Skuteczne doustne podawanie RNA interferencji (RNAi) dorosłym komarom z rodzaju Anopheles gambiae

Wiele chorób przenoszonych jest przez komary, co sprawia, że badanie fizjologii i genetyki komarów jest ważnym przedsięwzięciem. Zastosowanie RNAi w tych organizmach było widoczne w ciągu ostatnich 20 lat i pozwoliło na funkcjonalną charakterystykę wielu genów komarów^1,2,3,4,5. Najczęściej stosowaną techniką dostarczania dsRNA jest mikroiniekcja, która ma tę wadę, że może zranić komary i wymaga znacznego czasu i wysiłku. Metody doustnego dostarczania RNAi zostały przetestowane, ale głównie w stadium larwalnym komarów^6,7,8,9. Doustne dostarczanie dsRNA dorosłym komarom nie zostało w pełni zbadane i może być użytecznym narzędziem do badań nad biologią wektorów i ich kontrolą.

Malaria jest przenoszona przez komary Anopheles, gdy zarażona samica komara pobiera posiłek z krwi od niezakażonego gospodarza i wstrzykuje ślinę zawierającą pasożyty malarii¹⁰. Aby ostatecznie przenieść się w ślinie komara, pasożyt musi pokonać wiele przeszkód, w tym uniknięcie układu odpornościowego komara, przejście przez barierę jelita środkowego i inwazję gruczołów ślinowych¹¹. Architektura gruczołów ślinowych komarów (SG) ma kluczowe znaczenie dla inwazji pasożytów i jest kontrolowana zarówno przez kluczowe czynniki transkrypcyjne wyrażane przez gruczoły ślinowe, jak i determinanty dymorfizmu płciowego. Kilka wysoce konserwatywnych czynników transkrypcyjnych jest wymaganych do specyfikacji komórkowej i utrzymania homeostazy gruczołów ślinowych oraz do produkcji i wydzielania białek ślinowych, które funkcjonują w żywieniu krwi^12,13,14. Głowica widelca (Fkh) jest czynnikiem transkrypcyjnym skrzydlatej helisy, który działa jako główny regulator struktury i funkcji SG owadów (na podstawie badań na muszkach owocowych i jedwabnika)^{15,16,17,18,19,20}. U Drosophila SGs, Fkh funkcjonuje z Sage, specyficznym dla SG podstawowym czynnikiem transkrypcyjnym helisa-pętla-helisa (bHLH), aby promować przeżycie SG i produkcję śliny¹⁹. Ważnym, pozytywnym współregulatorem produkcji śliny u Drosophila jest CrebA, dobrze przebadany czynnik transkrypcyjny leucyny, który zwiększa ekspresję genów szlaku wydzielniczego^21,22,23. Istnieje również silny stopień zróżnicowania morfologicznego żeńskich gruczołów ślinowych, który prawdopodobnie odgrywa kluczową rolę, nie tylko w odżywianiu krwią, ale także w zdolności pasożytów do inwazji tej tkanki²⁴.

Wiele genów zaangażowanych w określanie przeżycia gruczołów ślinowych, struktury, fizjologii i dymorfizmu płciowego ma złożone czasoprzestrzenne profile ekspresji^25,26,27, a tradycyjne metody dostarczania dsRNA do indukcji RNAi nie zawsze są skuteczne w celowaniu w tego rodzaju geny w tej lub innych tkankach. Jednak doustne podawanie dsRNA w stadium larwalnym komarów Aedes aegypti i An. gambiae zostało z powodzeniem wykorzystane do wyciszenia specyficznej dla samicy formy genu dsx^9,28. Wcześniejsze badania z użyciem dsRNA w gruczołach ślinowych komarów wykazały, że chociaż wymagane były duże ilości dsRNA, efekt wyciszenia był stosunkowo długotrwały (co najmniej 13 dni)²⁹. Przetestowano tutaj zdolność zabijanego termicznie szczepu E. coli HT115 (DE3) wyrażającego specyficzne dla sekwencji dsRNA dla dsx, fkh lub CrebA do indukowania wyciszania RNAi tych genów u dorosłych samic komarów. Doustne podawanie dsRNA wywołało knockdown genu u An. gambiae, z wyraźnym obniżeniem poziomów mRNA i z fenotypami zgodnymi z utratą funkcji tych genów. W związku z tym takie podejście prawdopodobnie zadziała w celu obniżenia funkcji różnych genów gruczołów ślinowych.

1. Klonowanie dsRNA do wektora ekspresji E. coli

1. Wybierz docelową sekwencję genu, aby wstawić ją do odpowiedniego wektora do ekspresji dsRNA. Pobierz wartości wyrażeń z Vectorbase.org przy użyciu następującej metody.
   1. Wyszukaj interesujący Cię gen (np. Tabela 1) w polu wyszukiwania na stronie głównej.
   2. Na wyświetlonej stronie genu przejdź do 8. Sekcja transkryptomiki.
   3. Poszukaj wymienionych odpowiednich eksperymentów z sekwencją RNA i ekspresją genów mikromacierzy.
   4. Dokonaj transkrypcji interesujących Cię wartości do arkusza kalkulacyjnego i utwórz tabelę danych.
2. Wybierz dostępny w handlu plazmid z co najmniej jednym promotorem T7, który ma być użyty. Jeśli wybrany plazmid ma tylko jeden promotor T7 (jak większość komercyjnych plazmidów), dołącz drugi promotor T7 do odwrotnego startera, który zostanie użyty do amplifikacji dsDNA dla interesującego genu.
   UWAGA: Sekwencję dsRNA dla docelowych genów można wybrać za pomocą aplikacji internetowej E-RNAi do projektowania odczynników RNAi³⁰. Na podstawie określonych sekwencji genów można zaprojektować zarówno długie dsRNA (około 400 pz), jak i krótkie dRNA (shRNA). Sekwencje te powinny zostać amplifikowane i zsekwencjonowane w celu potwierdzenia tożsamości przed klonowaniem. Wybrane regiony genów, plazmidy i promotory użyte w tym badaniu są wymienione w pliku uzupełniającym 1.
3. Wykonaj klonowanie zgodnie z prostą, jednoetapową procedurą opisaną wcześniej^9,31. W tym celu należy oczyścić produkt PCR i podwiązać do zlinearyzowanego plazmidowego DNA. Użyj produktu ligacji do transformacji w wyniku szoku cieplnego kompetentnych komórek E. coli³². Zaznacz przekształcone komórki za pomocą niebiesko-białego rastrowania. Potwierdź orientację wkładki za pomocą startera T7-PCR i potwierdź sekwencję za pomocą starterów M13.
   UWAGA: Białe/niebieskie badania przesiewowe mogą być stosowane, gdy plazmid wybrany do transformacji zawiera gen lacZ, który koduje β-galaktozydazę. Białe kolonie powinny zawierać pożądaną wstawkę w lacZ i mogą być wybierane w celu dalszego potwierdzenia obecności i orientacji sekwencji docelowej³³.
4. Oczyść plazmid z pierwszej transformacji i użyj go do przekształcenia kompetentnego E. coli HT115 (DE3), jak wcześniej opisano³⁴. Po potwierdzeniu, że plazmid z wkładką jest obecny w właściwym E. coli HT115 (DE3), przygotuj zapasy glicerolu bakterii do jednorazowego użytku.
   UWAGA: Odpowiednie, niespokrewnione kontrolne dsRNA powinno być pozyskane lub przygotowane do użycia w każdym eksperymencie. W tym przypadku stosuje się sekwencję niepowiązanego genu aintegumenta (mrówka) z Arabidopsis thaliana.

2. Przygotowanie zabijanych termicznie bakterii wyrażających dsRNA

1. Wyhodować kulturę z pojedynczej kolonii bakteryjnej szczepu E. coli HT115 (DE3) zawierającego plazmid eksprymujący dsRNA w 50 ml bulionu Luria (LB) zawierającego 100 μg/ml ampicyliny i 12,5 μg/ml tetracykliny, na wytrząsarce platformowej (180 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 12 godzin.
2. Rozcieńczyć kulturę bakteryjną (1:1000) w 2x pożywce z tryptonu drożdżowego (2x YT) zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i 12,5 μg/ml tetracykliny.
3. Indukuj wytwarzanie dsRNA przez dodanie 40 μM (stężenie końcowe) izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG).
Gdy komórki osiągną wartość _o.D.600 = 0,4, mniej więcej po 2 godzinach indukcji w temperaturze 37 °C z mieszaniem przy 180 obr./min, przygotuj skoncentrowaną zawiesinę bakterii zabitych termicznie, jak opisano przez Taracena i wsp. 9.
4. Komórki rozdrobnić przez odwirowanie (4000 x g, 4 °C, 10 min) i umyć komórki w jednej objętości buforu fosforanu sodu (PBS).
5. Ponownie odwirować w tych samych warunkach, ponownie zawiesić w PBS do 1/100 początkowej objętości i umieścić w temperaturze 70 °C na 1 godzinę.
6. Przygotować 400 μl porcji bakterii zabitych termicznie i przechowywać te podwielokrotności w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia (nie przechowywać dłużej niż tydzień). Ta zawiesina bakterii zabitych termicznie zawiera specyficzne dsRNA dla eksperymentów RNAi. Procedurę tę należy przeprowadzić zarówno dla bakterii dsRNA z genem docelowym, jak i dla niepowiązanej kontroli dsRNA, która ma być stosowana w każdym eksperymencie.

3. Karmienie komarów zabitymi termicznie bakteriami wyrażającymi dsRNA

1. Rozmrozić jedną porcję dsRNA (zawiesina bakterii HT115 (DE3)) i wymieszać z 1,6 ml 12% roztworu cukru zawierającego 0,2% metyloparabenu.
2. Namocz mały wacik w tym roztworze i umieść namoczony wacik w klatce zawierającej 5-dniowe komary. Upewnij się, że komary żywią się tym roztworem, zbierając jednocześnie zarówno cukier, jak i bakterie zawierające dsRNA.
3. Zmieniaj wacik nasączony roztworem dsRNA-cukru co drugi dzień przez 8 kolejnych dni.
4. Klatki na komary należy przechowywać w stałych warunkach, tj. 27 °C i wilgotności względnej 80% przy fotoperiodzie 12 h: 12 h światło: ciemny fotocykl, oddzielony 30-minutowym świtem i 30-minutowym zmierzchem.

4. Poziomy ekspresji genów docelowych do oznaczania

1. Znieczulenie na zimno komary, umieszczając pojemnik na lodzie na minutę lub do momentu, gdy komary przestaną się poruszać. Po znieczuleniu komarów umieść je na zimnej powierzchni, aby odizolować samice do sekcji.
2. Rozpyl 70% etanolu na komary i umieść je na szklanej powierzchni z PBS. Za pomocą kleszczy zabezpiecz głowę komara stabilnie i bardzo powoli pociągnij klatkę piersiową, umożliwiając uwolnienie gruczołów ślinowych do PBS.
3. Trzymaj gruczoły ślinowe w lodowatym PBS, dopóki 10 osobników nie zostanie wypreparowanych. Pula dziesięciu SG do ekstrakcji RNA przy użyciu metody tiocyjanianu fenolu i chloroformu guanidyny. Zawiesić osad RNA w 30 μl wody wolnej od RNaz.
4. Użyć 1 μl podwielokrotności RNA wyekstrahowanego z SG w poprzednim kroku, aby odczytać absorbancję przy 260 i 280 nm i obliczyć stężenie RNA w każdej próbce, mnożąc przez współczynnik rozcieńczenia. Stosunek 260/280 wynoszący ~2,0 wskazuje na dobrą jakość RNA.
5. Użyj 1 μg oczyszczonego RNA do syntezy komplementarnego DNA (cDNA) przy użyciu komercyjnego zestawu do odwrotnej transkrypcji.
6. Wykonaj rozcieńczenie cDNA w stosunku 1:10, aby przygotować reakcję RT-PCR zgodnie z zaleceniami producenta. Dla każdej próbki przygotuj reakcję dla genu docelowego i równolegle ustaw reakcję z genem porządkowania (HK). Ustaw każdą reakcję genu w technicznym triplecie, aby wyeliminować wpływ losowych zmian z metody.
   UWAGA: W tym przypadku rybosomalny gen S7 An. gambiae (GeneBank: L20837.1) i aktyna (VectorBase: AGAP000651) zostały użyte jako geny HK.
7. Wszystkie podkłady należy stosować w końcowym stężeniu 300 nM, zgodnie ze wskazaniami producenta SYBR-green. Amplifikacja w standardowych warunkach PCR: 95 °C przez 10 minut, a następnie 40 cykli po 15 s w temperaturze 95 °C i 60 s w temperaturze 60 °C.
   UWAGA: Aby określić ilościowo ekspresję genów, stosuje się metodę delta-delta-Ct (ΔΔCt). Delta Ct (ΔCt) jest różnicą między Ct genu docelowego a Ct genu porządkowego. ΔΔCt jest różnicą między ΔCt grupy eksperymentalnej a ΔCt grupy kontrolnej³⁵.

5. Ocena fenotypowa: skuteczne karmienie krwią

1. Aby ocenić zdolność do odżywiania się krwią, należy umieścić grupy 15 samic komarów leczonych docelowym i kontrolnym dsRNA na małych klatkach (12 cm średnicy) i głodzić je przez 4 godziny.
2. Za pomocą kąpieli wodnej obiegowej o temperaturze 37 °C, szklanych karmników dla komarów (o średnicy 24 mm) i membrany parafilmowej podawanie komarom zdefibrynowanej krwi owczej.
   UWAGA: Krew można nabyć od komercyjnego sprzedawcy, który aseptycznie pobiera ją od zdrowych zwierząt dawców pochodzących z USA i ręcznie defibrynuje bez antykoagulantów i dodatków.
3. Poprzez bezpośrednią obserwację policz i zapisz liczbę prób sondowania, aby pomyślnie uzyskać posiłek z krwi od pierwszych pięciu samic, które stały się w pełni nabrzmiałe w każdej grupie.
   UWAGA: Aby uniknąć znaczących zmian metabolicznych u komarów, które mogłyby zakłócać zasoby energetyczne wpływające na zachowania związane z poszukiwaniem krwi, głód ograniczono do minimum (4 godziny). W rezultacie, nie każdy komar byłby chciwie szukający mączki z krwi i ograniczyliśmy liczbę nabrzmiałych samic do pięciu (jedna trzecia całkowitej populacji każdej grupy), aby zmniejszyć wpływ zmiennych czasowych, takich jak ekspozycja na ludzki zapach, zmiana temperatury między komorami a powierzchniami żerowania itp.

6. Ocena fenotypowa: morfologia gruczołów ślinowych i regulacja w dół odpowiednich białek

1. Odizoluj świeżą tkankę w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zgodnie z opisem w kroku 4.2 i utrwal w lodowatym acetonie przez 90 s. Spłucz kilka razy w 1x PBS po usunięciu acetonu. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C z surowicą odpornościową (patrz tabela materiałów) rozcieńczoną do 1x PBS.
   UWAGA: Patrz Tabela materiałów w celu identyfikacji pierwszorzędowych przeciwciał stosowanych do białek śliny (Anopheles anti-platelet protein, AAPP; Mucyna 2, MUC2), czynniki transkrypcyjne SG (Fork Head, fkh; Szałwia, szałwia; Białko wiążące element odpowiedzi cyklicznej AMP A, CrebA) i marker pęcherzyków wydzielniczych (Rab11). Przeciwciała te są używane jako odczyty formy i funkcji SG. Jednak każde przeciwciało odpowiednie do immunofluorescencji powinno być odpowiednie dla tego protokołu.
2. Umyj w 1x PBS kilka razy. Dodać przeciwciała drugorzędowe (fluorescencyjne) rozcieńczone w 1x PBS i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Dodać dowolny barwnik przeciwstawny [taki jak 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI; DNA), aglutyninę z kiełków pszenicy (WGA; dla chityny), falloidynę (dla F-aktyny) i/lub czerwień nilową (dla lipidów)] 30 minut przed końcem 2-godzinnej inkubacji.
3. Umyj trzy razy w 1x PBS. Następnie zamontuj tkanki w 100% glicerolu na standardowym szkiełku mikroskopowym z szkiełkiem nakrywkowym o grubości 1 mm i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu obrazowania za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego.
   UWAGA: Aby uzyskać dane ilościowe, ustawienia obrazowania muszą być stałe. W tym przypadku uwzględniono tylko obrazy projekcji o maksymalnej intensywności w całej objętości 3D tkanki, a cała kwantyfikacja obrazu została znormalizowana między zabiegami (w ramach eksperymentu) w oparciu o sygnał DAPI w resztkach tkanek innych niż SG (ciało tłuszczowe, naskórek lub głowa) również obecnych na szkiełku.

Na początek, dane dotyczące wyrażeń mikromacierzy z VectorBase zostały wykorzystane do skanowania potencjalnych celów na różnych etapach rozwoju36,37 w celu określenia statusu ekspresji wszystkich genów istotnych dla obecnego badania (Tabela 1). Zgodnie z oczekiwaniami, wszystkie wybrane przez nas geny docelowe wykazywały ekspresję w dorosłych SG. Poziomy aapp i szałwii były szczególnie wysokie (Tabela 1). Na uwagę zasługuje również wysoki poziom ekspresji f-Agdsx u dorosłych samic SGs9.

Specyficzne segmenty z każdego genu zostały ocenione pod kątem użycia jako dsRNA za pomocą aplikacji internetowej E-RNAi do projektowania odczynników RNAi30. Regiony ~400 pz zawierające sekwencje unikalne dla każdego genu docelowego zostały następnie sklonowane (Rysunek 1A), przekształcone w odpowiednie szczepy bakteryjne i wykorzystane do przygotowania zawiesin bakterii zabitych termicznie, które zostały indukowane do produkcji dsRNA. Dorosłe komary karmiono przez 8 dni wacikami nasączonymi sacharozą zawierającymi bakteryjne zawiesiny dsRNA dla f-Agdsx, fkh lub mrówek (niepowiązana kontrola negatywna).

Dla analizy karmienia RNAi samic komarów, najpierw ustalono, czy karmienie f-Agdsx czy fkh dsRNA spowodowało wyciszenie genów. Zmniejszenie o 98,8% (±2,1) poziomów transkryptu fkh zaobserwowano w grupie karmionej fkh-dsRNA (Figura 1B), co wskazuje, że dsRNA bardzo skutecznie zmniejszyło obfitość transkryptów fkh w SGs. Co zaskakujące, poziomy mRNA fkh zostały zmniejszone o 82,0% (±18,9) u komarów leczonych dsRNA dla f-Agdsx, które miały 89,86% (±4,48) redukcji f-Agdsx, sugerując, że fkh może być celem F-Dsx w gruczołach ślinowych. Równocześnie ze znacznym obniżeniem poziomu ekspresji fkh, komary z nokautem fkh wykazywały znaczny wzrost liczby prób sondowania potrzebnych do pobrania krwi. Komary te wykazywały średnio pięć razy więcej prób żerowania niż grupa kontrolna lub komary karmione f-Agdsx dsRNA, które były całkowicie nabrzmiałe krwią (Rysunek 1C). Doprowadziło to do pytania, czy leczenie RNAi knockdown fkh spowodowało zmiany w lokalizacji i/lub dystrybucji kluczowych regulatorów transkrypcji (SG, TFs, Sage i CrebA) (Figura 2), wydzielanych białek (AAPP i mucyna) (Figura 3) i maszynerii wydzielniczej [Nil Red (lipidy) i Rab11 (pęcherzyki wydzielnicze)] (Rysunek 4). Co ważne, zaobserwowano znaczne różnice w intensywności barwienia w różnych regionach płatów, płatach i poszczególnych SG.

Zgodnie z przewidywaniami, poziomy barwienia szałwią i CrebA zostały znacznie zmniejszone we wszystkich płatach SG po fkh RNAi (Rysunek 2B) w porównaniu do RNAi kontroli mrówek (Rysunek 2A). Zmniejszenie zarówno najwyższych maksymalnych wartości intensywności (czerwone przerywane linie i etykiety numeryczne), jak i najniższych maksymalnych wartości intensywności (niebieskie przerywane linie i etykiety numeryczne) w profilach skanowania linii sugerowało redukcję obszarów zarówno wysokiego, jak i niskiego sygnału w tkance (Rysunki 2A,B). Dane te sugerują, że An. gambiae fkh RNAi jest skuteczny i że fkh reguluje produkcję i/lub stabilność SG TFs Sage i CrebA w An. gambiae, analogicznie do ich genetycznego pokrewieństwa u Drosophila SGs19,38,39.

Biorąc pod uwagę bardzo obfite białka składnikowe śliny, poziomy białka przeciwpłytkowego Anopheles (AAPP)40,41 zostały obniżone we wszystkich trzech płatach SG po fkh RNAi, w porównaniu do kontrolnego leczenia RNAi (Rysunek 3A,B; zielony). Z drugiej strony, nie zaobserwowano żadnych zmian w poziomie mucyny (Ryc. 3A,B; fioletowy). Dane te sugerują, że Fkh w różny sposób przyczynia się do ekspresji różnych genów białka śliny.

Na koniec, zaobserwowano dwa markery wydzielania (Ryciny 4A,B): Rab11 (pęcherzyki związane z endosomami recyklingu wierzchołkowego)42 i czerwień nilowa (lipidy). Zmniejszoną fluorescencję Rab11 zaobserwowano w dystalnych płatach bocznych (DL) po leczeniu fkh RNAi (Rysunek 4A v vs. 4B v; zielony). Jednak zwiększony sygnał Rab11 w płatach przyśrodkowych (M) i proksymalnych bocznych (PL) (Rysunek 4A vii, ix vs. 4B vii, ix; zielony) również wystąpił). Nie zaobserwowano zauważalnej różnicy w sygnale czerwieni nilowej (ryc. 4A,B; fioletowy) po leczeniu RNAi fkh w porównaniu z kontrolnym RNAi. Dane te sugerują, że redukcja fkh może zmieniać niektóre działania maszynerii wydzielniczej w złożony sposób, który różni się między płatami SG.

Tabela 1: Średnie profile wyrażeń mikromacierzy log2 dla An. Gambia geny będące przedmiotem zainteresowania. Pokazano nazwy genów, kategorię funkcjonalną, identyfikatory bazy wektorowej (AGAP) i średnie dane dotyczące wyrażeń mikromacierzy log2 zebrane z bazy wektorów. Dane te wskazują, że nasze interesujące nas geny (zaangażowane w biologię i wydzielanie komórek gruczołów ślinowych (SG)) ulegają ekspresji i wzbogaceniu w stadium larwalnym 3 (L3) i dorosłych SG, w porównaniu z całymi osobnikami.

Rysunek 1: knockdown f-Agdsx i fkh u dorosłych An. gambiae obniża poziom mRNA fkh w SG i wpływa na zdolność samic do odżywiania się krwią. (A) Reprezentatywny obraz projektu plazmidu wykorzystywanego do produkcji dsRNA w tej metodologii. Druga sekwencja promotora T7 jest dodawana do plazmidu poprzez włączenie jej do startera 3' używanego do amplifikacji insertu, który ma zostać sklonowany do plazmidu pGEMT. Plazmid jest następnie przekształcany w bakterie E. coli HT115 (DE3), a roztwór pokarmowy składa się z zawiesiny indukowanych bakterii zabitych termicznie w 10% wodzie z cukrem. (B) Zwierzęta karmione roztworem do karmienia dsRNA dla f-Agdsx lub fkh wykazywały znacznie niższe poziomy transkryptów fkh (jednoczynnikowa ANOVA z wielokrotnymi porównaniami; n = 15). Jednak tylko grupa karmiona fkh dsRNA (C) wykazała istotną różnicę w liczbie prób ugryzienia potrzebnych do pozyskania posiłku z krwi. Komary w tej grupie potrzebowały średnio pięć razy więcej prób sondowania, aby uzyskać udany posiłek z krwi, niż było to potrzebne grupom kontrolnym lub karmionym dsx-dsRNA (jednokierunkowa ANOVA z wieloma porównaniami; n = 15). Słupki błędów wskazują błąd standardowy średniej (SEM). Każdy eksperyment przeprowadzono w trzech oddzielnych powtórzeniach biologicznych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: knockdown fkh u dorosłych gruczołów ślinowych An. gambiae obniża poziom czynnika transkrypcyjnego SG. Pokazano reprezentatywne obrazy z 13 dnia dorosłej samicy An. gambiae SGs po 8 dniach (dniach 5-13) doustnej ekspozycji na (A) niespokrewnioną kontrolę dsRNA (ant) lub (B) dsRNA ukierunkowaną na główkę widelca SG TF (fkh, AGAP001671) w 10% sacharozie barwionej barwnikami DAPI (DNA; czerwony), znakowaną aglutyniną z kiełków pszenicy (WGA, chityna / O-GlcNAcylacja; niebieski), surowice odpornościowe przeciwko SG TFs: szałwii (zielony) i CrebA (fioletowy). Pokazane długości pasków skali są podawane w mikronach. SG (i) są oznaczone białymi kreskami. Żółte linie na powiększonych obrazach płatów (obszarów otoczonych żółtymi ramkami i oznaczonych jako "wstawka") wskazują, gdzie przeprowadzono skany liniowe intensywności sygnału. Intensywności kanałów zielonego i fioletowego odpowiadające skanom liniowym dla każdego powiększonego płata są wykreślone (zawsze od lewej do prawej w SG) na wykresach poniżej obrazów; Oś X = odległość (w pikselach), a oś Y = jednostka szarości (intensywność pikseli). Zakres dynamiczny intensywności pikseli jest ograniczony czerwonymi (maksymalnymi) i niebieskimi (minimalnymi) liniami przerywanymi, a odpowiednie wartości są pokazane na każdym wykresie. MIP = projekcja 3D o maksymalnej intensywności na całej głębokości SG. DL: dystalny płat boczny; M: płat przyśrodkowy; PL: bliższy płat boczny; SD: przewód ślinowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: knockdown fkh u dorosłych gruczołów ślinowych An. gambiae zmniejsza poziom białka wydzielanego przez SG. Pokazano reprezentatywne obrazy z 13 dnia dorosłej samicy An. gambiae SGs po 8 dniach (dniach 5-13) doustnej ekspozycji na (A) niespokrewnioną kontrolę dsRNA (ant) lub (B) dsRNA ukierunkowaną na główkę widelca SG TF (fkh,AGAP001671) w 10% sacharozie barwionej barwnikami DAPI (DNA; czerwony), znakowaną aglutyniną z kiełków pszenicy (WGA, chityna / O-GlcNAcylacja; niebieski), oraz białka śliny AAPP (zielone) i mucyna (MUC2, fioletowe). Pokazane długości pasków skali są podawane w mikronach. SG (i) są oznaczone białymi kreskami. Żółte linie na powiększonych obrazach płatów (obszarów otoczonych żółtymi polami) wskazują, gdzie przeprowadzono skany liniowe intensywności sygnału. Intensywności kanałów zielonego i fioletowego odpowiadające skanom liniowym dla każdego płata są wykreślone (zawsze od lewej do prawej w SG) na wykresach poniżej obrazów; Oś X = odległość (w pikselach), a oś Y = jednostka szarości (intensywność pikseli). Zakres dynamiczny intensywności pikseli jest ograniczony czerwonymi (maksymalnymi) i niebieskimi (minimalnymi) liniami przerywanymi, a odpowiednie wartości są pokazane na każdym wykresie. MIP = projekcja 3D o maksymalnej intensywności na całej głębokości SG. DL: dystalny płat boczny; M: płat przyśrodkowy; PL: bliższy płat boczny; SD: przewód ślinowy. Kursywa etykiet "DL" (Bi) wskazuje dwa widoczne obszary tego samego płata DL. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: knockdown fkh u dorosłych gruczołów ślinowych An. gambiae zmniejsza markery wydzielania SG. Pokazano reprezentatywne obrazy z 13 dnia dorosłej samicy An. gambiae SGs po 8 dniach (dniach 5-13) doustnej ekspozycji na (A) niespokrewnioną kontrolę dsRNA (ant) lub (B) dsRNA ukierunkowaną na główkę widelca SG TF (fkh, AGAP001671) w 10% sacharozie barwionej barwnikami DAPI (DNA; czerwony), znakowaną aglutyniną z kiełków pszenicy (WGA, chityna/ O-GlcNAcylacja; niebieski), Czerwień nilowa (lipidy; fioletowy) i surowice odpornościowe przeciwko recyklingowi markera pęcherzyków endosomu Rab11 (zielony). Pokazane długości pasków skali są podawane w mikronach. SG (i) są oznaczone białymi kreskami. Żółte linie na powiększonych obrazach płatów (obszarów otoczonych żółtymi polami) wskazują, gdzie przeprowadzono skany liniowe intensywności sygnału. Intensywności kanałów zielonych i fioletowych odpowiadające skanom liniowym dla każdego płata są wykreślone (zawsze od lewej do prawej w SG) na wykresach poniżej obrazów; Oś X = odległość (w pikselach), a oś Y = jednostka szarości (intensywność pikseli). Zakres dynamiczny intensywności pikseli jest ograniczony czerwonymi (maksymalnymi) i niebieskimi (minimalnymi) liniami przerywanymi, a odpowiednie wartości są pokazane na każdym wykresie. MIP = projekcja 3D o maksymalnej intensywności na całej głębokości SG. DL: dystalny płat boczny; M: płat przyśrodkowy; PL: bliższy płat boczny; SD: przewód ślinowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy informują, że nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.