Method Article

Wydajna i ekonomiczna metoda elektroporacji do badania pierwotnych szlaków sygnałowych zależnych od rzęsek w prekursorze komórek ziarnistych

DOI:

10.3791/63283

⸱

November 30th, 2021

 ,  , 
1Department of Chemistry, Faculty of Science, Hong Kong Baptist University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy powtarzalny protokół elektroporacji in vitro do manipulacji genetycznej pierwotnych prekursorów komórek ziarnistych móżdżku (GCP), który jest opłacalny, wydajny i opłacalny. Co więcej, protokół ten demonstruje również prostą metodę badania molekularnego pierwotnych szlaków sygnałowych Hedgehog zależnych od rzęsek w pierwotnych komórkach GCP.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rzęska pierwotna jest krytycznym organellem sygnałowym, znajdującym się na prawie każdej komórce, która przekazuje bodźce sygnalizacyjne Hedgehog (Hh) z powierzchni komórki. W prekursorze komórek ziarnistych (GCP) rzęska pierwotna działa jako kluczowe centrum sygnalizacyjne, które koordynuje proliferację komórek prekursorowych poprzez modulację szlaku sygnałowego Hh. Badanie pierwotnej maszynerii sygnalizacyjnej Hh zależnej od rzęsek jest ułatwione dzięki manipulacji genetycznej in vitro składników szlaku w celu wizualizacji ich dynamicznej lokalizacji w rzęsce pierwotnej. Jednak transfekcja transgenów w pierwotnych kulturach GCP przy użyciu obecnie znanych metod elektroporacji jest na ogół kosztowna i często prowadzi do niskiej żywotności komórek i niepożądanej wydajności transfekcji. W tym artykule przedstawiono wydajny, ekonomiczny i prosty protokół elektroporacji, który wykazuje wysoką wydajność transfekcji wynoszącą ~80-90% i optymalną żywotność ogniw. Jest to prosta, powtarzalna i wydajna metoda modyfikacji genetycznej, która ma zastosowanie do badania pierwotnego szlaku sygnałowego Hedgehog zależnego od rzęsek w pierwotnych kulturach GCP.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mózgowe GCP są szeroko stosowane do badania maszynerii szlaku sygnałowego Hh w neuronalnych typach komórek progenitorowych, ze względu na ich dużą obfitość i wysoką wrażliwość na szlak sygnałowy Hh in vivo1,2,3,4. W GCP rzęska pierwotna działa jako kluczowy koncentrator transdukcji sygnału Hh5, który koordynuje proliferację komórek prekursorowych6,7,8. Wizualizacja in vitro składników sygnalizacyjnych Hh na rzęsce pierwotnej jest często trudna ze względu na ich niski endogenny poziom podstawowy. W związku z tym transgenowa modyfikacja poziomów ekspresji białek i znakowanie fluoroforem genu będącego przedmiotem zainteresowania są użytecznymi podejściami do badania szlaku w rozdzielczości molekularnej. Jednak manipulacje genetyczne kultur pierwotnych GCP przy użyciu metod transfekcji opartych na liposomach często skutkują niską wydajnością transfekcji, utrudniając dalsze badania molekularne9. Elektroporacja zwiększa wydajność, ale zwykle wymaga wygórowanych odczynników do elektroporacji specyficznych dla dostawcy i typu ogniwa10.

Ten artykuł przedstawia wysoce efektywną i opłacalną metodę elektroporacji do manipulowania składnikami szlaku sygnałowego Hh w kulturach pierwotnych GCP. Korzystając z tego zmodyfikowanego protokołu elektroporacji, wygładzony transgen (pEGFP-Smo) znakowany zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) został skutecznie dostarczony do GCP i osiągnął wysokie wskaźniki przeżycia i transfekcji komórek (80-90%). Ponadto, jak wykazano w barwieniu immunocytochemicznym, transfekowane GCP wykazywały wysoką wrażliwość na wygładzoną przez agonistę aktywację szlaku sygnałowego Hh poprzez transport EGFP-Smo do rzęsek pierwotnych. Protokół ten ma bezpośrednie zastosowanie i jest korzystny dla doświadczeń, które obejmują modyfikację genetyczną in vitro typów komórek, które są trudne do transfekcji, takich jak hodowle komórek pierwotnych u ludzi i gryzoni, a także indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury związane ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi postępowania ze zwierzętami i protokołem zatwierdzonym przez Departament Zdrowia Hongkongu. Licencje na eksperymenty na zwierzętach zgodnie z rozporządzeniem o kontroli eksperymentów na zwierzętach (rozdział 340) zostały uzyskane od Departamentu Zdrowia rządu Hongkongu. Praca na zwierzętach została przeprowadzona zgodnie z etyką bezpieczeństwa zwierząt zatwierdzoną przez Biuro Badawcze HKBU i Komitet ds. Bezpieczeństwa Laboratoryjnego. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie do eksperymentu

  1. Przygotowanie pożywek hodowlanych i
    1. Podłoże bez surowicy (SFM)
      1. Aby przygotować 50 ml SFM, dodaj 500 μl 100x substytut L-glutaminy, 500 μl penicyliny-streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu i 12,5 μl 1 M KCl (końcowe 250 μM) do 49 ml podłoża neuropodstawnego.
      2. Podzielić SFM na 2 porcje po 10 ml i 40 ml w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać je w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
    2. Podłoże blokujące trawienie: 10% FBS w SFM
      1. Dodać 1,1 ml inaktywowanego termicznie FBS do 10 ml podwielokrotności SFM, aby przygotować pożywkę blokującą trawienie.
    3. Pożywka hodowlana GCP: SFM z B27
      1. Aby przygotować pożywkę hodowlaną GCP, dodaj 800 μl bezsurowicowego suplementu B-27 do 40 ml porcji SFM.
        UWAGA: Zduszoną powierzchnię zmarzniętą z dodatkiem B-27 można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca. Jednak świeżo przygotowane podłoża dają optymalne wyniki.
    4. Bufor preparacyjny: EBSS z glukozą + HEPES
      1. Dodać 6 g/l glukozy do wolnego od wapnia i magnezu roztworu soli Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) zawierającego 10 mM kwasu HEPES (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego).
      2. Wysterylizować roztwór, przepuszczając go przez filtr strzykawkowy 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C do długotrwałego przechowywania.
    5. Bufor do wytrawiania
      UWAGA: Przygotuj świeżo przed użyciem.
      1. Przygotuj 2 ml buforu trawiącego do trawienia 2-4 tkanek móżdżku i 4 ml na 4-10 tkanek. Aby przygotować 4 ml buforu wytrawiającego, rozpuść 1,5 mg L-cysteiny (końcowe stężenie 200-400 μg/ml) w 4 ml EBSS. Kilkakrotnie odwracać probówkę, aż proszek całkowicie się rozpuści.
      2. Wysterylizuj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm i strzykawki o pojemności 5 ml, a następnie przenieś roztwór do sterylnego naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm.
      3. Dodać 4 μl papainy (rozcieńczenie 1:1 000 z stężenia podstawowego 20 jednostek/mg) i 40 μl DNazy I (rozcieńczenie 1:100 z podstawówki 10 mg/ml do końcowego stężenia 0,1 mg/ml).
      4. Roztwór inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przez co najmniej 30 minut lub do momentu użycia.
        UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla aktywacji papainy. Aby uzyskać optymalne rezultaty, nie należy przekraczać 45 minut w temperaturze 37 °C przed użyciem. Przed użyciem upewnij się, że roztwór staje się przezroczysty i nie ma białych osadów.
  2. Wstępne powlekanie szkiełek nakrywkowych
    1. W celu przygotowania szkiełek nakrywkowych do przyłączenia do komórek, inkubować szkiełka nakrywkowe ze szkła o średnicy 12 mm w autoklawie ze 100 μg/ml poli-D-lizyny (PDL, 1 mg/ml w sterylnym dH2O) przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w tym samym roztworze PDL w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
    2. W dniu pierwotnej hodowli komórkowej zebrać PDL do czystej stożkowej probówki i dokładnie przepłukać szkiełka nakrywkowe trzykrotnie sterylnymdH2O, aby usunąć resztki PDL.
      UWAGA: PDL może być przechowywany w temperaturze 4 °C do ponownego użycia.
    3. Przenieść szkiełka nakrywkowe pokryte PDL na płytkę 24-dołkową, umieszczając po jednym szkiełku nakrywkowym w każdym dołku.
    4. Usuń nadmiar wody i dodaj 200-300 μl Matrigel (rozpuszczonego zgodnie z instrukcją w karcie katalogowej produktu w DMEM-F12 bez surowicy), aby całkowicie pokryć szkiełka nakrywkowe.
    5. Inkubować szkiełka nakrywkowe w Matrigel przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .
      UWAGA: Usuń Matrigel przed wysiewem komórek. Ten Matrigel może być zbierany i przechowywany w temperaturze 4 °C w celu wielokrotnego użycia.
  3. Przygotowanie naczynia do hodowli wstępnej
    1. Pokryć naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm 2 ml 100 μg/ml PDL (rozpuść 1 mg/ml roztwór podstawowy PDL w sterylnym dH2O) przez inkubację w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    2. Bezpośrednio przed wysiewem komórek należy usunąć i zebrać zużyty PDL w czystej stożkowej probówce i przechowywać w temperaturze 4 °C do wielokrotnego użycia. Opłukać i umyć naczynie pokryte PDL trzykrotnie sterylnymdH2O. Naczynie do hodowli wysuszyć na powietrzu przed wysiewem komórek.
    3. Użyj jednej płytki do hodowli komórkowej o średnicy 60 mm do wysiewu komórek zebranych z maksymalnie 2 całych tkanek móżdżku.
    4. Przygotuj dodatkowe naczynia hodowlane dla dodatkowych móżdżków.
      UWAGA: Patrz kroki 2.1.18 i 2.1.19, aby zapoznać się z użyciem naczynia do hodowli wstępnej.

2. Dzień eksperymentalny 0

  1. Izolacja i hodowla pierwotnych GCP myszy
    UWAGA: Metoda hodowli GCP została zmodyfikowana w stosunku do standardowego protokołu, a krótki protokół został pokrótce opisany w naszej poprzedniej pracy6,11,12. Aby uzyskać optymalną wydajność GCP, do izolacji GCP należy użyć szczeniąt po urodzeniu (P) w dniu 6 lub P7. Wykonaj następujące kroki sekcji 2.1.6-2.1.10 tak szybko, jak to możliwe, aby zapewnić optymalną żywotność komórek.
    1. Wstępnie podgrzej SFM, pożywkę blokującą trawienie, pożywkę hodowlaną i Opti-MEM w temperaturze 37 °C podczas preparacji.
    2. Na czystej ławce namocz wszystkie aparaty do preparowania w 70% etanolu w celu dezynfekcji.
    3. Napełnij naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm 2-3 ml buforu do rozwarstwiania i schłodzić je na lodzie.
    4. Przygotować świeży bufor do wytrawiania zgodnie z opisem w ppkt 1.1.5 i utrzymywać go w cieple w temperaturze 37 °C.
    5. Użyj 70% etanolu do wytarcia głowy szczeniaka w celu dezynfekcji.
    6. Odetnij głowę szczeniakowi bez znieczulenia. Użyj kleszczy do przytrzymania głowy i wysterylizowanych nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć tył czaszki, aby odciąć głowę szczeniakowi. Ostrożnie usuń skórę i czaszkę, aby odsłonić mózg za pomocą kleszczy.
    7. Za pomocą kleszczy uszczypnij móżdżek i szybko zanurz go we wstępnie schłodzonym buforze preparacyjnym przygotowanym w kroku 2.1.3.
    8. Usuń opony mózgowe z móżdżkiem zanurzonym w buforze preparacyjnym pod mikroskopem preparacyjnym. Opony mózgowe wzbogacone naczyniami krwionośnymi powinny wydawać się różowawe pod mikroskopem preparacyjnym.
    9. Usuń wszystkie opony mózgowe za pomocą kleszczy.
      UWAGA: Móżdżek bez opon mózgowych powinien mieć białawy wygląd.
    10. Usuń wszelkie widoczne tkanki śródmózgowia i splot naczyniówkowy z móżdżku.
    11. Przenieść móżdżek do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm wstępnie napełnionego ciepłym buforem do wytrawiania przygotowanym w kroku 2.1.4. Unikać przenoszenia nadmiaru buforu rozwarstwiającego. Pokrój móżdżek na drobne kawałki za pomocą nożyczek z mikrosprężynami tak szybko, jak to możliwe.
    12. Natychmiast inkubować rozdrobniony móżdżek w temperaturze 37 °C przez 15 minut w inkubatorze z użyciem CO2 . Wydłuż czas inkubacji do 20 minut, jeśli mają być przetworzone więcej niż 4 móżdżki.
      UWAGA: Po inkubacji tkanka zlepia się ze sobą.
    13. Natychmiast przenieś strawioną tkankę na dno nowej sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą końcówki pipety P1000 wstępnie zwilżonej pożywką blokującą trawienie (unikać przenoszenia buforu do wytrawiania).
    14. Dodać odpowiednią objętość pożywki blokującej trawienie (1 ml na 1 móżdżek), aby zakończyć trawienie i delikatnie pipetować w górę i w dół 30 razy za pomocą mikropipety P1000, aby dalej dysocjować tkankę do zawiesiny jednokomórkowej. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.
    15. Delikatnie przepuść zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 70 μm do nowej sterylnej probówki wirówkowej, aby usunąć grudki komórek.
    16. Przepuść dodatkowy 1 ml świeżej pożywki blokującej trawienie przez sitko komórkowe, aby zebrać resztki komórek z sitka komórkowego.
    17. Odwirować filtrat o stężeniu 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z 1 ml SFM. Powtórz ten krok dwukrotnie. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.
    18. Zawiesić osad w końcowej objętości 2 ml pożywki hodowlanej GCP i przenieść zawiesinę komórek do naczynia do hodowli wstępnie posiewnej o średnicy 60 mm, pokrytego PDL, przygotowanego w kroku 1.3. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 .
      UWAGA: Nie przekraczaj 20 min.
    19. Po inkubacji postukaj w naczynie hodowlane z boku, aby usunąć luźno przylegające komórki GCP. Zebrać przylegające komórki GCP w pożywce hodowlanej, delikatnie pipetując za pomocą pipety P1000. Zebrać tę zawiesinę GCP do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wyrzuć naczynie 60 mm.
      UWAGA: Silnie przylegające komórki astrogleju i fibroblastów pozostaną przyczepione na dnie czaszy o średnicy 60 mm i zostaną oddzielone na tym etapie. Pominięcie tego kroku zagrozi czystości kultury GCP.
    20. Policz ogniwa i natychmiast przystąp do elektroporacji.
  2. Dzień in vitro (DIV) 0: Elektroporacja nadekspresji transgenu receptora Hh: pEGFP-Smo
    1. Do elektroporacji przy użyciu kuwety o odstępie 2 mm należy przygotować następującą mieszaninę elektroporacji plazmid-ogniwo dla każdej reakcji elektroporacji: 1,2 × 106 komórek i 10 μg pEGFP-mSmo (dostosować stężenie podstawowe DNA do ~2-5 μg/μL w buforze Tris-EDTA lub sterylnym dH2O) w 100 μL Opti-MEM.
      UWAGA: Zmniejsz całkowitą liczbę ogniw, jeśli ogniwa są niewystarczające (chociaż może to zmniejszyć wydajność elektroporacji). Nie należy jednak dostosowywać ilości plazmidu ani całkowitej objętości Opti-MEM użytego na kuwetę. Jeśli całkowita liczba komórek wymaganych w eksperymencie przekracza 1,5 ×10 6 komórek, należy odpowiednio zwiększyć ilość mieszaniny do elektroporacji i przeprowadzić oddzielnie wiele reakcji elektroporacji. Kuweta może być ponownie użyta do 5 razy.
    2. Przygotować płytkę wysiewającą po elektroporacji, dodając 0,5 ml pożywki hodowlanej do każdego dołka 24-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej powlekane szkiełka nakrywkowe (od kroku 1.2) i utrzymywać ją w cieple w temperaturze 37 °C w inkubatorzeCO2
      3. .
    3. Począwszy od kroku 2.1.20, odpipetować wymaganą liczbę komórek do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować z prędkością 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 200 μl Opti-MEM. Powtórz ten krok dwukrotnie z Opti-MEM, aby upewnić się, że w probówce
      nie ma pozostałości pożywki hodowlanej. UWAGA: Dla każdego dołka/szkiełka nakrywkowego na płytce 24-dołkowej, elektroporować i wysiać 1,2-1,3 × 106 komórek/studzienkę, aby uzyskać ~70-75% konfluencji komórek w następnym dniu hodowli.
    4. Ustaw parametry elektroporacji, jak pokazano w Tabeli 1.
    5. Delikatnie odpipetować reakcję elektroporacji, aby dobrze wymieszać i użyć długiej końcówki P200, aby przenieść dokładną objętość 100 μl mieszaniny do kuwety o szczelinie 2 mm. Unikaj tworzenia się bąbelków.
    6. Umieść kuwetę w komorze kuwety.
    7. Naciśnij przycisk Ω elektroporatora (patrz Tabela Materiałów) i zanotuj wartość impedancji, która powinna wynosić ~30-35. Aby upewnić się, że wartość impedancji elektrycznej Ω mieści się w zakresie 30-35, należy przestrzegać dokładnej objętości 100 μl.
    8. Naciśnij przycisk start, aby zainicjować impuls.
    9. Zapisz wartości mierzonego prądu i dżuli pokazane na ramce odczytu.
    10. Wyjmij kuwetę z komory kuwety.
    11. Natychmiast dodać 100 μl podgrzanej pożywki hodowlanej do kuwety i ponownie zawiesić, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy. Natychmiast przenieść zawiesinę komórek na płytkę 24-dołkową przygotowaną w kroku 2.2.2.
      UWAGA: Aby zminimalizować śmierć komórki, zasiej komórki natychmiast po elektroporacji.
    12. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 . Pozostaw komórki w spokoju przez 3 godziny, aby uniknąć oderwania komórek.
    13. Po 3 godzinach od wysiewu delikatnie odessać i wyrzucić połowę pożywki sklarowanej nad osadem, aby usunąć pływające martwe komórki i zanieczyszczenia, a następnie zastąpić taką samą ilością wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej.
    14. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 i uzupełniać połowę pożywki co drugi dzień.
    15. Obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym następnego dnia, tj. DIV1 (Rysunek 1) pod kątem sygnału GFP, aby określić skuteczność nadekspresji Smo.
    16. W celu stymulacji szlaku sygnałowego Hh na DIV 1 po uzupełnieniu połowy pożywki, dodaj 0,2 μM wygładzonego agonisty (SAG) do komórek, dodając równą objętość DMSO do kontroli. Inkubować przez 24 godziny przed utrwaleniem komórek.
      UWAGA: Utrzymuj głośność dodawanego DMSO/SAG na jak najniższym poziomie. W tym przypadku dodano 0,5 μl DMSO lub 0,5 μl 0,2 mM SAG na 500 μl pożywki na studzienkę, co daje stosunek rozcieńczenia 1:1,000.

3. DIV 2: Wizualizacja rzęsek pierwotnych i badanie szlaku sygnałowego Hh

  1. Utrwalanie komórek
    1. Po 24 godzinach od poddania działaniu należy usunąć pożywkę hodowlaną i przepłukać komórki 2-3 razy roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą jednorazowej pipety Pasteura, unikając usuwania komórek.
    2. Utrwal komórki, dodając ~400 μl 4% paraformaldehydu (przygotowanego w PBS) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    3. Spłukać i przemyć 2-3 razy PBS za pomocą jednorazowej pipety Pasteura.
    4. Przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy lub przystąpić do barwienia immunologicznego.
  2. Barwienie immunocytochemiczne GCP i pierwszorzędowego markera rzęskowego
    1. Na 24-dołkowej płytce umyj komórki dwukrotnie w PBS, za każdym razem delikatnie wstrząsając przez 5 minut.
    2. Dodać 0,5 ml 100 mM chlorku amonu do komórki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w celu utrwalenia.
    3. Spłucz raz i umyj 2-3 razy PBS, delikatnie potrząsając przez 10 minut za każdym razem.
    4. Delikatnie nanieść pipetą 30 μl buforu blokującego (BB: 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 2% inaktywowana termicznie surowica końska w PBS) na kawałek parafilmu, aby utworzyć kropelkę bez pęcherzyków powietrza.
    5. Delikatnie przenieś szkiełko nakrywkowe ze studzienki na kroplę BB stroną z ziarnami komórek skierowaną w dół. Inkubować komórki z BB w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    6. Przygotować pierwszorzędową mieszaninę przeciwciał w BB, jak pokazano w Tabeli Materiałów. Aby zbadać komórki za pomocą przeciwciała pierwszorzędowego, powtórz kroki 3.2.4 i 3.2.5, zastępując BB mieszanką przeciwciał pierwszorzędowych. Inkubować komórki z pierwszorzędowym przeciwciałem przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    7. Za pomocą kleszczy przenieś szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytkę 24-dołkową stroną z nasionami komórek skierowaną do góry. Opłucz komórki raz i umyj 3-4 razy w PBS, delikatnie potrząsając przez 10 minut za każdym razem.
    8. Przygotować drugorzędową mieszaninę przeciwciał w BB, jak pokazano w tabeli materiałów. Aby inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym, powtórz kroki 3.2.4 i 3.2.5, zastępując BB mieszanką przeciwciał drugorzędowych. Inkubować w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    9. Powtórzyć krok 3.2.7 dla powtórnego przemywania przeciwciałami po wtórnym zakażeniu.
    10. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na czystym mikroskopijnym szkiełku podstawowym za pomocą medium montażowego.
    11. Wysusz szkiełko na powietrzu w ciemności przez noc i przystąp do obrazowania konfokalnego13.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Używając Opti-MEM (patrz Tabela Materiałów) jako uniwersalnego odczynnika, ta proponowana metodologia elektroporacji mogłaby osiągnąć niezmiennie wysoką wydajność elektroporacji na poziomie ~80-90% (Rysunek 1). Wydajność elektroporacji wektora Smo-EGFP określono w DIV 2 po elektroporacji poprzez ilościowe określenie procentu komórek dodatnich pod kątem zielonej fluorescencji we wszystkich sparowanych komórkach GCP wykazujących ekspresję białka pudełkowego-6 (Pax6). Wydajność elektropo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfekcja transgenów w pierwotnej hodowli GCP metodą elektroporacji zwykle wiąże się z niską żywotnością komórek i słabą wydajnością transfekcji 9,10. W artykule przedstawiono ekonomiczny i powtarzalny protokół elektroporacji, który wykazał wysoką wydajność i żywotność. Ponadto demonstrujemy również prostą metodę badania pierwotnego szlaku sygnałowego Hh zależnego od rzęsek w pierwotnych komórkach GCP.

Inne popularne metody elektropo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez HKBU Seed Fund and Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) dla C.H.H. Hor.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GCP Culture
B27 suplementLife Technologies LTD17504044
Sitko komórkowe, 70 &mikro; mCorning352350
DNaza I z trzustki bydlęcejRoche11284932001
Earle' s Zrównoważony roztwór soliGibco, Life Technologies14155063
FBS, wykwalifikowanyThermo ScientificSH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100xGibco, Life Technologies35050061substytut L-glutaminy
L-cysteinaSigma AldrichC7352
MatrigelBD Biosciences354277Macierz błony podstawnej
NeurobasalGibco, Life Technologies21103049
Papaina, zawiesinaWorthington Biochemical CorporationLS003126
Bromowodorek poli-D-lizynySigma AldrichP6407
SAGCayman Chemical11914-1Wygładzony agonista
IF barwienie
Surowica bydlęca AlbuminaSigma AldrichA7906
ParaformaldehydSigma AldrichP6148
Triton X-100Sigma AldrichX100
Pierwotna mieszanka przeciwciałAnty-GFP-koza
abRockland600-101-215Współczynnik rozcieńczenia: 1 : 1000
Mysz monoklonalna ab anty-Arl13bNeuroMab75-287Współczynnik rozcieńczenia: 1: 1000
Poliklonalny ab królika anty-Pax6CovancePRB-278P: 1: 1000
Mieszanka przeciwciał drugorzędowych
Alexa Fluor 488 osła anty-koza IgGInvitrogenA-11055Współczynnik rozcieńczenia: 1: 1000
Alexa Fluor 555 osioł anty-mysz IgGInvitrogenA-31570Współczynnik rozcieńczenia: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 osioł anty-królik IgGInvitrogenA-31573Współczynnik rozcieńczenia: 1 : 1000
DAPIThermo Scientific62247Współczynnik rozcieńczenia: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 komora kuwetowaNepageneCU500
Kuweta do elektroporacji EPA (odstęp 2 mm)NepageneEC-002
Opti-MEMLife Technologies LTD31985070pożywka o obniżonej surowicy do transfekcji
pEGFP-mSmoAddgene25395
Super Electroporator NEPA21 TYP II Elektroporacja In Vitro i In VivoElektroporacjaNepageneNEPA21
Współczynnik rozcieńczenia

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
  2. Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
  3. Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).
  4. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
  5. Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175(2017).
  6. Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
  7. Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
  8. Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Developmental Biology. 317 (1), 246-259 (2008).
  9. Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564(2018).
  10. Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99(2017).
  11. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990(2009).
  12. Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
  13. Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , Springer. New York, NY. 235-247 (2014).
  14. Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Primary CiliumElectroporation MethodGranule Cell PrecursorHedgehog SignalingGenetic ModificationIn Vitro TransfectionCell ViabilityCilium Marker Arl13bSmoothened EGFP LocalizationPax6 Expression

Related Articles