Method Article

Wydajna i ekonomiczna metoda elektroporacji do badania pierwotnych szlaków sygnałowych zależnych od rzęsek w prekursorze komórek ziarnistych

DOI:

10.3791/63283

⸱

November 30th, 2021

 ,  , 
1Department of Chemistry, Faculty of Science, Hong Kong Baptist University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy powtarzalny protokół elektroporacji in vitro do manipulacji genetycznej pierwotnych prekursorów komórek ziarnistych móżdżku (GCP), który jest opłacalny, wydajny i opłacalny. Co więcej, protokół ten demonstruje również prostą metodę badania molekularnego pierwotnych szlaków sygnałowych Hedgehog zależnych od rzęsek w pierwotnych komórkach GCP.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rzęska pierwotna jest krytycznym organellem sygnałowym, znajdującym się na prawie każdej komórce, która przekazuje bodźce sygnalizacyjne Hedgehog (Hh) z powierzchni komórki. W prekursorze komórek ziarnistych (GCP) rzęska pierwotna działa jako kluczowe centrum sygnalizacyjne, które koordynuje proliferację komórek prekursorowych poprzez modulację szlaku sygnałowego Hh. Badanie pierwotnej maszynerii sygnalizacyjnej Hh zależnej od rzęsek jest ułatwione dzięki manipulacji genetycznej in vitro składników szlaku w celu wizualizacji ich dynamicznej lokalizacji w rzęsce pierwotnej. Jednak transfekcja transgenów w pierwotnych kulturach GCP przy użyciu obecnie znanych metod elektroporacji jest na ogół kosztowna i często prowadzi do niskiej żywotności komórek i niepożądanej wydajności transfekcji. W tym artykule przedstawiono wydajny, ekonomiczny i prosty protokół elektroporacji, który wykazuje wysoką wydajność transfekcji wynoszącą ~80-90% i optymalną żywotność ogniw. Jest to prosta, powtarzalna i wydajna metoda modyfikacji genetycznej, która ma zastosowanie do badania pierwotnego szlaku sygnałowego Hedgehog zależnego od rzęsek w pierwotnych kulturach GCP.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mózgowe GCP są szeroko stosowane do badania maszynerii szlaku sygnałowego Hh w neuronalnych typach komórek progenitorowych, ze względu na ich dużą obfitość i wysoką wrażliwość na szlak sygnałowy Hh in vivo1,2,3,4. W GCP rzęska pierwotna działa jako kluczowy koncentrator transdukcji sygnału Hh5, który koordynuje proliferację komórek prekursorowych6,7,8. Wizualizacja in vitro składników sygnalizacyjnych Hh na ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury związane ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi postępowania ze zwierzętami i protokołem zatwierdzonym przez Departament Zdrowia Hongkongu. Licencje na eksperymenty na zwierzętach zgodnie z rozporządzeniem o kontroli eksperymentów na zwierzętach (rozdział 340) zostały uzyskane od Departamentu Zdrowia rządu Hongkongu. Praca na zwierzętach została przeprowadzona zgodnie z etyką bezpieczeństwa zwierząt zatwierdzoną przez Biuro Badawcze HKBU i Komitet ds. Bezpieczeństwa Laboratoryjnego. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Używając Opti-MEM (patrz Tabela Materiałów) jako uniwersalnego odczynnika, ta proponowana metodologia elektroporacji mogłaby osiągnąć niezmiennie wysoką wydajność elektroporacji na poziomie ~80-90% (Rysunek 1). Wydajność elektroporacji wektora Smo-EGFP określono w DIV 2 po elektroporacji poprzez ilościowe określenie procentu komórek dodatnich pod kątem zielonej fluorescencji we wszystkich sparowanych komórkach GCP wykazujących ekspresję białka pudełkowego-6 (Pax6). Wydajność elektropo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfekcja transgenów w pierwotnej hodowli GCP metodą elektroporacji zwykle wiąże się z niską żywotnością komórek i słabą wydajnością transfekcji 9,10. W artykule przedstawiono ekonomiczny i powtarzalny protokół elektroporacji, który wykazał wysoką wydajność i żywotność. Ponadto demonstrujemy również prostą metodę badania pierwotnego szlaku sygnałowego Hh zależnego od rzęsek w pierwotnych komórkach GCP.

Inne popularne metody elektropo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez HKBU Seed Fund and Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) dla C.H.H. Hor.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GCP Culture
B27 suplementLife Technologies LTD17504044
Sitko komórkowe, 70 &mikro; mCorning352350
DNaza I z trzustki bydlęcejRoche11284932001
Earle' s Zrównoważony roztwór soliGibco, Life Technologies14155063
FBS, wykwalifikowanyThermo ScientificSH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100xGibco, Life Technologies35050061substytut L-glutaminy
L-cysteinaSigma AldrichC7352
MatrigelBD Biosciences354277Macierz błony podstawnej
NeurobasalGibco, Life Technologies21103049
Papaina, zawiesinaWorthington Biochemical CorporationLS003126
Bromowodorek poli-D-lizynySigma AldrichP6407
SAGCayman Chemical11914-1Wygładzony agonista
IF barwienie
Surowica bydlęca AlbuminaSigma AldrichA7906
ParaformaldehydSigma AldrichP6148
Triton X-100Sigma AldrichX100
Pierwotna mieszanka przeciwciałAnty-GFP-koza
abRockland600-101-215Współczynnik rozcieńczenia: 1 : 1000
Mysz monoklonalna ab anty-Arl13bNeuroMab75-287Współczynnik rozcieńczenia: 1: 1000
Poliklonalny ab królika anty-Pax6CovancePRB-278P: 1: 1000
Mieszanka przeciwciał drugorzędowych
Alexa Fluor 488 osła anty-koza IgGInvitrogenA-11055Współczynnik rozcieńczenia: 1: 1000
Alexa Fluor 555 osioł anty-mysz IgGInvitrogenA-31570Współczynnik rozcieńczenia: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 osioł anty-królik IgGInvitrogenA-31573Współczynnik rozcieńczenia: 1 : 1000
DAPIThermo Scientific62247Współczynnik rozcieńczenia: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 komora kuwetowaNepageneCU500
Kuweta do elektroporacji EPA (odstęp 2 mm)NepageneEC-002
Opti-MEMLife Technologies LTD31985070pożywka o obniżonej surowicy do transfekcji
pEGFP-mSmoAddgene25395
Super Electroporator NEPA21 TYP II Elektroporacja In Vitro i In VivoElektroporacjaNepageneNEPA21
Współczynnik rozcieńczenia

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
  2. Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Primary CiliumElectroporation MethodGranule Cell PrecursorHedgehog SignalingGenetic ModificationIn Vitro TransfectionCell ViabilityCilium Marker Arl13bSmoothened EGFP LocalizationPax6 Expression

Related Articles