrader za pomoc w części ekspresji białek. M.R.-S. pragnie podziękować grantowi NIH-P20 GM103650-COBRE Integrative Neuroscience oraz nagrodzie UNR R&D mICRO SEED Grant Award.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m sterylny filtrSigma AldrichSLGP033RSSłuży do usuwania niektórych zanieczyszczeń z ekstraktu białkowego przed oczyszczeniem i zapobiegania zatykaniu się kolumny Ni-NTA
1 L TermosyFisher ScientificS76106Fn/a
1 L szklane butelkiThermo Fisher Scientific06-414-1Dn/a
1,5 ml probówki do mikrofugeThermo Fisher Scientific02-682-002N/a
Probówki stożkowe 15 mlThermo Fisher Scientific339650n/a
18 G, igła skośna1 cal AmazonB07S7VBHM2Używany w połączeniu z kasetą dializacyjną
2 ml kolumna odsalającaThermo Fisher Scientific89890Usuwa APMA po aktywacji
Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES)Thermo Fisher ScientificAAA1610422n/a
Stożkowe poduszki na butelki 250 mlThermo Fisher Scientific05-538-53AStabilizacja stożkowych butelek podczas wirowania o dużej objętości
Butelki stożkowe 250 mlThermo Fisher Scientific05-538-53n/a
400 mL mieszadło komórkoweSigmaAldrich UFSC40001Ponownie zagęszcza znacznie większą objętość niż filtr odśrodkowy. Komórki Rosetta2(DE3)pLysS wytwarzają duże ilości białka, które mogą przekraczać limit 15 ml odśrodkowego jednostki filtrującej
Octan 4-aminofenylortęci (APMA)Sigma AldrichA9563-5GAktywuje MMP-3 poprzez rozszczepienie strzykawki propeptyd
5 mlThermo Fisher ScientificNC0829167Używany w połączeniu z kasetą do dializy
50 ml rurki stożkoweThermo Fisher Scientific339650Służy do przechowywania na wielu etapach oczyszczania
50 ml probówka do ponownego zatężaniaSigma AldrichUFC901024DSłuży do ponownego zagęszczania próbek białek po dializach lub usuwania zanieczyszczeń
AgarThermo Fisher ScientificBP1423-500Składnik buforowy, który zestala autoklawowane podłoże LB po schłodzeniu
AmpicillinThermo Fisher ScientificBP1760-25Antybiotyk stosowany z wektorem pET3a; używany przy 100 &mikro; g/ml w pożywce LB
BamHINEBR3136SEnzym restrykcyjny do stosowania z wektorem pET3a
Chlorek wapnia (CaCl2)Thermo Fisher Scientific600-30-23Jon wapnia stabilizuje strukturę MMP
Rozsiewacze komórekThermo Fisher Scientific50-189-7544Może być stosowany do rozprowadzania komórek na szalce Petriego po transformacji
ChloramfenikolThermo Fisher Scientific22-055-125GMAntybiotyk stosowany z wektorem pET3a; stosowany w 34 &mikro; g/ml w pożywce LB
Bufor do dializy 1n/an/d20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &mikro; M ZnCl2, 4 M Mocznik.
Bufor do dializy 2n/an/d20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &mikro; M ZnCl2, 2 M Mocznik.
Bufor do dializy 3n/dn/d20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 &mikro; M ZnCl2.
Klipsy do dializyThermo Fisher Scientific68011Używany w połączeniu z rurkami dializacyjnymi ze skóry węża Rurki
do dializy ThermoFisher Scientific88243Alternatywna metoda dializy, która utrzymuje znacznie większe objętości próbek, ale z większym ryzykiem utraty próbki
Bufor trawiennyNEBB7204SBufor używany do trawienia wektora pET3a
Kuwety jednorazoweThermo Fisher Naukowy21-200-257Służy do pomiaru OD kultury bakteryjnej podczas wzrostu i ekspresji
Ditiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificD107125GPomaga w denaturacji białek poprzez redukcję wiązań dwusiarczkowych
Mieszanka montażowa DNANEB E2621SSłuży do ligacji produktu Hisx6-pro-MMP-3cd PCR i strawionego wektora pET3a
DNazy INEBM0303SEndonukleaza do degradacji niekorzystnych zanieczyszczeń DNA, które mogą później wpływać na oczyszczanie białek
EtanolThermo Fisher ScientificA995-4n/a
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Thermo Fisher ScientificJ15694-AEStosowany w denaturacji. Zapobiega utlenianiu i późniejszemu tworzeniu się wiązań dwusiarczkowych
Zestaw do odzyskiwania żeluPromegaA9281Izoluje i oczyszcza DNA z żeli agarozowych
GlicerolThermo Fisher ScientificG33-500Służy do wytwarzania zapasów glicerolu, które są zamrażane w temperaturze -80 &; C
Kolumna przepływu grawitacyjnegoBioRad7321010Służy do oczyszczania Ni-NTA rekombinowanych białek znakowanych Hisem Ogniwa
o wysokiej wydajności transformacjiNEBC2987Ogniwa o wysokiej wydajności transformacji z większą szansą na powodzenie w klonowaniu N-końcowego znacznika Hisa do konstruktu pET3a-pro-MMP-3cd
Bufor elucyjny HTnienie dotyczy20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 6 M mocznik, 250 mM imidazol. Dostosować pH do 7,4
HT Bufor równowagowyn/an/d20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 6 M mocznik. Dostosować pH do 7,4
HT Bufor regeneracyjnynienie dotyczy20 mM MES, 0,1 M NaCl. Dostosuj pH do 5,0
HT Bufor płuczącynie20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 6 M mocznika, 25 mM imidazolu. Dostosuj pH do 7,4
Kwas solny (HCl)Thermo Fisher ScientificA144C-212Służy do buforowania
pH ImidazolThermo Fisher ScientificAAA1022122Naśladuje grupę boczną histydyny. Służy do oddzielania białek niewiążących niespecyficznie od znakowanego przez niego białka docelowego
Inclusion Body Buffern/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0,5 M mocznik. Dostosuj pH do 8,0
Izopropylo-ß-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Thermo Fisher ScientificFERR0392Odczynnik, który indukuje ekspresję docelowego genu w pET3a. Przygotować 0,5 ml 1 M porcji, przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze -20 stopni; C
LB Amp CamR medianieNie dotyczy Wlać do sterylnej butelki o pojemności 1 l lub kolby o pojemności 1 l. Na 1 l dodaj 25 g bulionu LB. Sterylizuj w autoklawie. Po schłodzeniu do temperatury poniżej 50 stopni C, dodaj ampicylinę do 100 i mikro; g / ml i chloramfenikolu do 34 &mikro; g/mL
LB Amp CamR płytkinieNie dotyczy Do wlania do sterylnych szalek Petriego. Wlewać, aż pokrywka szalki Petriego zostanie całkowicie zakryta. Z 1 l podłoża wystarcza na 40-60 płytek. Na 1 l: 25 g bulionu LB, 16 g agaru. Sterylizuj w autoklawie. Po schłodzeniu do temperatury poniżej 50 stopni C, dodaj ampicylinę do 100 i mikro; g / ml i chloramfenikolu do 34 &mikro; g/ml
LB BulionThermo Fisher ScientificBP1426-2Wstępnie zmieszany z tryptonem, ekstraktem drożdżowym i chlorkiem sodu
Bufor do lizyn/an/a50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0,133 g/ml lizozymu, 0,49% v/v Triton X-100. Dostosuj pH do 8,0
LizozymMP Biomedicals195303Stosowany w ekstrakcji białek. Enzym lizujący ściany komórkowe bakterii
Zestaw miniprepPromegaA1330Jeśli się powiedzie, ekstrahuje konstrukt pET3a-pro-MMP-3cd z transformantów
NdeINEBR0111Sstosowania z wektorem pET3a
Żywica Ni-NTAThermo Fisher ScientificPI88221Służy do wiązania rekombinowanych białek znakowanych przez jego. Ta silna interakcja może być wyparta przez wyższe stężenia imidazolu
niejonowego środka powierzchniowo czynnegoThermo Fisher ScientificPI28316Detergent do przechowywania, zapobiegający agregacji MMP. Minimalizuje interakcje między pozostałościami hydrofobowymi na powierzchni MMP a cząsteczkami wody, nie zakłócając przy tym aktywności katalitycznej.
Mieszanka PCRNEBM0492SOdczynnik do PCR do wprowadzania N-końcowego znacznika his-tag do plazmidu pET wektorowego pET3a-pro-MMP-3cd
Addgenen/aWektor pET3a oferuje oporność na ampicylinę, indukowalną ekspresję docelowego genu i sekwencjonowanie za pomocą starterów T7
Szalki PetriegoVWR25384-342Służy do powlekania transformantów na podłożach agarowych LB
Komórki R2DPNovagen714033pochodne BL21 o zwiększonej ekspresji białek eukariotycznych. Zawierają tRNA kodonów, które okazały się rzadkie w
pożywce wzrostowej ENEBB9020SNieselektywne podłoża wzrostowe do szybkiego wzrostu podczas transformacji
Chlorek sodu (NaCl)Thermo Fisher ScientificBP358-1Stosowany w i pomaga w stabilności białek
Deoksycholan soduThermo Fisher ScientificPI89905Detergent stosowany w ekstrakcji białek. Lizuje ściany komórkowe
Bufor solubilizacyjnyn/an/d20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M mocznik. Dostosuj pH do 8,0
Tris baseThermo Fisher ScientificBP152-1Powszechny bufor stosowany w fizjologicznym zakresie pH. Wrażliwy
na temperaturę Triton X-100Thermo Fisher ScientificM1122980101Detergent stosowany do lizy komórek
MocznikThermo Fisher ScientificAAJ75826A7Pierwszy chaotropowy środek do zaburzania struktury drugorzędowej białka
Chlorek (ZnCl2)Thermo Fisher ScientificAAA162810EStabilizuje strukturę MMP. Jon znajduje się w miejscu katalitycznym MMP-3
dotyczy dotyczy dotyczy dotyczy dotyczy Enzym restrykcyjny do , . coli SOC

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Portolano, N., et al. Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897(2014).
  2. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568(2015).
  3. Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370(2012).
  4. Yang, Z., et al. Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method. PLoS One. 6 (7), 22981(2011).
  5. Hu, X., Beeton, C. Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445(2010).
  6. Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).
  7. Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics. Cells. 9 (5), 1313(2020).
  8. Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
  9. Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition. Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).
  10. Batra, J., et al. Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).
  11. Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K. Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli. Matrix Metalloproteases. Galea, C. A. , Humana Press. New York, NY. 3-16 (2017).
  12. Manka, S. W., et al. Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).
  13. Gomis-Ruth, F. X., et al. Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1. Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).
  14. Shirian, J., et al. Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14. FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).
  15. Li, C., et al. Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).
  16. Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041(2012).
  17. McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli. Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).
  18. Maity, R., et al. GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320(2013).
  19. Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Montón Silva, A., Hochkoeppler, A. The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431(2015).
  20. Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772(2015).
  21. Zeytuni, N., Zarivach, R. Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamAΔ41. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844(2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie bia ek rekombinowanychekspresja w E colirefolding cia ek inkluzyjnychoczyszczanie z u yciem znacznika His Tagdializa bia ekanaliza SDS PAGEkom rki R2DP

Powiązane artykuły