Artykuł metodologiczny

Przecięcie rdzenia kręgowego u kijanek Xenopus laevis

4.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63276

⸱

10 grudnia 2021

 , 
1Center for Aging and Regeneration, Facultad de Ciencias Biológicas, P. Universidad Católica de Chile

W tym artykule

Podsumowanie

Przecięcie rdzenia kręgowego kijanki Xenopus laevis jest odpowiednią metodą do badania uszkodzenia rdzenia kręgowego i regeneracji poprzez wykonanie poprzecznego cięcia, które całkowicie przecina rdzeń kręgowy na poziomie klatki piersiowej.

Streszczenie

Uraz rdzenia kręgowego (SCI) to trwała przypadłość, która wpływa na nerwy ruchowe i czuciowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN), powodując paraliż poniżej miejsca urazu. Do tej pory nie ma funkcjonalnej terapii regeneracyjnej dla SCI i brakuje jasności co do wielu kompleksów i dynamicznych zdarzeń występujących po SCI. Wiele organizmów innych niż ssaki może się zregenerować po ciężkim SCI, takich jak ryby teleostowe, urodele i stadia larwalne bezogonowych, w tym kijanek Xenopus laevis. Są to prawdziwe organizmy modelowe do badania i zrozumienia reakcji na SCI oraz mechanizmów leżących u podstaw udanych procesów regeneracyjnych. Tego typu badania mogą prowadzić do identyfikacji potencjalnych celów interwencji terapeutycznej w przypadku SCI. W tym artykule opisano, jak wykonać przekrój kijanki kręgowej Xenopus laevis, w tym hodowlę, operację, opiekę pooperacyjną i ocenę testów funkcjonalnych. Ta metoda uszkodzenia może być zastosowana do wyjaśnienia różnych etapów regeneracji rdzenia kręgowego poprzez badanie mechanizmów komórkowych, molekularnych i genetycznych, a także ewolucji histologicznej i funkcjonalnej po SCI i podczas regeneracji rdzenia kręgowego.

Wprowadzenie

Uraz rdzenia kręgowego (SCI) to przypadłość, która dotyka około 250 000-500 000 osób na całym świecie każdego roku1. Oprócz tej wysokiej częstości występowania, SCI wpływa na nerwy czuciowe i ruchowe, powodując paraliż poniżej miejsca urazu i odłączenie niektórych narządów wewnętrznych od kontroli OUN. Rdzeń kręgowy, będący częścią OUN, nie może się zregenerować, a ze względu na złożoność dolegliwości i brak pełnego zrozumienia wszystkich zaangażowanych procesów, nadal nie ma skutecznych terapii pozwalających na powrót do sprawności.

Organizmy niessaków, takie jak ryby teleoste, urodele i stadia larwalne bezogonowych, które mogą zregenerować rdzeń kręgowy po ciężkim SCI2,3,4, są doskonałymi organizmami modelowymi do badania procesów rządzących udanym zdarzeniem regeneracyjnym i zrozumienia niepowodzenia regeneracji ssaków. Wiedza ta jest bardzo interesująca, ponieważ może dostarczyć oryginalnych spostrzeżeń w celu opracowania nowych celów terapeutycznych i możliwych terapii SCI.

Żaba anurowa, Xenopus laevis, jest doskonałym organizmem modelowym do badania SCI. Ma doskonałe zdolności regeneracyjne w stadiach kijanki, które są stopniowo tracone podczas metamorfozy, co pozwala na eksperymentowanie w fazach regeneracyjnych i nieregeneracyjnych3,5. Ustaloną metodą badania SCI u kijanek Xenopus laevis jest amputacja ogona, w której usuwa się cały ogon, w tym tkanki takie jak mięśnie, struna grzbietowa i rdzeń kręgowy6. Podejście to odegrało zasadniczą rolę w zrozumieniu ogólnych mechanizmów procesów regeneracyjnych4,7,8,9,10.

Ponieważ amputacja ogona obejmuje wiele tkanek oprócz rdzenia kręgowego, co różni się od tego, co dzieje się po ludzkim SCI, potrzebny jest bardziej odpowiedni paradygmat urazów do badania SCI. Opieraliśmy się na badaniach używanych w przeszłości11 do generowania wyczerpujących opisów paradygmatów urazów5,12,13,14 oraz różnych metod badania SCI12,13,14,15,16,17,18. Po przecięciu rdzenia kręgowego część ogonową rdzenia kręgowego można wyizolować w celu ekspresji RNA i białka oraz analiz wysokoprzepustowych14,19,20,21. Dodatkowo, docelomiczne iniekcje leków i małych cząsteczek, a także elektroporacja cDNA, RNA lub morpholinos, przed lub po przecięciu rdzenia kręgowego, pozwalają na badanie wpływu tych cząsteczek na zapobieganie lub leczenie SCI lub określonych zdarzeń występujących po SCI i regeneracji rdzenia kręgowego13,14. Co więcej, ewolucję urazu i procesy regeneracyjne można badać w różnym czasie po urazie przy użyciu podejść biochemicznych, molekularnych, histologicznych i funkcjonalnych12,13,14,17,19,20,21,22,23.

Wreszcie, wszystkie wyżej wymienione techniki mogą być używane w etapach nieregeneracyjnych, podkreślając jedną z najważniejszych zalet wykorzystania Xenopus laevis jako organizmu modelowego do badania SCI, badań porównawczych mechanizmów regeneracyjnych i nieregeneracyjnych u tego samego gatunku13,19,20,21,22. W pracy przedstawiono protokół przecięcia kijanki kręgowej Xenopus laevis, rozpoczynając od oceny stopnia zaawansowania i selekcji regeneracyjnych kijanek Nieuwkoopa i Fabera (NF) w stadium 50. Po tym następuje opis procedur chirurgii rdzenia kręgowego w celu wytworzenia zwierząt pozorowanych i transektowanych, opieka pooperacyjna, a na końcu analiza powrotu do zdrowia funkcjonalnego poprzez pomiar wolnej odległości pływania kijanki.

Protokół

Ten protokół dostarcza wystarczająco dużo informacji, aby pomyślnie przeprowadzić przecięcie rdzenia kręgowego. Warto zauważyć, że istnieją doskonałe szczegółowe protokoły tych technik opublikowane gdzie indziej14, które mogą uzupełniać ten przedstawiony tutaj. Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Bioetyki i Bezpieczeństwa Biologicznego z Wydziału Nauk Biologicznych Pontificia Universidad Católica de Chile.

1. Naturalne krycie żab

  1. Trzy do pięciu dni przed kryciem należy wstrzyknąć podskórnie samcom i samicom żab 50 jednostek ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG). Użyj techniki "żelaznego pazura" do powstrzymywania żab; Ponieważ żaby są śliskie, w razie potrzeby użyj siatki, aby otoczyć żabę. Włóż końcówkę igły 26 G x 1/2" z tyłu do linii bocznej, popychając ją grzbietowo na głębokość 1 cm, między skórą a mięśniem.
  2. Przed kryciem wstrzyknąć samcowi 300 jednostek, a samicy 700 jednostek hCG.
  3. Aby doszło do krycia, umieścić samca i samicę w 2 litrach 0,1 x roztworu Bartha natychmiast po schłodzeniu roztworu w temperaturze 4 °C przez 15 minut, aby przypominały warunki wiosenne i pozostawić na noc w temperaturze 18 °C.
  4. Szesnaście godzin później ostrożnie zbierz zarodki za pomocą plastikowej pipety Pasteura, z odciętą końcówką, i umieść je na szalkach Petriego o średnicy 10 cm. Usunąć embrionalną galaretowatą otoczkę, inkubując zarodki z 25 ml 2% cysteiny w wodzie destylowanej (pH 7,8; upewnić się, że roztwór pokrywa zarodki) przez 5 minut z lekkim mieszaniem. Przemyć 3 razy wodą destylowaną i 3 razy 0,1x roztworem Bartha (8,9 mM NaCl; 102 μM KCl; 238,1 μM NaHCO3; 1 mM 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazyno-kwas etanosulfonowy (HEPES); 81,14 μM MgSO4; 33,88 μM Ca(NO3)2; 40,81 μM CaCl2, pH 7,6).
  5. Wybierz zdrowe zarodki, które mają brązowawy kolor i symetrycznie dzielące się blastomery. Umieścić zarodki na szalkach Petriego o średnicy 10 cm z 50 ml 0,1 x roztworu Bartha o gęstości nie większej niż 100 zarodków na szalkę.

2. Hodowla

  1. Przez pierwszy tydzień należy utrzymywać zarodki w temperaturze 18 °C, aż do momentu, gdy usuną się z worka witelinowego. W tym czasie codziennie zmieniaj roztwór Bartha i usuwaj białawe martwe zarodki i kijanki wykazujące widoczne zmiany anatomiczne lub kijanki bez ruchu pływackiego.
  2. Po pierwszym tygodniu przenieś kijanki do wody bez chloru w plastikowych zbiornikach o gęstości 10 zwierząt na litr. Uprawiaj kijanki w temperaturze 20-21 °C w 12-godzinnym cyklu światła/12-godzinnym ciemnym cyklu, z kamieniami tlenowymi dostępnymi w każdym zbiorniku do napowietrzania wody i karmionymi raz dziennie w ilości 0,5 mg na zwierzę. Wymieniaj wodę raz w tygodniu i codziennie sprawdzaj, czy nie ma nagromadzonych odpadów i martwych zwierząt24.

3. Inscenizacja

  1. Trzy do czterech tygodni po zapłodnieniu umieść zwierzęta na szalce Petriego, a następnie, jedno po drugim, sprawdź morfologię i wygląd kończyn przednich i tylnych. Jeśli to konieczne, znieczulij zwierzęta, umieszczając je na szalce Petriego z 50 ml 0,02% mesylanu tricainy w 0,1 x roztworze Bartha dla lepszej manipulacji. Po nie więcej niż 2 minutach umieść zwierzęta w 0,1x roztworze Bartha, aby dojść do siebie po znieczuleniu.
  2. Zwróć uwagę na następujące cechy anatomiczne zwierząt w stadium 5025: kończyny przednie, które dopiero się pojawiają i są kuliste (Rysunek 1); kończyny tylne, które wystają i są kuliste (Rysunek 1).
    UWAGA: Do tej procedury można wykorzystać zwierzęta od etapów od 49 do 51 (Rysunek 1); Aby uzyskać więcej informacji na temat etapów, zapoznaj się z tabelą normalnych Nieuwkoopa i Fabera Xenopus laevis25.

4. Chirurgia: przecięcie rdzenia kręgowego i pozorowane operowanie zwierząt

  1. Znieczulij kijanki etapu 50, umieszczając je na szalce Petriego z 50 ml 0,02% mezylanu tricainy w 0,1 x roztworze Bartha na 2 minuty.
  2. Za pomocą łyżki stołowej i kleszczy umieść kijankę, grzbietową stroną do góry, na mokrym kawałku gazy w górnej połowie szklanej szalki Petriego.
  3. Wykonaj nacięcie skóry i mięśni grzbietowych na środkowym poziomie klatki piersiowej (Rysunek 2A, B) za pomocą nożyczek sprężynowych do mikrodysekcji.
    1. W przypadku kontrolnych zwierząt pozorowanych upewnij się, że rozmiar nacięcia wynosi tylko ~0,2 mm (Rysunek 2C); nie uszkadzaj rdzenia kręgowego (Rysunek 2D,D').
    2. W przypadku zwierząt z transektem należy wykonać drugie nacięcie o średnicy ~0,2 mm (Rycina 2C), aby w pełni przeciąć rdzeń kręgowy (Rycina 2E,E').

5. Opieka pooperacyjna

  1. Po zabiegu przenieś kijanki do zbiornika zawierającego 0,5 l 0,1x roztworu Bartha z 1x penicyliną-streptomycyną, w gęstości 10-12 zwierząt na zbiornik. Utrzymuj transektowane i kontroluj zwierzęta pozorowane w oddzielnych zbiornikach.
    UWAGA: Kijanki wyzdrowieją po znieczuleniu w ciągu kilku minut.
  2. Utrzymuj kijanki z napowietrzaniem w temperaturze 20-21 °C.
  3. Zmieniaj roztwór Bartha z antybiotykami co drugi dzień aż do końca eksperymentu.
  4. Zacznij karmić zwierzęta dzień po operacji, raz dziennie.
  5. Wyeliminuj martwe zwierzęta.

6. Test pływacki

  1. Zaopatrz się w skrzynkę z oświetleniem LED od wewnątrz, pokrytą przezroczystą blachą styropianową, która przepuszcza światło.
  2. Zainstaluj kamerę nad skrzynką LED.
  3. Umieść szalkę Petriego o średnicy 15 cm na wierzchu pudełka, wypełnioną 100 ml 0,1 x roztworu Bartha.
  4. Jednego dnia po przecięciu umieść kijankę na szalce Petriego i pozostaw na 5-minutowy okres adaptacji.
  5. Po adaptacji rozpocznij filmowanie zachowania podczas swobodnego pływania za pomocą wspomnianego oprogramowania (patrz tabela materiałów) przez 5 minut.
  6. Po zakończeniu filmu przenieś kijankę z powrotem do zbiornika.
  7. Powtórz śledzenie wideo 5, 10, 15 i 20 dni po przecięciu (Rysunek 3).

7. Rozważania bioetyczne

UWAGA: Śmiertelność zwierząt po pozorowanej operacji i przecięciu wynosi odpowiednio 13% i 30%. Dodatkowo do analizy statystycznej niezbędne jest minimum 15-20 zwierząt w grupie. Dlatego zacznij od 23 zwierząt pozorowanych i 26 zwierząt transektowanych.

  1. Znieczulij zwierzęta 0,02% mesylanem trikainy przez 2 minuty, aby zapewnić zmniejszenie aktywności neuronalnej i motorycznej oraz bólu przed operacją.
  2. Po operacji sprawdź, czy zwierzęta nie dochodzą do siebie po znieczuleniu. Dodatkowo codziennie karm i sprawdzaj zwierzęta.
  3. Po zakończeniu testu pływania należy uśmiercić zwierzęta, przedawkowując mezylan trikainy (1% mezylan tricainy przygotowany w 30 mM roztworze wodorowęglanu sodu).

Wyniki

Opisany w niniejszym dokumencie protokół umożliwia badanie regeneracji rdzenia kręgowego u Xenopus laevis. Wpływ specyficznych zabiegów farmakologicznych oraz udział konkretnej ekspresji genów w regeneracji rdzenia kręgowego można ocenić, mierząc ich oddziaływanie na powrót zdolności do pływania. Całkowity dystans pływania jest zestawiony w stosunku do liczby dni po urazie, aby porównać zwierzęta kontrolne i leczone w określonym punkcie czasowym lub w wyznaczonym okresie. Przykład regeneracji funkcji motorycznych w czasie przedstawiono na Rysunku 3, który ukazuje dystans pływania w 5, 10, 15 i 20 dniach po przecięciu rdzenia. W 5. dniu po przecięciu zwierzęta przepłynęły średnio 0,7 m w 5 min, co wskazuje na obniżoną zdolność pływania. Zdolność ta wzrastała wraz z upływem dni – średnio 2,1 i 3,1 m/5 min zaobserwowano odpowiednio po 10 i 15 dniach od przecięcia – a całkowity powrót zdolności pływania odnotowano w 20. dniu po przecięciu, przy średnim wyniku 5,7 m/5 min.

Etapy rozwoju kończyn przednich i tylnych 49-51, analiza wzrostu kończyn na obrazach mikroskopowych.
Rysunek 1: Okresy rozwojowe kijanki Xenopus. Reprezentatywne obrazy etapów 49-51, przedstawiające kończyny przednie i tylne jako punkt odniesienia do określania stadium rozwoju zwierzęcia. Paski skali = 2 mm. Powiększenia obszarów zaznaczonych ramkami znajdują się w prawym dolnym rogu każdego obrazu. Paski skali = 1 mm. W etapie 49 kończyn przednich nie obserwuje się, natomiast kończyny tylne dopiero się pojawiają, wykazując kształt sferyczny. Etap 50 przedstawia pojawiające się kończyny przednie o kształcie sferycznym oraz wysuwające się kończyny tylne o kształcie sferycznym. W etapie 51 kończyny przednie mają wysuwający się kształt sferyczny, a kończyny tylne wysuwający się kształt wydłużony. Przerywane linie obrysowują kończyny przednie i tylne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat wzorca komórek neuronalnych; obraz mikroskopowy analizy tkanek pozorowanych w stosunku do przeciętych.
Rycina 2: Przecięcie rdzenia kręgowego. (A) Reprezentatywny obraz pokazujący prawidłowe ułożenie zwierzęcia, stroną grzbietową do góry, do przeprowadzenia operacji. Pasek skali = 2 mm. (B) Powiększenie obrazu A pokazuje lokalizację i zakres urazu. Czerwony krzyżyk wskazuje dokładne miejsce urazu na poziomie piersiowym rdzenia kręgowego, a przerywana linia pokazuje zakres urazu. Pasek skali = 1 mm. (C) Reprezentatywny obraz pokazujący widok boczny poziomu piersiowego rdzenia kręgowego. Przedstawiono zasięg nacięcia pozorowanego oraz przecięcia. Linie przerywane wyznaczają granice rdzenia kręgowego. Pasek skali = 1 mm. (D) Reprezentatywny obraz pokazujący zwierzę w grupie pozorowanej z nienaruszonym rdzeniem kręgowym. Paski skali = 1 mm. (E) Reprezentatywny obraz pokazujący zwierzę po przecięciu z przerwanym rdzeniem kręgowym. Paski skali = 1 mm. Powiększenia obszaru w ramce znajdują się w prawym dolnym rogu każdego obrazu (D´ i E´). Paski skali = 1 mm. Skróty: S = nacięcie pozorowane; T = przecięcie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza ruchu; wykres odległości w czasie; pokazuje wzrost ruchu wraz z upływem czasu; wykres i schemat.
Rycina 3: Powrót funkcji pływania w czasie. Reprezentatywny wykres punktowy odległości przepłyniętej przez zwierzęta po przekroju w ciągu 5 min w 5, 10, 15 i 20 dni po przekroju. Przykładowe trajektorie pływania przedstawiono u góry. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM dla 10 kijanków. Skróty: dpT = dni po przekroju; SEM = standardowy błąd średniej. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Opisany w niniejszym dokumencie protokół jest doskonałą metodą przeprowadzania SCI i oceny funkcjonalnego powrotu do zdrowia. Aby zapewnić powtarzalność, ważne jest, aby hodować zdrowe kijanki i wybierać zwierzęta o podobnej wielkości. Brak odpowiedniego żywienia generuje stres związany ze składnikami odżywczymi, co skutkuje słabymi zdolnościami regeneracyjnymi26; Dlatego należy zwrócić szczególną uwagę na karmienie kijanek. Ponieważ kijanki osiągają stadium 50 po 3-4 tygodniach, można je hodować w wyższych temperaturach, aby przyspieszyć proces wzrostu, przy czym optymalna jest 18-25 °C27. Jakość wody jest ważna, ponieważ zwierzęta są wrażliwe na warunki wodne i produkty chemiczne. Optymalne warunki wodne obejmują stosowanie wody filtrowanej węglem, bezchlorowej o następujących parametrach: pH (6,5-7,5), chlorek (<0,02 mg/L), przewodność wody (1,0 mS/cm ± 0,1 jednostki), miedź (<0,3 mg/L); twardość węglanowa (KH: 5-10 dKH); twardość ogólna (GH: 6-16 dGH); azotan (NR3: <20 mg/L); i azotyny (NO2: <0,1 mg/L)14,27,28. Dodatkowo, aby uniknąć zanieczyszczenia, plastikowe zbiorniki powinny być czyszczone raz w tygodniu w przypadku hodowli zwierząt lub co drugi dzień po operacji, dokładnie myjąc je wodą bez chlorków i gąbką; Należy unikać detergentów.

Aby uzyskać lepszą przeżywalność po operacji, kijanki nie mogą być poddawane znieczuleniu przez długi czas (nie dłużej niż 2 minuty). Ponadto zaleca się znieczulanie jednej kijanki na raz. Ponieważ zwierzęta muszą być nawodnione, utrzymuj je zanurzone w roztworze przez cały czas przed i po operacji, a przed rozpoczęciem operacji wylej roztwór łyżką na kijankę. Upewnij się, że uszkodzenie jest wystarczająco rozległe, aby objąć cały rdzeń kręgowy, ale nie za rozległe, ponieważ może to spowodować słabą regenerację funkcjonalną lub śmierć. Jeśli struna grzbietowa zostanie uszkodzona, zwierzę zostanie zgięte, co wpłynie na powrót do sprawności. Jeśli uszkodzenie wykracza poza strunę grzbietową, prawdopodobieństwo śmierci wzrasta14. Podczas testu pływania zapis uważa się za prawidłowy, jeśli oprogramowanie identyfikuje każde zwierzę za pomocą niebieskiego cienia; W przeciwnym razie nagranie należy powtórzyć. Ważne jest, aby unikać ruchu i zmian powietrza lub światła podczas procesu nagrywania, aby zapobiec błędom podczas nagrywania.

Wciąż istnieje wiele otwartych pytań dotyczących komórkowych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw uszkodzenia i regeneracji rdzenia kręgowego. Protokół opisany w tej pracy może być wykorzystany do badania wpływu różnych zdarzeń komórkowych, ekspresji genów i leczenia na regenerację funkcjonalną, określoną przez pomiar zdolności pływackich. Dodatkowo w przypadku operowanych zwierząt można zastosować wiele innych technik. Rdzeń kręgowy można wyizolować w celu przeprowadzenia ekstrakcji białka i/lub mRNA14 w celu zbadania profili ekspresji białek i genów po uszkodzeniu i leczeniu19,20. Operacja ta była również podstawą do zbadania odpowiedzi komórkowej rdzenia kręgowego22 i zachowania nerwowych komórek progenitorowych 12,13,22 po urazie rdzenia kręgowego. Kaskady sygnalizacyjne zaangażowane w regenerację rdzenia kręgowego były również badane przy użyciu paradygmatu uszkodzenia rdzenia kręgowego opisanego w niniejszymdokumencie 23. Podsumowując, opisany tutaj protokół jest doskonałym modelem do badania urazów i regeneracji rdzenia kręgowego i został wykorzystany w wielu badaniach, które przyczyniły się do istniejącej wiedzy na ten temat.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana z grantów badawczych od: PG Slater: FONDECYT N° 3190820; J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pompa powietrzaRegent CALMRC-006Do funkcji kamieni dyfuzora tlenu
Oprogramowanie ANY-labiryntStoeltingTest zachowania podczas pływania
Ca(NO3)2· 4H2OSigma-Aldrich237124
CaCl2· 2H2OSigma-Aldrich223506
CameraStoelting60528Test zachowania podczas pływania
Komputerowytest zachowania podczas pływania (minimalne zalecane specyfikacje: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB RAM, dysk 10 GB,
1 dostępny port USB, monitor 1,366 i 768)
CysteinaSigma-AldrichC7352
Preparacyjny mikroskop stereoskopowyNikonSMZ745TChirurgia / inscenizacja
Szklane szalki100 x 20 mm
HEPESGibco11344-041
Ludzka gonadotropinaMożna go znaleźć w różnych formatach w aptece
KClMerck Millipore104936
Light Boxna zamówienie wykonanadrewniana skrzynka: długość 55 cm, szerokość 34 cm, wysokość 9 cm, oświetlenie LED, przezroczysta płyta polistyrenu)
MgSO4· 7H2OMerck Millipore105886
do cięciaFine Science Tools15003-08Nożyczki sprężynowe do chirurgii
MS-222Sigma-AldrichE10521Znieczulenie; mezylan trikainy
NaClMerck Millipore106404
NaHCO3Sigma-AldrichS6014
Nasco Frog Brittle dla kijanki XenopusNascoSB09480(LM)MXPokarm dla kijanek Xenopus etap  44 do 60
Kamienie dyfuzora tlenuPentairAA1Hodowla zwierząt
Para kleszczyFine Science ToolsDumont n° 5 kleszczy SFdo operacji
PenicylinaSigma-AldrichP7794
pH-metr
Plastikowa pipeta PasteuraSigma-AldrichZ331740Do pobierania zarodków po kryciu
Plastikowe szalki PetriegoSigma-AldrichP5981150 x 15 mm
Plastikowy zbiornik/pudełko z pokrywkąo pojemności 4,5 litra; 20 cm i razy; 17 cm i razy; 15 cm lub podobne
Gaza
sterylizowanaStreptomycinSigma-AldrichS1277
Łyżka
Xenopus laevis
wyspecjalizowane szczepy i linie		Krajowy zasób Xenopus
Europejskie Centrum Zasobów Xenopus
Centrum		Zasobów Badawczych Xenopus laevishttp://www.mbl.edu/xenopus
https://xenopusresource.org/
https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspxXenopus laevis dziki typXenopus 1
Xenopus Express		https://xenopus1.com
http://www.xenopus.com
Petriego kosmówkowa LED Nożyczki do mikrodysekcji stołowa

Bibliografia

  1. International perspectives on spinal cord injury. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/I/item/international-perspectives-on-spinal-cord-injury (2013).
  2. Quiroz, J. F. D., Echeverri, K. Spinal cord regeneration: Where fish, frogs and salamanders lead the way, can we follow. Biochemical Journal. 451 (3), 353-364 (2013).
  3. Lee-Liu, D., Méndez-Olivos, E. E., Muñoz, R., Larraín, J. The African clawed frog Xenopus laevis: A model organism to study regeneration of the central nervous system. Neuroscience Letters. 652, 82-93 (2017).
  4. Phipps, L. S., Marshall, L., Dorey, K., Amaya, E. Model systems for regeneration: Xenopus. Development. 147 (6), (2020).
  5. Lee-Liu, D., Edwards-Faret, G., Tapia, V. S., Larraín, J. Spinal cord regeneration: Lessons for mammals from non-mammalian vertebrates. Genesis. 51 (8), 529-544 (2013).
  6. Beck, C. W., Christen, B., Slack, J. M. W. Molecular pathways needed for regeneration of spinal cord and muscle in a vertebrate. Developmental Cell. 5 (3), 429-439 (2003).
  7. Love, N. R., et al. Genome-wide analysis of gene expression during Xenopus tropicalis tadpole tail regeneration. BMC Developmental Biology. 11, 70(2011).
  8. Love, N. R., et al. Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration. Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).
  9. Gargiolo, C., Slack, J. M. W. Cell lineage tracing during Xenopus tail regeneration. Development. 131 (11), 2669-2679 (2004).
  10. Lin, G., Chen, Y., Slack, J. M. W. Regeneration of neural crest derivatives in the Xenopus tadpole tail. BMC Developmental Biology. 7, 56(2007).
  11. Filoni, S., Bosco, L., Cioni, C. Reconstitution of the spinal cord after ablation in larval Xenopus laevistle. Acta Embryologiae et Morphologiae Experimentalis. 5 (2), 109-129 (1984).
  12. Gaete, M., et al. Spinal cord regeneration in Xenopus tadpoles proceeds through activation of Sox2-positive cells. Neural Development. 7, 13(2012).
  13. Muñoz, R., et al. Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells. Developmental Biology. 408 (2), 229-243 (2015).
  14. Edwards-Faret, G., et al. Spinal cord regeneration in Xenopus laevis. Nature Protocols. 12 (2), 372-389 (2017).
  15. Méndez-Olivos, E. E., Larraín, J. Cell transplantation as a method to investigate spinal cord regeneration in regenerative and nonregenerative xenopus stages. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (12), 943-947 (2018).
  16. Méndez-Olivos, E. E., Muñoz, R., Larraín, J. Spinal cord cells from pre-metamorphic stages differentiate into neurons and promote axon growth and regeneration after transplantation into the injured spinal cord of non-regenerative Xenopus laevis froglets. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 398(2017).
  17. de Vidts, S., Méndez-Olivos, E., Palacios, M., Larraın, J., Mery, D. Characterization of spinal cord damage based on automatic video analysis of froglet swimming. Biology Open. 8 (12), 2-11 (2019).
  18. Slater, P. G., Palacios, M., Larraín, J. Xenopus, a model to study wound healing and regeneration: Experimental approaches. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (8), 100966(2021).
  19. Lee-Liu, D., et al. Genome-wide expression profile of the response to spinal cord injury in Xenopus laevis reveals extensive differences between regenerative and non-regenerative stages. Neural Development. 9, 12(2014).
  20. Lee-Liu, D., Sun, L., Dovichi, N. J., Larraín, J. Quantitative proteomics after spinal cord injury (SCI) in a regenerative and a nonregenerative stage in the frog Xenopus laevis. Molecular and Cellular Proteomics. 17 (4), 592-606 (2018).
  21. Peñailillo, J., et al. Analysis of the early response to spinal cord injury identi fi ed a key role for mTORC1 signaling in the activation of neural stem progenitor cells. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 68(2021).
  22. Edwards-Faret, G., et al. Cellular response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages in Xenopus laevis. Neural Development. 16 (1), 2(2021).
  23. Tapia, V. S., Herrera-Rojas, M., Larrain, J. JAK-STAT pathway activation in response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages of Xenopus laevis. Regeneration. 4 (1), 21-35 (2017).
  24. Ishibashi, S., Amaya, E. How to grow Xenopus laevis tadpole stages to adult. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (3), (2021).
  25. Normal table of Xenopus laevis (Daudin).: A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. (1994).
  26. Williams, M. C., Patel, J. H., Kakebeen, A. D., Wills, A. E. Nutrient availability contributes to a graded refractory period for regeneration in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 473, 59-70 (2021).
  27. Xenopus: Methods and protocols. Vleminckx, K. , Humana Press. New York, NY. (2018).
  28. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , Cold Spring Harbory Laboratory Press. New York. (2000).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Regeneracja rdzenia kr gowegouraz rdzenia kr gowegopowr t funkcjitest p ywaniachirurgia mikrodysekcyjnao rodkowy uk ad nerwowyprocesy regeneracyjnepowr t funkcji motorycznych
Przecięcie rdzenia kręgowego u kijanek Xenopus laevis
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.