Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny metabolizmu komórkowego

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63282

⸱

15 listopada 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University-College Station

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje obrazowanie fluorescencyjne i analizę endogennych koenzymów metabolicznych, zredukowanego dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (fosforanu) (NAD(P)H) i utlenionego dinukleotydu flawinoadeninowego (FAD). Obrazowanie autofluorescencyjne NAD(P)H i FAD zapewnia bezznacznikową, nieniszczącą metodę oceny metabolizmu komórkowego.

Streszczenie

Metabolizm komórkowy to proces, w którym komórki wytwarzają energię, a wiele chorób, w tym rak, charakteryzuje się nieprawidłowym metabolizmem. Zredukowany dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (fosforanowy) (NAD(P)H) i utleniony dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD) są koenzymami reakcji metabolicznych. NAD(P)H i FAD wykazują autofluorescencję i mogą być izolowane spektralnie za pomocą długości fal wzbudzenia i emisji. Oba koenzymy, NAD(P)H i FAD, mogą występować w konfiguracji wolnej lub związanej z białkiem, z których każdy ma odrębny czas życia fluorescencji - czas, przez który fluorofor pozostaje w stanie wzbudzonym. Obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) umożliwia ilościowe określenie intensywności fluorescencji i czasu życia NAD(P)H i FAD w celu bezznacznikowej analizy metabolizmu komórkowego. Mikroskopy o intensywności fluorescencji i żywotności można zoptymalizować pod kątem obrazowania NAD(P)H i FAD, dobierając odpowiednie długości fal wzbudzenia i emisji. Zaburzenia metaboliczne spowodowane cyjankiem weryfikują protokoły obrazowania autofluorescencyjnego w celu wykrycia zmian metabolicznych w komórkach. W artykule przedstawiona zostanie technika obrazowania autofluorescencyjnego NAD(P)H i FAD do pomiaru metabolizmu komórkowego.

Wprowadzenie

Metabolizm jest procesem komórkowym służącym do wytwarzania energii. Metabolizm komórkowy obejmuje wiele szlaków, w tym glikolizę, fosforylację oksydacyjną oraz glutaminolizę. Zdrowe komórki wykorzystują te szlaki metaboliczne do generowania energii niezbędnej do proliferacji i pełnienia funkcji, takich jak produkcja cytokin przez komórki odpornościowe. Wiele chorób, w tym zaburzenia metaboliczne, nowotwory i neurodegeneracja, charakteryzuje się zaburzonym metabolizmem komórkowym1. Na przykład niektóre typy komórek nowotworowych wykazują podwyższone tempo glikolizy, nawet w obecności tlenu, aby wytworzyć cząsteczki do syntezy kwasów nukleinowych, białek i lipidów2,3. Zjawisko to, znane jako efekt Warburga, jest cechą charakterystyczną wielu typów nowotworów, w tym raka piersi, raka płuc i glejaków4. Ze względu na zmiany w metabolizmie komórkowym związane z progresją nowotworu, metabolizm komórkowy może służyć jako zastępczy biomarker odpowiedzi na lek5,6. Ponadto zrozumienie skuteczności leku na poziomie komórkowym jest kluczowe, ponieważ heterogenność komórkowa może prowadzić do zróżnicowanych odpowiedzi na leki u poszczególnych osobników7,8.

Technologie identyfikujące i ilościowo określające zmiany w metabolizmie komórkowym są niezbędne w badaniach nad nowotworami i odpowiedzią na leki. Analizy chemiczne i białkowe są wykorzystywane do oceny metabolizmu komórek lub tkanek, lecz brakuje im rozdzielczości na poziomie pojedynczych komórek oraz informacji przestrzennych. Testy metaboliczne oparte na czytnikach płytek mogą mierzyć pH i zużycie tlenu w próbce w czasie oraz następujące po nim zaburzenia metaboliczne wywołane przez substancje chemiczne. Wartość pH może służyć do obliczenia szybkości zakwaszania zewnątrzkomórkowego (ECAR), co pozwala uzyskać wgląd w aktywność glikolityczną komórek9. Metody obrazowania całego ciała, w tym pozytonowa tomografia emisyjna z użyciem 2-[fluor-18] fluoro-D-glukozy (FDG PET) oraz spektroskopia rezonansu magnetycznego (MRS), to nieinwazyjne modalności obrazowania stosowane w klinice do identyfikacji nawrotów guza i oceny skuteczności leków za pomocą pomiarów metabolicznych10,11,12,13,14.

Obrazowanie FDG-PET pozwala na wizualizację wychwytu przez tkanki FDG, będącego radioznakowanym analogiem glukozy. Zwiększony wychwyt FDG-PET przez guzy w stosunku do tkanek otaczających wynika z efektu Warburga12,13. Metoda MRS obrazuje powszechne jądra atomowe cząsteczek wykorzystywanych w metabolizmie, takich jak 13C i 31P, i pozwala uzyskać dynamiczne informacje o tym, jak metabolizm zmienia się w odpowiedzi na bodźce, takie jak wysiłek fizyczny lub spożycie posiłku14. Chociaż FDG-PET i MRS mogą być stosowane w klinice, technologiom tym brakuje rozdzielczości przestrzennej niezbędnej do rozróżnienia heterogeniczności wewnątrzguzowej. Podobnie, pomiary zużycia tlenu są wykonywane na całej populacji komórek. Obrazowanie autofluorescencyjne pokonuje barierę rozdzielczości przestrzennej tych technologii i zapewnia nieinwazyjną metodę ilościowego oznaczania metabolizmu komórkowego.

Schemat cyklu Krebsa w mitochondriach, pokazujący produkcję NADH, syntezę ATP i transport elektronów.
Rycina 1: NADH i FAD w powszechnych szlakach metabolicznych. NADH i FAD to koenzymy wykorzystywane w glikolizie, cyklu Krebsa oraz łańcuchu transportu elektronów. Obrazowanie autofluorescencji tych cząsteczek dostarcza informacji o metabolizmie komórkowym. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Zredukowany nikotynamidoadeninowy (fosforanowy) dinukleotyd (NAD(P)H) oraz utleniony flawinoadeninowy dinukleotyd (FAD) to koenzymy reakcji metabolicznych, w tym glikolizy, fosforylacji oksydacyjnej i glutaminolizy (Rysunek 1). Zarówno NAD(P)H, jak i FAD wykazują autofluorescencję i zapewniają endogenny kontrast w obrazowaniu fluorescencyjnym1,15. NADPH posiada właściwości fluorescencyjne podobne do NADH. Z tego powodu NAD(P)H jest często stosowany do reprezentowania połączonego sygnału NADH i NADPH2,16.

Obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) pozwala na ilościowe oznaczenie czasu życia fluorescencji, czyli czasu, przez który fluorofor pozostaje w stanie wzbudzonym. Czas życia fluorescencji zależy od mikrośrodowiska fluoroforów i dostarcza informacji o metabolizmie komórkowym17. NAD(P)H oraz FAD mogą występować w komórkach w formie związanej z białkiem lub wolnej, a każda z tych konformacji charakteryzuje się innym czasem życia. Wolny NAD(P)H ma krótszy czas życia niż NAD(P)H związany z białkiem; przeciwnie, wolny FAD ma dłuższy czas życia niż FAD związany18,19. Czasy życia oraz wagi poszczególnych składowych czasu życia można wyznaczyć z danych o zaniku czasu życia fluorescencji za pomocą równania (1)20:

I(t) = α1e-t/τ1 + α2e-t/τ2 + C  (1)

Równanie (1) przedstawia znormalizowaną intensywność fluorescencji jako funkcję czasu. Symbole α1 i α2 w tym równaniu reprezentują proporcjonalne składniki krótkiego i długiego czasu życia (α1+ α2=1), natomiast τ1 i τ2 reprezentują odpowiednio krótki i długi czas życia; C odpowiada za światło tła7,20. Średni czas życia ważony amplitudą, reprezentowany tutaj jako τm, oblicza się za pomocą równania (2).

τm= α1τ1+ α2τ2  (2)

Średni czas życia można obliczyć, wyciągając średnią z „t” w funkcji spadku intensywności fluoroforu, co w przypadku rozkładu dwueksponencjalnego przedstawia równanie (3)17,21.

τ*m= (α1τ12+ α2τ22)/ (α1τ1+ α2τ2)  (3)

Obraz intensywności fluorescencji można obliczyć z obrazu czasu życia poprzez całkowanie zaniku czasu życia fluorescencji. Obrazowanie autofluorescencji jest niedestrukcyjną i bezznakową metodą, która może być stosowana do charakteryzacji metabolizmu żywych komórek z rozdzielczością podkomórkową. Optyczny stosunek redoks stanowi optyczny analog wskaźnika stanu redoks komórki i jest obliczany jako stosunek intensywności NAD(P)H do FAD. Choć wzór na obliczanie optycznego stosunku redoks nie jest ustandaryzowany22,23,24,25, zdefiniowano go tutaj jako stosunek intensywności FAD do sumy intensywności NAD(P)H i FAD. Taka definicja jest stosowana, ponieważ sumaryczna intensywność w mianowniku normalizuje wskaźnik w zakresie od 0 do 1, a oczekiwanym rezultatem inhibicji cyjankiem jest spadek stosunku redoks. Czas życia fluorescencji wolnego NAD(P)H i FAD pozwala na wgląd w zmiany w podłoże metabolicznym mikrośrodowisku, w tym pH, temperaturę, bliskość tlenu oraz osmolarity17.

Zmiany czasu życia fluorescencji frakcji związanych NAD(P)H i FAD mogą wskazywać na wykorzystanie szlaków metabolicznych oraz metabolizm specyficzny dla danego substratu26. Udziały poszczególnych składowych można interpretować jako zmiany w stosunku frakcji wolnej do związanej koenzymów18,19. Łącznie te ilościowe parametry czasu życia autofluorescencji umożliwiają analizę metabolizmu komórkowego, a obrazowanie autofluorescencyjne było wykorzystywane do identyfikacji nowotworów w tkankach prawidłowych27,28, charakteryzacji komórek macierzystych29,30, oceny funkcji komórek odpornościowych31,32,33,34,35, pomiaru aktywności neurologicznej36,37,38 oraz oceny skuteczności leków w typach nowotworów, takich jak rak piersi oraz nowotwory głowy i szyi21,39,40,41,42. Wysokorozdzielcze obrazowanie autofluorescencyjne można łączyć z segmentacją obrazu w celu analizy pojedynczych komórek i kwantyfikacji heterogeniczności wewnątrzpopulacyjnej43,44,45,46,47.

NAD(P)H oraz FAD można obrazować za pomocą jednofotonowych lub wielofotonowych mikroskopów fluorescencyjnych skonfigurowanych do obrazowania intensywności lub czasu życia. W przypadku mikroskopów jednofotonowych NAD(P)H i FAD są zazwyczaj wzbudzane odpowiednio przy długościach fal 375-405 nm oraz 488 nm, ze względu na powszechność źródeł laserowych o tych parametrach48. W dwufotonowym wzbudzeniu fluorescencyjnym NAD(P)H i FAD ulegają wzbudzeniu odpowiednio przy długościach fal od około 700 do 750 nm oraz od 700 do 900 nm15,49. Po wzbudzeniu fluoroforów NAD(P)H i FAD emitują fotony odpowiednio przy długościach fal od ~410 nm do ~490 nm oraz od ~510 nm do ~640 nm15. Maksymalne długości fal emisji dla NAD(P)H i FAD wynoszą odpowiednio około 450 nm i 535 nm48.

Ze względu na różne długości fal wzbudzenia i emisji, fluorescencję dwóch koenzymów metabolicznych można wyizolować widmowo. Zrozumienie charakterystyki widmowej NAD(P)H oraz FAD jest niezbędne do zaprojektowania i optymalizacji protokołów obrazowania autofluorescencji. Cyjanek jest inhibitorem kompleksu IV łańcucha transportu elektronów (ETC). Wpływ cyjanku na metabolizm komórkowy oraz natężenia i czasy życia autofluorescencji NAD(P)H i FAD wewnątrz komórek jest dobrze scharakteryzowany27,40. W związku z tym eksperyment z zaburzeniem wywołanym cyjankiem jest skutecznym sposobem walidacji protokołów obrazowania NAD(P)H i FAD. Pomyślny eksperyment z użyciem cyjanku daje pewność, że protokół obrazowania NAD(P)H i FAD może być wykorzystany do oceny metabolizmu nieznanych grup lub zaburzeń.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wysiewanie komórek do obrazowania

  1. Odssać medium z kolby T-75 z komórkami MCF-7 o konfluencji 80-90%, przepłukać komórki 10 mL sterylnego soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) i dodać 2 mL 0,25% trypsyny (1x), aby odkleić komórki od dna kolby.
  2. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez ok. 4 min. Sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki zostały odklejone.
  3. Natychmiast dodać 8 mL medium hodowlanego, aby dezaktywować trypsynę.
  4. Zebrać komórki do probówki stożkowej (15 mL lub 50 mL). Policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
  5. Wirować komórki z prędkością 200 × g przez 5 min.
  6. Po odwirowaniu odessać supernatant. Resuspendować osad komórkowy w 1 mL medium hodowlanego i wysiać 4 × 105 komórek na szklaną płytkę obrazową o średnicy 35 mm (lub do odpowiedniego uchwytu na próbki dla używanego mikroskopu).
  7. Dodać 2 mL medium hodowlanego do płytki obrazowej, aby podtrzymać metabolizm komórek.
  8. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 24-48 h przed obrazowaniem, aby komórki przywarły do podłoża i osiągnęły logarytmiczną fazę wzrostu.
    UWAGA: Fazę wzrostu określono na podstawie wcześniejszego doświadczenia z tymi komórkami i potwierdzono za pomocą karty charakterystyki linii komórkowej.

2. Wielofotonowe obrazowanie FLIM NAD(P)H i FAD

  1. Włącz wszystkie komponenty wielofotonowego mikroskopu do pomiaru czasu życia fluorescencji, w tym mikroskop, źródło laserowe oraz używane detektory.
  2. Umieszczenie próbek
    1. Włącz lampę do jasnego pola. Upewnij się, że światło dociera do okularu. Wybierz obiektyw, zazwyczaj 20x, 40x lub 100x do obrazowania komórek. Nanieś 1 kroplę odpowiedniego medium imersyjnego na wierzch obiektywu [pomiń ten krok w przypadku użycia obiektywu powietrznego].
    2. Przesuń obiektyw w dół, aby odpowiednio umieścić próbkę, unikając kontaktu z obiektywem. Umieść szkiełko denną szalkę na uchwycie do próbek na stoliku mikroskopu. Upewnij się, że preparat jest stabilny i nie przesunie się podczas obrazowania.
    3. Wycentruj preparat względem obiektywu, korzystając z pokręteł sterujących przesuwem stolika w osiach X-Y. Po wykonaniu tej czynności spójrz przez okular i przesuń obiektyw w górę, aby ustawić ostrość obrazu komórek.
    4. Jeśli mikroskop znajduje się w obudowie, należy zamknąć drzwiczki lightboxa. Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazów i kliknij w Obrazowanie wielofotonowe zakładkę i ustaw następujące parametry obrazowania wielofotonowego: rozmiar obrazu = 256 x 256 pikseli; czas przebywania piksela = 4-25 µs; całkowity czas akwizycji obrazu = ~60 s; zoptymalizowany wzmocnienie detektora dla zliczania pojedynczych fotonów = 85% (wartość specyficzna dla używanego systemu).
  3. Obrazowanie funkcji odpowiedzi przyrządu (IRF) i standardu czasu życia fluorescencji
    1. Umieść kryształy mocznika w naczyniu z szklanym dnem i zabezpiecz pokrywkę naczynia taśmą lub parafilmem.
      UWAGA: Kryształy mocznika pozostają stabilne w temperaturze pokojowej przez wiele miesięcy.
    2. Wykonaj obrazowanie kryształów mocznika.
      1. Umieść szalkę z mocznikiem na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość na krysztale mocznika.
      2. Ustaw długość fali lasera wzbudzającego na 900 nm.
      3. Należy użyć filtra emisyjnego wychwytującego fale o długości 450 nm.
      4. Uzyskaj obraz czasu życia fluorescencji kryształu mocznika przy danej mocy lasera w punkcie próbki <1 mW i należy zastosować zalecane parametry obrazowania wymienione w kroku 2.2.4.
    3. Obrazuj paciorki żółto-zielone (YG) jako standard czasu życia fluorescencji.
      1. Przygotuj preparat z kulek YG, rozcieńczając roztwór kulek YG w stosunku 1:1000 w sterylnej wodzie. Nanieś niewielką objętość (~30 µL) na szkiełko przedmiotowe lub naczynie z szklanym dnem. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnić krawędzie szkiełka lakierem do paznokci bezbarwnym.
      2. Umieść preparat z kuleczkami YG na stoliku mikroskopu tak, aby strona z szkiełkiem nakrywkowym była skierowana w stronę obiektywu.
      3. Ustaw długość fali lasera wzbudzającego na 890 nm
      4. Należy użyć filtra emisyjnego wychwytującego długości fal w zakresie ok. 500–600 nm.
      5. Uzyskaj obraz czasu życia fluorescencji kulek YG, stosując odpowiednią moc lasera w miejscu próbki <1 mW oraz zalecane parametry obrazowania [krok 2.2.4].
      6. Sprawdź czas życia mikrokulki, korzystając z IRF (funkcji odpowiedzi impulsowej) mocznika. Jeśli czas życia nie wynosi około 2,1 ns, sprawdź, czy mikrokulka nie styka się z inną mikrokulką, co może prowadzić do gaszenia fluorescencji, czy roztwór mikrokulek nie wyschnął, czy mikrokulka nie znajduje się poza płaszczyzną ostrości, czy IRF jest dokładna lub czy przesunięcie między IRF a zanikiem fluorescencji zostało zoptymalizowane [patrz krok 4.2.4].
        UWAGA: czas życia wynoszący ~2,1 ns jest stabilny w czasie.
  4. Obrazowanie NAD(P)H
    1. Umieść naczynie z szklanym dnem zawierające komórki na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość na komórkach.
      UWAGA: Zaleca się umieszczenie komórek w komorze inkubacyjnej w celu utrzymania temperatury, wilgotności oraz poziomu CO2.2 poziomy podczas akwizycji obrazu, ponieważ parametry te mogą wpływać na metabolizm komórkowy.
    2. Ustaw wzmocnienie detektora na wartość optymalną dla FLIM. Następnie zmień czas przebywania (dwell time) na pożąnaną wartość – parametr ten określa czas, przez który laser oświetla każdy piksel preparatu.
      UWAGA: Parametry te powinny pozostać NIEZMIENNE przez resztę procedury. Ma to na celu zapewnienie spójności naświetlania laserowego i ustawień detektora, aby zagwarantować poprawność pomiarów opartych na intensywności, które zależą od mocy lasera, parametrów skanowania oraz wzmocnienia detektora. Dla pracy detektorów w trybie zliczania pojedynczych fotonów istnieje zoptymalizowana wartość wzmocnienia detektora; w przypadku opisanego systemu wartość ta wynosi 85%.
    3. Ustaw laser wielofotonowy na 750 nm. Upewnij się, że sterowanie mocą lasera jest początkowo ustawione na zero, aby uniknąć uszkodzenia komórek po otwarciu migawki lasera.
      UWAGA: W przypadku NAD(P)H zaleca się wzbudzenie przy 750 nm, mimo że wykazuje ono szerokie absorpcję w zakresie 700–750 nm. W przypadku FAD zaleca się wzbudzenie przy 890 nm, mimo że wykazuje ono szeroką absorpcję w zakresie 700–900 nm.
    4. Ustawić lub wybrać filtr emisyjny, aby zbierać długości fal emisji w zakresie ~400-500 nm.
    5. Rozpocznij obrazowanie w ogniskowanie lub podgląd na żywo sposób optymalizacji ustawień obrazu.
      UWAGA: Laser jest obecnie włączony. W tym momencie nie należy otwierać obudowy mikroskopu. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
    6. Powoli zwiększaj moc lasera do poziomu ok. 3–8 mW w miejscu próbki, dbając jednocześnie o to, aby komórki znajdowały się w ogniskowej. Po dokonaniu regulacji zapisz wartość maksymalnej użytej mocy. Stosuj to ustawienie mocy podczas obrazowania pozostałych fragmentów szalki Petriego w celu obrazowania NAD(P)H.
      UWAGA: Ważne jest mierzenie mocy lasera na próbce lub w oknie poboru (pick-off window), a nie poleganie na napięciu ogniwa Pockelsa, ponieważ ogniwa Pockelsa nie są stabilne. Często podczas obrazowania moc lasera monitoruje się za pomocą okna poboru zamiast bezpośrednio na próbce. Wykorzystując drugi watymierz przy obiektywie, można ustalić zależność między mocą w oknie poboru a mocą na próbce, co pozwala na oszacowanie przybliżonej mocy na próbce na podstawie pomiarów z okna poboru.
    7. Wykonaj obrazowanie FLIM dla NAD(P)H z czasem całkowania obrazu wynoszącym 60 s.
    8. Należy sprawdzić, czy obraz zawiera wystarczającą liczbę fotonów (szczyt na poziomie ok. 100 fotonów dla piksela cytoplazmy) w obrębie krzywej zaniku czasu życia fluorescencji. Jeśli liczba fotonów jest zbyt niska, należy zwiększyć moc lasera lub czas akwizycji obrazu.
      UWAGA: Minimalna liczba fotonów w szczycie wykładniczego zaniku fluorescencji zależy od parametrów systemu, w tym od rozdzielczości czasowej, funkcji odpowiedzi przyrządu (IRF) oraz szumu tła.
  5. obrazowanie FAD
    1. Ustaw laser wielofotonowy na 890 nm i poczekaj, aż nastąpi blokada modowa przy nowej długości fali. Upewnij się, że sterowanie mocą lasera jest początkowo ustawione na zero, aby komórki nie uległy uszkodzeniu po otwarciu przysłony lasera.
      UWAGA: Podczas wykonywania tego kroku nie należy przesuwać stolika ani zmieniać ostrości obiektywu. Pole widzenia (FOV) dla FAD powinno dokładnie odpowiadać polu widzenia (FOV) dla NAD(P)H w przypadku tego obrazu.
    2. Ustaw lub wybierz filtr emisyjny, aby zbierać długości fal emisji w zakresie ~500–600 nm.
    3. Rozpocząć obrazowanie w ustawianie ostrości lub podgląd na żywo sposób optymalizacji ustawień obrazu.
      UWAGA: Laser pracuje. W tym momencie nie należy otwierać obudowy mikroskopu.
    4. Powoli zwiększaj moc lasera do poziomu ~5–10 mW na próbce i zapisz maksymalną użytą moc. Przyjmij tę wartość jako ustawienie mocy dla obrazowania innych segmentów płytki Petriego podczas obrazowania FAD.
    5. Należy wykonać obraz FAD FLIM z czasem integracji obrazu wynoszącym 60 s.
    6. Należy sprawdzić, czy obraz zawiera wystarczającą liczbę fotonów (szczyt rzędu ~100 fotonów dla piksela cytoplazmy) w krzywej zaniku czasu życia fluorescencji. Jeśli liczba fotonów jest zbyt niska, należy zwiększyć moc lasera lub czas akwizycji obrazu.
      UWAGA: Minimalna liczba fotonów w szczycie wykładniczego zaniku fluorescencji zależy od parametrów systemu, w tym od rozdzielczości czasowej, funkcji odpowiedzi impulsowej (IRF) oraz szumu tła.
  6. Powtórz kroki 2.4–2.5 w dodatkowych czterech lub pięciu polach widzenia (FOV). Upewnij się, że każde obrazowane miejsce znajduje się w odległości co najmniej 2 FOV od poprzednich lokalizacji.

3. Przygotowanie eksperymentu z cyjankiem

  1. Rozpuścić 130,24 mg cyjanku sodu w 25 mL PBS, aby przygotować 80 mM (20x) roztwór cyjanku sodu.
    UWAGA: Cyjanek jest toksyczny. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
  2. Odssać 100 µL pożywki hodowlanej z naczynia. Zastąpić ją 100 µL roztworu cyjanku sodu, aby uzyskać stężenie cyjanku w naczyniu wynoszące 4 mM.
  3. Umieścić komórki w inkubatorze na 5 min, aby umożliwić reakcję komórek z roztworem cyjanku.
  4. Powtórzyć kroki 2.4-2.6, aby uzyskać obrazy NAD(P)H i FAD komórek po ekspozycji na cyjanek.
    UWAGA: Przedłużona ekspozycja na cyjanek doprowadzi do śmierci komórek. Obrazy po podaniu cyjanku należy pozyskać w ciągu 30 min od dodania związku.

4. Analiza obrazów FLIM

  1. Uruchom oprogramowanie do analizy czasu życia w technice FLIM.
    1. Otwórz obraz mocznika, aby uzyskać zmierzoną funkcję odpowiedzi impulsowej (IRF).
    2. Zaimportuj obraz mocznika. Wybierz a punkt na obrazie kryształu mocznika, który zostanie wykorzystany do analizy obrazu. Zwiększyć wartość koszyka przestrzennego aby zintegrować dane FLIM z wielu pikseli do 1 lub większej liczby dla pik rozpadu > 100 fotonów poprzez zmianę Kosz zmienna znajdująca się w głównym interfejsie oprogramowania.
    3. Zapisz dane jako IRF.
      1. W wskazanym oprogramowaniu należy kliknąć menu rozwijalne o nazwie IRFwybierz Kopiuj z danych o rozpadzieNastępnie kliknij Kopiuj do schowka do wykorzystania w analizie obrazów pobranych podczas eksperymentu.
  2. Analiza obrazów czasu życia NAD(P)H i FAD
    1. Zaimportuj plik obrazu do oprogramowania do analizy czasu życia fluorescencji.
    2. Popraw wizualizację obrazu, aby widzieć komórki i przedziały podkomórkowe, zmieniając w razie potrzeby intensywność i kontrast.
      1. Kliknij Opcje menu rozwijane i wybierz IntensywnośćTutaj należy dostosować intensywność i kontrast według uznania, a następnie kliknąć OK.
    3. Zaimportuj IRF z obrazu mocznika.
      1. Kliknij IRF menu rozwijane i wybierz Wklej z schowka.
    4. Zestaw Rozkład wielowykładniczy parametry50.
      1. Ustaw wartość progową do oceny zaników dla pikseli cytoplazmy.
        UWAGA: W tym przypadku zastosowano wartość 50. Wartość tę wybrano, porównując wartości szczytowe fluorescencji kilku reprezentatywnych pikseli tła i jądra z wartością szczytową kilku pikseli cytoplazmy. Jako próg wybrano wartość pośrednią między pikselami jądra a pikselami cytoplazmy.
    5. Upewnij się, że wartość przesunięcia (Shift) wyrównuje IRF względem krawędzi wznoszącej fluorescencji. W razie potrzeby dostosuj przesunięcie do wartości, która minimalizuje wartość chi-kwadrat.
    6. Zwiększ rozmiar koszyka przestrzennego (spatial bin), aby piksele cytoplazmy miały wartości szczytowe fluorescencji równe lub wyższe od 100.
      UWAGA: Zwiększenie binowania przestrzennego doprowadzi do zmniejszenia rozdzielczości przestrzennej.
    7. Oblicz czasy życia fluorescencji dla wszystkich pikseli w obrazie.
      1. W wskazanym programie kliknij przycisk Oblicz menu rozwijane | Macierz rozpadu.
        UWAGA: O sukcesie świadczy obraz z fałszywymi kolorami przypisanymi do amplitudy ważonego czasu życia fluorescencji.
    8. Zapisz dane dotyczące czasu życia fluorescencji.
      1. Kliknij Plik menu rozwijane | EksportujWybierz żądane parametry analizy i kliknij Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia.Zapisz obraz.
      2. Wybierz Kolor przycisk z Opcje menu rozwijane do dostosowania wyświetlanej metryki czasu życia fluorescencji, the konfiguracja kolorów Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. B-G-Roraz ustaw odpowiednie minimalne i maksymalne wartości paska kolorów, aby dostosować skalę kolorystyczną obrazu czasu życia fluorescencji.

Spektroskopia optyczna; obraz i wykres analizy widm emisji fotonów przy użyciu zestawu spektrometru.
Rycina 2: Pomiar IRF kryształu mocznika. (A) Obraz intensywności uzyskany z mocznika. Wybrano reprezentatywny piksel do stworzenia krzywej zaniku IRF (B) dla późniejszej analizy obrazów czasu życia fluorescencji komórek. Skrót: IRF = instrument response function (funkcja odpowiedzi instrumentu). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Segmentacja komórek
    UWAGA: Protokół opisany w tym miejscu wykorzystuje oprogramowanie do analizy obrazów51. Reprezentatywne obrazy MCF-7 oraz kod do analizy danych zostały udostępnione52.
    1. Pobierz plik MCF7_Segmentation_Final.cpproj52.
    2. Importuj potok (pipeline) MCF7_Segmentation, klikając File | Import | Pipeline from file i wybierając plik MCF7_Segmentation_Final.cpproj.
    3. Kliknij moduł Images i dodaj obrazy intensywności NAD(P)H, które mają zostać poddane segmentacji.
      UWAGA: Obrazy muszą być w formacie .tif, .png lub .jpg.
    4. Naciśnij przycisk Analyze Images w lewym dolnym rogu.
      UWAGA: Potok może wymagać optymalizacji dla obrazów pozyskanych na różnych systemach. W przypadku problemów należy wypróbować następujące kroki pomocnicze:
      1. Użyj trybu Test Mode do testowania różnych parametrów: kliknij Start Test Mode i uruchamiaj każdy moduł, klikając przycisk odtwarzania (play) obok nazwy modułu.
      2. Kliknij pierwszy moduł IdentifyPrimaryObjects i dostosuj Typical diameter of objects, in pixel units (Min, Max) tak, aby odpowiadały one średnicy komórek.
        UWAGA: Dla komórek MCF-7 zastosowano odpowiednio 10 i 40 pikseli dla wartości minimalnej i maksymalnej.
      3. Kliknij moduł EnhanceOrSuppressFeatures i dostosuj Feature size, aby poprawić identyfikację wybranego Feature type.
        UWAGA: Dla komórek MCF-7 zastosowano rozmiar cechy wynoszący 10 pikseli.
      4. Kliknij drugi moduł EnhanceOrSuppressFeatures i dostosuj Range of hole sizes, aby zoptymalizować wzmocnienie obszarów jądrowych.
        UWAGA: Dla komórek MCF-7 zastosowano zakres 5-20.
      5. Kliknij drugi moduł IdentifyPrimaryObjects i dostosuj parametry (Threshold strategy, Thresholding method, Threshold smoothing scale oraz Threshold correction factor), aby zoptymalizować identyfikację jąder. Kliknij znak ? przy każdym parametrze, aby określić optymalne ustawienia i zastosować je w module IdentifySecondaryObjects.
      6. Kliknij moduł FilterObjects i dostosuj kształt obszaru. Wybierz minimalną i maksymalną liczbę pikseli dla kształtu obszaru, który ma zostać zidentyfikowany.
        ​UWAGA: Dla komórek MCF-7 zastosowano odpowiednio 100 i 500 dla wartości maksymalnej i minimalnej. Proces segmentacji komórek poprzez identyfikację jądra i propagację do granic komórki został szczegółowo opisany przez Walsh i Skala47.
    5. Korzystając z masek cytoplazmy komórkowej, oblicz średnie wartości zmiennych wyjściowych czasu życia fluorescencji dla każdej komórki na obrazie.

Analiza segmentacji obrazów komórek; mikroskopia fluorescencyjna; identyfikacja jądra i cytoplazmy.
Rysunek 3: Identyfikacja i segmentacja poszczególnych komórek. Obraz intensywności NAD(P)H komórek MCF7 (A>) uzyskany poprzez integrację obrazu czasu życia fluorescencji. Komórki obrazowano przy wzbudzeniu 750 nm z mocą 5 mW przez 60 s. Osie x i y reprezentują położenie pikseli na obrazie. (A>) Zidentyfikowano poszczególne komórki. Wykonano maskowanie komórek (B>), aby wyeliminować szum tła ze zbioru danych. Następnie zidentyfikowano jądro komórkowe (C>) i rzutowano je na maskę komórki (D>). Następnie przefiltrowano komórki (E>), aby usunąć zamaskowane obszary, które nie odpowiadają rozmiarowi typowych komórek. Pasek skali = 50 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Metoda alternatywna: Obrazowanie intensywności fluorescencji

  1. Włącz sprzęt, który będzie wykorzystywany podczas eksperymentu.
    UWAGA: Obrazy intensywności fluorescencji można pozyskać za pomocą mikroskopów fluorescencyjnych szerokopolowych, konfokalnych lub mikroskopów wielofotonowych.
    1. Upewnij się, że używany mikroskop posiada odpowiednie źródło wzbudzenia dla NAD(P)H (długość fali jednofotonowej ~370-405 nm, długość fali dwufotonowej ~700-750 nm) i FAD (długość fali jednofotonowej ~488 nm, długość fali dwufotonowej ~890 nm).
    2. Upewnij się, że mikroskop posiada filtr do izolacji emisji NAD(P)H (~400-500 nm).
      UWAGA: Ustawienia dla 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) często sprawdzają się w przypadku NAD(P)H.
    3. Upewnij się, że mikroskop posiada filtr do izolacji emisji FAD (~500-600 nm).
      UWAGA: Ustawienia dla zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) często sprawdzają się w przypadku FAD.
  2. Przygotuj mikroskop.
    1. Włącz lampę światła przechodzącego. Upewnij się, że światło dociera do okularu. W razie potrzeby nanieś 1 kroplę odpowiedniego medium imersyjnego na właściwy obiektyw.
    2. Przesuń obiektyw w dół, aby prawidłowo umieścić próbki bez żadnych przeszkód. Właściwie umieść szalkę Petriego na stole przedmiotowym. Upewnij się, że preparat jest stabilny i nie przesunie się podczas obrazowania.
      UWAGA: Zaleca się umieszczenie komórek w komorze inkubacyjnej w celu utrzymania temperatury, wilgotności i poziomu CO2 podczas akwizycji obrazów, ponieważ parametry te mogą wpływać na metabolizm komórkowy.
    3. Wycentruj preparat względem obiektywu. Po wykonaniu tej czynności spójrz przez okular i przesuwaj obiektyw, aż komórki znajdą się w ogniskowej.
  3. Rozpocznij obrazowanie intensywności.
    1. Uruchom oprogramowanie do obrazowania i ustaw konfigurację wzbudzenia oraz emisji do rejestracji NAD(P)H, klikając zakładkę Capture w programie do akwizycji obrazu i ustawiając filtr wzbudzenia i emisji NAD(P)H w rewolwerze mikroskopu.
      UWAGA: Do obrazowania NAD(P)H użyto filtra wzbudzenia 357/44, dichroika longpass 409 oraz filtra emisji 447/60.
    2. Zoptymalizuj oświetlenie wzbudzenia i parametry detektora. Jeśli występuje problem z fotobieleniem, zmniejsz intensywność oświetlenia i zwiększ czas całkowania obrazu.
      UWAGA: Sygnał NAD(P)H jest słaby; należy uważać na fotobielenie w przypadku zastosowania zbyt dużej mocy.
    3. Pozyskaj obraz NAD(P)H o żądanym rozmiarze. Upewnij się, że obraz został zapisany.
    4. Ustaw konfigurację wzbudzenia i emisji do rejestracji FAD. Zoptymalizuj oświetlenie wzbudzenia i parametry detektora.
      UWAGA: Do obrazowania FAD użyto filtra wzbudzenia 458/64, dichroika longpass 495 oraz filtra emisji 550/88.
    5. Pozyskaj obraz FAD. Upewnij się, że obraz został zapisany.
      UWAGA: Parametry akwizycji obrazów NAD(P)H i FAD (intensywność oświetlenia, rozmiar obrazu, wzmocnienie detektora) powinny pozostać takie same przez cały eksperyment obrazowania.
    6. Powtórz proces w dodatkowych pięciu lokalizacjach, oddalonych od siebie o co najmniej 2 pola widzenia (FOV) od wcześniej obrazowanych miejsc.
  4. Analiza danych stosunku redoks na poziomie obrazu
    1. Otwórz obrazy intensywności NAD(P)H i FAD w programie do przetwarzania obrazów.
    2. Ustaw próg dla NAD(P)H, aby zachować piksele cytoplazmy, a piksele tła i jądra ustaw na 0.
    3. Oblicz obraz stosunku redoks, stosując równanie FAD/(NAD(P)H+FAD) dla każdego piksela, wykorzystując obraz NAD(P)H po zastosowaniu progu.
    4. Oblicz średnią wartość pikseli niezerowych.
      UWAGA: Kroki te można wykonać w oprogramowaniu do analizy obrazu lub zakodować bezpośrednio za pomocą skryptów.
  5. Analiza stosunku redoks na poziomie komórkowym
    1. Wykonaj kroki 4.3.1-4.3.5, aby uzyskać obraz maski komórek w każdym obrazie NAD(P)H.
    2. Oblicz obraz stosunku redoks, stosując równanie FAD/(NAD(P)H+FAD) dla każdego piksela.
    3. Korzystając z maski cytoplazmy komórkowej, wyznacz średni stosunek redoks dla wszystkich pikseli każdej komórki w obrazie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Linia komórkowa raka piersi epithelialnego, MCF-7, była hodowana w medium DMEM uzupełnionym o 10% płotkowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Do obrazowania fluorescencyjnego komórki wysiano w gęstości 4 × 105 komórek na szklaną podstawkę do obrazowania o średnicy 35 mm na 48 h przed badaniem. Obrazowanie komórek przeprowadzono przed i po traktowaniu cyjankiem, stosując opisane powyżej protokoły. Celem eksperymentu z cyjankiem jest potwierdzenie izolacji spektralnej fluorescencji NAD(...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Intensywność autofluorescencji i obrazowanie czasu życia są szeroko stosowane do oceny metabolizmu w komórkach21,55. FLIM ma wysoką rozdzielczość, a zatem rozpuszcza pojedyncze komórki, co jest ważne w badaniach nad rakiem, ponieważ heterogeniczność komórkowa przyczynia się do agresji guza i oporności na leki 7,39,41,44,45,46,58.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Źródła finansowania obejmują Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP200668) oraz Texas A&M University. Rysunek 1 został stworzony za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-deoksy-d-glukoza (2-DG)SigmaAC111980000; AC111980010; AC111980050;
Antybiotyk Antybiotyk Przeciwbakteryjny (pen-strep)Próbki komórek Gibco15240096
Kolekcja kultur typu amerykańskiegoNieLinia nowotworowa MCF-7
CellProfilerBroad InstituteNie dotyczyOprogramowanie do analizy obrazu
Rurka stożkowaVWR89039-664Rurka stożkowa 15 ml
DMEMThermoFisher11965092Pożywki
hodowlane Lustro dichroiczne FAD Filtr emisjiSemrockFF495-Di03-25x36495 nm
emisji FADSemrockFF01-550/88-25550/88 nm
Filtr wzbudzenia FADSemrockFF01-458/64-25458/64 nm
FBSThermoFisher16000036
Mikroskop czasu życia fluorescencji3iN/A
Szklana podstawkaMatTek CorpP35G-1.0-14-C
Multiphoton LaserCoherentN/A2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H lustro dichroiczneSemrockFF409-Di03-25x36409 nm
Filtr emisji NAD(P)HSemrockFF02-447/60-25447/60 nm
Filtr wzbudzenia NAD(P)HSemrockFF01-357/44-25357/44 nm
PBSThermoFisher70011044
Cyjanek potasuSigma-Aldrich380970
SlideBooks 63iN/AOprogramowanie do akwizycji obrazu
SPCImageBecker & Hickl GmbHN/AOprogramowanie do analizy czasu życia fluorescencji
Stage Top InkubatorokoLabN/A
TrypsinBiosciences786-262
MocznikSigma-AldrichU5128
Koraliki YGPolysciences19096-2Mikrosfery Yg (20,0 &mikro; m)
AC111980250 dotyczy FAD Filtr

Bibliografia

  1. Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomarkers in Medicine. 4 (2), 241-263 (2010).
  2. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using endogenous contrast to assess metabolic state. Annual Review of Biomedical Engineering. 14, 351-367 (2012).
  3. Zheng, J. Energy metabolism of cancer: Glycolysis versus oxidative phosphorylation (Review). Oncology Letters. 4 (6), 1151-1157 (2012).
  4. Potter, M., Newport, E., Morten, K. J. The Warburg effect: 80 years on. Biochemical Society Transactions. 44 (5), 1499-1505 (2016).
  5. Zhao, Y., Butler, E. B., Tan, M. Targeting cellular metabolism to improve cancer therapeutics. Cell Death and Disease. 4 (3), 532(2013).
  6. Patel, S., Ahmed, S. Emerging field of metabolomics: Big promise for cancer biomarker identification and drug discovery. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 63-74 (2015).
  7. Walsh, A. J., Cook, R. S., Skala, M. C. Functional optical imaging of primary human tumor organoids: Development of a personalized drug screen. Journal of Nuclear Medicine. 58 (9), 1367-1372 (2017).
  8. Zaal, E. A., Berkers, C. R. The influence of metabolism on drug response in cancer. Frontiers in Oncology. 8, 500(2018).
  9. Little, A. C., et al. High-content fluorescence imaging with the metabolic flux assay reveals insights into mitochondrial properties and functions. Communications Biology. 3 (1), 271(2020).
  10. Wang, X., et al. Comparison of magnetic resonance spectroscopy and positron emission tomography in detection of tumor recurrence in posttreatment of glioma: A diagnostic meta-analysis. Asia-Pacific Journal of Clinical Oncology. 11 (2), 97-105 (2015).
  11. Nabi, H. A., Zubeldia, J. M. Clinical applications of 18F-FDG in oncology. Journal of Nuclear Medicine Technology. 30 (1), 3-9 (2002).
  12. Kostakoglu, L., Agress, H., Goldsmith, S. J. Clinical role of FDG PET in evaluation of cancer patients. Radiographics. 23 (2), 315-340 (2003).
  13. Hoh, C. K. Clinical use of FDG PET. Nuclear Medicine and Biology. 34 (7), 737-742 (2007).
  14. van de Weijer, T., Schrauwen-Hinderling, V. B. Application of magnetic resonance spectroscopy in metabolic research. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1865 (4), 741-748 (2019).
  15. Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and Flavoprotein. Biophysical Journal. 82, 2811-2825 (2002).
  16. Lagarto, J. L., et al. Characterization of NAD(P)H and FAD autofluorescence signatures in a Langendorff isolated-perfused rat heart model. Biomedical Optics Express. 9 (10), 4961-4978 (2018).
  17. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2013).
  18. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 89 (4), 1271-1275 (1992).
  19. Nakashima, N., Yoshihara, K., Tanaka, F., Yagi, K. Picosecond fluorescence lifetime of the coenzyme of D-amino acid oxidase. Journal of Biological Chemistry. 255 (11), 5261-5263 (1980).
  20. Hu, L., Wang, N., Cardona, E., Walsh, A. J. Fluorescence intensity and lifetime redox ratios detect metabolic perturbations in T cells. Biomedical Optics Express. 11 (10), 5674-5688 (2020).
  21. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (7), 1-43 (2020).
  22. Liu, Z., et al. Mapping metabolic changes by noninvasive, multiparametric, high-resolution imaging using endogenous contrast. Science Advances. 4 (3), (2018).
  23. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using endogenous contrast to assess metabolic state. Annual Review of Biomedical Engineering. 14, 351-367 (2012).
  24. Varone, A., et al. Endogenous two-photon fluorescence imaging elucidates metabolic changes related to enhanced glycolysis and glutamine consumption in precancerous epithelial tissues. Cancer Research. 74 (11), 3067-3075 (2014).
  25. Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
  26. Sharick, J. T., et al. Protein-bound NAD(P)H lifetime is sensitive to multiple fates of glucose carbon. Scientific Reports. 8 (1), 5456(2018).
  27. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of NADH and FAD redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19494-19499 (2007).
  28. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton fluorescence lifetime imaging of protein-bound and free nicotinamide adenine dinucleotide in normal and precancerous epithelia. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024014(2007).
  29. Uchugonova, A. A., König, K. Two-photon autofluorescence and second-harmonic imaging of adult stem cells. Journal of Biomedical Optics. 13 (5), 054068(2008).
  30. Miranda-Lorenzo, I., et al. Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells. Nature Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).
  31. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nature Biomedical Engineering. 5 (1), 77-88 (2021).
  32. Heaster, T. M., Humayun, M., Yu, J., Beebe, D. J., Skala, M. C. Autofluorescence imaging of 3D tumor-macrophage microscale cultures resolves spatial and temporal dynamics of macrophage metabolism. Cancer Research. 80 (23), 5408-5423 (2020).
  33. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2676-2685 (2018).
  34. Chang, C. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
  35. Kaech, S. M., Cui, W. Transcriptional control of effector and memory CD8+ T cell differentiation. Nature Reviews. Immunology. 12 (11), 749-761 (2012).
  36. Gómez, C. A., Fu, B., Sakadžić, S., Yaseena, M. A. Cerebral metabolism in a mouse model of Alzheimer's disease characterized by two-photon fluorescence lifetime microscopy of intrinsic NADH. Neurophotonics. 5 (4), 045008(2018).
  37. Yaseen, M. A., et al. In vivo imaging of cerebral energy metabolism with two-photon fluorescence lifetime microscopy of NADH. Biomedical Optics Express. 4 (2), 307-321 (2013).
  38. Bower, A. J., et al. High-speed label-free two-photon fluorescence microscopy of metabolic transients during neuronal activity. Applied Physics Letters. 118 (8), 081104(2021).
  39. Walsh, A. J., et al. Quantitative optical imaging of primary tumor organoid metabolism predicts drug response in breast cancer. Cancer Research. 74 (18), 5184-5194 (2014).
  40. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, subtypes, and early-treatment response in breast cancer. Cancer Research. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  41. Chowdary, M. V. P., et al. Autofluorescence of breast tissues: Evaluation of discriminating algorithms for diagnosis of normal, benign, and malignant conditions. Photomedicine and Laser Surgery. 27 (2), 241-252 (2009).
  42. Demos, S. G., Bold, R., White, R. D., Ramsamooj, R. Investigation of near-infrared autofluorescence imaging for the detection of breast cancer. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 11 (4), 791-798 (2005).
  43. Heaster, T. M., Humayun, M., Yu, J., Beebe, D. J., Skala, M. C. Autofluorescence imaging of 3D tumor-macrophage microscale cultures resolves spatial and temporal dynamics of macrophage metabolism. Cancer Research. 80 (23), 5408-5423 (2020).
  44. Sharick, J. T., et al. Cellular metabolic heterogeneity in vivo is recapitulated in tumor organoids. Neoplasia. 21 (6), 615-626 (2019).
  45. Shah, A. T., Diggins, K. E., Walsh, A. J., Irish, J. M., Skala, M. C. In vivo autofluorescence imaging of tumor heterogeneity in response to treatment. Neoplasia. 17 (12), 862-870 (2015).
  46. Walsh, A. J., Skala, M. C. Optical metabolic imaging quantifies heterogeneous cell populations. Biomedical Optics Express. 6 (2), 559-573 (2015).
  47. Walsh, A. J., Skala, M. C. An automated image processing routine for segmentation of cell cytoplasms in high-resolution autofluorescence images. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XIV. , (2014).
  48. Skala, M., Ramanujam, N. Methods in Molecular Biology. 594, 155-162 (2010).
  49. Stringari, C., et al. Multicolor two-photon imaging of endogenous fluorophores in living tissues by wavelength mixing. Scientific Reports. 7, 3792(2017).
  50. SPCImage 2.9: Data analysis software for fluorescence lifetime imaging microscopy. SPCImage. , Available from: https://biology.uiowa.edu/sites/biology.uiowa.edu/files/SPCIMAGE29.pdf (2007).
  51. CellProfiler. , Available from: https://cellprofiler.org/releases (2007).
  52. Autofluorescence Imaging. GitHub. , Available from: https://github.com/walshlab/Autofluorescence-Imaging (2021).
  53. Ramey, N. A., Park, C. Y., Gehlbach, P. L., Chuck, R. S. Imaging mitochondria in living corneal endothelial cells using autofluorescence microscopy. Photochemistry and Photobiology. 83 (6), 1325-1329 (2007).
  54. Walsh, A., Cook, R. S., Rexer, B., Arteaga, C. L., Skala, M. C. Optical imaging of metabolism in HER2 overexpressing breast cancer cells. Biomedical Optics Express. 3 (1), 75-85 (2012).
  55. Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxidants & Redox Signaling. 30, 875-889 (2019).
  56. Bird, D. K., et al. Metabolic mapping of MCF10A human breast cells via multiphoton fluorescence lifetime imaging of the coenzyme NADH. Cancer Research. 65, 8766-8773 (2005).
  57. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, subtypes, and early-treatment response in breast cancer. Cancer Research. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  58. Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical imaging of drug-induced metabolism changes in murine and human pancreatic cancer organoids reveals heterogeneous drug response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
  59. Gubser, P. M., et al. Rapid effector function of memory CD8+ T cells requires an immediate-early glycolytic switch. Nature Immunology. 14 (10), 1064-1072 (2013).
  60. Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Review. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
  61. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology: Series A. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  62. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-protocol. 8 (10), 2850(2018).
  63. Becker, W. The bh TCSPC Handbook. , Available from: https://www.becker-hickl.com/wp-content/uploads/2021/10/SPC-handbook-9ed-05a.pdf (2021).
  64. Gadella, T. W. J. Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. Mason, W. T. 34, Ch. 34 467-479 (1999).
  65. Miller, D. R., Jarrett, J. W., Hassan, A. M., Dunna, A. K. Deep tissue iImaging with multiphoton fluorescence microscopy. Current Opinion in Biomedical Engineering. 4, 32-39 (2017).
  66. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie czasu ycia fluorescencjiobrazowanie NADPHobrazowanie FADmikroskopia wielofotonowaoptyczny stosunek redokszaburzenie metaboliczneobrazowanie ywych kom rektraktowanie cyjankiem
Obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny metabolizmu komórkowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.