Artykuł metodologiczny

Czasoprzestrzenna subkomórkowa manipulacja cytoszkieletu mikrotubul w żywym zarodku myszy przed implantacją za pomocą fotostatyn

DOI:

10.3791/63290

⸱

30 listopada 2021

 ,  ,  ,  , 
1Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University, 2School of BioSciences, The University of Melbourne

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Typowe inhibitory mikrotubul, szeroko stosowane w badaniach podstawowych i stosowanych, mają dalekosiężny wpływ na komórki. Ostatnio fotostatyny pojawiły się jako klasa fotoprzełączalnych inhibitorów mikrotubul, zdolnych do natychmiastowej, odwracalnej, czasoprzestrzennie precyzyjnej manipulacji mikrotubulami. Ten protokół krok po kroku szczegółowo opisuje zastosowanie fotostatyn w żywym zarodku myszy preimplantacyjnej 3D.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytoszkielet mikrotubul tworzy szkielet komórki i ma fundamentalne znaczenie dla transportu wewnątrzkomórkowego, podziału komórki i transdukcji sygnału. Tradycyjne farmakologiczne zakłócenie wszechobecnej sieci mikrotubul za pomocą np. nokodazolu może mieć katastrofalne konsekwencje dla każdej komórki. Odwracalnie fotoprzełączalne inhibitory mikrotubul mają potencjał, aby przezwyciężyć ograniczenia, umożliwiając realizację efektów działania leków w sposób kontrolowany czasowo. Jedną z takich rodzin leków są fotostatyny na bazie azobenzenu (PST). Związki te są nieaktywne w ciemnych warunkach, a po naświetleniu światłem UV wiążą się z miejscem wiązania kolchicyny β-tubuliny i blokują polimeryzację mikrotubul oraz dynamiczny obrót. W tym przypadku zastosowanie PST w trójwymiarowym (3D) żywym zarodku myszy preimplantacyjnej ma na celu zakłócenie sieci mikrotubul na poziomie subkomórkowym. Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące konfiguracji eksperymentalnej, a także parametry aktywacji i dezaktywacji światła dla PST przy użyciu mikroskopii konfokalnej z żywymi komórkami. Zapewnia to powtarzalność i umożliwia innym zastosowanie tej procedury do swoich pytań badawczych. Innowacyjne fotoprzełączniki, takie jak PST, mogą ewoluować jako potężne narzędzia do pogłębiania wiedzy na temat dynamicznej wewnątrzkomórkowej sieci mikrotubul i nieinwazyjnego manipulowania cytoszkieletem w czasie rzeczywistym. Ponadto PST mogą okazać się przydatne w innych strukturach 3D, takich jak organoidy, blastoidy lub zarodki innych gatunków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Architektura mikrotubul różni się znacznie w zależności od typu komórek, aby wspierać różne funkcje1,2. Jego dynamiczna natura wzrostu i kurczenia się pozwala na szybką adaptację do sygnałów zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych oraz reagowanie na stale zmieniające się potrzeby komórki. W związku z tym można go uznać za "morfologiczny odcisk palca" odgrywający kluczową rolę w tożsamości komórkowej.

Farmakologiczne celowanie w cytoszkielet mikrotubul za pomocą inhibitorów małych cząsteczek doprowadziło do mnóstwa fundamentalnych odkryć w biologii rozwojowej, biologii komórek macierzystych, biologii nowotworów i neurobiologii3,4,5,6,7. Podejście to, choć niezbędne, wiąże się z różnymi ograniczeniami, takimi jak toksyczność i skutki niezamierzone. Na przykład jeden z najczęściej stosowanych środków ukierunkowanych na mikrotubule, nokodazol, jest silnym lekiem depolimeryzującym mikrotubule8. Jednak inhibitory małocząsteczkowe, takie jak nokodazol, są aktywne od momentu aplikacji, a biorąc pod uwagę zasadniczy charakter cytoszkieletu mikrotubul dla wielu krytycznych funkcji komórkowych, globalna depolimeryzacja mikrotubul może powodować efekty niezgodne z celem, które mogą być nieodpowiednie dla wielu zastosowań. Dodatkowo, leczenie nokodazolem jest nieodwracalne, chyba że próbki zostaną wypłukane z leku, co uniemożliwi ciągłe obrazowanie na żywo, a tym samym precyzyjne śledzenie poszczególnych włókien mikrotubul.

Rozwój związków aktywowanych światłem rozpoczął się od stworzenia fotoklatkowych cząsteczek i zwiastował nową erę w celowaniu i monitorowaniu efektów hamowania wzrostu mikrotubul w sposób precyzyjny i kontrolowany czasowo. Jedna rodzina odwracalnie fotoprzełączalnych leków, fotostatyny (PST), została opracowana przez zastąpienie składnika stilbenu komretastatyny A-4 azobenzenem9. PST są nieaktywne do momentu oświetlenia światłem UV, przy czym nieaktywna konfiguracja trans przekształca się w aktywną konfigurację cis przez odwracalną izomeryzację. Cis-PST hamują polimeryzację mikrotubul poprzez wiązanie się z miejscem wiązania kolchicyny β-tubuliny, blokując jej interfejs z β-tubuliną i zapobiegając dimeryzacji wymaganej do wzrostu mikrotubul10. W kohorcie PST PST-1P pojawił się jako związek wiodący, ponieważ ma najwyższą moc, jest w pełni rozpuszczalny w wodzie i wykazuje szybki początek bioaktywności po naświetleniu.

Najbardziej efektywna izomeryzacja trans- do cis-izomeryzacji PST występuje przy długościach fal między 360-420 nm, co umożliwia podwójne opcje aktywacji PST. Linia laserowa o długości fali 405 nm w typowym mikroskopie konfokalnym może być podawana w celu optymalnego ukierunkowania przestrzennego na zahamowanie wzrostu mikrotubul. Możliwość precyzyjnego określenia miejsca i czasu aktywacji PST za pomocą oświetlenia laserowego 405 nm ułatwia precyzyjną kontrolę czasową i przestrzenną, umożliwiając zakłócenie dynamiki mikrotubul na poziomie subkomórkowym, w czasie reakcji poniżej sekundy9. Alternatywnie, niedrogie światło LED UV pozwala na oświetlenie całego organizmu w celu wywołania zakłócenia architektury mikrotubul w całym organizmie. Może to być opłacalna alternatywa dla badaczy, dla których celem jest precyzyjnie określony początek hamowania, a nie celowanie przestrzenne. Kolejną cechą PST jest ich inaktywacja na żądanie poprzez zastosowanie zielonego światła o długości fali w zakresie 510-540 nm9. Umożliwia to śledzenie włókien mikrotubul przed, w trakcie i po zahamowaniu wzrostu za pośrednictwem PST.

PST, choć wciąż stosunkowo nowym projektem, były używane w licznych zastosowaniach in vitro w różnych dziedzinach badań11, w tym badając nowe mechanizmy migracji komórek u ameboidów12, w neuronach wyizolowanych z mózgu nowonarodzonego myszy13, oraz rozwój nabłonka skrzydeł u Drosophila melanogaster14. Inne leki reagujące na światło okazały się cennymi narzędziami w ukierunkowanym zaburzeniu funkcji komórkowych. Na przykład, analog blebbistatyny, azydoblebbistatyna, został użyty do zwiększonego hamowania miozyny w oświetleniu15,16. Podkreśla to potencjał nowych odkryć dzięki zdolności do kontrolowanego czasowo hamowania funkcji komórkowych.

Żywe organizmy 3D prezentują doskonałe, ale bardziej delikatne systemy do manipulowania dynamiką mikrotubul na poziomie całego zwierzęcia, pojedynczej komórki lub subkomórki w warunkach fizjologicznych. W szczególności preimplantacyjny zarodek myszy oferuje wyjątkowy wgląd w wewnętrzne funkcjonowanie komórki, a także relacje międzykomórkowe w organizmie17. Ukierunkowane czasowo i przestrzennie następujące po sobie cykle aktywacji i dezaktywacji PST przyczyniły się do scharakteryzowania mostka interfazowego, postcytokinetycznej struktury między komórkami, jako niecentrycznego centrum organizującego mikrotubule w preimplantacyjnym zarodku myszy16. Podobny układ eksperymentalny wykazał udział rosnących mikrotubul w uszczelnianiu zarodka myszy, aby umożliwić tworzenie blastocysty18. Co więcej, PST wykorzystano również w całych zarodkach danio pręgowanego do zbadania migracji komórek neuronalnych poprzez hamowanie wzrostu mikrotubul w podzbiorze komórek w tyłomózgowiu19.

Ten protokół opisuje eksperymentalną konfigurację i użycie PST-1P w preimplantacyjnym zarodku myszy. Przedstawione tutaj instrukcje mogą również pomóc w zastosowaniu PST do szerokiego zakresu celów, takich jak badanie segregacji chromosomów i podziału komórek, transport ładunku wewnątrzkomórkowego oraz morfogeneza i migracja komórek. Co więcej, takie badania pomogą we wdrożeniu PST w układach organoidowych, blastoidach i innych modelach zarodków, takich jak Caenorhabditis elegans i Xenopus laevis, a także potencjalnie rozszerzą zastosowanie PST w technologiach zapłodnienia in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Monash pod numerem etyki zwierząt 19143. Zwierzęta były trzymane w specyficznych, wolnych od patogenów warunkach w obiekcie dla zwierząt (Monash Animal Research Platform) w ścisłej zgodności z wytycznymi etycznymi.

1. Pobieranie zarodków myszy przed implantacją

  1. Zwierzaj myszy i łącz je w pary, jak opisano wcześniej16,18, zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi etyki zwierząt.
    UWAGA: Najczęściej stosowanymi szczepami do pobierania żywych zarodków są myszy C57BL/6 lub FVB/N. Wszystkie pokazane tutaj dane zostały wygenerowane przy użyciu myszy FVB/N.
  2. Następnego ranka po kryciu wypłucz zygoty z jajowodu za pomocą pożywki M2, jak opisano20 lub pożywki z płynu z ludzkich jajowodów (HTF). Używając pipety doustnej zgodnie z opisem21,22, przenieś zygoty do świeżych kropelek pożywki Potassium Simplex Optimized Medium (KSOM), wstępnie podgrzanych do 37 °C i zrównoważonych do 5% CO2, w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm pokrytym wystarczającą ilością oleju mineralnego, aby zapewnić pokrycie w mediach.
  3. Mikrowstrzyknij zygoty zgodnie z opisem20 z kodowaniem cRNA dla czerwonej fluorescencyjnie znakowanej mikrotubuli plus marker końcowy. W tym przypadku zastosowano cRNA dla białka wiązania końca 3 (EB3)-dTomato w stężeniu 30 ng/μL po przygotowaniu i oczyszczeniu zgodnie z opisem16,18 i rozcieńczeniu w buforze do mikroiniekcji.
    UWAGA: Zaleca się wcześniejsze przygotowanie cRNA i przechowywanie go w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie to wymagane.
  4. Hodowla zarodków w ciemności w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do momentu osiągnięcia przez zarodki pożądanego etapu rozwoju do leczenia PST-1P.
    UWAGA: Aby uzyskać wyczerpujące informacje na temat czasów hodowli wymaganych dla różnych stadiów embrionalnych, zobacz23. W przypadku zarodków w stadium 16-komórkowym hodowla do 3 dnia embrionalnego (E3) po zapłodnieniu.

2. Przygotowanie leków i potraw obrazowych

UWAGA: Dla Kroków 2.1-2.10 pracuj wyłącznie w ciemnościach lub w warunkach czerwonego światła, aby uniknąć niezamierzonej aktywacji PST-1P. Folia aluminiowa lub ciemne osłony powinny być używane do wszystkich probówek i naczyń zawierających PST.

  1. Przygotować stężenie zapasowe 50 mM PST-1P w ultraczystej wodzie.
    UWAGA: Masa cząsteczkowa PST-1P wynosi 440 g/mol. Roztwór podstawowy jest stabilny w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku. PST-1P jest rozpuszczalny w wodzie lub buforze wodnym, ale nie rozpuszcza się łatwo w DMSO.
  2. Od kroku 2.1 przygotuj pośrednie stężenie robocze 800 μM PST-1P w wodzie ultraczystej.
  3. Rozcieńczyć PST-1P do końcowego stężenia 40 μM w świeżym KSOM. Ponieważ typowy eksperyment wymaga około 20 μl KSOM poddanego działaniu PST-1P, rozcieńczyć 1 μL 800 μM PST-1P w 19 μL KSOM dla końcowej objętości 20 μL, aby upewnić się, że wcześniej przygotowano wystarczającą ilość podłoża, używając tylko czerwonego światła dla widoczności.
    UWAGA: Zarówno stężenie, jak i stan aktywacji rozcieńczenia PST-1P można sprawdzić, pobierając widmo absorbancji UV-Vis za pomocą spektrofotometru, co należy wykonać podczas ustalania testu. Absorbancja przy 380 nm (A380) w całkowicie trans 40 μM rozcieńczeniu w kuwecie o średnicy 1 cm powinna wynosić około 0,8. Zarówno formy cis, jak i trans mają taką samą absorbancję przy 455 nm (A455). Gdy stosunek A380 do A455 wynosi około 9:1, rozcieńczenie jest nieaktywne (w pełni trans). Gdy stosunek A380:A455 wynosi 1:2, rozcieńczenie jest w pełni aktywowane (całkowicie cis). Współczynniki pośrednie odzwierciedlają pośrednie stany aktywacji.
  4. Aby przygotować szkiełko komory do obrazowania na żywo, należy odpipetować 10 μl KSOM nasączonego PST-1P do środka jednej studzienki, aby utworzyć półkulistą kroplę (Rysunek 1A).
  5. Delikatnie dodaj wystarczającą ilość oleju mineralnego, aby przykryć kroplę, upewniając się, że nie rozproszy ona podłoża. Zapewni to, że kropla nie wyparuje.
  6. Wstępnie podgrzać i zrównoważyć naczynie szkiełka komory w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 3 godziny lub najwyżej przez noc.
  7. Pod koniec okresu równowagi w kroku 2.6 przygotuj naczynie hodowlane o średnicy 35 mm z kroplą 10 μl KSOM poddanego działaniu PST-1P, wstępnie podgrzanego i zrównoważonego jako etap mycia. Nie pokrywać olejem.
  8. Przenieść zarodki za pomocą pipetowania doustnego do kropelki KSOM poddanej działaniu PST-1P z kroku 2.7.
    UWAGA: Kroki 2.7 i 2.8 są zalecane do pipetowania zarodków do ust, ale są opcjonalne.
  9. Natychmiast przenieś zarodki za pomocą pipetowania doustnego do środka kropli KSOM traktowanej PST-1P na szkiełku komory obrazowania przygotowanym w krokach 2.4-2.6 (Rysunek 1A).
  10. Inkubować zarodki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w KSOM traktowanym PST-1P na szkiełku w komorze obrazowania przez co najmniej 1 godzinę przed obrazowaniem. Jeśli to możliwe, zamontuj szkiełko komory na mikroskopie w komorze środowiskowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i w całkowitej ciemności, aby upewnić się, że wszystkie PST-1P są w nieaktywnej konfiguracji trans i że zarodki mogą opaść na dno naczynia.

3. Obrazowanie na żywo i fotoaktywacja PST-1P

UWAGA: Kroki 3.1-3.13 są wykonywane na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w detektory fotodiod lawinowych (APD) i ciemną komorę środowiskową. Instrukcje te odnoszą się w szczególności do konfiguracji obrazowania przy użyciu oprogramowania do akwizycji opisanego w Tabeli materiałów; Można je jednak również stosować w innych systemach mikroskopii konfokalnej.

  1. Przygotuj obiektyw do zanurzania w oleju wodnym 63x/1,2 NA z zalecanym medium zanurzeniowym.
  2. Używając latarki z czerwonym światłem do kierowania pozycją, przesuń obiektyw do przodu, aby zetknąć się z medium zanurzeniowym. Na tym etapie należy unikać używania światła białego lub jasnego pola do znajdowania zarodków, ponieważ może to przedwcześnie aktywować PST-1P.
  3. Używając okularu i przy czerwonym oświetleniu, zlokalizuj krawędź kropli medium i ustaw obiektyw bezpośrednio nad tym miejscem. Może to pomóc użytkownikowi w ustaleniu orientacji i znalezieniu płaszczyzny ogniskowej.
  4. Następnie, za pomocą okularu lub podczas skanowania w trybie na żywo za pomocą oprogramowania, użyj czerwonego filtra długości fali lub lasera 561 nm, aby zlokalizować zarodki w kropli.
  5. Użyj kontrolerów etapów i trybu skanowania na żywo, aby ustawić punkt początkowy i końcowy do uzyskania stosu Z całego zarodka.
  6. Dostosuj ustawienia mocy lasera (zazwyczaj w przypadku bardzo czułych detektorów, takich jak APD, wystarczająca jest moc lasera 561 nm mniejsza niż 5%), przesunięcie cyfrowe (zwykle na poziomie -0,900), aby zoptymalizować wygląd komet EB3-dTomato i zminimalizować szum tła, otworek przy 2 μm, rozdzielczość pikseli 512 x 512 i czas przebywania pikseli 3,15 μs.
  7. Zdobądź stos z całego zarodka w odstępach między sekcjami 1 μm, aby ocenić obszary wzrostu mikrotubul w całym organizmie (Rysunek 1B).
  8. Użyj obrazu 3D z-stack z kroku 3.7, aby zidentyfikować obszary zainteresowania (ROI) dla eksperymentów śledzenia EB3-dTomato. Zwiększ powiększenie do 3x i narysuj prostokątny ROI wokół określonego subkomórkowego obszaru zainteresowania.
  9. Utwórz film poklatkowy pojedynczej płaszczyzny z przy użyciu typowych wartości parametrów obrazowania: moc lasera 561 nm przy 5%, przesunięcie cyfrowe -0,900, rozdzielczość pikseli 512 x 512, otwórka przy 3 μm, czas przebywania piksela 3,15 μs, zoom 3x, interwał czasowy 500 ms.
    UWAGA: 120 przedziałów czasowych zapewni film śledzenia trwający 1 minutę i powinien wystarczyć do analizy danych. Akwizycja może trwać dłużej, pod warunkiem, że bielenie fluoroforu jest minimalne (Rysunek 1C).
  10. Aby aktywować PST-1P, przełącz się na laser 405 nm i nabierz kolejny film poklatkowy z laserem 405 nm ustawionym na 10% mocy, rozdzielczość pikseli 512 x 512, maksymalnie otwarty otwór, czas przebywania pikseli 3,15 μs, zoom 3x, interwał czasowy 500 ms i łącznie 20 klatek (Rysunek 1D).
  11. Przełącz się z powrotem na laser 561 nm i powtórz akwizycję, jak w kroku 3.9, aby potwierdzić utratę komet EB3-dTomato po aktywacji PST-1P (Rysunek 1E). Upewnij się, że to przejęcie nastąpi tak szybko, jak to możliwe po aktywacji.
    UWAGA: Krok 3.10 może być wykonywany powtarzalnie w celu dłuższego hamowania komet EB3-dTomato. Jednak zarodki muszą być uważnie monitorowane, aby uniknąć szkód spowodowanych przez światło UV.
  12. Aby odwrócić PST-1P z powrotem do nieaktywnego stanu trans-stanu, włącz laser 514 nm o mocy 10%. Nakręć film poklatkowy za pomocą lasera 514 nm ustawionego na 10% mocy, rozdzielczości pikseli 512 x 512, maksymalnie otwartego otworka, czasu przebywania pikseli 3,15 μs, zoomu 3x, interwału czasowego 500 ms i łącznie 20 klatek czasowych (Rysunek 1F).
  13. Powtórz krok 3.11, aby zwizualizować regenerację komet EB3-dTomato (Rysunek 1G).

4. Analiza danych obrazu

  1. Do analizy i ilościowego określenia zahamowania polimeryzacji mikrotubul przez PST należy korzystać z programów dostępnych dla badaczy, dostosowanych do ich konkretnych potrzeb. Osoby zalecane do użytku będą posiadały narzędzie do śledzenia, które może ręcznie lub automatycznie śledzić ruch, kierunek i prędkość komety EB3-dPomidory16,18.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie fotoaktywacji i dezaktywacji PST-1P w żywym zarodku myszy preimplantacyjnej 3D. Wszystkie eksperymenty wykonywane są w całkowitej ciemności (czarne tło) lub tylko przy czerwonym oświetleniu. (A) Żywe preimplantacyjne zarodki myszy wykazujące ekspresję EB3-dTomato są hodowane do stadium 16-komórkowego, a następnie przenoszone do kropli KSOM zawierającej 40 μM PST-1P na szkiełku w komorze obrazowania. (B) Obraz 3D całego zarodka pozwala na ocenę wzrostu mikrotubul poprzez wizualizację rozmieszczenia komet EB3-dTomato. (C) Aby rozpocząć eksperyment, komety EB3-dTomato są śledzone w regionie subkomórkowym za pomocą obrazowania poklatkowego. (D) Późniejsza fotoaktywacja PST-1P w tym samym regionie subkomórkowym przy użyciu lasera o długości fali 405 nm powoduje utratę komet EB3-dTomato (E). Zintensyfikowana aktywacja PST-1P może być zrealizowana, jeśli to konieczne, przez sekwencyjne oświetlenie światłem 405 nm. Aby odwrócić PST-1P z powrotem do stanu nieaktywnego i przywrócić komety EB3-dTomato, do tego samego regionu subkomórkowego stosuje się laser o długości fali 514 nm. W razie potrzeby można przeprowadzić wiele rund fotoaktywacji i dezaktywacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z protokołem, preimplantacyjnym zarodkom myszy mikrowstrzykiwano cRNA dla EB3, oznaczone czerwonym fluorescencyjnym dTomato (EB3-dTomato). Umożliwia to wizualizację rosnących mikrotubul, gdy EB3 wiąże się z polimeryzującą mikrotubulą plus ends24.

Eksperymenty przeprowadzono 3 dni po zapłodnieniu (E3), gdy zarodek myszy składa się z 16 komórek. Można zastosować każdy inny etap rozwoju preimplantacyjnego, w zależności od kwestii naukowej, która ma być badana. Aby ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sieć mikrotubul jest integralną częścią podstawowych wewnętrznych funkcji komórki. W związku z tym stanowi to wyzwanie w manipulowaniu dynamiką mikrotubul w organizmach żywych, ponieważ wszelkie zakłócenia w sieci mają zwykle rozległe konsekwencje dla wszystkich aspektów funkcji komórkowych. Pojawienie się fotoprzełączalnych związków ukierunkowanych na mikrotubule stanowi sposób na precyzyjne manipulowanie cytoszkieletem na poziomie subkomórkowym, z doskonałą kontrolą indukcji i odwrócenia zahamowania wzrostu mikrotubul<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak interesów konkurencyjnych lub finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Oliverowi Thorn-Sesholdowi i Li Gao za dostarczenie nam fotostatyn i porad dotyczących przygotowania rękopisu, Monash Production za wsparcie w filmowaniu oraz Monash Micro Imaging za wsparcie mikroskopowe.

Ta praca była wspierana przez projekt National Health and Medical Research Council (NHMRC) grant APP2002507 dla J.Z. oraz Kanadyjski Instytut Badań Zaawansowanych (CIFAR) Stypendium Azrieli dla J.Z. Australijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej jest wspierany przez dotacje rządu stanowego Wiktorii i rządu australijskiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurka aspiratoraSigma-AldrichA5177Do aparatu do aspiracji jamy ustnej
Szkiełka komorowe - LabTekThermo Fisher ScientificNUN155411
kodowanie cRNA dla EB3-dPomidorNr dotyczyPrzygotowane zgodnie z instrukcją producenta przy użyciu zestawu do transkrypcji mMessage in vitro Naczynia
do hodowli - 35mmThermo Fisher Scientific150560
Ludzki hormon wzrostu kosmówkiSigma-AldrichC8554
Płyn jajowodowy (HTF) mediumCosmo-BioCSR-R-B071
Imaris Oprogramowanie do analizy obrazuBitplane
Immersion Oil W 2010Carl Zeiss444969-0000-000Do użytku z obiektywem zanurzeniowym
LED do mikroskopu - czerwone światłoCelestron93588
M2 średniSigma-AldrichM7167
Myszy - typ dziki FVB/N, samce i samiceN/AN/ASamice w wieku 8-9 tygodni. Samce w wieku 2-6 miesięcy.
Pipety mikrokapilarne - KimbleSigma-AldrichZ543306Do aparatury do aspiracji jamy ustnej
Bufor do mikroiniekcjiN/AN/D5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,4
Olej mineralnyOrigioART-4008-5P
mMessage Zestaw do transkrypcji in vitro Zestaw do transkrypcjiThermo Fisher ScientificAM1340
NanoDrop SpektrofotometrThermo Fisher Scientific
Potassium Simplex Optimized Medium (KSOM)medium Cosmo-BioCSR-R-B074
Gonadotropina surowicy klaczyciężarnych Prospec BioHOR-272
PST-1PN/AN/ABorowiak, M. et al., Fotoprzełączalne inhibitory dynamiki mikrotubul optycznie kontrolują mitozę i śmierć komórki. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).
Zestaw do oczyszczania RNASangonB511361-0100
Ultraczysta wodaSigma-AldrichW1503
ZEN Black SoftwareCarl Zeiss

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells. Development. 148 (20), (2021).
  2. Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).
  3. Galli, M., Morgan, D. O. Cell size determines the strength of the spindle assembly checkpoint during embryonic development. Developmental Cell. 36 (3), 344-352 (2016).
  4. Vazquez-Diez, C., Paim, L. M. G., FitzHarris, G. Cell-size-independent spindle checkpoint failure underlies chromosome segregation error in mouse embryos. Current Biology. 29 (5), 865-873 (2019).
  5. Baudoin, J. P., Alvarez, C., Gaspar, P., Metin, C. Nocodazole-induced changes in microtubule dynamics impair the morphology and directionality of migrating medial ganglionic eminence cells. Developmental Neuroscience. 30 (1-3), 132-143 (2008).
  6. Munz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312(2018).
  7. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  8. Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
  9. Borowiak, M., et al. Photoswitchable inhibitors of microtubule dynamics optically control mitosis and cell death. Cell. 162 (2), 403-411 (2015).
  10. Gaspari, R., Prota, A. E., Bargsten, K., Cavalli, A., Steinmetz, M. O. Structural basis of cis- and trans-Combretastatin binding to tubulin. Chem. 2 (1), 102-113 (2017).
  11. Thorn-Seshold, O., Meiring, J. Photocontrolling microtubule dynamics with photoswitchable chemical reagents. ChemRxiv. , (2021).
  12. Kopf, A., et al. Microtubules control cellular shape and coherence in amoeboid migrating cells. Journal of Cell Biology. 219 (6), 201907154(2020).
  13. Sawada, M., et al. PlexinD1 signaling controls morphological changes and migration termination in newborn neurons. The EMBO Journal. 37 (4), 97404(2018).
  14. Singh, A., et al. Polarized microtubule dynamics directs cell mechanics and coordinates forces during epithelial morphogenesis. Nature Cell Biology. 20 (10), 1126-1133 (2018).
  15. Kepiro, M., et al. Azidoblebbistatin, a photoreactive myosin inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (24), 9402-9407 (2012).
  16. Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
  17. White, M. D., Zenker, J., Bissiere, S., Plachta, N. Instructions for assembling the early mammalian embryo. Developmental Cell. 45 (6), 667-679 (2018).
  18. Zenker, J., et al. Expanding actin rings zipper the mouse embryo for blastocyst formation. Cell. 173 (3), 776-791 (2018).
  19. Theisen, U., et al. Microtubules and motor proteins support zebrafish neuronal migration by directing cargo. Journal of Cell Biology. 219 (10), 201908040(2020).
  20. Rulicke, T. Pronuclear microinjection of mouse zygotes. Methods in Molecular Biology. 254, 165-194 (2004).
  21. Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio-protocol. 11 (15), 4104(2021).
  22. Subramanian, G. N., et al. Oocytes mount a noncanonical DNA damage response involving APC-Cdh1-mediated proteolysis. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201907213(2020).
  23. Mihajlovic, A. I., Bruce, A. W. The first cell-fate decision of mouse preimplantation embryo development: integrating cell position and polarity. Open Biology. 7 (11), 170210(2017).
  24. Roostalu, J., et al. The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability. Elife. 9, 51992(2020).
  25. Gao, L., et al. In vivo photocontrol of microtubule dynamics and integrity, migration and mitosis, by the potent GFP-imaging-compatible photoswitchable reagents SBTubA4P and SBTub2M. BioRxiv. bioRxiv. , (2021).
  26. Tichy, A. M., Gerrard, E. J., Legrand, J. M. D., Hobbs, R. M., Janovjak, H. Engineering strategy and vector library for the rapid generation of modular light-controlled protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3046-3055 (2019).
  27. van Haren, J., Adachi, L. S., Wittmann, T. Optogenetic control of microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 2101, 211-234 (2020).
  28. Adikes, R. C., Hallett, R. A., Saway, B. F., Kuhlman, B., Slep, K. C. Control of microtubule dynamics using an optogenetic microtubule plus end-F-actin cross-linker. Journal of Cell Biology. 217 (2), 779-793 (2018).
  29. Kogler, A. C., et al. Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos. Developmental Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).
  30. Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
  31. Bukhari, S. N. A., Kumar, G. B., Revankar, H. M., Qin, H. L. Development of combretastatins as potent tubulin polymerization inhibitors. Bioorganic Chemistry. 72, 130-147 (2017).
  32. Gilazieva, Z., Ponomarev, A., Rutland, C., Rizvanov, A., Solovyeva, V. Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine. Cancers (Basel). 12 (10), 2727(2020).
  33. Scherer, K. M., et al. Three-dimensional imaging and uptake of the anticancer drug combretastatin in cell spheroids and photoisomerization in gels with multiphoton excitation. Journal of Biomedical Optics. 20 (7), 78003(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Manipulacja czasoprzestrzennaobrazowanie ywych kom rekmikroskopia konfokalnapolimeryzacja mikrotubulledzenie EB3 dTomatofotoprzek czalne inhibitory

Powiązane artykuły