Artykuł metodologiczny

Obrazowanie autofluorescencyjne w celu oceny metabolizmu komórkowego

DOI:

10.3791/63282

⸱

15 listopada 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University-College Station

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje obrazowanie fluorescencyjne i analizę endogennych koenzymów metabolicznych, zredukowanego dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (fosforanu) (NAD(P)H) i utlenionego dinukleotydu flawinoadeninowego (FAD). Obrazowanie autofluorescencyjne NAD(P)H i FAD zapewnia bezznacznikową, nieniszczącą metodę oceny metabolizmu komórkowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolizm komórkowy to proces, w którym komórki wytwarzają energię, a wiele chorób, w tym rak, charakteryzuje się nieprawidłowym metabolizmem. Zredukowany dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (fosforanowy) (NAD(P)H) i utleniony dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD) są koenzymami reakcji metabolicznych. NAD(P)H i FAD wykazują autofluorescencję i mogą być izolowane spektralnie za pomocą długości fal wzbudzenia i emisji. Oba koenzymy, NAD(P)H i FAD, mogą występować w konfiguracji wolnej lub związanej z białkiem, z których każdy ma odrębny czas życia fluorescencji - czas, przez który fluorofor pozostaje w stanie wzbudzonym. Obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) umożliwia ilościowe określenie intensywności fluorescencji i czasu życia NAD(P)H i FAD w celu bezznacznikowej analizy metabolizmu komórkowego. Mikroskopy o intensywności fluorescencji i żywotności można zoptymalizować pod kątem obrazowania NAD(P)H i FAD, dobierając odpowiednie długości fal wzbudzenia i emisji. Zaburzenia metaboliczne spowodowane cyjankiem weryfikują protokoły obrazowania autofluorescencyjnego w celu wykrycia zmian metabolicznych w komórkach. W artykule przedstawiona zostanie technika obrazowania autofluorescencyjnego NAD(P)H i FAD do pomiaru metabolizmu komórkowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolizm to komórkowy proces wytwarzania energii. Metabolizm komórkowy obejmuje wiele szlaków, w tym glikolizę, fosforylację oksydacyjną i glutaminolizę. Zdrowe komórki wykorzystują te szlaki metaboliczne do generowania energii do proliferacji i funkcjonowania, takiego jak produkcja cytokin przez komórki odpornościowe. Wiele chorób, w tym zaburzenia metaboliczne, nowotwory i neurodegeneracja, charakteryzuje się zmienionym metabolizmem komórkowym1. Na przykład niektóre typy komórek rakowych mają podwyższone tempo glikolizy, nawet w obecności tlenu, w celu wytworzenia cząsteczek do syntezy kwasów nukleinowych, białek i lipidów2,3. Zjawisko to, znane jako efekt Warburga, jest cechą charakterystyczną wielu typów nowotworów, w tym raka piersi, raka płuc i glejaków4. Ze względu na zmiany metabolizmu komórkowego związane z progresją raka, metabolizm komórkowy może być zastępczym biomarkerem odpowiedzi na lek5,6. Co więcej, zrozumienie skuteczności leków na poziomie komórkowym ma kluczowe znaczenie, ponieważ heterogeniczność komórek może prowadzić do różnych reakcji na leki u poszczególnych osób7,8.

Technologie identyfikujące i określające ilościowo zmiany w metabolizmie komórkowym są niezbędne do badań nad rakiem i reakcją na leki. Analizy chemiczne i białkowe są wykorzystywane do oceny metabolizmu komórek lub tkanek, ale brakuje im rozdzielczości pojedynczej komórki i informacji przestrzennych. Testy metaboliczne oparte na czytniku płytek mogą mierzyć pH i zużycie tlenu w próbce w czasie oraz późniejsze zaburzenia metaboliczne przez chemikalia. pH można wykorzystać do obliczenia współczynnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR), co zapewnia wgląd w aktywność glikolityczną komórek9. Metody obrazowania całego ciała, w tym pozytonowa tomografia emisyjna 2-[fluoru-18] fluoro-D-glukozy (FDG PET) i spektroskopia rezonansu magnetycznego (MRS), są nieinwazyjnymi metodami obrazowania stosowanymi klinicznie do identyfikacji nawrotu guza i skuteczności leku poprzez pomiary metaboliczne10,11,12,13,14.

FDG-PET obrazuje wychwyt tkankowy FDG, radioznakowanego analogu glukozy. Zwiększony wychwyt FDG-PET przez nowotwory w stosunku do otaczającej tkanki jest spowodowany efektem Warburga12,13. MRS obrazuje wspólne jądra cząsteczek używanych do metabolizmu, takich jak 13C i 31P, i może uzyskać dynamiczne informacje o tym, jak zmienia się metabolizm w odpowiedzi na bodźce, takie jak ćwiczenia lub jedzenie14. Chociaż FDG-PET i MRS mogą być stosowane klinicznie, technologie te nie mają rozdzielczości przestrzennej, aby rozwiązać problem heterogeniczności wewnątrznowotworowej. Podobnie, pomiary zużycia tlenu są wykonywane na dużej populacji komórek. Obrazowanie autofluorescencyjne pokonuje przeszkodę związaną z rozdzielczością przestrzenną tych technologii i zapewnia nieinwazyjną metodę ilościowego określania metabolizmu komórkowego.

figure-introduction-1
Rysunek 1: NADH i FAD w wspólnych szlakach metabolicznych. NADH i FAD to koenzymy stosowane w glikolizie, cyklu Krebsa i łańcuchu transportu elektronów. Obrazowanie autofluorescencyjne tych cząsteczek dostarcza informacji o metabolizmie komórkowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zredukowany dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (fosforan) (NAD(P)H) i utleniony dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD) są koenzymami reakcji metabolicznych, w tym glikolizy, fosforylacji oksydacyjnej i glutaminolizy (Rysunek 1). Zarówno NAD(P)H, jak i FAD są autofluorescencyjne i zapewniają endogenny kontrast dla obrazowania fluorescencyjnego1,15. NADPH ma podobne właściwości fluorescencyjne do NADH. Z tego powodu NAD(P)H jest często używany do reprezentowania połączonego sygnału NADH i NADPH2,16.

Obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) określa ilościowo czas życia fluorescencji lub czas, przez który fluorofor znajduje się w stanie wzbudzonym. Czas życia fluorescencji reaguje na mikrośrodowisko fluoroforów i dostarcza informacji o metabolizmie komórkowym17. NAD(P)H i FAD mogą istnieć w komórkach w konformacjach związanych z białkami lub wolnych, z których każda ma inny czas życia. Wolny NAD(P)H ma krótszy czas życia niż NAD(P)H związany z białkiem; I odwrotnie, swobodny FAD ma dłuższą żywotność niż związany FAD18,19. Czasy życia i masy składników w czasie życia można określić ilościowo na podstawie danych o rozpadzie czasu życia fluorescencji za pomocą równania (1)20:

I(t) = α1 e-t/τ1 + α2 e-t/τ2 + C (1)

Eq (1) reprezentuje znormalizowaną intensywność fluorescencji w funkcji czasu. α1 i α2 w tym równaniu reprezentują proporcjonalne składowe krótkich i długich czasów życia (α1 + α2 = 1), odpowiednio, τ1 i τ2 reprezentują odpowiednio krótkie i długie czasy życia, a C odpowiada za światło tła7,20. Czas życia ważony amplitudą, reprezentowany tutaj jako τm, oblicza się za pomocą równania (2).

τm= α1τ1+ α2τ2 (2)

Średni czas życia można obliczyć, uśredniając "t" przez intensywność zaniku fluoroforu, co dla rozpadu dwuwykładniczego pokazuje równanie Eq. (3)17,21.

τ*m= (α1τ1 2+ α2τ22)/ (α1τ1+ α2τ2) (3)

Obraz intensywności fluorescencji można obliczyć na podstawie obrazu czasu życia, integrując zanik czasu życia fluorescencji. Obrazowanie autofluorescencyjne jest nieniszczącą i bezznacznikową metodą, którą można wykorzystać do scharakteryzowania metabolizmu żywych komórek w rozdzielczości subkomórkowej. Optyczny współczynnik redoks zapewnia optyczną analogową metrykę chemicznego stanu redoks ogniwa i jest obliczany jako stosunek intensywności NAD(P)H i FAD. Chociaż wzór na obliczanie optycznego współczynnika redoks nie jest ustandaryzowany22,23,24,25, jest on tutaj zdefiniowany jako intensywność FAD w łącznych intensywnościach NAD(P)H i FAD. Definicja ta jest używana, ponieważ zsumowana intensywność w mianowniku normalizuje metrykę w zakresie od 0 do 1, a oczekiwanym wynikiem hamowania cyjanku jest spadek współczynnika redoks. Czas życia fluorescencji wolnego NAD(P)H i FAD zapewnia wgląd w zmiany w mikrośrodowisku metabolicznym rozpuszczalnika, w tym pH, temperaturę, bliskość tlenu i osmolarność17.

Zmiany w czasie życia fluorescencji związanych frakcji NAD(P)H i FAD mogą wskazywać na wykorzystanie szlaku metabolicznego i metabolizm specyficzny dla substratu26. Masy składników mogą być interpretowane pod kątem zmian we frakcji wolnej do związanej koenzymów18,19. Ogólnie rzecz biorąc, te ilościowe wskaźniki czasu życia autofluorescencji pozwalają na analizę metabolizmu komórkowego, a obrazowanie autofluorescencyjne zostało wykorzystane do identyfikacji nowotworów na podstawie normalnych tkanek27,28, charakteryzując komórki macierzyste29,30, ocena funkcji komórek odpornościowych31,32,33,34,35, mierząc aktywność neurologiczną36,37,38, oraz zrozumienie skuteczności leków w typach nowotworów, takich jak rak piersi oraz rak głowy i szyi21,39,40,41,42. Obrazowanie autofluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości może być połączone z segmentacją obrazu w celu analizy pojedynczych komórek i kwantyfikacji niejednorodności wewnątrzpopulacyjnej43,44,45,46,47.

NAD(P)H i FAD mogą być obrazowane na jedno- lub wielofotonowych mikroskopach fluorescencyjnych skonfigurowanych do obrazowania intensywności lub czasu życia. W przypadku mikroskopów jednofotonowych NAD(P)H i FAD są zwykle wzbudzane na długościach fal odpowiednio 375-405 nm i 488 nm, ze względu na popularne źródła laserowe na tych długościach fal48. W przypadku wzbudzenia fluorescencyjnego dwufotonowego, NAD(P)H i FAD będą wzbudzać na długościach fal odpowiednio około 700 do 750 nm i 700 do 900 nm15,49. Po wzbudzeniu fluoroforów, NAD(P)H i FAD emitują fotony o długościach fal odpowiednio od ~410 nm do ~490 nm i ~510 nm do ~640 nm15. Maksymalne długości fal emisji NAD(P)H i FAD wynoszą odpowiednio około 450 nm i 535 nm48.

Ze względu na różne długości fal wzbudzenia i emisji, fluorescencja dwóch metabolicznych koenzymów może być spektralnie izolowana. Zrozumienie charakterystyki spektralnej NAD(P)H i FAD jest niezbędne do projektowania i optymalizacji protokołów obrazowania autofluorescencyjnego. Cyjanek jest inhibitorem kompleksu IV łańcucha transportu elektronów (ETC). Wpływ cyjanku na metabolizm komórkowy oraz intensywność autofluorescencji i czas życia NAD(P)H i FAD w komórkach jest dobrze scharakteryzowany27,40. Dlatego eksperyment z zaburzeniami cyjanku jest skutecznym sposobem walidacji protokołów obrazowania NAD(P)H i FAD. Udany eksperyment z cyjankiem daje pewność, że protokół obrazowania NAD(P)H i FAD może być wykorzystany do oceny metabolizmu nieznanych grup lub perturbacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Posiewanie komórek do obrazowania

  1. Odessać pożywkę z 80-90% zlewającej się kolby T-75 z komórkami MCF-7, przepłukać komórki 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i dodać 2 ml 0,25% trypsyny (1x), aby oderwać komórki od dna kolby.
  2. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez ~4 min. Sprawdzić komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić oderwanie.
  3. Natychmiast dodaj 8 ml pożywki hodowlanej, aby dezaktywować trypsynę.
  4. Zebrać komórki w stożkowej probówce (15 ml lub 50 ml). Policz komórki za pomocą hemocytometru.
  5. Odwirować komórki 200 × g przez 5 minut.
  6. Po odwirowaniu odessać supernatant. Zawiesić osad komórek w 1 ml pożywki hodowlanej i zasiać 4 × 105 komórek na naczyniu do obrazowania o średnicy 35 mm ze szklanym dnem (lub odpowiednim uchwytem na próbkę do używanego mikroskopu).
  7. Dodaj 2 ml pożywki hodowlanej do naczynia do obrazowania, aby utrzymać metabolizm komórkowy.
  8. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24-48 godzin przed obrazowaniem, aby komórki przylegały i osiągnęły logarytmiczną fazę wzrostu.
    UWAGA: Faza wzrostu została określona na podstawie wcześniejszych doświadczeń z tymi komórkami i potwierdzona w arkuszu danych ogniw.

2. Wielofotonowe obrazowanie FLIM NAD(P)H i FAD

  1. Włącz wszystkie elementy wielofotonowego mikroskopu fluorescencyjnego, w tym mikroskop, źródło lasera i używane detektory.
  2. Rozmieszczenie próbek
    1. Włącz lampę jasnego pola. Upewnij się, że światło wpada do okularu. Wybierz obiektyw, zwykle 20x, 40x lub 100x do obrazowania komórek. Nałóż 1 kroplę odpowiedniego medium zanurzeniowego na wierzch obiektywu [pomiń, jeśli używasz obiektywu powietrznego].
    2. Przesuń obiektyw w dół, aby prawidłowo umieścić próbkę bez dotykania obiektywu. Umieść naczynie ze szklanym dnem na uchwycie próbki na stoliku mikroskopu. Upewnij się, że próbka jest bezpieczna i nie będzie się poruszać podczas obrazowania.
    3. Wyśrodkuj preparat z obiektywem za pomocą sterownika stolika XY. Gdy to zrobisz, spójrz w okular i przesuń obiektyw w górę, aby ustawić ostrość na komórkach.
    4. Jeśli mikroskop znajduje się w obudowie, zamknij drzwiczki lightboxa. Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazu, kliknij kartę Obrazowanie wielofotonowe i ustaw następujące parametry obrazowania wielofotonowego: rozmiar obrazu = 256 x 256 pikseli; czas przebywania pikseli = 4-25 μs; całkowity czas akwizycji obrazu = ~60 s; Zoptymalizowane wzmocnienie detektora dla zliczania pojedynczych fotonów = 85% (specyficzne dla używanego systemu).
  3. Obrazowanie funkcji odpowiedzi instrumentu (IRF) i wzorca żywotności fluorescencji
    1. Umieść kryształki mocznika na naczyniu ze szklanym dnem i zabezpiecz pokrywkę naczynia taśmą lub parafilmem.
      UWAGA: Kryształy mocznika pozostają stabilne w temperaturze pokojowej przez wiele miesięcy.
    2. Wyobraź sobie kryształy mocznika.
      1. Umieść naczynie mocznika na stoliku mikroskopu i skup się na krysztale mocznika.
      2. Ustaw długość fali lasera wzbudzającego na 900 nm.
      3. Użyj filtra emisyjnego, który wychwytuje fale o długości 450 nm.
      4. Uzyskać obraz czasu życia fluorescencji kryształu mocznika z mocą lasera na próbce <1 mW i zastosować zalecane parametry obrazowania wymienione w kroku 2.2.4.
    3. Zobrazuj koraliki żółto-zielone (YG) jako wzorzec żywotności fluorescencji.
      1. Utwórz szkiełko kulkowe YG, rozcieńczając roztwór kulek YG w stosunku 1:1,000 w sterylnej wodzie. Umieść niewielką objętość (~30 μl) na szkiełku podstawowym lub naczyniu ze szklanym dnem. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci.
      2. Umieść szkiełko kulkowe YG na stoliku mikroskopu stroną szkiełka nakrywkowego w kierunku obiektywu.
      3. Ustaw długość fali lasera wzbudzającego na 890 nm
      4. Użyj filtra emisyjnego, który wychwytuje fale o długości ~500-600 nm.
      5. Uzyskać obraz czasu życia fluorescencji koralika YG za pomocą mocy lasera na próbce <1 mW i zalecanych parametrów obrazu [krok 2.2.4].
      6. Sprawdź żywotność stopki za pomocą IRF mocznika. Jeśli czas życia nie wynosi ~2,1 ns, sprawdź, czy koralik styka się z innym koralikiem przyczyniającym się do wygaszania fluorescencji, roztwór kulki wyschł, koralik jest nieostry, IRF nie jest dokładny lub przesunięcie między IRF a zanikiem fluorescencji nie jest zoptymalizowane [patrz krok 4.2.4].
        UWAGA: Żywotność ~2,1 ns jest stabilna w czasie.
  4. Obrazowanie NAD(P)H
    1. Umieść naczynie ze szklanym dnem z komórkami na stoliku mikroskopu i skup się na komórkach.
      UWAGA: Zaleca się umieszczenie komórek w komorze środowiskowej w celu utrzymania ciepła, wilgotności i poziomu CO2 podczas akwizycji obrazu, ponieważ parametry te mogą wpływać na metabolizm komórkowy.
    2. Dostosuj wzmocnienie detektora do optymalnej wartości dla FLIM. Dodatkowo zmień na żądany czas przebywania - parametr wskazujący czas, jaki laser spędza na każdym pikselu próbki.
      UWAGA: Te parametry powinny pozostać TAKIE TAKIE same przez pozostałą część procedury. Ma to na celu zapewnienie spójności oświetlenia laserowego i ustawień detektora, aby zapewnić ważność pomiarów opartych na intensywności, które są zależne od mocy lasera, parametrów skanowania i wzmocnienia detektora. Istnieje zoptymalizowane wzmocnienie detektora do pracy detektorów w trybie zliczania pojedynczych fotonów; Wartość ta wynosi 85% dla systemu, do którego się odwołuje.
    3. Ustaw laser wielofotonowy na 750 nm. Upewnij się, że regulator mocy lasera jest początkowo ustawiony na zero, aby ogniwa nie uległy uszkodzeniu po otwarciu migawki lasera.
      UWAGA: Wzbudzenie przy 750 nm jest zalecane dla NAD(P)H, chociaż ma szeroką absorpcję przy 700-750 nm. Wzbudzenie przy 890 nm jest zalecane dla FAD, chociaż ma szeroką absorpcję przy 700-900 nm.
    4. Ustaw lub wybierz filtr emisyjny, aby zbierać długości fal emisji przy ~400-500 nm.
    5. Rozpocznij obrazowanie w trybie ustawiania ostrości lub podglądu na żywo, aby zoptymalizować ustawienia obrazu.
      UWAGA: Laser jest teraz aktywny. Nie otwieraj w tym momencie obudowy mikroskopu. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
    6. Powoli zwiększaj moc lasera do ~ 3-8 mW na próbce, upewniając się jednocześnie, że komórki są ostre. Po wyregulowaniu zapisz maksymalną używaną moc. Użyj tego ustawienia mocy do obrazowania innych segmentów płytki Petriego do obrazowania NAD(P)H.
      UWAGA: Ważne jest, aby zmierzyć moc lasera na próbce lub w oknie odbioru i nie polegać na napięciu ogniwa pockels, ponieważ ogniwa pockelsa nie są stabilne. Często moc lasera jest monitorowana podczas obrazowania za pomocą okna odbioru, a nie na próbce. Korzystając z drugiego miernika mocy na obiektywie, zależność między mocą w oknie odbioru a mocą w próbce może być wykorzystana do oszacowania przybliżonej mocy w próbce na podstawie pomiarów w oknie odbioru.
    7. Zbierz obraz NAD(P)H FLIM o czasie integracji obrazu wynoszącym 60 s.
    8. Sprawdź, czy obraz ma wystarczającą ilość fotonów (pik ~100 fotonów dla piksela cytoplazmy) w obrębie krzywej rozpadu czasu życia fluorescencji. Jeśli liczba fotonów jest zbyt mała, zwiększ moc lasera lub czas akwizycji obrazu.
      UWAGA: Minimalna szczytowa liczba fotonów w rozpadzie wykładniczym fluorescencji zależy od parametrów systemu, w tym rozdzielczości czasowej, IRF i szumu tła.
  5. Obrazowanie FAD
    1. Ustaw laser wielofotonowy na 890 nm i poczekaj, aż zablokuje się na nowej długości fali. Upewnij się, że regulator mocy lasera jest początkowo ustawiony na zero, aby ogniwa nie uległy uszkodzeniu po otwarciu migawki lasera.
      UWAGA: Nie przesuwaj stage ani ostrości obiektywu podczas wykonywania tego kroku. Pole widzenia FAD (FOV) powinno być bezpośrednio zgodne z NAD(P)H FOV dla tego obrazu.
    2. Ustaw lub wybierz filtr emisyjny, aby zbierać długości fal emisji przy ~500-600 nm.
    3. Rozpocznij obrazowanie w trybie ustawiania ostrości lub podglądu na żywo, aby zoptymalizować ustawienia obrazu.
      UWAGA: Laser jest teraz aktywny. Nie otwieraj w tym momencie obudowy mikroskopu.
    4. Powoli zwiększaj moc lasera do ~5-10 mW na próbce i zapisuj maksymalną użytą moc. Użyj tego jako ustawienia mocy dla obrazowania na innych segmentach szalki Petriego do obrazowania FAD.
    5. Zbierz obraz FAD FLIM o czasie integracji obrazu wynoszącym 60 s.
    6. Sprawdź, czy obraz ma wystarczającą ilość fotonów (pik ~100 fotonów dla piksela cytoplazmy) w obrębie krzywej rozpadu czasu życia fluorescencji. Jeśli liczba fotonów jest zbyt mała, zwiększ moc lasera lub czas akwizycji obrazu.
      UWAGA: Minimalna szczytowa liczba fotonów w rozpadzie wykładniczym fluorescencji zależy od parametrów systemu, w tym rozdzielczości czasowej, IRF i szumu tła.
  6. Powtórz kroki 2.4-2.5 dla dodatkowych czterech do pięciu pól widzenia. Upewnij się, że każdy obraz jest oddalony o co najmniej 2 pola widzenia od zobrazowanych lokalizacji.

3. Przygotowanie eksperymentu z cyjankiem

  1. Rozpuścić 130,24 mg cyjanku sodu w 25 ml PBS, aby uzyskać 80 mM (20x) roztwór cyjanku sodu.
    UWAGA: Cyjanek jest toksyczny. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
  2. Odessać 100 μl pożywki hodowlanej z naczynia. Zastąp to 100 μl roztworu cyjanku sodu, aby uzyskać stężenie cyjanku 4 mM w naczyniu.
  3. Umieść komórki w inkubatorze na 5 minut, aby komórki mogły zareagować z roztworem cyjanku.
  4. Powtórz kroki 2.4-2.6, aby uzyskać obrazy komórek NAD(P)H i FAD po ekspozycji na cyjanek.
    UWAGA: Długotrwałe narażenie na cyjanek zabije komórki. Obrazy postcyjankowe są uzyskiwane w ciągu 30 minut od dodania cyjanku.

4. Analiza obrazu FLIM

  1. Otwórz oprogramowanie do analizy żywotności FLIM.
    1. Otwórz obraz mocznika, aby uzyskać zmierzony IRF.
    2. Zaimportuj obraz mocznika. Wybierz punkt na obrazie kryształu mocznika, który ma zostać użyty do analizy obrazu. Zwiększ wartość przedziału przestrzennego, aby zintegrować dane FLIM z wielu pikseli do 1 lub więcej dla piku zaniku > 100 fotonów, zmieniając zmienną Bin znajdującą się w głównym interfejsie oprogramowania.
    3. Zapisz dane jako IRF.
      1. W oprogramowaniu, do którego się odwołuje, kliknij menu rozwijane zatytułowane IRF, wybierz opcję Kopiuj z danych zaniku. Następnie kliknij przycisk Kopiuj do schowka, aby użyć go w analizie obrazu wykonanego podczas eksperymentu.
  2. Analiza obrazów czasu życia NAD(P)H i FAD
    1. Zaimportuj plik obrazu do oprogramowania do analizy czasu życia fluorescencji.
    2. Popraw wizualizację obrazu, aby zobaczyć komórki i przedziały subkomórkowe, zmieniając intensywność i kontrast w razie potrzeby.
      1. Kliknij menu rozwijane Opcje i wybierz opcję Intensywność. Tutaj zmień intensywność i kontrast zgodnie z potrzebami i kliknij OK.
    3. Zaimportuj IRF z obrazu mocznika.
      1. Kliknij menu rozwijane IRF i wybierz opcję Wklej ze schowka.
    4. Ustaw parametry zaniku wielowykładniczego50.
      1. Ustaw wartość progową, aby ocenić rozpady pikseli cytoplazmy.
        UWAGA: W tym przypadku użyto wartości 50. Wartość została wybrana poprzez porównanie wartości pików fluorescencji kilku reprezentatywnych pikseli tła i jądra z wartością piku kilku pikseli cytoplazmy. Jako próg wybrano wartość między pikselami jądra a pikselami cytoplazmy.
    5. Sprawdź, czy wartość Przesunięcia wyrównuje IRF względem narastającej krawędzi fluorescencji. W razie potrzeby dostosuj przesunięcie do wartości, która minimalizuje wartość chi-kwadrat.
    6. Zwiększ przedział przestrzenny, tak aby piksele cytoplazmy miały wartości piku fluorescencji na poziomie lub wyższym niż 100,
      UWAGA: Zwiększenie przedziału przestrzennego spowoduje zmniejszenie rozdzielczości przestrzennej.
    7. Obliczanie czasów istnienia fluorescencji dla wszystkich pikseli obrazu.
      1. W programie, do którego się odwołuje, kliknij menu rozwijane Oblicz | Macierz rozpadu.
        UWAGA: Powodzenie jest sygnalizowane fałszywym kolorem obrazu w stosunku do czasu życia fluorescencji ważonej amplitudą.
    8. Zapisz dane dotyczące czasu życia fluorescencji.
      1. Kliknij menu rozwijane Plik | Eksport. Wybierz żądane parametry analizy i kliknij przycisk OK. Zapisz obraz.
      2. Wybierz przycisk Kolor z menu rozwijanego Opcje, aby dostosować wyświetlaną metrykę czasu życia fluorescencji, konfigurację kolorów na B-G-R i ustawić określone minimalne i maksymalne wartości paska kolorów, aby dostosować skalę kolorów obrazu o czasie życia fluorescencji.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Zmierzony IRF kryształu mocznika. (A) Obraz intensywności uzyskany z mocznika. Wybrano reprezentatywny piksel do stworzenia krzywej rozpadu IRF (B) w celu późniejszej analizy obrazów czasu życia fluorescencji komórek. Skrót: IRF = funkcja odpowiedzi instrumentu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Segmentacja komórek
    UWAGA: Opisany tutaj protokół korzysta z oprogramowania do analizy obrazu51. Reprezentatywne obrazy MCF-7 i kod analizy danych są dostępne52.
    1. Pobierz plik MCF7_Segmentation_Final.cpproj52.
    2. Zaimportuj potok MCF7_Segmentation, klikając Plik | Import | Potok z pliku, wybierz plik MCF7_Segmentation_Final.cpproj.
    3. Kliknij moduł Obrazy i dodaj obrazy intensywności NAD(P)H do segmentacji.
      UWAGA: Obrazy muszą mieć format in.tif, .png lub .jpg.
    4. Naciśnij przycisk Analizuj obrazy w lewym dolnym rogu.
      UWAGA: Potok może wymagać optymalizacji dla obrazów uzyskanych w różnych systemach. Aby rozwiązać problem, spróbuj wykonać następujące czynności podrzędne
      1. Użyj trybu testowego do testowania różnych parametrów: Kliknij przycisk Rozpocznij tryb testowy i uruchom każdy moduł, klikając przycisk odtwarzania obok nazwy modułu.
      2. Kliknij pierwszy moduł IdentifyPrimaryObjects i dostosuj Typową średnicę obiektów w jednostkach pikseli (Min, Max), aby dopasować ją do średnicy komórek.
        UWAGA: W przypadku komórek MCF-7 użyto odpowiednio 10 i 40 pikseli jako minimum i maksimum.
      3. Kliknij moduł EnhanceOrSuppressFeatures i dostosuj rozmiar elementu, aby ułatwić identyfikację wybranego typu elementu.
        UWAGA: W przypadku komórek MCF-7 użyto rozmiaru elementu wynoszącego 10 pikseli.
      4. Kliknij drugi moduł EnhanceOrSuppressFeatures i dostosuj zakres rozmiarów otworów, aby zoptymalizować uwydatnienie regionów jądrowych.
        UWAGA: Dla ogniw MCF-7 zastosowano zakres 5-20.
      5. Kliknij drugi moduł IdentifyPrimaryObjects i dostosuj parametry (Strategia progowa, Metoda progowania, Skala wygładzania progu i Współczynnik korekcji progu), aby zoptymalizować identyfikację jąder. Kliknij ? przy każdym parametrze, aby zidentyfikować optymalne ustawienia i zastosować je do modułu IdentifySecondaryObjects.
      6. Kliknij moduł FilterObjects i dostosuj kształt obszaru. Wybierz minimalny i maksymalny piksel kształtu obszaru, który ma zostać zidentyfikowany.
        UWAGA: W przypadku ogniw MCF-7 użyto 100 i 500 odpowiednio dla maksimum i minimum. Proces segmentacji komórek poprzez identyfikację jądra i propagację do granic komórek jest szczegółowo wyjaśniony przez Walsha i Skala47.
    5. Korzystając z masek cytoplazmy komórki, uśrednij zmienne wyjściowe czasu życia fluorescencji dla każdej komórki na obrazie.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Identyfikacja i segmentacja poszczególnych komórek. Obraz intensywności NAD(P)H komórek MCF7 (A) uzyskany przez integrację obrazu czasu życia fluorescencji. Komórki obrazowano przy użyciu wzbudzenia 750 nm przy 5 mW przez 60 s. Osie x i y reprezentują położenie obrazu w pikselach. (A) Zidentyfikowano poszczególne komórki. Komórki zostały zamaskowane (B) w celu wyeliminowania wszelkich szumów tła z zestawu danych. Jądro zostało następnie zidentyfikowane (C) i rzutowane na maskę komórkową (D). Komórki zostały następnie przefiltrowane (E) w celu usunięcia zamaskowanych obszarów, które nie pasują do rozmiaru typowych komórek. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Alternatywna metoda: obrazowanie intensywności fluorescencji

  1. Włącz sprzęt, który będzie używany podczas eksperymentu.
    UWAGA: Obrazy intensywności fluorescencji można uzyskać za pomocą szerokokątnych mikroskopów fluorescencyjnych, konfokalnych mikroskopów fluorescencyjnych lub mikroskopów wielofotonowych.
    1. Upewnij się, że mikroskop, który ma być używany, ma odpowiednie źródło wzbudzenia dla NAD(P)H (długość fali pojedynczego fotonu ~370-405 nm: długość fali dwóch fotonów ~700-750 nm) i FAD (długość fali pojedynczego fotonu ~488 nm, długość fali dwufotonowej ~890 nm).
    2. Upewnij się, że mikroskop jest wyposażony w filtr do izolacji emisji NAD(P)H (~400-500 nm).
      UWAGA: Ustawienia 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) często działają dla NAD(P)H.
    3. Upewnij się, że mikroskop jest wyposażony w filtr do izolacji emisji FAD (~500-600 nm).
      UWAGA: Ustawienia białka zielonej fluorescencji (GFP) często działają w przypadku FAZ.
  2. Przygotuj mikroskop.
    1. Włącz lampę jasnego pola. Upewnij się, że światło wpada do okularu. W razie potrzeby nałóż 1 kroplę odpowiedniego medium immersyjnego na odpowiedni obiektyw.
    2. Przesuń obiektyw w dół, aby prawidłowo umieścić próbki bez żadnych zakłóceń. Umieść szalkę Petriego na scenie prawidłowo. Upewnij się, że próbka jest bezpieczna i nie będzie się poruszać podczas obrazowania.
      UWAGA: Zaleca się umieszczenie komórek w komorze środowiskowej w celu utrzymania ciepła, wilgotności i poziomu CO2 podczas akwizycji obrazu, ponieważ parametry te mogą wpływać na metabolizm komórkowy.
    3. Wyśrodkuj preparat z obiektywem. Gdy to zrobisz, spójrz w okular i poruszaj obiektywem, aż komórki wydają się być ostre.
  3. Rozpocznij obrazowanie intensywności.
    1. Otwórz oprogramowanie do obrazowania i ustaw konfigurację wzbudzenia i emisji, aby wychwycić NAD(P)H, klikając kartę Przechwytywanie w oprogramowaniu do akwizycji obrazu i umieszczając filtr wzbudzenia i emisji NAD(P)H w wieżyczce mikroskopu.
      UWAGA: Do obrazowania NAD (P) H zastosowano filtr wzbudzenia 357/44, dichroiczny 409 długoprzepustowy i filtr emisyjny 447/60.
    2. Zoptymalizuj wzbudzenie, oświetlenie i parametry detektora. Jeśli problemem jest wybielanie, zmniejsz intensywność oświetlenia i wydłuż czas integracji obrazu.
      UWAGA: NAD(P)H jest słabym sygnałem; Należy pamiętać o wybielaniu, jeśli używana jest zbyt duża moc.
    3. Uzyskaj obraz NAD(P)H o żądanym rozmiarze obrazu. Upewnij się, że obraz został zapisany.
    4. Ustaw konfigurację wzbudzenia i emisji, aby wychwycić FAD. Zoptymalizuj oświetlenie wzbudzenia i parametry detektora.
      UWAGA: Do obrazowania FAD zastosowano filtr wzbudzenia 458/64, dichroik długoprzepustowy 495 i filtr emisyjny 550/88.
    5. Uzyskaj obraz FAD. Upewnij się, że obraz jest zapisany.
      Uwaga: Parametry akwizycji obrazu NAD(P)H i FAD (intensywność oświetlenia, rozmiar obrazu, wzmocnienie detektora) powinny pozostać takie same przez cały czas trwania eksperymentu obrazowania.
    6. Powtórz proces w dodatkowych pięciu lokalizacjach, oddalonych od zobrazowanych lokalizacji w odległości co najmniej 2 pól widzenia.
  4. Analiza danych współczynnika redoks na poziomie obrazu
    1. Otwórz obrazy intensywności NAD(P)H i FAD w programie do przetwarzania obrazu.
    2. Ustaw próg na NAD(P)H, aby zachować piksele cytoplazmy i ustaw piksele tła i jądra na 0.
    3. Oblicz obraz współczynnika redoks, obliczając równanie FAD/(NAD(P)H+FAD) dla każdego piksela przy użyciu progowego obrazu NAD(P)H.
    4. Obliczanie średniej wartości pikseli innych niż 0.
      UWAGA: Czynności te można wykonać w oprogramowaniu do analizy obrazu lub zakodować bezpośrednio za pomocą skryptów.
  5. Analiza współczynnika redoks na poziomie komórki
    1. Wykonaj kroki 4.3.1-4.3.5, aby uzyskać obraz maski komórek w każdym obrazie NAD(P)H.
    2. Oblicz obraz współczynnika redoks, obliczając równanie FAD/(NAD(P)H+FAD) dla każdego piksela.
    3. Korzystając z maski cytoplazmy komórki, uśrednij współczynnik redoks dla wszystkich pikseli dla każdej komórki na obrazie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Linia komórkowa nabłonkowego raka piersi, MCF-7, została wyhodowana w DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną. W przypadku obrazowania fluorescencyjnego komórki wysiewano w gęstości 4 × 105 komórek na 35-milimetrową miskę obrazową ze szklanym dnem 48 godzin przed obrazowaniem. Komórki zostały zobrazowane przed i po leczeniu cyjankiem przy użyciu protokołów wymienionych powyżej. Celem eksperymentu z cyjankiem jest potwierdzenie izolacji spektralnej fluorescencji NAD(P)...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intensywność autofluorescencji i obrazowanie czasu życia są szeroko stosowane do oceny metabolizmu w komórkach21,55. FLIM ma wysoką rozdzielczość, a zatem rozpuszcza pojedyncze komórki, co jest ważne w badaniach nad rakiem, ponieważ heterogeniczność komórkowa przyczynia się do agresji guza i oporności na leki 7,39,41,44,45,46,58.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródła finansowania obejmują Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP200668) oraz Texas A&M University. Rysunek 1 został stworzony za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-deoksy-d-glukoza (2-DG)SigmaAC111980000; AC111980010; AC111980050;
Antybiotyk Antybiotyk Przeciwbakteryjny (pen-strep)Próbki komórek Gibco15240096
Kolekcja kultur typu amerykańskiegoNieLinia nowotworowa MCF-7
CellProfilerBroad InstituteNie dotyczyOprogramowanie do analizy obrazu
Rurka stożkowaVWR89039-664Rurka stożkowa 15 ml
DMEMThermoFisher11965092Pożywki
hodowlane Lustro dichroiczne FAD Filtr emisjiSemrockFF495-Di03-25x36495 nm
emisji FADSemrockFF01-550/88-25550/88 nm
Filtr wzbudzenia FADSemrockFF01-458/64-25458/64 nm
FBSThermoFisher16000036
Mikroskop czasu życia fluorescencji3iN/A
Szklana podstawkaMatTek CorpP35G-1.0-14-C
Multiphoton LaserCoherentN/A2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H lustro dichroiczneSemrockFF409-Di03-25x36409 nm
Filtr emisji NAD(P)HSemrockFF02-447/60-25447/60 nm
Filtr wzbudzenia NAD(P)HSemrockFF01-357/44-25357/44 nm
PBSThermoFisher70011044
Cyjanek potasuSigma-Aldrich380970
SlideBooks 63iN/AOprogramowanie do akwizycji obrazu
SPCImageBecker & Hickl GmbHN/AOprogramowanie do analizy czasu życia fluorescencji
Stage Top InkubatorokoLabN/A
TrypsinBiosciences786-262
MocznikSigma-AldrichU5128
Koraliki YGPolysciences19096-2Mikrosfery Yg (20,0 &mikro; m)
AC111980250 dotyczy FAD Filtr

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomarkers in Medicine. 4 (2), 241-263 (2010).
  2. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using endogenous contrast to assess metabolic state. Annual Review of Biomedical Engineering. 14, 351-367 (2012).
  3. Zheng, J. Energy metabolism of cancer: Glycolysis versus oxidative phosphorylation (Review). Oncology Letters. 4 (6), 1151-1157 (2012).
  4. Potter, M., Newport, E., Morten, K. J. The Warburg effect: 80 years on. Biochemical Society Transactions. 44 (5), 1499-1505 (2016).
  5. Zhao, Y., Butler, E. B., Tan, M. Targeting cellular metabolism to improve cancer therapeutics. Cell Death and Disease. 4 (3), 532(2013).
  6. Patel, S., Ahmed, S. Emerging field of metabolomics: Big promise for cancer biomarker identification and drug discovery. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 63-74 (2015).
  7. Walsh, A. J., Cook, R. S., Skala, M. C. Functional optical imaging of primary human tumor organoids: Development of a personalized drug screen. Journal of Nuclear Medicine. 58 (9), 1367-1372 (2017).
  8. Zaal, E. A., Berkers, C. R. The influence of metabolism on drug response in cancer. Frontiers in Oncology. 8, 500(2018).
  9. Little, A. C., et al. High-content fluorescence imaging with the metabolic flux assay reveals insights into mitochondrial properties and functions. Communications Biology. 3 (1), 271(2020).
  10. Wang, X., et al. Comparison of magnetic resonance spectroscopy and positron emission tomography in detection of tumor recurrence in posttreatment of glioma: A diagnostic meta-analysis. Asia-Pacific Journal of Clinical Oncology. 11 (2), 97-105 (2015).
  11. Nabi, H. A., Zubeldia, J. M. Clinical applications of 18F-FDG in oncology. Journal of Nuclear Medicine Technology. 30 (1), 3-9 (2002).
  12. Kostakoglu, L., Agress, H., Goldsmith, S. J. Clinical role of FDG PET in evaluation of cancer patients. Radiographics. 23 (2), 315-340 (2003).
  13. Hoh, C. K. Clinical use of FDG PET. Nuclear Medicine and Biology. 34 (7), 737-742 (2007).
  14. van de Weijer, T., Schrauwen-Hinderling, V. B. Application of magnetic resonance spectroscopy in metabolic research. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1865 (4), 741-748 (2019).
  15. Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and Flavoprotein. Biophysical Journal. 82, 2811-2825 (2002).
  16. Lagarto, J. L., et al. Characterization of NAD(P)H and FAD autofluorescence signatures in a Langendorff isolated-perfused rat heart model. Biomedical Optics Express. 9 (10), 4961-4978 (2018).
  17. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2013).
  18. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 89 (4), 1271-1275 (1992).
  19. Nakashima, N., Yoshihara, K., Tanaka, F., Yagi, K. Picosecond fluorescence lifetime of the coenzyme of D-amino acid oxidase. Journal of Biological Chemistry. 255 (11), 5261-5263 (1980).
  20. Hu, L., Wang, N., Cardona, E., Walsh, A. J. Fluorescence intensity and lifetime redox ratios detect metabolic perturbations in T cells. Biomedical Optics Express. 11 (10), 5674-5688 (2020).
  21. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (7), 1-43 (2020).
  22. Liu, Z., et al. Mapping metabolic changes by noninvasive, multiparametric, high-resolution imaging using endogenous contrast. Science Advances. 4 (3), (2018).
  23. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Optical imaging using endogenous contrast to assess metabolic state. Annual Review of Biomedical Engineering. 14, 351-367 (2012).
  24. Varone, A., et al. Endogenous two-photon fluorescence imaging elucidates metabolic changes related to enhanced glycolysis and glutamine consumption in precancerous epithelial tissues. Cancer Research. 74 (11), 3067-3075 (2014).
  25. Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
  26. Sharick, J. T., et al. Protein-bound NAD(P)H lifetime is sensitive to multiple fates of glucose carbon. Scientific Reports. 8 (1), 5456(2018).
  27. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of NADH and FAD redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19494-19499 (2007).
  28. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton fluorescence lifetime imaging of protein-bound and free nicotinamide adenine dinucleotide in normal and precancerous epithelia. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024014(2007).
  29. Uchugonova, A. A., König, K. Two-photon autofluorescence and second-harmonic imaging of adult stem cells. Journal of Biomedical Optics. 13 (5), 054068(2008).
  30. Miranda-Lorenzo, I., et al. Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells. Nature Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).
  31. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nature Biomedical Engineering. 5 (1), 77-88 (2021).
  32. Heaster, T. M., Humayun, M., Yu, J., Beebe, D. J., Skala, M. C. Autofluorescence imaging of 3D tumor-macrophage microscale cultures resolves spatial and temporal dynamics of macrophage metabolism. Cancer Research. 80 (23), 5408-5423 (2020).
  33. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (12), 2676-2685 (2018).
  34. Chang, C. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
  35. Kaech, S. M., Cui, W. Transcriptional control of effector and memory CD8+ T cell differentiation. Nature Reviews. Immunology. 12 (11), 749-761 (2012).
  36. Gómez, C. A., Fu, B., Sakadžić, S., Yaseena, M. A. Cerebral metabolism in a mouse model of Alzheimer's disease characterized by two-photon fluorescence lifetime microscopy of intrinsic NADH. Neurophotonics. 5 (4), 045008(2018).
  37. Yaseen, M. A., et al. In vivo imaging of cerebral energy metabolism with two-photon fluorescence lifetime microscopy of NADH. Biomedical Optics Express. 4 (2), 307-321 (2013).
  38. Bower, A. J., et al. High-speed label-free two-photon fluorescence microscopy of metabolic transients during neuronal activity. Applied Physics Letters. 118 (8), 081104(2021).
  39. Walsh, A. J., et al. Quantitative optical imaging of primary tumor organoid metabolism predicts drug response in breast cancer. Cancer Research. 74 (18), 5184-5194 (2014).
  40. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, subtypes, and early-treatment response in breast cancer. Cancer Research. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  41. Chowdary, M. V. P., et al. Autofluorescence of breast tissues: Evaluation of discriminating algorithms for diagnosis of normal, benign, and malignant conditions. Photomedicine and Laser Surgery. 27 (2), 241-252 (2009).
  42. Demos, S. G., Bold, R., White, R. D., Ramsamooj, R. Investigation of near-infrared autofluorescence imaging for the detection of breast cancer. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 11 (4), 791-798 (2005).
  43. Heaster, T. M., Humayun, M., Yu, J., Beebe, D. J., Skala, M. C. Autofluorescence imaging of 3D tumor-macrophage microscale cultures resolves spatial and temporal dynamics of macrophage metabolism. Cancer Research. 80 (23), 5408-5423 (2020).
  44. Sharick, J. T., et al. Cellular metabolic heterogeneity in vivo is recapitulated in tumor organoids. Neoplasia. 21 (6), 615-626 (2019).
  45. Shah, A. T., Diggins, K. E., Walsh, A. J., Irish, J. M., Skala, M. C. In vivo autofluorescence imaging of tumor heterogeneity in response to treatment. Neoplasia. 17 (12), 862-870 (2015).
  46. Walsh, A. J., Skala, M. C. Optical metabolic imaging quantifies heterogeneous cell populations. Biomedical Optics Express. 6 (2), 559-573 (2015).
  47. Walsh, A. J., Skala, M. C. An automated image processing routine for segmentation of cell cytoplasms in high-resolution autofluorescence images. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XIV. , (2014).
  48. Skala, M., Ramanujam, N. Methods in Molecular Biology. 594, 155-162 (2010).
  49. Stringari, C., et al. Multicolor two-photon imaging of endogenous fluorophores in living tissues by wavelength mixing. Scientific Reports. 7, 3792(2017).
  50. SPCImage 2.9: Data analysis software for fluorescence lifetime imaging microscopy. SPCImage. , Available from: https://biology.uiowa.edu/sites/biology.uiowa.edu/files/SPCIMAGE29.pdf (2007).
  51. CellProfiler. , Available from: https://cellprofiler.org/releases (2007).
  52. Autofluorescence Imaging. GitHub. , Available from: https://github.com/walshlab/Autofluorescence-Imaging (2021).
  53. Ramey, N. A., Park, C. Y., Gehlbach, P. L., Chuck, R. S. Imaging mitochondria in living corneal endothelial cells using autofluorescence microscopy. Photochemistry and Photobiology. 83 (6), 1325-1329 (2007).
  54. Walsh, A., Cook, R. S., Rexer, B., Arteaga, C. L., Skala, M. C. Optical imaging of metabolism in HER2 overexpressing breast cancer cells. Biomedical Optics Express. 3 (1), 75-85 (2012).
  55. Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxidants & Redox Signaling. 30, 875-889 (2019).
  56. Bird, D. K., et al. Metabolic mapping of MCF10A human breast cells via multiphoton fluorescence lifetime imaging of the coenzyme NADH. Cancer Research. 65, 8766-8773 (2005).
  57. Walsh, A. J., et al. Optical metabolic imaging identifies glycolytic levels, subtypes, and early-treatment response in breast cancer. Cancer Research. 73 (20), 6164-6174 (2013).
  58. Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical imaging of drug-induced metabolism changes in murine and human pancreatic cancer organoids reveals heterogeneous drug response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
  59. Gubser, P. M., et al. Rapid effector function of memory CD8+ T cells requires an immediate-early glycolytic switch. Nature Immunology. 14 (10), 1064-1072 (2013).
  60. Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Review. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
  61. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology: Series A. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  62. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-protocol. 8 (10), 2850(2018).
  63. Becker, W. The bh TCSPC Handbook. , Available from: https://www.becker-hickl.com/wp-content/uploads/2021/10/SPC-handbook-9ed-05a.pdf (2021).
  64. Gadella, T. W. J. Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. Mason, W. T. 34, Ch. 34 467-479 (1999).
  65. Miller, D. R., Jarrett, J. W., Hassan, A. M., Dunna, A. K. Deep tissue iImaging with multiphoton fluorescence microscopy. Current Opinion in Biomedical Engineering. 4, 32-39 (2017).
  66. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chemical Reviews. 110 (5), 2641-2684 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie czasu ycia fluorescencjiobrazowanie NADPHobrazowanie FADmikroskopia wielofotonowaoptyczny stosunek redokszaburzenie metaboliczneobrazowanie ywych kom rektraktowanie cyjankiem

Powiązane artykuły