Wizualizacja i kwantyfikacja związków farmaceutycznych w skórze za pomocą obrazowania ze spójnym rozpraszaniem Ramana

Podsumowanie

Opisana jest spójna metodologia obrazowania rozpraszania Ramana do wizualizacji i ilościowego oznaczania związków farmaceutycznych w skórze. W artykule opisano przygotowanie tkanki skórnej (ludzkiej i mysiej) i miejscowe stosowanie preparatów, akwizycję obrazu w celu ilościowego określenia czasoprzestrzennych profili stężeń oraz wstępną analizę farmakokinetyczną w celu oceny miejscowego dostarczania leków.

Streszczenie

Farmakokinetyka skórna (cPK) po zastosowaniu preparatu miejscowego była obszarem badawczym szczególnie interesującym dla naukowców zajmujących się regulacjami i rozwojem leków, aby mechanistycznie zrozumieć miejscową biodostępność (BA). Techniki półinwazyjne, takie jak usuwanie taśmy, mikrodializa skórna lub mikroperfuzja skórna z otwartym przepływem, określają ilościowo cPK w makroskali. Chociaż techniki te dostarczyły ogromnej wiedzy na temat cPK, społeczność nie ma mechanistycznego zrozumienia penetracji i przenikania aktywnych składników farmaceutycznych (API) na poziomie komórkowym.

Jednym z nieinwazyjnych podejść do rozwiązania problemu cPK w mikroskali jest koherentne obrazowanie rozpraszania Ramana (CRI), które selektywnie celuje w wewnętrzne drgania molekularne bez potrzeby stosowania zewnętrznych etykiet lub modyfikacji chemicznej. CRI ma dwie główne metody - koherentne rozpraszanie Ramana przeciwko Stokesowi (CARS) i wymuszone rozpraszanie Ramana (SRS) - które umożliwiają czułą i selektywną kwantyfikację API lub składników nieaktywnych. CARS jest zwykle wykorzystywany do uzyskiwania informacji strukturalnych skóry lub wizualizacji kontrastu chemicznego. Natomiast sygnał SRS, który jest liniowy ze stężeniem molekularnym, jest używany do ilościowego oznaczania API lub składników nieaktywnych w stratyfikacjach skóry.

Chociaż tkanka myszy była powszechnie stosowana do cPK z CRI, miejscowe BA i biorównoważność (BE) muszą ostatecznie zostać ocenione w tkance ludzkiej przed zatwierdzeniem przez organy regulacyjne. W artykule przedstawiono metodologię przygotowania i obrazowania skóry ex vivo do wykorzystania w ilościowych badaniach farmakokinetycznych CRI w ocenie miejscowych BA i BE. Metodologia ta umożliwia wiarygodną i powtarzalną ocenę ilościową API w skórze człowieka i myszy w czasie. Stężenia w przedziałach bogatych i ubogich w lipidy, a także całkowite stężenie API w czasie są określane ilościowo; są one wykorzystywane do oszacowań BA w mikro- i makroskali oraz, potencjalnie, BE.

Wprowadzenie

Metodologie oceny cPK po miejscowym zastosowaniu produktu leczniczego rozszerzyły się z klasycznych badań in vitro permeation testing (IVPT)^1,2,3,4,5 i taśma-stripping^6,7,8 do dodatkowych metodologii, takich jak mikroperfuzja z otwartym przepływem lub mikrodializa skórna^{9,10,11,12,13,14}. Istnieją potencjalnie różne lokalne miejsca działania terapeutycznego w zależności od choroby będącej przedmiotem zainteresowania. W związku z tym może istnieć odpowiednia liczba metodologii do oceny szybkości i zakresu, w jakim API dociera do zamierzonego lokalnego miejsca działania. O ile każda z wyżej wymienionych metodyk ma swoje zalety, o tyle główną wadą jest brak informacji o cPK w mikroskali (tj. brak możliwości wizualizacji, dokąd zmierza API i jak się przenika).

Jedną z nieinwazyjnych metodologii oceny miejscowych BA i BE jest CRI, którą można podzielić na dwie metody obrazowania: mikroskopię CARS i SRS. Te spójne metody Ramana umożliwiają specyficzne chemicznie obrazowanie cząsteczek za pomocą nieliniowych efektów Ramana. W CRI dwa ciągi impulsów laserowych są ogniskowane i skanowane w próbce; Różnica energii między częstotliwościami lasera jest ustawiona tak, aby celować w tryby drgań specyficzne dla interesujących struktur chemicznych. Ponieważ procesy CRI są nieliniowe, sygnał jest generowany tylko w ognisku mikroskopu, co pozwala na trójwymiarowe farmakokinetyczne obrazowanie tomograficzne tkanki. W kontekście cPK, CARS został wykorzystany do uzyskania informacji o strukturze tkanki, takich jak lokalizacja bogatych w lipidy struktur skóry¹⁵. W przeciwieństwie do tego, SRS został wykorzystany do ilościowego określenia stężenia molekularnego, ponieważ jego sygnał jest liniowy ze stężeniem. W przypadku próbek skóry ex vivo korzystne jest przeprowadzenie CARS w epi-direction¹⁶ i SRS w trybie transmisji¹⁷. Dlatego próbki tkanek, które są cienkie, pozwolą na wykrycie sygnału SRS i określenie ilościowe.

Jako modelowa chusteczka, ucho myszy nude ma kilka zalet z niewielkimi wadami. Jedną z zalet jest to, że tkanka ma już grubość ~200-300 μm i nie wymaga dalszego przygotowania próbki. Ponadto kilka stratyfikacji skóry jest widocznych przez ogniskowanie osiowe w jednym polu widzenia (np. warstwa rogowa naskórka, gruczoły łojowe (SG), adipocyty i tłuszcz podskórny)^16,18. Pozwala to na wstępną przedkliniczną ocenę szlaków przenikania skóry i miejscowe oszacowanie BA przed przejściem do próbek ludzkiej skóry. Jednak nagi model myszy ma ograniczenia, takie jak trudności w ekstrapolacji do scenariuszy in vivo ze względu na różnice w strukturze skóry¹⁹. Podczas gdy nagie ucho myszy jest doskonałym modelem do uzyskania wstępnych wyników, model ludzkiej skóry jest złotym standardem. Chociaż pojawiły się różne komentarze na temat przydatności i możliwości zastosowania zamrożonej ludzkiej skóry do dokładnego podsumowania kinetyki przenikania in vivo^20,21,22, użycie zamrożonej ludzkiej skóry jest akceptowaną metodą oceny kinetyki przenikania API in vitro^23,24,25. Protokół ten wizualizuje różne warstwy skóry w skórze myszy i człowieka, jednocześnie określając ilościowo stężenia API w strukturach bogatych w lipidy i ubogich w lipidy.

Chociaż CRI był wykorzystywany w wielu dziedzinach do specyficznej wizualizacji związków w tkankach, podjęto ograniczone wysiłki w celu zbadania cPK w produktach leczniczych stosowanych miejscowo. Aby ocenić miejscowe BA/BE produktów do stosowania miejscowego za pomocą CRI, konieczne jest najpierw posiadanie ustandaryzowanego protokołu w celu dokonania dokładnych porównań. Wcześniejsze próby wykorzystania CRI do dostarczania leków do skóry wykazały zmienność w obrębie danych. Ponieważ jest to stosunkowo nowe zastosowanie CRI, ustanowienie protokołu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych wyników^18,26,27. Podejście to jest ukierunkowane tylko na jedną konkretną liczbę falową w biologicznym cichym obszarze widma Ramana. Jednak większość API i składników nieaktywnych ma przesunięcia Ramana w obszarze odcisku palca. Wcześniej stanowiło to wyzwanie ze względu na nieodłączny sygnał pochodzący z tkanki w obszarze odcisku palca. Ostatnie postępy w dziedzinie laserów i obliczeń usunęły tę barierę, która może być również wykorzystana w połączeniu z podejściem przedstawionym tutaj²⁸. Przedstawione tutaj podejście pozwala na ilościowe określenie API, który ma przesunięcie Ramana w cichym obszarze (2000-2300 ^cm-1). Nie ogranicza się to do właściwości fizykochemicznych leku, co może mieć miejsce w przypadku niektórych wcześniej wymienionych metodologii monitorowania cPK²⁹.

Protokół musi redukować zmienność grubości skóry między próbkami dla różnych preparatów, ponieważ grube próbki ludzkiej skóry będą wytwarzać minimalny sygnał po zastosowaniu produktu leczniczego z powodu rozpraszania światła przez grubą próbkę. Celem niniejszego manuskryptu jest przedstawienie metodologii przygotowania tkanek, która zapewni powtarzalne standardy obrazowania. Ponadto system CRI jest skonfigurowany zgodnie z opisem, aby zmniejszyć potencjalne źródła błędów, a także zminimalizować stosunek sygnału do szumu.Jednak w tym artykule nie będzie omawiane zasady przewodnie i zalety techniczne mikroskopu CRI, ponieważ zostało to już wcześniej omówione³⁰. Na koniec badana jest obszerna procedura analizy danych, która umożliwia interpretację wyników w celu określenia sukcesu lub porażki eksperymentu.

Protokół

Użycie tkanki ucha nagiej myszy zostało zatwierdzone przez Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), podczas gdy użycie ludzkiej tkanki skórnej zostało zatwierdzone przez Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (IRB). Zgodnie z protokołami IACUC, świeżo uśpione myszy uzyskano od współpracowników z nagimi koloniami myszy. Tkanka ludzka została pobrana z planowych zabiegów abdominoplastyki w Massachusetts General Hospital za pomocą zatwierdzonego protokołu. Ponadto określone rodzaje tkanek inne niż skóra brzucha zostały pozyskane za pośrednictwem organu ds. dawstwa ciała, również za pomocą protokołu zatwierdzonego przez IRB.

1. Przygotowanie tkanki

1. Przygotowanie nagiej tkanki skóry ucha myszy
   1. Po pozyskaniu świeżo zebranych nagich ciał myszy należy usunąć uszy za pomocą kleszczy i nożyczek mikrochirurgicznych. Umieść jedno ucho na małej szalce Petriego (tj. 35 mm x 10 mm). Umieść nagie ciało myszy w torbie na wypadek zagrożenia biologicznego, która ma zostać usunięta zgodnie z lokalnymi protokołami IACUC.
   2. Opłucz każde ucho myszy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i delikatnie osusz je wycieraczką zadaniową. Powtórz dwukrotnie, aby usunąć wszelkie resztki brudu lub zanieczyszczeń z ucha, które mogą mieć wpływ na jakość obrazowania (patrz rysunek 1).
   3. Jeśli ucho ma być zużyte w ciągu 24 godzin, umieść je na małej szalce Petriego (tj. 35 mm x 10 mm) ze świeżym PBS w lodówce (2-8 °C). Jeśli kłos będzie używany po 24 godzinach od zbioru, umieść je na szalce Petriego (35 mm x 10 mm) bez PBS, przykryj naczynie parafilmem i umieść w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
2. Przygotowanie ludzkiej tkanki skórnej
   1. Po pobraniu tkanki ludzkiej należy umieścić ją na dużej szalce Petriego (tj. 60 mm x 15 mm) w kapturze biologicznym, aby zapewnić wystarczającą ilość miejsca na przygotowanie próbki.
   2. Umieść warstwę rogową naskórka stroną skierowaną w dół, tak aby dostępny był podskórny tłuszcz.
   3. Za pomocą kleszczy i nożyczek mikrochirurgicznych zacznij ostrożnie usuwać podskórną tkankę tłuszczową. Gdy tłuszczu podskórnego nie można już usunąć nożyczkami, zmień go na jednorazowy skalpel z 10 ostrzami (lub jego odpowiednik), aby usunąć pozostały tłuszcz podskórny. Używaj skalpela pod kątem 45° do skóry, trzymając skórę nieruchomo kleszczami (patrz rysunek 1).
      UWAGA: Aby uzyskać wysokiej jakości transmisyjne obrazy SRS, próbki muszą być jak najcieńsze, bez przebicia.

Rysunek 1: Obrazy o idealnej grubości do obrazowania skóry myszy i człowieka. (A) Skóra uszu myszy wystawiona na działanie światła, które może widocznie przepuszczać światło. (B) Idealna ludzka skóra wystawiona na działanie światła po przygotowaniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Pokrój ludzką skórę na kawałki o wymiarach 1 cm x 1 cm.
   UWAGA: Fresh skin, może być stosowany do 24 godzin bez użycia złoża z żelu agarozowego, jak opisano wcześniej³¹. Jednak świeża skóra może być wykorzystywana przez dłuższy czas, jeśli jest trzymana na łóżku z żelu agarozowego. Jeżeli skóra ma być wykorzystana później, umieszcza się ją w torbie do transportu próbek, a następnie umieszcza w zamrażarce o temperaturze -20 °C. Zamrożona skóra musi zostać rozmrożona zgodnie z poniższą procedurą w celu uzyskania optymalnych rezultatów (patrz krok 3.1.2).

2. Ustawienie lasera i mikroskopu

1. Około 30 minut przed obrazowaniem włącz szeroko przestrajany ultraszybki laser (zwany dalej laserem) i pozwól mu się rozgrzać. Włącz system znaku/zamka ostrzegawczego lasera, aby powiadomić personel na zewnątrz o potencjalnym zagrożeniu przy wejściu.
   UWAGA: Podczas pracy z laserami klasy IV należy zawsze nosić odpowiednie okulary. Dla konkretnego zastosowanego tutaj lasera zalecane są odpowiednie okulary o średnicy zewnętrznej ≥ 6 dla zakresu roboczego lasera 800-1 300 nm.
2. Podczas nagrzewania się lasera włącz pozostały sprzęt do sterowania mikroskopem, wykrywania CARS i wykrywania SRS.
3. Odpowiednio ustaw mikroskop, aby zapewnić optymalne obrazowanie. W oknie Image Acquisition Control w oprogramowaniu sterującym mikroskopem (zwanym dalej oprogramowaniem MC) kliknij lampę transmisyjną, aby światło mogło pochodzić z lampy transillumination mikroskopu.
4. Upewnij się, że oświetlenie Köhlera jest prawidłowe, aby ustawić mikroskop wzdłuż osi pionowej: zamknij przysłonę w dół, aby minimalna ilość światła była widoczna przez okular³².
5. Patrząc przez okular, otwórz przysłonę, aby sprawdzić, czy wielokąt styka się ze wszystkimi stronami jednocześnie. Dostosuj wysokość kondensora, jeśli kształt wielokąta nie jest widoczny przed otwarciem przysłony.
6. Jeśli kształt wielokąta nie styka się ze wszystkimi bokami w tym samym czasie, wyreguluj pozycję wyrównania przysłony za pomocą pokręteł regulacyjnych.
   UWAGA: Zobacz Sanderson et al.³³, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat konfiguracji mikroskopu.
7. Umieścić szkiełko mikroskopowe ze szkiełkiem nakrywkowym i dwustronnym klejem dystansowym zawierającym próbkę oleju (np. oliwę z oliwek, ponieważ w olejach znajduje się wiele wiązań -_{CH 2}-) na uchwycie stolika mikroskopu.
8. W oknie Ustawienia akwizycji w oprogramowaniu MC znajdź menu rozwijane mikroskopu i ustaw obiektyw mikroskopu na 20x.
9. Sprawdź, czy filtr detekcyjny CARS (645 nm/50 nm) jest w pozycji umożliwiającej wizualizację i pomiar sygnału epiCARS wzdłuż rurki fotopowielacza z bocznym portem mikroskopu.
   UWAGA: Ten konkretny filtr jest wybierany do obrazowania lipidów jako sygnał anty-Stokes CARS generowany przy 652 nm dla długości fali pompy 803 nm i długości fali Stokesa 1,040 nm (patrz równanie (1).
   (1)
   Gdzie zmienne λ mają jednostki nm; λ_pompa to długość fali wiązki pompy; a λ_Stokes to długość fali wiązki Stokesa.
10. Spójrz przez okular, aby znaleźć krawędź próbki oleju, która zostanie użyta do sprawdzenia wyrównania systemu.
11. Upewnij się, że krawędź jest w ostrości Z za pomocą pokręteł ostrości na mikroskopie i wyreguluj stage kontroler, aby uzyskać ostrość XY.
12. Po rozgrzaniu lasera ustaw wiązkę pompy na 803 nm z precyzyjnym dostrojeniem silnika ustawionym na 50.0 w graficznym interfejsie użytkownika lasera. Dokładne dostrojenie silnika może się różnić w zależności od konfiguracji.
    UWAGA: Wiązka pompy jest jedyną wiązką o regulowanej długości fali w tym laserze, ponieważ długość fali wiązki Stokesa jest ustalona na 1,040 nm. Ta konfiguracja jest ukierunkowana na drgania CO na wysokości 2850 ^cm-1 (patrz równanie (2), aby obliczyć długość fali pompy dla określenia liczby falowej).
    (2)
    Gdzie ma jednostki względnej liczby falowej (cm⁻¹), a zmienne λ mają jednostki w cm.
13. Sprawdź ustawienie lasera w mikroskopie przed obrazowaniem; zobacz Rysunek 2, aby zobaczyć obraz ścieżki lasera. Podczas wstępnej konfiguracji mikroskopu zainstaluj dwie tęczówki na ścieżce wiązki jako prowadnice w celu prawidłowego ustawienia w mikroskopie. Ponieważ ścieżka optyczna lasera może z czasem dryfować, upewnij się, że ścieżki wiązki laserowej przechodzą przez środek tęczówek, tak aby prawidłowo wchodziły do mikroskopu.
14. Korzystając z przeglądarki podczerwieni, całkowicie zamknij wszystkie tęczówki i upewnij się, że wiązka jest wyśrodkowana na obu: najpierw na tęczówce najbliżej lasera, a na końcu na porcie wejściowym mikroskopu.
15. Najpierw sprawdź belkę pompy, aby upewnić się, że wiązka idzie prosto do mikroskopu. Po ustawieniu pompy należy sprawdzić, czy wiązka Stokesa również prawidłowo wchodzi do mikroskopu.
    1. Jeśli wiązki nie są wyrównane przez tęczówki, iteracyjnie przeprowadź wiązki przez tęczówki za pomocą pokręteł regulacyjnych x i y dwóch mocowań lusterek dla pompy i ścieżek wiązki Stokesa.
16. Gdy plamki wiązki zachodzą na siebie przed wejściem do mikroskopu, sprawdź, czy prawidłowo przechodzą przez mikroskop.
    1. W oknie Image Acquisition Control w oprogramowaniu MC kliknij kanał TD dla transmisji, ALG1 (kanał analogowy 1) dla spójnego kanału Ramana anty-Stokesa i ALG2 (kanał analogowy 2) dla kanału wymuszonego rozpraszania Ramana. Użyj następujących ustawień (jak w tym protokole): wzmocnienie 1 i przesunięcie -1 dla ALG1, wzmocnienie 1,25 i przesunięcie -2 dla ALG2,
       UWAGA: W zależności od konfiguracji systemu, kanały analogowe mogą mieć różną numerację dla poszczególnych kanałów obrazowania. Jeśli detektor SRS jest na miejscu, nie będzie sygnału transmisyjnego, ponieważ żadne światło nie może się przedostać (tj. nie można jednocześnie wizualizować obrazów z TD i ALG2 w tej konfiguracji).

Rysunek 2: Schemat dla spójnej ścieżki obrazowania laserowego Ramana. Wiązki są niezależnie kondycjonowane pod kątem wielkości plamki i dopasowywane za pomocą stopnia opóźnienia czasowego w celu wygenerowania spójnego rozpraszania Ramana w próbkach dla żądanej częstotliwości strojenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

17. Włącz miernik mocy i za pomocą czujnika mocy cieplnej dużej mocy zmierz moc pompy, a wiązki Stokesa będą indywidualnie potrzebne do eksperymentu.
    UWAGA: W tym konkretnym przykładzie moc wiązki pompy wynosiła 80 mW, podczas gdy moc wiązki Stokesa wynosiła 180 mW przed wejściem do mikroskopu.
18. W oknie Image Acquisition Control kliknij przycisk Focus x2, aby wyświetlić obraz w oprogramowaniu MC.
19. W oknie Ustawienia pobierania upewnij się, że proporcje pikseli i czas przebywania są ustawione na żądane parametry eksperymentu.
    UWAGA: W tym protokole zastosowano proporcje pikseli 1,024 x 1,024 i czas przebywania 2 μs/piksel.
20. Potwierdź ustawienie lasera względem mikroskopu, odblokowując wiązkę pompy i patrząc na kanał TD.
    UWAGA: Laser jest prawidłowo ustawiony, jeśli wiązka jest wyśrodkowana na obrazie z prawidłowymi ustawieniami detektora.
21. W przeciwnym razie użyj pokręteł regulacji X i Y na peryskopie, aby przesunąć wiązkę do środka obrazu.
22. Potwierdź wyrównanie lasera i mikroskopu, widząc ten sam obraz zarówno w kanałach CARS, jak i SRS.
23. Aby uzyskać obraz wyrównania, kliknij przycisk skanowania XY w oknie Image Acquisition Control z odpowiednim ustawionym trybem filtrowania (np. Linia Kalmana 3).
24. Zapisz ten zestaw obrazów z opisową nazwą pliku, aby porównać je w czasie i potwierdzić wydajność/wyrównanie systemu.

3. Obrazowanie lipidów

1. Ucho myszy i tkanka ludzka
   1. Jeśli używasz świeżej tkanki, pomiń krok 3.1.2.
   2. Wyjąć skórę ucha myszy z zamrażarki w temperaturze -20 °C i umieścić ją w komorze inkubacyjnej (32 °C) na 10 minut. Wyjmij ucho myszy z komory inkubacyjnej.
      UWAGA: Patrz krok 1.1.2. do przygotowania skóry uszu myszy. Nieostrożne obchodzenie się lub skrobanie tkanki może spowodować mechaniczną degradację, zniszczenie lub uszkodzenie tkanki, zwłaszcza warstwy rogowej naskórka.
   3. Jeśli używasz ucha nagiej myszy, umieść przednią część ucha skierowaną w stronę szklanego dna naczynia 35 mm nr 0. Jeśli używasz ludzkiej skóry, umieść ją warstwą rogową naskórka skierowaną w dół, ponieważ umożliwi to ilościowe określenie leku od warstw powierzchownych do głębszych warstw (Rysunek 1).
      UWAGA: Tylna część nagiego ucha myszy jest bardziej podatna na niedoskonałości związane z obudową. Jeśli ludzka skóra nie zostanie umieszczona stroną warstwy rogowej naskórka skierowaną w dół pod odwróconym mikroskopem, nie będzie można zobaczyć poza skórę właściwą, ponieważ rozproszona jest spora ilość światła, a lek przenikający do warstwy rogowej naskórka nie jest widoczny.
   4. Po wyśrodkowaniu chusteczki na szklanym dnie użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby upewnić się, że skóra jest płaska i ma pełny kontakt z powierzchnią szkiełka nakrywkowego naczynia ze szklanym dnem.
      UWAGA: Jest to krok, który może powodować trudności podczas obrazowania skóry, jeśli nie jest ona całkowicie płaska.
   5. Umieść podkładkę na wierzchu skóry, aby zapobiec wszelkim ruchom podczas obrazowania. Upewnij się, że tkanka jest widoczna przez środkowy otwór pralki w celu wykrycia transmisji SRS.
   6. Wyjmij wkładkę stopnia suwaka i zastąp ją komorą inkubacyjną, w której znajduje się wkładka z pojedynczym naczyniem.
   7. Umieścić naczynie ze szklanym dnem z tkanką skórną w nasadce pojedynczej naczyń w komorze inkubacyjnej.
      UWAGA: Alternatywnie użyj płytki 6-dołkowej, aby zobrazować wiele próbek skóry i preparatów jednocześnie.
   8. Zmniejsz proporcje pikseli w oknie Ustawienia akwizycji w oprogramowaniu MC (np. z 1,024 x 1,024 do 512 x 512), aby uzyskać większą prędkość skanowania galvo, podczas gdy głębokość Z jest zmieniana, aby znaleźć warstwę rogową naskórka (patrz Rysunek 3A dla myszy lub Rysunek 3E dla człowieka).
   9. Po znalezieniu warstwy rogowej naskórka zarejestruj tę pozycję osiową jako pozycję zerową w oknie Ustawienia akwizycji i zmień proporcje pikseli dla każdego konkretnego eksperymentu (np. 1,024 x 1,024).

Rysunek 3: Przykładowa głębokość warstwy uzyskana za pomocą SRS. Górny zestaw zdjęć pochodzi z nagiej skóry uszu myszy przedstawiającej następujące elementy: (A) warstwa rogowa naskórka, (B) gruczoły łojowe, (C) adipocyty, (D) tłuszcz podskórny. Dolny zestaw obrazów uzyskano z ludzkiej skóry przedstawiających następujące elementy: (E) warstwa rogowa naskórka, (F) brodawkowata skóra właściwa i (G) gruczoł łojowy. Podziałka = 100 μm. Zarówno obrazy skóry myszy, jak i człowieka zostały uzyskane przy użyciu obiektywu 20x o wymiarach 1024 x 1024 pikseli; ludzki SG został wykonany w rozdzielczości 512 x 512 pikseli. Skróty: SRS = stymulowane rozpraszanie Ramana; SG = gruczoł łojowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Stosowanie preparatu do stosowania miejscowego

1. Odpipetować ustaloną dawkę preparatu na skórę (np. 10 μl/^cm2).
   UWAGA: Lepkość preparatu będzie odgrywać rolę w wyborze pipety. Zaleca się stosowanie pipety wyporowej do lepkich preparatów, takich jak kremy lub żele, oraz pipety wyporowej do roztworów. W tym eksperymencie ruksolitynib był związkiem modelowym w prostym roztworze glikolu propylenowego (propano-1,2-diolu).
2. Używając końcówki tłoka strzykawki lub palca w rękawiczce, pocierać preparat ruchem wskazówek zegara przez 30 sekund. Zanotować czas, w którym preparat jest nakładany do późniejszej analizy cPK (patrz kroki 6.15-6.17 poniżej).
   UWAGA: Czas stosowania zależy od eksperymentu; Każdy z nich może być inny.
3. Po upływie czasu przewidzianego na przenikanie preparatu należy usunąć nadmiar preparatu i ułożyć skórę stroną z preparatem skierowaną w stronę naczynia ze szklanym dnem.
   UWAGA: Preparat usuwa się za pomocą delikatnej wycieraczki roboczej lub małej (~1 cal) ściągaczki wydrukowanej w 3D w jednym kierunku (np. z północy na południe).

5. Eksperymentalne przygotowanie do kwantyfikacji leków

1. Ustawić belkę pompy na 803 nm. Sprawdź moc pompy i wiązki Stokesa za pomocą fotodiody, aby upewnić się, że są to pożądane moce dla eksperymentu. Odblokuj każdą wiązkę z osobna, aby zmierzyć moc i ponownie zablokować wiązki.
   UWAGA: W tym konkretnym przykładzie moc wiązki pompy wynosiła 100 mW, podczas gdy moc wiązki Stokesa wynosiła 180 mW.
2. Umieścić naczynie ze szklanym dnem w komorze inkubacyjnej z wkładką na jedno naczynie ze szklanym dnem. Zabezpiecz naczynie klipsami, aby zapobiec przesuwaniu się podczas obrazowania.
3. Włącz lampkę skrzyni biegów w oprogramowaniu MC. Patrząc przez okular, wyreguluj ostrość osiową za pomocą pokrętła regulacyjnego, aby upewnić się, że tkanka jest w ostrości.
4. Odblokuj zarówno pompę, jak i belki Stokesa. Upewnij się, że kanały ALG1 i ALG2 są włączone, a następnie kliknij Focus x2 w oprogramowaniu MC, aby wyświetlić skórę w kanałach CARS i SRS. Upewnij się, że fotodioda SRS znajduje się nad kondensatorem.
5. W menu rozwijanym Urządzenie kliknij opcję Multi Area Time Lapse (MATL). Poszukaj ostrzeżenia XY Stage; gdy stół montażowy przesunie się, aby znaleźć swój mechaniczny początek układu, kliknij przycisk OK.
6. W module MATL przejdź do Widok, a następnie kliknij Lista zarejestrowanych punktów w oprogramowaniu MC. Zacznij dodawać albo 1) określone głębokości w skórze (tj. warstwę rogową naskórka, SG, adipocyty, podskórną tkankę tłuszczową, jak określono podczas obrazowania na żywo z kontrastem dostrojonym do lipidów) lub 2) pozycje XY, jeśli mają być wykonane całe stosy głębokości. Zobacz przykłady Rysunek 3.
   1. Po zidentyfikowaniu warstwy rogowej naskórka przewiń przez ognisko osiowe (lub ognisko z), aby zidentyfikować określone stratyfikacje tkanek wymienione powyżej. Zobacz Rysunek 3 dla przykładów w skórze ludzkiej i myszy.
   2. W przypadku obrazowania określonych głębokości, w przeciwieństwie do pełnych stosów głębokości Z, dla każdej warstwy warstwy kliknij przycisk Zarejestruj punkt, aby dodać go do kolejki MATL. W przypadku stosów o pełnej głębokości kliknij przycisk Zarejestruj punkt dla każdej pozycji XY z wyborem głębokości w oknie parametrów akwizycji.
   3. Po zarejestrowaniu wszystkich pożądanych pozycji XY (pełne stosy o głębokości Z) lub XYZ (specyficzne stratyfikacje skóry) w oprogramowaniu MATL, zmień katalog plików i nazwę w sposób, który będzie spójny we wszystkich eksperymentach dla analiz obrazu i cPK (patrz kroki 6.15-6.17).
7. Ustaw liczbę powtórzeń na 1 w module MATL i kliknij przycisk Gotowe. Poczekaj, aż strzałka Play zmieni kolor z szarego na, co oznacza, że oprogramowanie jest gotowe. Naciśnij przycisk Odtwórz, aby rozpocząć obrazowanie wstępnego stosu lipidów (zwanego dalej Obrazami Lipidów).
   UWAGA: Zostanie to wykorzystane do oddzielenia bogatych i ubogich w lipidy regionów poszczególnych stratyfikacji tkanek podczas analizy. Cykl i czas całkowity są wskazane w prawym dolnym rogu zarejestrowanej listy punktów.
8. Po zakończeniu cyklu zablokuj zarówno pompę, jak i belki Stokesa. Zmień długość fali w graficznym interfejsie użytkownika lasera na żądaną długość fali w oparciu o docelową liczbę falową lub wibracje Ramana.
   UWAGA: Na przykład 843 nm dla belki pompy jest używane do kierowania na 2,250 ^cm-1 za pomocą równania (2), a precyzyjne dostrojenie silnika jest zmieniane na 50,1. Prezentowany tutaj przykładowy lek, ruksolitynib, zawiera nitryl, który może być ukierunkowany na 2250 ^cm-1. Liczba falowa docelowa dla struktury skóry będzie zawsze taka sama (2 850 ^cm-1); jednak liczba falowa dla API może być dowolną liczbą falową, ale musi być znana lub obliczona a priori.
9. Dostosuj ręczne opóźnienie czasowe stage (Rysunek 2), aby zapewnić nakładanie się w czasie dla nowej długości fali i mocy wiązki pompy. Upewnij się, że te same uprawnienia są używane zarówno do obrazowania lipidów, jak i API, które są ustalane a priori.
10. Czas trwania cyklu służy do obliczania łącznej liczby powtórzeń wymaganych w eksperymencie. Po prostu podziel całkowity pożądany przebieg eksperymentu przez czas trwania cyklu.
    UWAGA: Czas trwania cyklu jest funkcją rozmiaru obrazu, czasu przebywania pikseli, uśredniania Kalmana i liczby obrazów w cyklu. Optymalizacja tych parametrów skróci czas cyklu, zwiększając tym samym rozdzielczość czasową.
11. Po wybraniu całkowitej liczby powtórzeń cyklu odblokuj wiązkę pompy, sprawdź moc za pomocą fotodiody i upewnij się, że odpowiada mocy żądanej. Na koniec odblokuj wiązkę Stokesa, aby umożliwić obrazowanie.
12. Naciśnij przycisk Odtwórz, aby rozpocząć automatyczne obrazowanie nastaw.
13. Po zakończeniu obrazowania MATL przełącz wiązkę pompy z powrotem na 803 nm i dostosuj moc z powrotem do oryginalnej mocy obrazowania lipidów użytej w kroku 5.1.
14. Podobnie jak w poprzednich krokach, zmień nazwę pliku tak, aby była spójna dla obrazów po eksperymencie przez cały czas trwania badania.
15. Ustaw liczbę powtórzeń na 1.
16. Kliknij opcję Gotowe | Przycisk odtwarzania, aby uzyskać stos lipidów po upływie czasu i upewnić się, że podczas obrazowania nie nastąpił żaden ruch tkanki (Rysunek 4).

Rysunek 4: Ruch tkanek w skórze nagich uszu myszy pokazany przez wizualizację gruczołów łojowych. Przykład ograniczonego ruchu tkanek jest przedstawiony w A i B, podczas gdy znaczny ruch tkanek jest przedstawiony w C i D. (A) pokazuje gruczoły łojowe w momencie aplikacji preparatu i (B) tę samą głębokość po 120 minutach od aplikacji. (C) mysie gruczoły łojowe w momencie stosowania preparatu i (D) 120 minut po zastosowaniu preparatu; Gruczoły łojowe są ledwo widoczne, co wskazuje, że w tym eksperymencie nie mierzono wychwytu do gruczołów łojowych przez cały czas trwania eksperymentu. Podziałka = 100 μm. Obrazy mają wymiary 1024 x 1024 piksele. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Analiza danych

1. Pobieraj obrazy jako pliki . OIB (lub . OIR w zależności od mikroskopu i oprogramowania MC), przy czym każda pozycja XYZ ma oddzielny podfolder.
2. Skompiluj obrazy lipidów z obrazami kanałów API, zmieniając nazwy obrazów lipidów na następującą końcówkę _lipid.oib.
3. Wykonaj następujące kroki dla każdej stratyfikacji skóry (pokazane tutaj przy użyciu tylko stratyfikacji SG dla uproszczenia; patrz Rysunek 3B).
   1. Zaimportuj obraz lipidów SG do ImageJ (lub Fidżi)³⁴ i zaznacz pole wyboru Split Channels, aby podzielić plik na kanały CARS i SRS.
      UWAGA: Fidżi podzieli plik na liczbę obrazów uzyskanych podczas eksperymentu na liczbie kanałów.
   2. Otwórz menedżera obszaru zainteresowania (ROI), klikając pozycję Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji.
   3. Korzystając z kanału SRS (np. C = 1), wyznacz SG na obrazie.
      UWAGA: SG to jasne miejsca ze względu na ukierunkowane wibracje -CH₂-.
   4. Dodaj go do menedżera ROI, klikając Dodaj [t] w menedżerze ROI lub naciskając t na klawiaturze. Powtórz ten proces dla każdego SG na obrazie.
   5. Aby zamaskować obszary bogate w lipidy, wybierz każdy zwrot z inwestycji i kliknij kartę Więcej | LUB (Połącz) | Dodaj do menedżera ROI.
   6. Aby zamaskować obszary ubogie w lipidy, użyj narzędzia prostokąt w menu FIJI i narysuj kwadrat wokół całego obrazu. Dodaj to do menedżera ROI.
   7. Kliknij nowo dodany kwadratowy ROI oprócz ROI, który wybiera wszystkie regiony bogate w lipidy w menedżerze ROI. W obszarze Więcej wybierz opcję XOR, aby wygenerować maskę regionów ubogich w lipidy i dodać ją do menedżera ROI.
4. Załaduj obrazy interfejsu API na Fidżi.
5. Połącz obrazy w kolejności numerycznej (np. Image0001, Image0002, Image0003 itd.), korzystając z następującej sekwencji menu: Obraz | Stosy | Narzędzia | Konkatenacja.
   1. Możesz też zaimportować te obrazy, ładując jeden z obrazów na Fidżi, a następnie wybierając opcję o nazwie Grupuj pliki o podobnych nazwach na stronie konfiguracji.
      UWAGA: Daje to możliwość importowania wszystkich obrazów o podobnej nazwie pliku i automatycznego łączenia ich.
6. Gdy połączony obraz jest aktywny, przejdź do menedżera ROI, wybierz regiony bogate w lipidy (tj. SG), kliknij przycisk Więcej i wybierz opcję Multi-measure. Poczekaj, aż pojawi się okno Wyniki.
7. Poszukaj opcji Powierzchnia, Średnia, Minimum, Maksimum i Mediana w domyślnych ustawieniach pomiaru. Jeśli do analizy potrzebne są inne metryki, włącz te opcje, zaznaczając odpowiednie pole wyboru w oknie Ustaw miary (punkt menu Analizuj | Ustaw wymiary...).
8. Wyeksportuj dane z okna Wyniki do arkusza kalkulacyjnego i dodaj kolumnę zatytułowaną Region.
9. Dodaj bogate w lipidy do każdego wiersza danych dla regionów bogatych w lipidy. Dodaj ubogie w lipidy regiony, które znajdowały się poza lipidami.
10. Dodaj kolumnę zatytułowaną warstwę i dodaj odpowiednią warstwę, która została przeanalizowana (tabela uzupełniająca S1).
11. Powtórz kroki 6,5 - 6,7 dla regionów ubogich w lipidy, gdy wybrany jest odpowiedni zwrot z inwestycji.
12. Aby zwizualizować dane, zapisz arkusz kalkulacyjny i zaimportuj go do JupyterLab (pakiet matplotlib)³⁵ lub w R (pakiet ggplot2)³⁶. Wykreśl dane jako funkcję liczby obrazu w funkcji średniej intensywności, aby oszacować dane dotyczące stężenia-czasu. (Rysunek 5).
13. Zaimportuj arkusz kalkulacyjny do programu RStudio, aby przeprowadzić analizę niekompartmentową (NCA) na potrzeby analizy farmakokinetycznej danych CRI.
14. Dodaj kolumnę zatytułowaną czas.
15. W przypadku Image0001 oblicz czas między nałożeniem preparatu a pierwszym obrazem.
    UWAGA: To jest pierwszy punkt czasowy. Czas trwania cyklu służy do obliczania pozostałych obrazów (a tym samym punktów czasowych), które zwiększają się w czasie. Na przykład, jeśli czas od aplikacji wynosi 30 minut, Image0001 będzie miał punkt czasu 30 min, a przy czasie trwania cyklu wynoszącym 8 minut, Image0002 będzie miał punkt czasu 38 min, Image0003 będzie miał punkt czasu 46 min i tak dalej.
16. Uruchom NCA w programie RStudio (przy użyciu pakietu NonCompart)³⁷ na danych intensywności-czasu zaimportowanych z arkusza kalkulacyjnego z następującym wywołaniem dla jednej warstwy/regionu:
    sNCA(x = czas, y = średnia, dawka = 1, jednostka_czasu = "s", jednostka_dawki ="mg")
    Gdzie x odnosi się do punktów czasowych, y odnosi się do intensywności, a dawkę można pozostawić jako jeden, obliczony jako dawka mM leku w postaci użytkowej lub dawki produktu.
    UWAGA: Wyjście NCA dostarczy parametry, takie jak C_max i AUC_all. Ponieważ jednak jest to skóra ex vivo, parametry te to w rzeczywistości J_max i_{strumień AUC-wszystko}.
17. Porównaj wizualnie metryki J_max i_{AUC flux-all}, wykreślając je (Rysunek 6) wraz z porównaniami statystycznymi w warunkach eksperymentalnych. Zobacz Rysunek 6 dla przykładu analizy badań CRI ex vivo.
    UWAGA: Odpowiednie testy statystyczne są zależne od każdego konkretnego zbioru danych. Ważne jest również, aby pamiętać, że wszystkie parametry farmakokinetyczne mają rozkład logarytmiczno-normalny, a wszelkie porównania muszą wykorzystywać dane przekształcone logarytmicznie (logarytm naturalny lub log10).

Rysunek 5: Profile intensywności a czas. (A) Przykład profili strumienia, które osiągnęły nasycenie, a zatem obserwuje się tylko spadek intensywności. Każdy zwrot z inwestycji ma inny profil strumienia, aby zademonstrować niejednorodność danych, które można uzyskać. (B) Przykład stężeń, które zwiększają się po rozpoczęciu obrazowania. Każdy ROI to inne pole widzenia (oznaczone różnymi śladami kolorów) w tej samej tkance tego samego eksperymentu. Oprócz stężeń globalnych istnieje możliwość wyjaśnienia, które środowisko lokalne preferuje API/preparat, jak wskazują regiony bogate w lipidy i ubogie w lipidy. Profile przedstawione w A wskazują, że nie ma wchłaniania leku do tkanki, ponieważ substancja czynna już przeniknęła i zaczęła opuszczać tkankę po rozpoczęciu obrazowania. Jednak w B tkanka nie osiągnęła nasycenia i nadal następuje wchłanianie API, po którym następuje eliminacja. Segmentacja obrazów na bogate w lipidy i ubogie w lipidy pomoże w wyjaśnieniu lokalizacji API (lub nieaktywnych) i szlaków przenikania do skóry (tj. warstwy rogowej naskórka). Wyższe stężenie w regionach bogatych w lipidy wskazuje, że API lokalizuje się w strukturze lipidowej badanej warstwy, co pomaga w ukierunkowanym dostarczaniu informacji o leku. Skróty: ROI = region zainteresowania; API = aktywny składnik farmaceutyczny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Obrazowanie uważa się za udane, jeśli tkanka nie przesunęła się znacząco ani w kierunku osiowym (<10 μm), ani bocznym po zakończeniu eksperymentu (Rysunek 4). Jest to natychmiastowa wskazówka, jeśli pomiar SRS dla substancji czynnej będącej przedmiotem zainteresowania nie jest reprezentatywny dla głębokości początkowej, dla której kwantyfikacja jest specyficzna dla warstwy. Jest to łagodzone przez obrazowanie stosów z dla każdej interesującej pozycji XY, przy czym kompromisem jest rozdzielczość cza...

Dyskusja

Ocena miejscowego BA/BE jest obszarem badań, który wymaga wieloaspektowego podejścia, ponieważ żadna pojedyncza metoda nie jest w stanie w pełni scharakteryzować cPK in vivo . W protokole tym przedstawiono metodologię oceny BA/BE produktu leczniczego stosowanego miejscowo w oparciu o spójne obrazowanie ramanowskie. Jednym z pierwszych punktów, które mogą zostać przeoczone, jest to, jak cienkie muszą być próbki skóry, szczególnie w przypadku ilościowego obrazowania SRS transmisyjnego. Jeśli skóra jest zbyt gruba ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Preparat tkankowy
Autoklawowalne worki na zagrożenia biologiczne	FisherBrand	22-044562	Jak określono w tekście: worki na zagrożenia biologiczne https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562& searchType=SZYBKI& matchedCatNo=22044562
do hodowli komórkowych: Roztwór soli buforowany fosforanem Dulbecco 1x	Corning	MT21030CV	Jak określono w tekście: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv& searchType= SZYBKI& matchedCatNo=21-030-cv
Skalpele jednorazowe	Exel International	14-840-00	Jak określono w tekście: skalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true
High Precision 45° Pęseta kątowa z szerokim czubkiem	Fisherbrand	12-000-132	Jak określono w tekście: kleszcze https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=
Wycieraczki Kimwipes Delicate Task, 1-warstwowe	Kimberly-Clark Professional Kimtech Science	06-666	Jak wspomniano w tekście: wycieraczka zadaniowa https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666
Laboratoryjna folia do owijania Parafilm M	Bemis	13-374-12	Jak określono w tekście: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412
Szalka Petriego (35 mm x 10 mm)	Fisherbrand	FB0875711YZ	Jak wspomniano w tekście: mała szalka Petriego https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true
szalka Petriego (60 mm x 15 mm)	Fisherbrand	FB0875713A	Jak wspomniano w tekście: duża szalka Petriego https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true
Nożyczki chirurgiczne	Roboz	NC9411473	Jak określono w tekście: nożyczki https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC& searchType=SZYBKI& dopasowanyNr kat.=RS-5915SC<
strong>Laser/mikroskop
650/60 nm jednozakresowy filtr pasmowo-przepustowy BrightLine	Semrock		Jak określono w tekście: Filtr CARS - drgania CH2 (filtr 645nm/60nm)
Skrzynka kontrolna IX2-UCB	Olympus		Jak określono w tekście: Skrzynka kontrolna
D700/30m	Chroma		Jak wspomniano w tekście: Filtr CARS - pasmo deuterowane https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m
DeepSee Insight	Spectra-Physics		Jak wspomniano w tekście: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser
Cyfrowa ręczna konsola do pomiaru mocy optycznej i energii	ThorLabs	PM100D	Jak określono w tekście: miernik mocy https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Fluoview Software	Olympus		Jak określono w tekście: Oprogramowanie do sterowania
mikroskopem Matowe szkiełka mikroskopowe	FisherBrand		Jak określono w tekście: Szkiełka mikroskopowe https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446
FV1000	Olympus		Jak wspomniano w tekście:
Mikroskopowa komora inkubacyjna	Tokai Hit	GM-800	Jak wspomniano w tekście: komora inkubacyjna
Integrująca sferyczna fotodioda Czujnik mocy	ThorLabs	S142C	Jak wspomniano w tekście: fotodioda https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Zasilacz FV31-PSU	Olympus		Jak wspomniano w tekście: Power Supply
Precision 4063, 80MHz Dwukanałowy generator funkcyjny	BK Precision		Jak określono w tekście: generator funkcji
ProScan – Automatyka mikroskopu precyzyjnego	Wcześniejsze instrumenty		Jak określono w tekście: kontroler stopnia https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation
Dystanse obrazowania SecureSeal	Grace Biolabs	654004	Jak określono w tekście: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/
Zestaw detekcyjny SRS	APE		Jak określono w tekście: Detektor SRS
UPLSAPO 20X NA:0,75	Olympus		Jak wspomniano w tekście: 20X Obiektyw https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/
Lipid/Obrazowanie leków
Talerz 35 mm, nr 0 Niepowlekane szkiełko nakrywkowe, średnica szkła 14 mm	MatTek Corporation	NC9711297	Jak wspomniano w tekście: Naczynie ze szklanym dnem https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297
Aplikatory z bawełnianą końcówką	FisherBrand		Jak określono w tekście: Aplikator z bawełnianą końcówką
Distriman Pipeta do dodatniego przemieszczenia	Gilson		Jak odniesiono się w tekście: Pipeta z przemieszczeniem dodatnim https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword=
Końcówki do pipet z dodatnim przemieszczeniem Distriman	Gilson		Jak określono w tekście: Końcówki do pipety https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true
Analiza danych
FIJI	Open-source		Jak określono w tekście: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Jupyter-Lab	open-source		Jak określono w tekście: JupyterLab https://jupyter.org/
Rstudio	Open-source		Jak określono w tekście: Rstudio https://www.rstudio.com/