Artykuł metodologiczny

Skuteczne doustne podawanie RNA interferencji (RNAi) dorosłym komarom z rodzaju Anopheles gambiae

3.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63266

⸱

1 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Parasitic Diseases and Malaria, Entomology Branch, Centers for Disease Control and Prevention, 2Department of Entomology, Cornell University, 3Centro de Estudios en Biotecnologia, Universidad del Valle de Guatemala, 4Department of Cell Biology, Johns Hopkins School of Medicine, 5Johns Hopkins Malaria Research Institute, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health and Malaria Research Institute, 7Department of Cell Biology, Johns Hopkins School of Medicine, 8Biomedical Sciences Department, Idaho College of Osteopathic Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Doustne podawanie dsRNA wytwarzanego przez bakterie, metoda dostarczania interferencji RNA (RNAi), która jest rutynowo stosowana u Caenorhabditis elegans, została tutaj z powodzeniem zastosowana u dorosłych komarów. Nasza metoda pozwala na rzetelne badania genetyki odwrotnej i badania wektorów blokujących transmisję bez użycia iniekcji.

Streszczenie

Interferencja RNA jest intensywnie wykorzystywanym narzędziem do odwrotnej analizy genetycznej od dwóch dekad. U dorosłych komarów podawanie dwuniciowego RNA (dsRNA) odbywa się głównie poprzez wstrzyknięcie, które wymaga dużo czasu i nie nadaje się do zastosowań w terenie. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, przedstawiamy tutaj bardziej wydajną metodę silnej aktywacji RNAi poprzez doustne dostarczanie dsRNA do dorosłych Anopheles gambiae. Długie dsRNA wyprodukowano w szczepie Escherichia coli HT115 (DE3), a skoncentrowaną zawiesinę zabitych termicznie bakterii zawierających dsRNA w 10% sacharozie podano dorosłym komarom na wacikach ad libitum. Waciki były wymieniane co 2 dni na czas trwania zabiegu. Zastosowanie tej metody do celowania w podwójną płeć (gen zaangażowany w różnicowanie płci) lub głowę widełkową (która koduje czynnik transkrypcyjny gruczołów ślinowych) skutkowało zmniejszoną ekspresją genu docelowego i/lub sygnałem immunofluorescencji białka, mierzonym odpowiednio za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) lub fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej. Zaobserwowano również wady w morfologii gruczołów ślinowych. Ta wysoce elastyczna, przyjazna dla użytkownika, tania i efektywna czasowo metoda dostarczania dsRNA może mieć szerokie zastosowanie w genach docelowych ważnych dla fizjologii wektorów owadów i nie tylko.

Wprowadzenie

Wiele chorób przenoszonych jest przez komary, co sprawia, że badanie fizjologii i genetyki komarów jest ważnym przedsięwzięciem. Zastosowanie RNAi w tych organizmach było widoczne w ciągu ostatnich 20 lat i pozwoliło na funkcjonalną charakterystykę wielu genów komarów1,2,3,4,5. Najczęściej stosowaną techniką dostarczania dsRNA jest mikroiniekcja, która ma tę wadę, że może zranić komary i wymaga znacznego czasu i wysiłku. Metody doustnego dostarczania RNAi zostały przetestowane, ale głównie w stadium larwalnym komarów6,7,8,9. Doustne dostarczanie dsRNA dorosłym komarom nie zostało w pełni zbadane i może być użytecznym narzędziem do badań nad biologią wektorów i ich kontrolą.

Malaria jest przenoszona przez komary Anopheles, gdy zarażona samica komara pobiera posiłek z krwi od niezakażonego gospodarza i wstrzykuje ślinę zawierającą pasożyty malarii10. Aby ostatecznie przenieść się w ślinie komara, pasożyt musi pokonać wiele przeszkód, w tym uniknięcie układu odpornościowego komara, przejście przez barierę jelita środkowego i inwazję gruczołów ślinowych11. Architektura gruczołów ślinowych komarów (SG) ma kluczowe znaczenie dla inwazji pasożytów i jest kontrolowana zarówno przez kluczowe czynniki transkrypcyjne wyrażane przez gruczoły ślinowe, jak i determinanty dymorfizmu płciowego. Kilka wysoce konserwatywnych czynników transkrypcyjnych jest wymaganych do specyfikacji komórkowej i utrzymania homeostazy gruczołów ślinowych oraz do produkcji i wydzielania białek ślinowych, które funkcjonują w żywieniu krwi12,13,14. Głowica widelca (Fkh) jest czynnikiem transkrypcyjnym skrzydlatej helisy, który działa jako główny regulator struktury i funkcji SG owadów (na podstawie badań na muszkach owocowych i jedwabnika)15,16,17,18,19,20. U Drosophila SGs, Fkh funkcjonuje z Sage, specyficznym dla SG podstawowym czynnikiem transkrypcyjnym helisa-pętla-helisa (bHLH), aby promować przeżycie SG i produkcję śliny19. Ważnym, pozytywnym współregulatorem produkcji śliny u Drosophila jest CrebA, dobrze przebadany czynnik transkrypcyjny leucyny, który zwiększa ekspresję genów szlaku wydzielniczego21,22,23. Istnieje również silny stopień zróżnicowania morfologicznego żeńskich gruczołów ślinowych, który prawdopodobnie odgrywa kluczową rolę, nie tylko w odżywianiu krwią, ale także w zdolności pasożytów do inwazji tej tkanki24.

Wiele genów zaangażowanych w określanie przeżycia gruczołów ślinowych, struktury, fizjologii i dymorfizmu płciowego ma złożone czasoprzestrzenne profile ekspresji25,26,27, a tradycyjne metody dostarczania dsRNA do indukcji RNAi nie zawsze są skuteczne w celowaniu w tego rodzaju geny w tej lub innych tkankach. Jednak doustne podawanie dsRNA w stadium larwalnym komarów Aedes aegypti i An. gambiae zostało z powodzeniem wykorzystane do wyciszenia specyficznej dla samicy formy genu dsx9,28. Wcześniejsze badania z użyciem dsRNA w gruczołach ślinowych komarów wykazały, że chociaż wymagane były duże ilości dsRNA, efekt wyciszenia był stosunkowo długotrwały (co najmniej 13 dni)29. Przetestowano tutaj zdolność zabijanego termicznie szczepu E. coli HT115 (DE3) wyrażającego specyficzne dla sekwencji dsRNA dla dsx, fkh lub CrebA do indukowania wyciszania RNAi tych genów u dorosłych samic komarów. Doustne podawanie dsRNA wywołało knockdown genu u An. gambiae, z wyraźnym obniżeniem poziomów mRNA i z fenotypami zgodnymi z utratą funkcji tych genów. W związku z tym takie podejście prawdopodobnie zadziała w celu obniżenia funkcji różnych genów gruczołów ślinowych.

Protokół

1. Klonowanie dsRNA do wektora ekspresji E. coli

  1. Wybierz docelową sekwencję genu, aby wstawić ją do odpowiedniego wektora do ekspresji dsRNA. Pobierz wartości wyrażeń z Vectorbase.org przy użyciu następującej metody.
    1. Wyszukaj interesujący Cię gen (np. Tabela 1) w polu wyszukiwania na stronie głównej.
    2. Na wyświetlonej stronie genu przejdź do 8. Sekcja transkryptomiki.
    3. Poszukaj wymienionych odpowiednich eksperymentów z sekwencją RNA i ekspresją genów mikromacierzy.
    4. Dokonaj transkrypcji interesujących Cię wartości do arkusza kalkulacyjnego i utwórz tabelę danych.
  2. Wybierz dostępny w handlu plazmid z co najmniej jednym promotorem T7, który ma być użyty. Jeśli wybrany plazmid ma tylko jeden promotor T7 (jak większość komercyjnych plazmidów), dołącz drugi promotor T7 do odwrotnego startera, który zostanie użyty do amplifikacji dsDNA dla interesującego genu.
    UWAGA: Sekwencję dsRNA dla docelowych genów można wybrać za pomocą aplikacji internetowej E-RNAi do projektowania odczynników RNAi30. Na podstawie określonych sekwencji genów można zaprojektować zarówno długie dsRNA (około 400 pz), jak i krótkie dRNA (shRNA). Sekwencje te powinny zostać amplifikowane i zsekwencjonowane w celu potwierdzenia tożsamości przed klonowaniem. Wybrane regiony genów, plazmidy i promotory użyte w tym badaniu są wymienione w pliku uzupełniającym 1.
  3. Wykonaj klonowanie zgodnie z prostą, jednoetapową procedurą opisaną wcześniej9,31. W tym celu należy oczyścić produkt PCR i podwiązać do zlinearyzowanego plazmidowego DNA. Użyj produktu ligacji do transformacji w wyniku szoku cieplnego kompetentnych komórek E. coli32. Zaznacz przekształcone komórki za pomocą niebiesko-białego rastrowania. Potwierdź orientację wkładki za pomocą startera T7-PCR i potwierdź sekwencję za pomocą starterów M13.
    UWAGA: Białe/niebieskie badania przesiewowe mogą być stosowane, gdy plazmid wybrany do transformacji zawiera gen lacZ, który koduje β-galaktozydazę. Białe kolonie powinny zawierać pożądaną wstawkę w lacZ i mogą być wybierane w celu dalszego potwierdzenia obecności i orientacji sekwencji docelowej33.
  4. Oczyść plazmid z pierwszej transformacji i użyj go do przekształcenia kompetentnego E. coli HT115 (DE3), jak wcześniej opisano34. Po potwierdzeniu, że plazmid z wkładką jest obecny w właściwym E. coli HT115 (DE3), przygotuj zapasy glicerolu bakterii do jednorazowego użytku.
    UWAGA: Odpowiednie, niespokrewnione kontrolne dsRNA powinno być pozyskane lub przygotowane do użycia w każdym eksperymencie. W tym przypadku stosuje się sekwencję niepowiązanego genu aintegumenta (mrówka) z Arabidopsis thaliana.

2. Przygotowanie zabijanych termicznie bakterii wyrażających dsRNA

  1. Wyhodować kulturę z pojedynczej kolonii bakteryjnej szczepu E. coli HT115 (DE3) zawierającego plazmid eksprymujący dsRNA w 50 ml bulionu Luria (LB) zawierającego 100 μg/ml ampicyliny i 12,5 μg/ml tetracykliny, na wytrząsarce platformowej (180 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 12 godzin.
  2. Rozcieńczyć kulturę bakteryjną (1:1000) w 2x pożywce z tryptonu drożdżowego (2x YT) zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i 12,5 μg/ml tetracykliny.
  3. Indukuj wytwarzanie dsRNA przez dodanie 40 μM (stężenie końcowe) izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG).
    4. Gdy komórki osiągną wartość o.D.600 = 0,4, mniej więcej po 2 godzinach indukcji w temperaturze 37 °C z mieszaniem przy 180 obr./min, przygotuj skoncentrowaną zawiesinę bakterii zabitych termicznie, jak opisano przez Taracena i wsp. 9.
  4. Komórki rozdrobnić przez odwirowanie (4000 x g, 4 °C, 10 min) i umyć komórki w jednej objętości buforu fosforanu sodu (PBS).
  5. Ponownie odwirować w tych samych warunkach, ponownie zawiesić w PBS do 1/100 początkowej objętości i umieścić w temperaturze 70 °C na 1 godzinę.
  6. Przygotować 400 μl porcji bakterii zabitych termicznie i przechowywać te podwielokrotności w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia (nie przechowywać dłużej niż tydzień). Ta zawiesina bakterii zabitych termicznie zawiera specyficzne dsRNA dla eksperymentów RNAi. Procedurę tę należy przeprowadzić zarówno dla bakterii dsRNA z genem docelowym, jak i dla niepowiązanej kontroli dsRNA, która ma być stosowana w każdym eksperymencie.

3. Karmienie komarów zabitymi termicznie bakteriami wyrażającymi dsRNA

  1. Rozmrozić jedną porcję dsRNA (zawiesina bakterii HT115 (DE3)) i wymieszać z 1,6 ml 12% roztworu cukru zawierającego 0,2% metyloparabenu.
  2. Namocz mały wacik w tym roztworze i umieść namoczony wacik w klatce zawierającej 5-dniowe komary. Upewnij się, że komary żywią się tym roztworem, zbierając jednocześnie zarówno cukier, jak i bakterie zawierające dsRNA.
  3. Zmieniaj wacik nasączony roztworem dsRNA-cukru co drugi dzień przez 8 kolejnych dni.
  4. Klatki na komary należy przechowywać w stałych warunkach, tj. 27 °C i wilgotności względnej 80% przy fotoperiodzie 12 h: 12 h światło: ciemny fotocykl, oddzielony 30-minutowym świtem i 30-minutowym zmierzchem.

4. Poziomy ekspresji genów docelowych do oznaczania

  1. Znieczulenie na zimno komary, umieszczając pojemnik na lodzie na minutę lub do momentu, gdy komary przestaną się poruszać. Po znieczuleniu komarów umieść je na zimnej powierzchni, aby odizolować samice do sekcji.
  2. Rozpyl 70% etanolu na komary i umieść je na szklanej powierzchni z PBS. Za pomocą kleszczy zabezpiecz głowę komara stabilnie i bardzo powoli pociągnij klatkę piersiową, umożliwiając uwolnienie gruczołów ślinowych do PBS.
  3. Trzymaj gruczoły ślinowe w lodowatym PBS, dopóki 10 osobników nie zostanie wypreparowanych. Pula dziesięciu SG do ekstrakcji RNA przy użyciu metody tiocyjanianu fenolu i chloroformu guanidyny. Zawiesić osad RNA w 30 μl wody wolnej od RNaz.
  4. Użyć 1 μl podwielokrotności RNA wyekstrahowanego z SG w poprzednim kroku, aby odczytać absorbancję przy 260 i 280 nm i obliczyć stężenie RNA w każdej próbce, mnożąc przez współczynnik rozcieńczenia. Stosunek 260/280 wynoszący ~2,0 wskazuje na dobrą jakość RNA.
  5. Użyj 1 μg oczyszczonego RNA do syntezy komplementarnego DNA (cDNA) przy użyciu komercyjnego zestawu do odwrotnej transkrypcji.
  6. Wykonaj rozcieńczenie cDNA w stosunku 1:10, aby przygotować reakcję RT-PCR zgodnie z zaleceniami producenta. Dla każdej próbki przygotuj reakcję dla genu docelowego i równolegle ustaw reakcję z genem porządkowania (HK). Ustaw każdą reakcję genu w technicznym triplecie, aby wyeliminować wpływ losowych zmian z metody.
    UWAGA: W tym przypadku rybosomalny gen S7 An. gambiae (GeneBank: L20837.1) i aktyna (VectorBase: AGAP000651) zostały użyte jako geny HK.
  7. Wszystkie podkłady należy stosować w końcowym stężeniu 300 nM, zgodnie ze wskazaniami producenta SYBR-green. Amplifikacja w standardowych warunkach PCR: 95 °C przez 10 minut, a następnie 40 cykli po 15 s w temperaturze 95 °C i 60 s w temperaturze 60 °C.
    UWAGA: Aby określić ilościowo ekspresję genów, stosuje się metodę delta-delta-Ct (ΔΔCt). Delta Ct (ΔCt) jest różnicą między Ct genu docelowego a Ct genu porządkowego. ΔΔCt jest różnicą między ΔCt grupy eksperymentalnej a ΔCt grupy kontrolnej35.

5. Ocena fenotypowa: skuteczne karmienie krwią

  1. Aby ocenić zdolność do odżywiania się krwią, należy umieścić grupy 15 samic komarów leczonych docelowym i kontrolnym dsRNA na małych klatkach (12 cm średnicy) i głodzić je przez 4 godziny.
  2. Za pomocą kąpieli wodnej obiegowej o temperaturze 37 °C, szklanych karmników dla komarów (o średnicy 24 mm) i membrany parafilmowej podawanie komarom zdefibrynowanej krwi owczej.
    UWAGA: Krew można nabyć od komercyjnego sprzedawcy, który aseptycznie pobiera ją od zdrowych zwierząt dawców pochodzących z USA i ręcznie defibrynuje bez antykoagulantów i dodatków.
  3. Poprzez bezpośrednią obserwację policz i zapisz liczbę prób sondowania, aby pomyślnie uzyskać posiłek z krwi od pierwszych pięciu samic, które stały się w pełni nabrzmiałe w każdej grupie.
    UWAGA: Aby uniknąć znaczących zmian metabolicznych u komarów, które mogłyby zakłócać zasoby energetyczne wpływające na zachowania związane z poszukiwaniem krwi, głód ograniczono do minimum (4 godziny). W rezultacie, nie każdy komar byłby chciwie szukający mączki z krwi i ograniczyliśmy liczbę nabrzmiałych samic do pięciu (jedna trzecia całkowitej populacji każdej grupy), aby zmniejszyć wpływ zmiennych czasowych, takich jak ekspozycja na ludzki zapach, zmiana temperatury między komorami a powierzchniami żerowania itp.

6. Ocena fenotypowa: morfologia gruczołów ślinowych i regulacja w dół odpowiednich białek

  1. Odizoluj świeżą tkankę w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zgodnie z opisem w kroku 4.2 i utrwal w lodowatym acetonie przez 90 s. Spłucz kilka razy w 1x PBS po usunięciu acetonu. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C z surowicą odpornościową (patrz tabela materiałów) rozcieńczoną do 1x PBS.
    UWAGA: Patrz Tabela materiałów w celu identyfikacji pierwszorzędowych przeciwciał stosowanych do białek śliny (Anopheles anti-platelet protein, AAPP; Mucyna 2, MUC2), czynniki transkrypcyjne SG (Fork Head, fkh; Szałwia, szałwia; Białko wiążące element odpowiedzi cyklicznej AMP A, CrebA) i marker pęcherzyków wydzielniczych (Rab11). Przeciwciała te są używane jako odczyty formy i funkcji SG. Jednak każde przeciwciało odpowiednie do immunofluorescencji powinno być odpowiednie dla tego protokołu.
  2. Umyj w 1x PBS kilka razy. Dodać przeciwciała drugorzędowe (fluorescencyjne) rozcieńczone w 1x PBS i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Dodać dowolny barwnik przeciwstawny [taki jak 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI; DNA), aglutyninę z kiełków pszenicy (WGA; dla chityny), falloidynę (dla F-aktyny) i/lub czerwień nilową (dla lipidów)] 30 minut przed końcem 2-godzinnej inkubacji.
  3. Umyj trzy razy w 1x PBS. Następnie zamontuj tkanki w 100% glicerolu na standardowym szkiełku mikroskopowym z szkiełkiem nakrywkowym o grubości 1 mm i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu obrazowania za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego.
    UWAGA: Aby uzyskać dane ilościowe, ustawienia obrazowania muszą być stałe. W tym przypadku uwzględniono tylko obrazy projekcji o maksymalnej intensywności w całej objętości 3D tkanki, a cała kwantyfikacja obrazu została znormalizowana między zabiegami (w ramach eksperymentu) w oparciu o sygnał DAPI w resztkach tkanek innych niż SG (ciało tłuszczowe, naskórek lub głowa) również obecnych na szkiełku.

Wyniki

Na początek wykorzystano dane z mikromacierzy ekspresyjnych z bazy VectorBase do przeskanowania potencjalnych celów na różnych etapach rozwoju36,37, aby określić status ekspresji wszystkich genów istotnych dla niniejszego badania (Tabela 1). Zgodnie z oczekiwaniami, wszystkie wybrane geny docelowe wykazały ekspresję w dojrzałych SGs. Poziomy aapp i sage były szczególnie wysokie (Tabela 1). Zauważalny był również wysoki poziom ekspresji f-Agdsx w dojrzałych żeńskich SGs9.

Konkretne segmenty każdego genu oceniono pod kątem przydatności jako dsRNA, korzystając z aplikacji internetowej E-RNAi for the design of RNAi reagents30. Regiony o długości ~400 bp zawierające sekwencje unikalne dla każdego genu docelowego zostały następnie sklonowane (Rysunek 1A), przetransformowane do odpowiednich szczepów bakteryjnych i wykorzystane do przygotowania zawiesin bakterii zabitych termicznie, które indukowano do produkcji dsRNA. Dorosłe komary karmiono przez 8 dni nasączonymi sacharozą kulkami bawełny zawierającymi zawiesiny bakteryjne dsRNA dla f-Agdsx,fkh lub ant (niepowiązanej kontroli negatywnej).

W celu analizy karmienia samic komarów w ramach RNAi najpierw określono, czy podanie dsRNA dla f-Agdsx lub fkh indukuje wyciszenie genów. W grupie karmionej fkh-dsRNA zaobserwowano redukcję poziomu transkrypcji fkh o 98,8% (±2,1) (Rysunek 1B), co wskazuje, że dsRNA bardzo skutecznie zredukowało ilość transkryptów fkh w gruczołach ślinowych (SG). Co zaskakujące, poziomy mRNA fkh zostały zredukowane o 82,0% (±18,9) u komarów traktowanych dsRNA dla f-Agdsx, u których odnotowano redukcję f-Agdsx o 89,86% (±4,48), co sugeruje, że fkh może być celem działania F-Dsx w gruczole ślinowym. Równocześnie ze znaczną redukcją poziomów ekspresji fkh, u komarów z wyciszonym genem fkh zaobserwowano istotny wzrost liczby prób nakłucia niezbędnych do pobrania krwi. Komary te wykazywały średnio pięciokrotnie więcej prób żerowania niż grupa kontrolna lub komary karmione dsRNA f-Agdsx, aby całkowicie nasycić się krwią (Rysunek 1C). Doprowadziło to do postawienia pytania, czy zabiegi RNAi z wyciszeniem fkh wywołały zmiany w lokalizacji i/lub rozkładzie kluczowych regulatorów transkrypcyjnych (czynników TF gruczołów ślinowych Sage i CrebA) (Rysunek 2), białek wydzielniczych (AAPP i mucyny) (Rysunek 3) oraz aparatu wydzielniczego [Nile Red (lipidy) i Rab11 (pęcherzyki wydzielnicze)] (Rysunek 4). Co istotne, zaobserwowano znaczące różnice w intensywności barwienia w różnych regionach płatów, między płatami oraz w poszczególnych gruczołach ślinowych.

Zgodnie z przewidywaniami, poziomy barwienia sage oraz CrebA były wyraźnie obniżone we wszystkich płatach SG po zastosowaniu fkh RNAi (Rycina 2B) w porównaniu do kontrolnego RNAi przeciwko ant (Rycina 2A). Spadki zarówno najwyższych wartości maksymalnej intensywności (czerwone linie przerywane i etykiety numeryczne), jak i najniższych wartości maksymalnej intensywności (niebieskie linie przerywane i etykiety numeryczne) w profilach skanowania liniowego sugerowały zmniejszenie obszarów o wysokim i niskim sygnale w obrębie tkanki (Ryciny 2A,B). Dane te sugerują, że An. gambiae fkh RNAi jest skuteczne oraz że fkh reguluje produkcję i/lub stabilność czynników transkrypcyjnych (TF) Sage i CrebA w SG An. gambiae, analogicznie do ich zależności genetycznej w SG Drosophila 19,38,39.

W analizie białek o wysokiej zawartości w ślinie stwierdzono, że poziomy białka antyagregacyjnego Anopheles (AAPP)40,41 były obniżone we wszystkich trzech płatach gruczol śliny (SG) po zastosowaniu RNAi przeciwko fkh, w porównaniu z kontrolną terapią RNAi (Rysunek 3A,B; kolor zielony). Z drugiej strony nie zaobserwowano zmian w poziomach mucyny (Rysunek 3A,B; kolor fioletowy). Dane te sugerują, że białko Fkh w różny sposób wpływa na ekspresję poszczególnych genów białek śliny.

W końcu zaobserwowano dwa markery sekrecji (Rycina 4A,B): Rab11 (pęcherzyki związane z apikalnymi endosomami recyklingującymi)42 oraz Nile Red (lipidy). Zmniejszoną fluorescencję Rab11 zaobserwowano w dystalnych płatach bocznych (DL) po zastosowaniu RNAi przeciwko fkh (Rycina 4A v vs. 4B v; kolor zielony). Jednocześnie odnotowano jednak zwiększony sygnał Rab11 w płatach przyśrodkowych (M) i proksymalnych bocznych (PL) (Rycina 4A vii, ix vs. 4B vii, ix; kolor zielony). Nie zauważono widocznej różnicy w sygnale Nile Red (Ryciny 4A,B; kolor fioletowy) po zastosowaniu RNAi przeciwko fkh w porównaniu z kontrolnym zabiegiem RNAi. Dane te sugerują, że redukcja fkh może w złożony sposób zmieniać działanie mechanizmów wydzielniczych, co różni się w zależności od płatów gruczołów ślinianych (SG).

Zbiór danych:GoltsevNeira OviedoNeira OviedoBakerBakerBakerBaker
symbol genufunkcjaIdentyfikator AGAPembrion (25 godz.)larwy L3L3 SGdorosła samica
ciało (3 dzień)		dorosły samiec
ciało (3 dzień)		dorosła samica
SG (3 dni)		dorosły samiec
SG (3 dni)
AAPPbiałko ślinyAGAP0099743.924.384.333.812.4611.922.69
CrebAczynnik transkrypcyjnyAGAP0014646.285.225.922.992.963.273.13
"czynnik transkrypcyjnyAGAP0110384.504.465.232.962.863.052.88
dsxczynnik transkrypcyjnyAGAP0040504.915.395.553.724.004.574.01
fkhczynnik transkrypcyjnyAGAP0016715.184.675.252.993.093.213.05
MUC2białko ślinyAGAP0120204.595.535.632.963.073.083.26
Rab11transport pęcherzykowyAGAP00455910.217.478.604.903.793.382.96
szałwiaczynnik transkrypcyjnyAGAP0133355.325.968.893.403.337.377.23

Tabela 1: Średnie profile ekspresji z mikromacierzy log2 dla An. gambiae w odniesieniu do wybranych genów. Przedstawiono nazwy genów, kategorię funkcjonalną, identyfikatory Vectorbase (AGAP) oraz średnie dane ekspresji z mikromacierzy log2 pobrane z bazy Vectorbase. Dane te wskazują, że wybrane geny (zaangażowane w biologię komórkową i sekrecję gruczołów ślinowych (SG)) są ekspresjonowane i wzbogacone w gruczołach ślinowych (SG) larw w stadium L3 oraz u osobników dorosłych w porównaniu do całych organizmów.

Analiza mapy wektora i wykresu słupkowego; schemat mapy wektora pGEM-T (3000bp). Ekspresja genów, dane z sondowania.
Rysunek 1: Wyciszenie genów f-Agdsx i fkh u dorosłych An. gambiae obniża poziom mRNA fkh w gruczołach ślinowych (SGs) i wpływa na zdolność samic do pobierania krwi. (A) Reprezentatywny obraz projektu plazmidu wykorzystanego do produkcji dsRNA w tej metodologii. Druga sekwencja promotora T7 zostaje dodana do plazmidu poprzez włączenie jej do primera 3' używanego do amplifikacji insertu klonowanego do plazmidu pGEMT. Następnie plazmid jest transformowany do bakterii E. coli HT115 (DE3), a roztwór do karmienia przygotowuje się z zawiesiny indukowanych, zabitych ciepłem bakterii w 10% roztworze cukru. (B) Zwierzęta karmione roztworem zawierającym dsRNA dla f-Agdsx lub fkh wykazały znacznie niższe poziomy transkryptów fkh (jednoczynnikowa ANOVA z porównaniami wielokrotnymi; n=15). Jednak tylko grupa karmiona dsRNA fkh (C) wykazała istotną różnicę w liczbie prób kąsania niezbędnych do pobrania posiłku krwi. Komary w tej grupie potrzebowały średnio pięciokrotnie więcej prób sondowania w celu skutecznego pobrania krwi niż grupy kontrolna lub karmiona dsRNA-dsx (jednoczynnikowa ANOVA z porównaniami wielokrotnymi; n=15). Słupki błędu wskazują standardowy błąd średniej (SEM). Każdy eksperyment przeprowadzono w trzech oddzielnych powtórzeniach biologicznych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna efektów RNAi; DAPI, WGA, Sage, CrebA; wykresy intensywności; badanie biologiczne.
Rysunek 2: Wyciszenie fkh w śliniankach dorosłych An. gambiae zmniejsza poziom czynników transkrypcyjnych SG. Przedstawiono reprezentatywne obrazy ślinianek (SGs) dorosłych samic An. gambiae w 13. dniu po 8 dniach (dni 5–13) doustnej ekspozycji na (A) niepowiązany dsRNA kontrolny (ant) lub (B) dsRNA celujący w czynnik transkrypcyjny SG fork head (fkh, AGAP001671) w 10% sacharozie, barwione barwnikami DAPI (DNA; czerwony), znakowaną aglutyniną z zarodków pszenicy (WGA, chityna/O-GlcNAcylowanie; niebieski) oraz antyserami przeciwko czynnikom transkrypcyjnym SG Sage (zielony) i CrebA (fioletowy). Długości pasków skali podano w mikronach. Ślinianki (i) zostały obrysowane białymi przerywanymi liniami. Żółte linie na powiększonych obrazach płatów (regionów zamkniętych w żółtych ramkach, oznaczonych jako „inset”) wskazują miejsca przeprowadzenia skanowania liniowego intensywności sygnału. Intensywności kanałów zielonego i fioletowego odpowiadające skanom liniowym dla każdego powiększonego płata zostały naniesione (zawsze od lewej do prawej w obrębie SG) na wykresy poniżej obrazów; oś X = odległość (w pikselach), a oś Y = jednostka szarości (intensywność piksela). Zakres dynamiczny intensywności pikseli jest ograniczony przez czerwone (maksimum) i niebieskie (minimum) linie kropkowane, a odpowiadające im wartości są pokazane na każdym wykresie. MIP = projekcja maksymalnej intensywności w 3D przez całą głębokość SG. DL: płat boczny dystalny; M: płat przyśrodkowy; PL: płat boczny proksymalny; SD: przewód ślinowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna efektów RNAi u Drosophila, wykresy pokazują zmiany w ekspresji AAPP i mucyny.
Rysunek 3: Knockdown fkh w śliniankach dorosłych An. gambiae obniża poziom wydzielanych białek ślinianek. Przedstawiono reprezentatywne obrazy z ślinianek (SGs) 13-dniowych dorosłych samic An. gambiae po 8 dniach (dni 5-13) doustnej ekspozycji na (A) niepowiązaną dsRNA kontrolną (ant) lub (B) dsRNA celującą w czynnik transkrypcyjny (TF) ślinianek fork head (fkh, AGAP001671) w 10% sacharozie, barwione barwnikami DAPI (DNA; czerwony), znakowaną aglutyniną z zarodków pszenicy (WGA, chityna/O-GlcNAcylacja; niebieski) oraz białkami śliny AAPP (zielony) i mucyną (MUC2, fioletowy). Podane długości pasków skali są w mikronach. Ślinianki (i) są obrysowane białymi przerywanymi liniami. Żółte linie na powiększonych obrazach płatów (regionów zamkniętych w żółtych ramkach) wskazują miejsca przeprowadzenia skanów liniowych intensywności sygnału. Intensywności kanałów zielonego i fioletowego odpowiadające skanom liniowym dla każdego płata są naniesione (zawsze od lewej do prawej w ślinionce) na wykresach poniżej obrazów; oś X = odległość (w pikselach), a oś Y = jednostka szarości (intensywność piksela). Zakres dynamiczny intensywności pikseli jest ograniczony czerwonymi (maksimum) i niebieskimi (minimum) przerywanymi liniami, a odpowiadające im wartości są pokazane na każdym wykresie. MIP = 3D projekcja maksymalnej intensywności przez całą głębokość ślinionki. DL: płat boczny dystalny; M: płat przyśrodkowy; PL: płat boczny proksymalny; SD: przewód ślinowy. Kursywą zapisane etykiety „DL” (Bi) wskazują dwa widoczne regiony tego samego płata DL. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schematy mikroskopii konfokalnej pokazujące lokalizację białek Rab11 i Nile Red oraz intensywność fluorescencji.
Rysunek 4: Wyciszenie genu fkh w gruczołach ślinowych dorosłych osobników An. gambiae zmniejsza poziom markerów sekrecyjnych gruczołów ślinowych (SG). Przedstawiono reprezentatywne obrazy gruczołów ślinowych (SGs) samic An. gambiae w 13. dniu życia po 8 dniach (dni 5-13) doustnej ekspozycji na (A) niepowiązany dsRNA kontrolny (ant) lub (B) dsRNA celujący w czynnik transkrypcyjny SG fork head (fkh, AGAP001671) w 10% sacharozie, barwione barwnikami DAPI (DNA; czerwony), znakowaną aglutyniną z kiełków pszenicy (WGA, chityna/O-GlcNAcylacja; niebieski), Nile Red (lipidy; fioletowy) oraz antyserami przeciwko markerowi pęcherzyków endosomów recyklingowych Rab11 (zielony). Podane długości pasków skali są w mikronach. Gruczoły ślinowe (i) są obrysowane białymi przerywanymi liniami. Żółte linie na powiększonych obrazach płatów (regionów zamkniętych w żółtych ramkach) wskazują miejsca przeprowadzenia skanowania liniowego intensywności sygnału. Intensywności kanału zielonego i fioletowego odpowiadające skanowaniu liniowemu dla każdego płata są naniesione (zawsze od lewej do prawej w SG) na wykresach poniżej obrazów; oś X = odległość (w pikselach), a oś Y = jednostka szarości (intensywność piksela). Zakres dynamiczny intensywności pikseli jest ograniczony przez czerwone (maksymalna) i niebieskie (minimalna) przerywane linie, a odpowiadające im wartości są pokazane na każdym wykresie. MIP = maksymalna projekcja intensywności 3D przez całą głębokość SG. DL: płat boczny dystalny; M: płat środkowy; PL: płat boczny proksymalny; SD: przewód ślinowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Zdolność do skutecznego dostarczania dsRNA do komarów An. gambiae poprzez karmienie doustne ma szerokie implikacje dla badań biologii wektorów zarówno w laboratorium, jak i w terenie. Mikroiniekcja od dawna jest akceptowana jako preferowany sposób dostarczania substancji chemicznych, przeciwciał, RNAi i strategii modyfikacji genetycznej u komarów43,44. Konsekwencji znacznej manipulacji fizycznej, uszkodzenia komórek i stresu można uniknąć, stosując podawanie doustne, które może być również potencjalnie odpowiednie do zastosowań na dużą skalę lub w terenie. Wcześniejsze prace sugerowały, że RNAi działa wszechobecnie w obrębie pojedynczego dorosłego komara29, co pozwala na działanie we wszystkich tkankach, w tym w gruczołach ślinowych. Karmiąc komary dużą liczbą E. coli wykazujących ekspresję dsRNA, które są trawione asynchronicznie przez długi czas, można potencjalnie osiągnąć stałą i jednolitą ekspozycję na RNAi u wszystkich osobników w klatce. Metoda ta pozwala na karmienie dużej liczby komarów i analizę potencjalnej zmienności powstałych fenotypów w zależności od docelowego genu. Jednak ważną kwestią jest możliwość niejednorodnego rozmieszczenia bakterii, a tym samym dsRNA, we włóknie bawełnianym. 400 μl bakterii używanych codziennie do karmienia komarów cukrem zawierałoby około ≤4,6 μg dsRNA, jak opisano i obliczono wcześniej9, ale ilość dsRNA spożywanego przez każdego komara nie została określona indywidualnie. Jeśli budowanie konstruktów dsRNA staje się rutyną, ten prosty protokół leczenia pozwala na szybkie przyswojenie tej techniki przez każdego badacza komarów. A priori wydatek czasowy podczas leczenia (30 minut dziennie) jest znikomy w porównaniu z czasem potrzebnym na naukę i zastosowanie mikroiniekcji do prób o podobnej wielkości.

Karmienie dsRNA jest rutynowo stosowane w badaniach genetyki odwrotnej w organizmie modelowym Caenorhabditis elegans45. Ten intensywny poziom stosowania podkreśla wartość podejścia opartego na przekazie ustnym. Budowa biblioteki obejmującej cały genom An. gambiae w przekształconej E. coli, podobnej do tej, która istnieje u C. elegans46,47, pozwoliłaby na szybkie odwrotne badania genetyczne komarów na większą skalę. Należy jednak zauważyć, że skuteczność metody zależy w dużej mierze od endogennych poziomów transkryptu i od tego, czy ekspresja nie ogranicza się do tkanki docelowej, ale jest wyrażana w szerszym zakresie 4,8,44. Ponadto istnieją dowody na to, że niektóre insektycydy mogą wywoływać unikanie zachowań ukomarów, a karmienie bakteriami, które potencjalnie wywołują u nich niepożądane skutki, może wywołać podobne wzorce unikania. W kontrolowanym środowisku laboratoryjnym, gdzie komary nie miały alternatywnego źródła pożywienia, nie miały wyboru, aby unikać wody z cukrem z E. coli, a potrzeba pożywnego źródła prawdopodobnie przesłoniłaby instynkt unikania bakterii. Należy to jednak wziąć pod uwagę, jeśli strategia miała być stosowana w mniej kontrolowanych warunkach.

Możliwe jest celowanie w wiele genów jednocześnie (przy użyciu jednego konstruktu, wielu konstruktów lub mieszaniny przekształconych izolatów bakteryjnych), ale potrzebne są dalsze badania, aby ocenić skuteczność. Inną ważną kwestią w tym zakresie jest ocena możliwych efektów niedocelowych lub synergicznych w przypadku stosowania jednego lub wielu celów. Ustalenie odpowiednich genów i grup kontrolnych jest ważną częścią projektu eksperymentalnego. Co więcej, kuszące jest spekulowanie, że to podejście może być wykorzystane do zwalczania innych patogenów lub wirusów49. Wcześniejsze prace nad indukcją RNAi u komarów prowadzono w warunkach, w których odczynnik był bezpośrednio wstrzykiwany, więc E. coli nie były obecne. Bakterie E. coli mogą zapewniać komorę ochronną pozwalającą na wolniejsze uwalnianie dsRNA w czasie, zapewniając, że ekspozycja jest mniej więcej ciągła przez znacznie dłuższy okresczasu29.

Wreszcie, wyniki te pokazują, że efekty tej techniki można dostosować poprzez dostosowanie ram czasowych (długości i dnia rozpoczęcia) ekspozycji oraz ilości użytej E. coli . Ta cecha pozwoliła nam na zbadanie funkcji niezbędnych genów (dsx i fkh) poprzez określenie optymalnych warunków knockdown metodą prób i błędów. To znacznie zwiększa prawdopodobieństwo, że docelowe geny będące przedmiotem zainteresowania mogą być badane za pomocą tej techniki.

Podsumowując, stwierdzono, że doustne dostarczanie RNAi dorosłym komarom może być proste, wszechstronne i stanowi skuteczne podejście do badania funkcji genów komarów oraz do tworzenia nowatorskich i plastycznych narzędzi do kontroli wektorów chorób przenoszonych przez komary.

Oświadczenia

Autorzy informują, że nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować personelowi i naukowcom z Oddziału Entomologii oraz Wydziału Chorób Pasożytniczych i Malarii w CDC, a także Brianowi Triggowi i Michelle Chiu za pomoc w przygotowaniu bakterii w JHU i/lub pomocne dyskusje na temat tej pracy. Dziękujemy JHMRI Insectary i kierownikowi Chrisowi Kizito za dostęp do komarów An. gambiae i ich hodowlę. Dziękujemy Wei Huang (JHSPH) za pomoc w uzyskaniu plazmidów PJet GFP i pPB47 GFP do wykorzystania w tym badaniu. Finansowanie tych prac zapewnili: NIH R21AI153588 (do DJA), stypendium podoktorskie Johns Hopkins Malaria Research Institute (do MW); oraz dzięki grantowi Fundacji Good Ventures i Projektu Otwartej Filantropii dla Fundacji CDC zatytułowanego Wspieraj kriokonserwację i tłumienie rozwoju samic u komarów w celu wsparcia badań nad malarią, Open Philanthropy Project, 2017. Jesteśmy głęboko wdzięczni za pomoc ze strony personelu JHU Microscope Facility oraz odpowiednie wsparcie w postaci grantu NIH na użyty mikroskop (NIH Grant #: S10OD016374). Ustalenia i wnioski zawarte w tym manuskrypcie są ustaleniami i wnioskami autorów i niekoniecznie reprezentują poglądy CDC. Nazwy handlowe są używane wyłącznie do celów identyfikacyjnych i nie oznaczają poparcia ze strony Centrów Kontroli i Prewencji Chorób, Publicznej Służby Zdrowia lub Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 Kb Plus DNA LadderThermo Fisher Scientific10787018
2x Ekstrakt drożdżowy Trypton (2xYT) MediumBD DifcoDF0440-17
AAPPn/an/dSurowice odpornościowe 1:50; prezent od Fabrizio Lombardo
AccuStart II PCR SupermixQuantabio95137-100
AgarozaMillipore SigmaA9539
AmpicillinMillipore SigmaA5354
Anopheles gambiae G3BioDefense and Emerging Infections (BEI) Centrum Badań nad Malarią i Odczynników Referencyjnych (MR4)MRA-112
Wirówka BugDormBioQuip1452
5810REppendorfP022628181
CrebADSHBSerie odpornościowe CrebA Rbt-PC. Rozcieńczenie 1:50 (królik); generowane przez dietę Andrew
Lab DamiensBioServ
DAPILife Technologiesn/a4&,6-diamidyn-2-fenyloindol; rozcieńczenie 1:200.
Defibrynowana krew owczaHemoStatDSB050
Escherichia coli HT115 (DE3)
bromek etydynyMillipore SigmaE7637
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościThermo Fisher Scientific4368814
;-D-1-tiogalaktopiranozydMillipore SigmaI5502
JM109 Kompetentne komórkiPromegaL2005
Luria Broth MediaThermo Fisher Scientific10855001
Mucin 2ProteintechMuc2; 27 675-1-APSurowice odpornościowe. Rozcieńczenie 1:100 (mysz).
Nanodrop 2000Thermo Fisher Scientific
Nile RedSigman/aBarwnik lipidowy; rozcieńczenie 1:50.
Owl EasyCast B2 Mini Żel Elektroforeza PoziomaThermo Fisher ScientificModel B2
pGEMT easyPromegaA3600
Power SYBR-green PCR master MIXPCR Applied Biosystems
Thermo Fisher ScientificK31001
QuantaStudio 6Applied Biosystems
System PCR w czasie rzeczywistym QuantStudio6Applied Biosystems
Rab11n/an/dAntysurowica. Rozcieńczenie 1:100 (królik); wytwarzane przez Andrew Lab
Rh-WGAVector Labsn/aaglutynina z kiełków pszenicy sprzężonej z rodaminą (chityna, barwnik O-GlcNAcylacyjny); Rozcieńczenie 1:40
Szałwianiedotyczy niesklasyfikowanaSurowica odpornościowa. Rozcieńczenie 1:50 (szczur); wygenerowane przez Andrew Lab
Ligaza DNA T4PromegaM1801
TetracyklinaMillipore Sigma87128
TrizolThermo Fisher Scientific15596018
Mikroskop fluorescencyjny konfokalny Zeiss LSM700 Zeiss
ANTIBODIES
Chicken anty-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 647Thermo Fisher ScientificA21472
Kozia anty-mysia IgG (H+L), Alexa Fluor 647Thermo Fisher ScientificA28181
IgG (H+L) Kozia anty-Królik, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA27034
Królik anty-kozi IgG (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA27012
PODKŁADY
ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGACDC Biotechnology Core Facility Branchn/astarter qRT-PCR
ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC
CGGA		CDC Biotechnology Core Facility Branchn/astarter qRT-PCR
FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCACDC Biotechnology Core Facility Branchn/astarter qRT-PCR
FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGCOddział CDC Biotechnology Core Facility/astarter qRT-PCR
nowyDSX-f: AGAGGGGGGGAAATTCTAGTOddział CDC Biotechnology Core Facility/astarter qRT-PCR
nowyDSX-r: GGGCTTGGGGCAGTACGAATACDC Biotechnology Core Facility Branchn/astarter qRT-PCR
S7qf1: AGAACCAGGACCATCCDC Biotechnology Core Facility Branchn/astarter qRT-PCR
S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTCCDC Biotechnology Core Facility Branchn/astarter qRT-PCR
Isopropyl &beta Zestaw do oczyszczania PureLink 4367659 n n

Bibliografia

  1. Hoa, N. T., Keene, K. M., Olson, K. E., Zheng, L. Characterization of RNA interference in an Anopheles gambiae cell line. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 33, 949-957 (2003).
  2. Caplen, N., Zheng, Z., Falgout, B., Morgan, R. Inhibition of viral gene expression and replication in mosquito cells by dsRNA-triggered RNA interference | Elsevier enhanced reader. Molecular Therapy. 6, 243-251 (2002).
  3. Brown, A. E., Catteruccia, F. Toward silencing the burden of malaria: progress and prospects for RNAi-based approaches. BioTechniques. , Suppl 38-44 (2006).
  4. Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control. Insects. 8, (2017).
  5. Blandin, S., et al. Reverse genetics in the mosquito Anopheles gambiae: targeted disruption of the Defensin gene. EMBO Reports. 3 (9), 852-856 (2002).
  6. Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi assays in adult mosquitoes (A. gambiae). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (5), e230(2007).
  7. Whyard, S., et al. Silencing the buzz: a new approach to population suppression of mosquitoes by feeding larvae double-stranded RNAs. Parasites & Vectors. 8, 96(2015).
  8. Wiltshire, R. M., Duman-Scheel, M. Advances in oral RNAi for disease vector mosquito research and control. Current Opinion in Insect Science. 40, 18-23 (2020).
  9. Taracena, M. L., Hunt, C. M., Benedict, M. Q., Pennington, P. M., Dotson, E. M. Downregulation of female doublesex expression by oral-mediated RNA interference reduces number and fitness of Anopheles gambiae adult females. Parasites & Vectors. 12, 170(2019).
  10. Grassi, B. Studi di uno zoologo sulla malaria. Real Accademia dei Lincei. 3, 229(1901).
  11. Smith, R. C., Jacobs-lorena, M. Plasmodium - Mosquito interactions: A tale of roadblocks and detours. Advances in Insect Physiology. 39, (2010).
  12. Das, S., et al. Transcriptomic and functional analysis of the Anopheles gambiae salivary gland in relation to blood feeding. BMC Genomics. 11, 1-14 (2010).
  13. Francischetti, I. M. B., Valenzuela, J. G., Pham, V. M., Garfield, M. K., Ribeiro, J. M. C. Toward a catalog for the transcripts and proteins (sialome) from the salivary gland of the malaria vector Anopheles gambiae. Journal of Experimental Biology. 205, 2429-2451 (2002).
  14. Henderson, K. D., Isaac, D. D., Andrew, D. J. Cell fate specification in thedrosophila salivary gland: The integration of homeotic gene function with the DPP signaling cascade. Developmental Biology. 205, 10-21 (1999).
  15. Mach, V., Ohno, K., Kokubo, H., Suzuki, Y. The Drosophila fork head factor directly controls larval salivary gland-specific expression of the glue protein gene Sgs3. Nucleic Acids Research. 24 (12), 2387-2394 (1996).
  16. Weiserova, M., et al. Mini-Mu transposition of bacterial genes on the transmissible plasmid. Folia Microbiologica. 32 (5), 368-375 (1987).
  17. Abrams, E. W., Mihoulides, W. K., Andrew, D. J. Fork head and Sage maintain a uniform and patent salivary gland lumen through regulation of two downstream target genes, PH4αSG1 and PH4αSG2. Development. 133, 3517-3527 (2006).
  18. Myat, M. M., Isaac, P. P., Andrew, D. J. Early genes required for salivary gland fate determination and morphogenesis in Drosophila melanogaster. Advances in Dental Research. 14, 89-98 (2000).
  19. Fox, R. M., Vaishnavi, A., Maruyama, R., Andrew, D. J. Organ-specific gene expression: the bHLH protein Sage provides tissue specificity to Drosophila FoxA. Development of Cell Biology. 140, 2160-2171 (2013).
  20. Maruyama, R., Grevengoed, E., Stempniewicz, P., Andrew, D. J. Genome-wide analysis reveals a major role in cell fate maintenance and an unexpected role in endoreduplication for the Drosophila FoxA gene fork head. PLOS ONE. 6, 20901(2011).
  21. Johnson, D. M., et al. CrebA increases secretory capacity through direct transcriptional regulation of the secretory machinery, a subset of secretory cargo, and other key regulators. Traffic. 21, 560-577 (2020).
  22. Fox, R. M., Hanlon, C. D., Andrew, D. J. The CrebA/Creb3-like transcription factors are major and direct regulators of secretory capacity. Journal of Cell Biology. 191, 479-492 (2010).
  23. Abrams, E. W., Andrew, D. J. CrebA regulates secretory activity in the Drosophila salivary gland and epidermis. Development. 132, 2743-2758 (2005).
  24. Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238(2019).
  25. Pei-Wen, L., Xiao-Cong, L., Jin-Bao, G., Yan, L., Xiao-Guang, C. Molecular cloning, characterization and expression analysis of sex determiantion gene doublesex from Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Acta Entomologica Sinica. 58 (2), 122-131 (2015).
  26. Scali, C., Catteruccia, F., Li, Q., Crisanti, A. Identification of sex-specific transcripts of the Anopheles gambiae doublesex gene. The Journal of Experimental Biology. 208, 3701-3709 (2005).
  27. Price, D. C., Egizi, A., Fonseca, D. M. Characterization of the doublesex gene within the Culex pipiens complex suggests regulatory plasticity at the base of the mosquito sex determination cascade. BMC Evolutionary Biology. 15, 1-13 (2015).
  28. Mysore, K., et al. siRNA-mediated silencing of doublesex during female development of the dengue vector mosquito Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9, 1-21 (2015).
  29. Boisson, B., et al. Gene silencing in mosquito salivary glands by RNAi. FEBS Letters. 580, 1988-1992 (2006).
  30. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents-2010 update. Nucleic Acids Research. 38, 332-339 (2010).
  31. Taracena, M. L., et al. Genetically modifying the insect gut microbiota to control chagas disease vectors through systemic RNAi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9, (2015).
  32. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  33. Ullmann, A., Jacob, F., Monod, J. Characterization by in vitro complementation of a peptide corresponding to an operator-proximal segment of the β-galactosidase structural gene of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 24, 339-343 (1967).
  34. Timmons, L. Bacteria-mediated RNAi-General outline. Carnegie Institution of Washington. , (2000).
  35. Pfaffl, M. W. Relative quantification. Real-time PCR. , 63-82 (2004).
  36. Neira-Oviedo, M., et al. The RNA-Seq approach to studying the expression of mosquito mitochondrial genes. Insect Molecular Biology. 20, 141-152 (2011).
  37. Baker, D. A., et al. A comprehensive gene expression atlas of sex- and tissue-specificity in the malaria vector, Anopheles gambiae. BMC Genomics. 12, (2011).
  38. Loganathan, R., Hoon, J., Wells, M. B., Andrew, D. J. Secrets of secretion - How studies of the Drosophila salivary gland have informed our understanding of the cellular networks underlying secretory organ form and function. Cellular Networks in Development. , Elsevier Inc. 143(2021).
  39. Chung, S., Hanlon, C. D., Andrew, D. J. Building and specializing epithelial tubular organs: The Drosophila salivary gland as a model system for revealing how epithelial organs are specified, form and specialize. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 3, 281-300 (2014).
  40. Yoshida, S., et al. Inhibition of collagen-induced platelet aggregation by anopheline antiplatelet protein, a saliva protein from a malaria vector mosquito. Blood. 111, 2007-2014 (2008).
  41. Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601(2017).
  42. Takahashi, S., et al. Rab11 regulates exocytosis of recycling vesicles at the plasma membrane. Journal of Cell Science. 125, 4049-4057 (2012).
  43. Catteruccia, F., Levashina, E. A. RNAi in the malaria vector, Anopheles gambiae. Methods in Molecular Biology. 555, 63-75 (2009).
  44. Balakrishna Pillai, A., et al. RNA interference in mosquito: understanding immune responses, double-stranded RNA delivery systems and potential applications in vector control. Insect Molecular Biology. 26, 127-139 (2017).
  45. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  46. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
  47. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  48. Carrasco, D., et al. Behavioural adaptations of mosquito vectors to insecticide control. Current Opinion in Insect Science. 34, 48-54 (2019).
  49. Magalhaes, T., et al. Induction of RNA interference to block Zika virus replication and transmission in the mosquito Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. , 111(2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

dwuniciowy RNAwyciszanie genówsekcja gruczołów ślinowychPCR w czasie rzeczywistymmikroskopia fluorescencyjnaekspresja w Escherichia Colikontrola wektorowagenetyka odwrotna
Skuteczne doustne podawanie RNA interferencji (RNAi) dorosłym komarom z rodzaju Anopheles gambiae
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.