Opisana jest spójna metodologia obrazowania rozpraszania Ramana do wizualizacji i ilościowego oznaczania związków farmaceutycznych w skórze. W artykule opisano przygotowanie tkanki skórnej (ludzkiej i mysiej) i miejscowe stosowanie preparatów, akwizycję obrazu w celu ilościowego określenia czasoprzestrzennych profili stężeń oraz wstępną analizę farmakokinetyczną w celu oceny miejscowego dostarczania leków.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wizualizacja i kwantyfikacja związków farmaceutycznych w skórze za pomocą obrazowania ze spójnym rozpraszaniem Ramana
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Farmakokinetyka skórna (cPK) po zastosowaniu preparatu miejscowego była obszarem badawczym szczególnie interesującym dla naukowców zajmujących się regulacjami i rozwojem leków, aby mechanistycznie zrozumieć miejscową biodostępność (BA). Techniki półinwazyjne, takie jak usuwanie taśmy, mikrodializa skórna lub mikroperfuzja skórna z otwartym przepływem, określają ilościowo cPK w makroskali. Chociaż techniki te dostarczyły ogromnej wiedzy na temat cPK, społeczność nie ma mechanistycznego zrozumienia penetracji i przenikania aktywnych składników farmaceutycznych (API) na poziomie komórkowym.
Jednym z nieinwazyjnych podejść do rozwiązania problemu cPK w mikroskali jest koherentne obrazowanie rozpraszania Ramana (CRI), które selektywnie celuje w wewnętrzne drgania molekularne bez potrzeby stosowania zewnętrznych etykiet lub modyfikacji chemicznej. CRI ma dwie główne metody - koherentne rozpraszanie Ramana przeciwko Stokesowi (CARS) i wymuszone rozpraszanie Ramana (SRS) - które umożliwiają czułą i selektywną kwantyfikację API lub składników nieaktywnych. CARS jest zwykle wykorzystywany do uzyskiwania informacji strukturalnych skóry lub wizualizacji kontrastu chemicznego. Natomiast sygnał SRS, który jest liniowy ze stężeniem molekularnym, jest używany do ilościowego oznaczania API lub składników nieaktywnych w stratyfikacjach skóry.
Chociaż tkanka myszy była powszechnie stosowana do cPK z CRI, miejscowe BA i biorównoważność (BE) muszą ostatecznie zostać ocenione w tkance ludzkiej przed zatwierdzeniem przez organy regulacyjne. W artykule przedstawiono metodologię przygotowania i obrazowania skóry ex vivo do wykorzystania w ilościowych badaniach farmakokinetycznych CRI w ocenie miejscowych BA i BE. Metodologia ta umożliwia wiarygodną i powtarzalną ocenę ilościową API w skórze człowieka i myszy w czasie. Stężenia w przedziałach bogatych i ubogich w lipidy, a także całkowite stężenie API w czasie są określane ilościowo; są one wykorzystywane do oszacowań BA w mikro- i makroskali oraz, potencjalnie, BE.
Wprowadzenie
Metodologie oceny cPK po miejscowym zastosowaniu produktu leczniczego rozszerzyły się z klasycznych badań in vitro permeation testing (IVPT)1,2,3,4,5 i taśma-stripping6,7,8 do dodatkowych metodologii, takich jak mikroperfuzja z otwartym przepływem lub mikrodializa skórna9,10,11,<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Użycie tkanki ucha nagiej myszy zostało zatwierdzone przez Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), podczas gdy użycie ludzkiej tkanki skórnej zostało zatwierdzone przez Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (IRB). Zgodnie z protokołami IACUC, świeżo uśpione myszy uzyskano od współpracowników z nagimi koloniami myszy. Tkanka ludzka została pobrana z planowych zabiegów abdominoplastyki w Massachusetts General Hospital za pomocą zatwierdzonego protokołu. Ponadto określone rodzaje tkanek inne niż skóra brzucha zostały pozyskane za pośrednictwem organu ds. dawstwa ciała, również za pomocą protokołu zatwierdzon....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Obrazowanie uważa się za udane, jeśli tkanka nie przesunęła się znacząco ani w kierunku osiowym (<10 μm), ani bocznym po zakończeniu eksperymentu (Rysunek 4). Jest to natychmiastowa wskazówka, jeśli pomiar SRS dla substancji czynnej będącej przedmiotem zainteresowania nie jest reprezentatywny dla głębokości początkowej, dla której kwantyfikacja jest specyficzna dla warstwy. Jest to łagodzone przez obrazowanie stosów z dla każdej interesującej pozycji XY, przy czym kompromisem jest rozdzielczość cza.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ocena miejscowego BA/BE jest obszarem badań, który wymaga wieloaspektowego podejścia, ponieważ żadna pojedyncza metoda nie jest w stanie w pełni scharakteryzować cPK in vivo . W protokole tym przedstawiono metodologię oceny BA/BE produktu leczniczego stosowanego miejscowo w oparciu o spójne obrazowanie ramanowskie. Jednym z pierwszych punktów, które mogą zostać przeoczone, jest to, jak cienkie muszą być próbki skóry, szczególnie w przypadku ilościowego obrazowania SRS transmisyjnego. Jeśli skóra jest zbyt gruba .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
CLE jest wynalazcą patentów na mikroskopię CARS, które zostały licencjonowane przez wielu producentów mikroskopów. Wszyscy pozostali autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować dr Fotisowi Iliopoulosowi i Danielowi Greenfieldowi z Grupy Evansa za dyskusję i korektę tego manuskryptu. Ponadto autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony LEO Pharma. Rysunek 2 został stworzony za pomocą BioRender.com.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Preparat tkankowy | |||
| Autoklawowalne worki na zagrożenia biologiczne | FisherBrand | 22-044562 | Jak określono w tekście: worki na zagrożenia biologiczne https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562& searchType=SZYBKI& matchedCatNo=22044562 |
| do hodowli komórkowych: Roztwór soli buforowany fosforanem Dulbecco 1x | Corning | MT21030CV | Jak określono w tekście: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv& searchType= SZYBKI& matchedCatNo=21-030-cv |
| Skalpele jednorazowe | Exel International | 14-840-00 | Jak określono w tekście: skalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
| High Precision 45° Pęseta kątowa z szerokim czubkiem | Fisherbrand | 12-000-132 | Jak określono w tekście: kleszcze https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword= |
| Wycieraczki Kimwipes Delicate Task, 1-warstwowe | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | Jak wspomniano w tekście: wycieraczka zadaniowa https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
| Laboratoryjna folia do owijania Parafilm M | Bemis | 13-374-12 | Jak określono w tekście: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
| Szalka Petriego (35 mm x 10 mm) | Fisherbrand | FB0875711YZ | Jak wspomniano w tekście: mała szalka Petriego https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
| szalka Petriego (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB0875713A | Jak wspomniano w tekście: duża szalka Petriego https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true |
| Nożyczki chirurgiczne | Roboz | NC9411473 | Jak określono w tekście: nożyczki https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC& searchType=SZYBKI& dopasowanyNr kat.=RS-5915SC< |
| strong>Laser/mikroskop | |||
| 650/60 nm jednozakresowy filtr pasmowo-przepustowy BrightLine | Semrock | Jak określono w tekście: Filtr CARS - drgania CH2 (filtr 645nm/60nm) | |
| Skrzynka kontrolna IX2-UCB | Olympus | Jak określono w tekście: Skrzynka kontrolna | |
| D700/30m | Chroma | Jak wspomniano w tekście: Filtr CARS - pasmo deuterowane https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m | |
| DeepSee Insight | Spectra-Physics | Jak wspomniano w tekście: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser | |
| Cyfrowa ręczna konsola do pomiaru mocy optycznej i energii | ThorLabs | PM100D | Jak określono w tekście: miernik mocy https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Fluoview Software | Olympus | Jak określono w tekście: Oprogramowanie do sterowania | |
| mikroskopem Matowe szkiełka mikroskopowe | FisherBrand | Jak określono w tekście: Szkiełka mikroskopowe https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446 | |
| FV1000 | Olympus | Jak wspomniano w tekście: | |
| Mikroskopowa komora inkubacyjna | Tokai Hit | GM-800 | Jak wspomniano w tekście: komora inkubacyjna |
| Integrująca sferyczna fotodioda Czujnik mocy | ThorLabs | S142C | Jak wspomniano w tekście: fotodioda https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Zasilacz FV31-PSU | Olympus | Jak wspomniano w tekście: Power Supply | |
| Precision 4063, 80MHz Dwukanałowy generator funkcyjny | BK Precision | Jak określono w tekście: generator funkcji | |
| ProScan – Automatyka mikroskopu precyzyjnego | Wcześniejsze instrumenty | Jak określono w tekście: kontroler stopnia https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation | |
| Dystanse obrazowania SecureSeal | Grace Biolabs | 654004 | Jak określono w tekście: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/ |
| Zestaw detekcyjny SRS | APE | Jak określono w tekście: Detektor SRS | |
| UPLSAPO 20X NA:0,75 | Olympus | Jak wspomniano w tekście: 20X Obiektyw https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/ | |
| Lipid/Obrazowanie leków | |||
| Talerz 35 mm, nr 0 Niepowlekane szkiełko nakrywkowe, średnica szkła 14 mm | MatTek Corporation | NC9711297 | Jak wspomniano w tekście: Naczynie ze szklanym dnem https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297 |
| Aplikatory z bawełnianą końcówką | FisherBrand | Jak określono w tekście: Aplikator z bawełnianą końcówką | |
| Distriman Pipeta do dodatniego przemieszczenia | Gilson | Jak odniesiono się w tekście: Pipeta z przemieszczeniem dodatnim https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword= | |
| Końcówki do pipet z dodatnim przemieszczeniem Distriman | Gilson | Jak określono w tekście: Końcówki do pipety https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true | |
| Analiza danych | |||
| FIJI | Open-source | Jak określono w tekście: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ | |
| Jupyter-Lab | open-source | Jak określono w tekście: JupyterLab https://jupyter.org/ | |
| Rstudio | Open-source | Jak określono w tekście: Rstudio https://www.rstudio.com/ |
Bibliografia
- Finnin, B., Walters, K. A., Franz, T. J. In vitro skin permeation methodology. In Transdermal and topical drug delivery: principles and methodology. Transdermal and topical drug delivery: principles and practice. Benson, H. E., Watkinson, A. C. , John Wiley & Sons. Hoboken NJ USA. 85-108 (2012).
- Shin, S. H., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
Obrazowanie koherentnym rozproszeniem Ramanowskimilościowe oznaczanie leków w skórzestymulowane rozproszenie Ramanowskiekoherentne anty-Stokesowskie rozproszenie Ramanowskiefarmakokinetyka skórnabiodostępność miejscowaprzygotowanie tkanki skóryobrazowanie lipidówobszar zainteresowaniaanaliza niekompartymentowa
