Izolacja i charakterystyka nienaruszonego fikobilisomu u cyjanobakterii

Summary

Obecny protokół szczegółowo opisuje izolację fikobilisomów z cyjanobakterii poprzez wirowanie przez nieciągły gradient gęstości sacharozy. Frakcje nienaruszonych fikobilisomów potwierdza widmo emisji fluorescencji 77K i analiza SDS-PAGE. Otrzymane frakcje fikobilisomów nadają się do barwienia ujemnego TEM i analizy spektrometrii mas.

Abstract

U cyjanobakterii, fikobilisom jest istotnym kompleksem białkowym anteny, który zbiera światło i przekazuje energię do fotosystemu I i II dla fotochemii. Badanie struktury i składu fikobilisomów cieszy się dużym zainteresowaniem naukowców, ponieważ ujawnia ewolucję i dywergencję fotosyntezy u sinic. Protokół ten zapewnia szczegółową i zoptymalizowaną metodę skutecznego rozbijania komórek sinic niskim kosztem za pomocą ubijaka do koralików. Nienaruszony fikobilisom można następnie wyizolować z ekstraktu komórkowego za pomocą ultrawirowania w gradionym gradiencie sacharozy. Metoda ta okazała się odpowiednia zarówno dla modelowych, jak i niemodelowych cyjanobakterii o różnych typach komórek. Przedstawiono również procedurę krok po kroku w celu potwierdzenia integralności i właściwości fikobiliprotein za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej 77K i SDS-PAGE barwionego siarczanem i Coomassie Blue. Wyizolowany fikobilisom może być również poddany dalszym analizom strukturalnym i składowym. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten stanowi pomocny przewodnik początkowy, który pozwala naukowcom niezaznajomionym z sinicami szybko wyizolować i scharakteryzować nienaruszone fikobilisomy.

Introduction

Fikobilisom (PBS) to ogromny, rozpuszczalny w wodzie kompleks pigmentowo-białkowy, który przyłącza się do cytoplazmatycznej strony fotosystemów w błonach tylakoidów cyjanobakterii¹. PBS składa się głównie z kolorowych fikobiliprotein i bezbarwnych białek łącznikowych^1,2. Fikobiliproteiny można podzielić na cztery główne grupy: fikoerytryna, fikoerytrocyjanina, fikocyjanina i allofikocyjanina³. Cztery główne grupy absorbują różne długości fal energii świetlnej w zakresie 490-650 nm, które chlorofile absorbują nieefektywnie³. PBS może służyć....

Protocol

Synechocystis sp. PCC 6803, modelowy szczep tolerujący glukozę, został uzyskany od Dr. Chu, Hsiu-An w Academia Sinica, Tajwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, niemodelowy nitkowaty, został uzyskany od dr Donalda A. Bryanta z Pennsylvania State University w USA.

1. Hodowla komórkowa i zbiór

1. Zaszczepić komórki Syn6803 lub JSC-1 za pomocą metalowej pętli inokulacyjnej do stożkowej kolby o pojemności 100 ml zawierającej 50 ml B-HEPES medium²⁸. Hodować komórki w temperaturze 30 °C poniżej 50 μmol fotonów ^{m-2 s-1} (dioda LED światła białego) w 1% (v/v) CO₂

Results

Komórki Syn6803 i JSC-1 były hodowane w stożkowych kolbach z ciągłym mieszaniem w pożywce B-HEPES w temperaturze 30 °C, pod białym światłem LED (50 μmol fotonów ^{m-2 s-1}) w komorze wzrostu wypełnionej 1% (v/v) CO₂. W fazie wzrostu wykładniczego (OD₇₅₀ = ~0,5) komórki poddano subhodowli na świeże podłoże o końcowej gęstości optycznej OD₇₅₀ = ~0,2. Po osiągnięciu późnej fazy wzrostu wykładniczego (OD₇₅₀ = 0,6-0,8) kultury zebrano i odwirowano (10 000 x g .......

Discussion

Protokół ten opisuje prostą i standardową metodę izolowania nienaruszonego PBS w dwóch typach sinic, jednokomórkowym modelu Syn6803 i nitkowatym, niemodelowym JSC-1. Krytycznymi etapami protokołu są homogenizacja komórek i ultrawirowanie na nieciągłym gradiencie gęstości sacharozy. Ogólnie rzecz biorąc, rozerwanie komórek nitkowatych jest bardziej skomplikowane niż w przypadku komórek jednokomórkowych. Zwiększenie ilości materiału wyjściowego (mokrej masy osadu komórkowego) i powtarzanie bicia kulek było pomocne w zwięks.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Koraliki szklane 0,1 mm	BioSpec	11079101	do ekstrakcji PBS
13 ml probówka wirówkowa	Hitachi	13PA	ultrawirowanie
40 ml probówka wirówkowa	Hitachi	40PA	ultrawirowanie
Kwas octowy	Merck	8.1875.2500	do barwienia Coomassie Blue
B-HEPES medium			Zmodyfikowana pożywka cyjanobakteryjna z pożywki BG-11
Brilliant Blue R-250	Sigma	B-0149	do barwienia Coomassie Blue
Błękit bromofenolowy	Bufor do ładowania białek	Wako	2-291
Waga elektroniczna	Radwag	WLC 2/A2/C/2	do pomiaru mokrej masy granulek komórkowych
Spektrofotometr fluorescencyjny	Hitachi	F-7000	Spektrofotometr
Glycerol	BioShop	Gly001.500	bufor ładujący białko
Wirówka z chłodzeniem o dużej prędkości	Hitachi	CR22N	do wymiany
Leptolyngbya sp. JSC-1			od dr Donalda A. Bryanta z Pennsylvania State University, USA.
Akcesorium do pomiaru niskiej temperatury	Hitachi	5J0-0112	Akcesorium zawiera przezroczysty pojemnik Dewara do spektroskopii fluorescencyjnej 77K.
Metanol	Merck	1.07018,2511	do barwienia Coomassie Blue
Mikrowirówka	Thermo Fisher	Pico 21	do ekstrakcji PBS
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	do ekstrakcji PBS
Fosforan potasu dwuzasadowy	PanReac AppliChem	121512.121	do ekstrakcji PBS
Fosforan potasu jednozasadowy	PanReac AppliChem	141509.121	do ekstrakcji PBS
Fiolka z nakrętką	BioSpec	10832	do ekstrakcji PBS
SmartView Pro Imager	Major Science	UVCI-2300	do wykrywania sygnału barwienia Znic
Dodecylosiarczan sodu	Bufor ładujący białko	Zymeset	BSD101
Sacharoza	Zymeset	BSU101	do izolacji
PBSSynechocystis sp. PCC 6803			szczep tolerancyjny glukozy od Dr. Chu, Hsiu-An w Academia Sinica, Tajwan
Tris	BioShop	TRS 011.1	bufor ładujący białko
Triton X-100	BioShop	TRX 506.500	do ekstrakcji PBS
Membranowy filtr odśrodkowy Ultra 10 K	Millipore	UFC901024	do wymiany
buforowejMembranowy filtr odśrodkowy Ultra 3 K	Millipore	UFC500324	do wymiany
Ultrawirówka	Hitachi	CP80WX	ultrawirowanie
Spektrofotometr UV/Vis	Agilent	Cary 60	Spektrofotometr
Siarczan	PanReac AppliChem	131787.121	do barwienia Znic
i beta;-Merkaptoetanol	BioBasic	MB0338	bufor ładujący białko