Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Czasoprzestrzenna subkomórkowa manipulacja cytoszkieletu mikrotubul w żywym zarodku myszy przed implantacją za pomocą fotostatyn

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63290

⸱

30 listopada 2021

 ,  ,  ,  , 
1Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University, 2School of BioSciences, The University of Melbourne

W tym artykule

Podsumowanie

Typowe inhibitory mikrotubul, szeroko stosowane w badaniach podstawowych i stosowanych, mają dalekosiężny wpływ na komórki. Ostatnio fotostatyny pojawiły się jako klasa fotoprzełączalnych inhibitorów mikrotubul, zdolnych do natychmiastowej, odwracalnej, czasoprzestrzennie precyzyjnej manipulacji mikrotubulami. Ten protokół krok po kroku szczegółowo opisuje zastosowanie fotostatyn w żywym zarodku myszy preimplantacyjnej 3D.

Streszczenie

Cytoszkielet mikrotubul tworzy szkielet komórki i ma fundamentalne znaczenie dla transportu wewnątrzkomórkowego, podziału komórki i transdukcji sygnału. Tradycyjne farmakologiczne zakłócenie wszechobecnej sieci mikrotubul za pomocą np. nokodazolu może mieć katastrofalne konsekwencje dla każdej komórki. Odwracalnie fotoprzełączalne inhibitory mikrotubul mają potencjał, aby przezwyciężyć ograniczenia, umożliwiając realizację efektów działania leków w sposób kontrolowany czasowo. Jedną z takich rodzin leków są fotostatyny na bazie azobenzenu (PST). Związki te są nieaktywne w ciemnych warunkach, a po naświetleniu światłem UV wiążą się z miejscem wiązania kolchicyny β-tubuliny i blokują polimeryzację mikrotubul oraz dynamiczny obrót. W tym przypadku zastosowanie PST w trójwymiarowym (3D) żywym zarodku myszy preimplantacyjnej ma na celu zakłócenie sieci mikrotubul na poziomie subkomórkowym. Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące konfiguracji eksperymentalnej, a także parametry aktywacji i dezaktywacji światła dla PST przy użyciu mikroskopii konfokalnej z żywymi komórkami. Zapewnia to powtarzalność i umożliwia innym zastosowanie tej procedury do swoich pytań badawczych. Innowacyjne fotoprzełączniki, takie jak PST, mogą ewoluować jako potężne narzędzia do pogłębiania wiedzy na temat dynamicznej wewnątrzkomórkowej sieci mikrotubul i nieinwazyjnego manipulowania cytoszkieletem w czasie rzeczywistym. Ponadto PST mogą okazać się przydatne w innych strukturach 3D, takich jak organoidy, blastoidy lub zarodki innych gatunków.

Wprowadzenie

Architektura mikrotubul różni się znacznie w zależności od typu komórek, aby wspierać różne funkcje1,2. Jego dynamiczna natura wzrostu i kurczenia się pozwala na szybką adaptację do sygnałów zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych oraz reagowanie na stale zmieniające się potrzeby komórki. W związku z tym można go uznać za "morfologiczny odcisk palca" odgrywający kluczową rolę w tożsamości komórkowej.

Farmakologiczne celowanie w cytoszkielet mikrotubul za pomocą inhibitorów małych cząsteczek doprowadziło do mnóstwa fundamentalnych odkryć w biologii rozwojowej, biologii komórek macierzystych, biologii nowotworów i neurobiologii3,4,5,6,7. Podejście to, choć niezbędne, wiąże się z różnymi ograniczeniami, takimi jak toksyczność i skutki niezamierzone. Na przykład jeden z najczęściej stosowanych środków ukierunkowanych na mikrotubule, nokodazol, jest silnym lekiem depolimeryzującym mikrotubule8. Jednak inhibitory małocząsteczkowe, takie jak nokodazol, są aktywne od momentu aplikacji, a biorąc pod uwagę zasadniczy charakter cytoszkieletu mikrotubul dla wielu krytycznych funkcji komórkowych, globalna depolimeryzacja mikrotubul może powodować efekty niezgodne z celem, które mogą być nieodpowiednie dla wielu zastosowań. Dodatkowo, leczenie nokodazolem jest nieodwracalne, chyba że próbki zostaną wypłukane z leku, co uniemożliwi ciągłe obrazowanie na żywo, a tym samym precyzyjne śledzenie poszczególnych włókien mikrotubul.

Rozwój związków aktywowanych światłem rozpoczął się od stworzenia fotoklatkowych cząsteczek i zwiastował nową erę w celowaniu i monitorowaniu efektów hamowania wzrostu mikrotubul w sposób precyzyjny i kontrolowany czasowo. Jedna rodzina odwracalnie fotoprzełączalnych leków, fotostatyny (PST), została opracowana przez zastąpienie składnika stilbenu komretastatyny A-4 azobenzenem9. PST są nieaktywne do momentu oświetlenia światłem UV, przy czym nieaktywna konfiguracja trans przekształca się w aktywną konfigurację cis przez odwracalną izomeryzację. Cis-PST hamują polimeryzację mikrotubul poprzez wiązanie się z miejscem wiązania kolchicyny β-tubuliny, blokując jej interfejs z β-tubuliną i zapobiegając dimeryzacji wymaganej do wzrostu mikrotubul10. W kohorcie PST PST-1P pojawił się jako związek wiodący, ponieważ ma najwyższą moc, jest w pełni rozpuszczalny w wodzie i wykazuje szybki początek bioaktywności po naświetleniu.

Najbardziej efektywna izomeryzacja trans- do cis-izomeryzacji PST występuje przy długościach fal między 360-420 nm, co umożliwia podwójne opcje aktywacji PST. Linia laserowa o długości fali 405 nm w typowym mikroskopie konfokalnym może być podawana w celu optymalnego ukierunkowania przestrzennego na zahamowanie wzrostu mikrotubul. Możliwość precyzyjnego określenia miejsca i czasu aktywacji PST za pomocą oświetlenia laserowego 405 nm ułatwia precyzyjną kontrolę czasową i przestrzenną, umożliwiając zakłócenie dynamiki mikrotubul na poziomie subkomórkowym, w czasie reakcji poniżej sekundy9. Alternatywnie, niedrogie światło LED UV pozwala na oświetlenie całego organizmu w celu wywołania zakłócenia architektury mikrotubul w całym organizmie. Może to być opłacalna alternatywa dla badaczy, dla których celem jest precyzyjnie określony początek hamowania, a nie celowanie przestrzenne. Kolejną cechą PST jest ich inaktywacja na żądanie poprzez zastosowanie zielonego światła o długości fali w zakresie 510-540 nm9. Umożliwia to śledzenie włókien mikrotubul przed, w trakcie i po zahamowaniu wzrostu za pośrednictwem PST.

PST, choć wciąż stosunkowo nowym projektem, były używane w licznych zastosowaniach in vitro w różnych dziedzinach badań11, w tym badając nowe mechanizmy migracji komórek u ameboidów12, w neuronach wyizolowanych z mózgu nowonarodzonego myszy13, oraz rozwój nabłonka skrzydeł u Drosophila melanogaster14. Inne leki reagujące na światło okazały się cennymi narzędziami w ukierunkowanym zaburzeniu funkcji komórkowych. Na przykład, analog blebbistatyny, azydoblebbistatyna, został użyty do zwiększonego hamowania miozyny w oświetleniu15,16. Podkreśla to potencjał nowych odkryć dzięki zdolności do kontrolowanego czasowo hamowania funkcji komórkowych.

Żywe organizmy 3D prezentują doskonałe, ale bardziej delikatne systemy do manipulowania dynamiką mikrotubul na poziomie całego zwierzęcia, pojedynczej komórki lub subkomórki w warunkach fizjologicznych. W szczególności preimplantacyjny zarodek myszy oferuje wyjątkowy wgląd w wewnętrzne funkcjonowanie komórki, a także relacje międzykomórkowe w organizmie17. Ukierunkowane czasowo i przestrzennie następujące po sobie cykle aktywacji i dezaktywacji PST przyczyniły się do scharakteryzowania mostka interfazowego, postcytokinetycznej struktury między komórkami, jako niecentrycznego centrum organizującego mikrotubule w preimplantacyjnym zarodku myszy16. Podobny układ eksperymentalny wykazał udział rosnących mikrotubul w uszczelnianiu zarodka myszy, aby umożliwić tworzenie blastocysty18. Co więcej, PST wykorzystano również w całych zarodkach danio pręgowanego do zbadania migracji komórek neuronalnych poprzez hamowanie wzrostu mikrotubul w podzbiorze komórek w tyłomózgowiu19.

Ten protokół opisuje eksperymentalną konfigurację i użycie PST-1P w preimplantacyjnym zarodku myszy. Przedstawione tutaj instrukcje mogą również pomóc w zastosowaniu PST do szerokiego zakresu celów, takich jak badanie segregacji chromosomów i podziału komórek, transport ładunku wewnątrzkomórkowego oraz morfogeneza i migracja komórek. Co więcej, takie badania pomogą we wdrożeniu PST w układach organoidowych, blastoidach i innych modelach zarodków, takich jak Caenorhabditis elegans i Xenopus laevis, a także potencjalnie rozszerzą zastosowanie PST w technologiach zapłodnienia in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Zwierząt Uniwersytetu Monash pod numerem etycznym 19143. Zwierzęta były utrzymywane w warunkach wolnych od określonych patogenów w jednostce zwierzęcej (Monash Animal Research Platform) w ścisłej zgodności z wytycznymi etycznymi.

1. Pobieranie mysich embrionów przedimplantacyjnych

  1. Przeprowadzić superowulację i kopulację myszy zgodnie z wcześniejszym opisem16,18, zgodnie z instytucyjnymi wytycznymi dotyczącymi etyki badań na zwierzętach.
    UWAGA: Najczęściej stosowanymi szczepami do pobierania żywych zarodków są myszy C57BL/6 lub FVB/N. Wszystkie przedstawione tutaj dane zostały uzyskane z wykorzystaniem myszy FVB/N.
  2. Rano, dzień po kopulacji, wypłukać zygoty z jajowodów przy użyciu medium M2 zgodnie z opisem20 lub medium Human Tubal Fluid (HTF). Korzystając z aparatu do pipetowania ustnego zgodnie z opisem21,22, przenieść zygoty do świeżych kropel medium Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM), uprzednio ogrzanych do 37 °C i równoważonych z 5% CO2, w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm, przykrytym odpowiednią objętością oleju mineralnego w celu zapewnienia pokrycia mediów.
  3. Wykonać mikroiniekcję zygot zgodnie z opisem20 za pomocą cRNA kodującego marker końca plus mikrotubul znakowany czerwonym fluorescencyjnie. W tym przypadku zastosowano cRNA dla białka End Binding protein 3 (EB3)-dTomato w stężeniu 30 ng/µL po przygotowaniu i oczyszczeniu zgodnie z opisem16,18 oraz rozcieńczeniu w buforze do mikroiniekcji.
    UWAGA: Zaleca się przygotowanie cRNA z wyprzedzeniem i przechowywanie go w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  4. Hodować zarodki w ciemności w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do momentu osiągnięcia przez zarodki pożądanego stopnia rozwoju do traktowania PST-1P.
    UWAGA: Kompleksowe źródło informacji o czasach hodowli wymaganych dla różnych stadiów embrionalnych znajduje się w23. W przypadku zastosowanych tutaj zarodków w stadium 16 komórek, hodować do 3. dnia embrionalnego (E3) po zapłodnieniu.

2. Przygotowanie leku i szalki do obrazowania

UWAGA: W krokach od 2.1 do 2.10 należy pracować wyłącznie w ciemności lub przy świetle czerwonym, aby uniknąć niezamierzonej aktywacji PST-1P. Wszystkie probówki i szalki zawierające PST należy osłonić folią aluminiową lub ciemnymi pokrywami.

  1. Przygotować roztwór zapasowy PST-1P o stężeniu 50 mM w wodzie ultrapurej.
    UWAGA: Masa cząsteczkowa PST-1P wynosi 440 g/mol. Roztwór zapasowy jest stabilny w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku. PST-1P rozpuszcza się w wodzie lub buforze wodnym, ale nie rozpuszcza się łatwo w DMSO.
  2. Na podstawie kroku 2.1 przygotować pośrednie stężenie robocze PST-1P o wartości 800 µM w wodzie ultrapurej.
  3. Rozcieńczyć PST-1P do stężenia końcowego 40 µM w świeżym KSOM. Ponieważ typowy eksperyment wymaga około 20 µL KSOM z dodatkiem PST-1P, należy rozcieńczyć 1 µL PST-1P o stężeniu 800 µM w 19 µL KSOM, aby uzyskać objętość końcową 20 µL i zapewnić wcześniejsze przygotowanie wystarczającej ilości medium, korzystając wyłącznie z czerwonego światła w celu zapewnienia widoczności.
    UWAGA: Zarówno stężenie, jak i stan aktywacji rozcieńczenia PST-1P można sprawdzić, wykonując widmo absorbancji UV-Vis za pomocą spektrofotometru, co powinno zostać przeprowadzone podczas etapu ustalania procedury. Absorbancja przy 380 nm (A380) dla rozcieńczenia 40 µM w formie całkowicie trans w kuwecie 1 cm powinna wynosić około 0,8. Zarówno formy cis, jak i trans mają taką samą absorbancję przy 455 nm (A455). Gdy stosunek A380 do A455 wynosi około 9:1, rozcieńczenie jest nieaktywne (całkowicie trans). Gdy stosunek A380:A455 wynosi 1:2, rozcieńczenie jest w pełni aktywowane (całkowicie cis). Stosunki pośrednie odzwierciedlają pośrednie stany aktywacji.
  4. Aby przygotować szkiełko z komorą do obrazowania żywych komórek, nalać pipetą 10 µL KSOM z dodatkiem PST-1P do środka jednej z dołek, tworząc kroplę hemisferyczną (Rysunek 1A).
  5. Ostrożnie dodać odpowiednią ilość oleju mineralnego, aby przykryć kroplę, dbając o to, by nie doprowadzić do rozproszenia medium. Zapobiegnie to odparowaniu kropli.
  6. Podgrzać wstępnie i zrównoważyć pod względem CO2 szkiełko z komorą w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez minimum 3 h lub maksymalnie przez noc.
  7. Po zakończeniu okresu równoważenia w kroku 2.6 przygotować 35-milimetrową płytkę hodowlaną z 10 µL kroplą wstępnie podgrzanego i zrównoważonego KSOM z dodatkiem PST-1P jako etap płukania. Nie przykrywać olejem.
  8. Przenieść embriony za pomocą pipetowania ustnego do kropli KSOM z dodatkiem PST-1P z kroku 2.7.
    UWAGA: Kroki 2.7 i 2.8 są zalecane przy pipetowaniu ustnym embrionów, ale są opcjonalne.
  9. Natychmiast przenieść embriony za pomocą pipetowania ustnego do środka kropli KSOM z dodatkiem PST-1P w szkiełku z komorą do obrazowania przygotowanym w krokach 2.4-2.6 (Rysunek 1A).
  10. Inkubować embriony w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 w KSOM z dodatkiem PST-1P w szkiełku z komorą do obrazowania przez co najmniej 1 h przed obrazowaniem. Jeśli to możliwe, zamocować szkiełko z komorą na mikroskopie wewnątrz komory środowiskowej w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2, w całkowitej ciemności, aby zapewnić, że wszystkie cząsteczki PST-1P znajdują się w nieaktywnej konfiguracji trans i że embriony mogą opaść na dno naczynia.

3. Obrazowanie na żywo i fotoaktywacja PST-1P

UWAGA: Kroki od 3.1 do 3.13 wykonuje się na konfokalnym mikroskopie skaningowym z laserem, wyposażonym w detektory fotodiod lawinowych (APDs) oraz ciemną komorę środowiskową. Instrukcje te odnoszą się konkretnie do konfiguracji obrazowania z wykorzystaniem oprogramowania akwizycyjnego opisanego w Tabeli Materiałów; można je jednak zastosować również do innych systemów mikroskopii konfokalnej.

  1. Przygotować obiektyw imersyjny wodno-olejowy 63x/1,2 NA z zalecanym medium imersyjnym.
  2. Używając czerwonej latarki do naprowadzania, przesunąć obiektyw tak, aby zetknął się z medium imersyjnym. Na tym etapie należy unikać używania światła białego lub jasnego pola do poszukiwania embrionów, ponieważ mogłoby to doprowadzić do przedwczesnej aktywacji PST-1P.
  3. Korzystając z okularu i przy oświetleniu czerwonym, zlokalizować krawędź kropli medium i ustawić obiektyw bezpośrednio nad tym obszarem. Może to pomóc użytkownikowi w ustaleniu orientacji i znalezieniu płaszczyzny ogniskowania.
  4. Następnie, przez okular lub w trybie skanowania na żywo w oprogramowaniu, użyć filtra o długości fali czerwonej lub lasera 561 nm, aby zlokalizować embriony wewnątrz kropli.
  5. Użyć sterowników stolika i trybu skanowania na żywo, aby ustawić punkty początkowy i końcowy dla akwizycji stosu z (z-stack) całego embrionu.
  6. Dostosować ustawienia mocy lasera (zazwyczaj w przypadku bardzo czułych detektorów, takich jak APD, wystarczająca jest moc lasera 561 nm poniżej 5%), offset cyfrowy (zazwyczaj na poziomie -0,900) w celu optymalizacji obrazu komet EB3-dTomato i minimalizacji szumu tła, przysłonę (pinhole) na 2 µm, rozdzielczość pikseli 512 x 512 oraz czas przebywania piksela (pixel dwell time) 3,15 µs.
  7. Wykonać akwizycję stosu z całego embrionu z interwałami sekcji 1 µm, aby ocenić obszary wzrostu mikrotubul w całym organizmie (Rycina 1B).
  8. Użyć obrazu 3D z kroku 3.7 do zidentyfikowania obszarów zainteresowania (ROI) dla eksperymentów śledzenia EB3-dTomato. Zwiększyć powiększenie do 3x i wyrysować prostokątny obszar ROI wokół konkretnego obszaru subkomórkowego.
  9. Nagrać film time-lapse z pojedynczej płaszczyzny z wykorzystaniem typowych wartości parametrów obrazowania: moc lasera 561 nm na poziomie 5%, offset cyfrowy -0,900, rozdzielczość pikseli 512 x 512, przysłona 3 µm, czas przebywania piksela 3,15 µs, powiększenie 3x, interwał czasowy 500 ms.
    UWAGA: 120 klatek czasowych zapewni film śledzący o długości 1 min, co powinno być wystarczające do analizy danych. Akwizycję można kontynuować dłużej, pod warunkiem, że wyblaknięcie fluoroforu jest minimalne (Rycina 1C).
  10. Aby aktywować PST-1P, przełączyć na laser 405 nm i nagrać kolejny film time-lapse z mocą lasera 405 nm ustawioną na 10%, rozdzielczością pikseli 512 x 512, maksymalnie otwartą przysłoną, czasem przebywania piksela 3,15 µs, powiększeniem 3x, interwałem czasowym 500 ms i łącznie 20 klatkami (Rycina 1D).
  11. Przełączyć z powrotem na laser 561 nm i powtórzyć akwizycję zgodnie z krokiem 3.9, aby potwierdzić zanik komet EB3-dTomato po aktywacji PST-1P (Rycina 1E). Należy upewnić się, że akwizycja ta odbywa się jak najszybciej po aktywacji.
    UWAGA: Krok 3.10 można powtarzać w celu dłuższego hamowania komet EB3-dTomato. Należy jednak uważnie monitorować embriony, aby uniknąć uszkodzeń spowodowanych światłem UV.
  12. Aby przywrócić PST-1P do nieaktywnego stanu trans, użyć lasera 514 nm przy mocy 10%. Nagrać film time-lapse z mocą lasera 514 nm ustawioną na 10%, rozdzielczością pikseli 512 x 512, maksymalnie otwartą przysłoną, czasem przebywania piksela 3,15 µs, powiększeniem 3x, interwałem czasowym 500 ms i łącznie 20 klatkami czasowymi (Rycina 1F).
  13. Powtórzyć krok 3.11, aby zwizualizować powrót komet EB3-dTomato (Rycina 1G).

4. Analiza danych obrazowych

  1. Do analizy i ilościowego określenia hamowania polimeryzacji mikrotubul przez PST należy wykorzystać programy komputerowe dostępne dla badaczy, dopasowane do ich konkretnych potrzeb. Zalecane programy powinny posiadać narzędzie do śledzenia, które umożliwia ręczne lub automatyczne śledzenie ruchu, kierunku i prędkości komet EB3-dTomato16,18.

Schemat aktywacji/dezaktywacji PST-1P przy użyciu laserów; śledzenie komet EB3-dTomato; konfiguracja mikroskopowa.
Rycina 1: Schematyczne przedstawienie fotoaktywacji i dezaktywacji PST-1P w żywym 3D zarodku myszy w okresie przedimplantacyjnym. Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane w całkowitej ciemności (czarne tło) lub wyłącznie przy oświetleniu czerwonym światłem. (A) Żywe zarodki myszy w okresie przedimplantacyjnym wykazujące ekspresję EB3-dTomato są hodowane do stadium 16 komórek, a następnie przenoszone do kropli medium KSOM zawierającego 40 µM PST-1P na szkiełku z komorą obrazową. (B) Obraz 3D całego zarodka umożliwia ocenę wzrostu mikrotubul poprzez wizualizację rozkładu komet EB3-dTomato. (C) Aby rozpocząć eksperyment, komety EB3-dTomato są śledzone w regionie subkomórkowym przy użyciu obrazowania poklatkowego. (D) Następująca fotoaktywacja PST-1P w tym samym regionie subkomórkowym przy użyciu lasera 405 nm skutkuje zanikiem komet EB3-dTomato (E). W razie potrzeby można zastosować intensywniejszą aktywację PST-1P poprzez sekwencyjne naświetlanie światłem 405 nm. (F-G) Aby przywrócić PST-1P do stanu nieaktywnego i odnowić komety EB3-dTomato, do tego samego regionu subkomórkowego przykładany jest laser 514 nm. Jeśli jest to wymagane, można przeprowadzić wielokrotne cykle fotoaktywacji i dezaktywacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z protokołem, do zarodków myszy przed implantacją wstrzyknięto metodą mikroiniekcji cRNA dla EB3, oznakowane czerwonym fluorescencyjnym białkiem dTomato (EB3-dTomato). Umożliwia to wizualizację rosnących mikrotubul, ponieważ EB3 wiąże się z polimeryzującymi końcami plus mikrotubul24.

Doświadczenia przeprowadzono 3 dni po zapłodnieniu (E3), gdy zarodek myszy składa się z 16 komórek. W zależności od badanej kwestii naukowej można wykorzystać dowolny inny przedimpl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Sieć mikrotubul jest integralną częścią podstawowych wewnętrznych funkcji komórki. W związku z tym stanowi to wyzwanie w manipulowaniu dynamiką mikrotubul w organizmach żywych, ponieważ wszelkie zakłócenia w sieci mają zwykle rozległe konsekwencje dla wszystkich aspektów funkcji komórkowych. Pojawienie się fotoprzełączalnych związków ukierunkowanych na mikrotubule stanowi sposób na precyzyjne manipulowanie cytoszkieletem na poziomie subkomórkowym, z doskonałą kontrolą indukcji i odwrócenia zahamowania wzrostu mikrotubul<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak interesów konkurencyjnych lub finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Oliverowi Thorn-Sesholdowi i Li Gao za dostarczenie nam fotostatyn i porad dotyczących przygotowania rękopisu, Monash Production za wsparcie w filmowaniu oraz Monash Micro Imaging za wsparcie mikroskopowe.

Ta praca była wspierana przez projekt National Health and Medical Research Council (NHMRC) grant APP2002507 dla J.Z. oraz Kanadyjski Instytut Badań Zaawansowanych (CIFAR) Stypendium Azrieli dla J.Z. Australijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej jest wspierany przez dotacje rządu stanowego Wiktorii i rządu australijskiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurka aspiratoraSigma-AldrichA5177Do aparatu do aspiracji jamy ustnej
Szkiełka komorowe - LabTekThermo Fisher ScientificNUN155411
kodowanie cRNA dla EB3-dPomidorNr dotyczyPrzygotowane zgodnie z instrukcją producenta przy użyciu zestawu do transkrypcji mMessage in vitro Naczynia
do hodowli - 35mmThermo Fisher Scientific150560
Ludzki hormon wzrostu kosmówkiSigma-AldrichC8554
Płyn jajowodowy (HTF) mediumCosmo-BioCSR-R-B071
Imaris Oprogramowanie do analizy obrazuBitplane
Immersion Oil W 2010Carl Zeiss444969-0000-000Do użytku z obiektywem zanurzeniowym
LED do mikroskopu - czerwone światłoCelestron93588
M2 średniSigma-AldrichM7167
Myszy - typ dziki FVB/N, samce i samiceN/AN/ASamice w wieku 8-9 tygodni. Samce w wieku 2-6 miesięcy.
Pipety mikrokapilarne - KimbleSigma-AldrichZ543306Do aparatury do aspiracji jamy ustnej
Bufor do mikroiniekcjiN/AN/D5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,4
Olej mineralnyOrigioART-4008-5P
mMessage Zestaw do transkrypcji in vitro Zestaw do transkrypcjiThermo Fisher ScientificAM1340
NanoDrop SpektrofotometrThermo Fisher Scientific
Potassium Simplex Optimized Medium (KSOM)medium Cosmo-BioCSR-R-B074
Gonadotropina surowicy klaczyciężarnych Prospec BioHOR-272
PST-1PN/AN/ABorowiak, M. et al., Fotoprzełączalne inhibitory dynamiki mikrotubul optycznie kontrolują mitozę i śmierć komórki. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).
Zestaw do oczyszczania RNASangonB511361-0100
Ultraczysta wodaSigma-AldrichW1503
ZEN Black SoftwareCarl Zeiss

Bibliografia

  1. Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells. Development. 148 (20), (2021).
  2. Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).
  3. Galli, M., Morgan, D. O. Cell size determines the strength of the spindle assembly checkpoint during embryonic development. Developmental Cell. 36 (3), 344-352 (2016).
  4. Vazquez-Diez, C., Paim, L. M. G., FitzHarris, G. Cell-size-independent spindle checkpoint failure underlies chromosome segregation error in mouse embryos. Current Biology. 29 (5), 865-873 (2019).
  5. Baudoin, J. P., Alvarez, C., Gaspar, P., Metin, C. Nocodazole-induced changes in microtubule dynamics impair the morphology and directionality of migrating medial ganglionic eminence cells. Developmental Neuroscience. 30 (1-3), 132-143 (2008).
  6. Munz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312(2018).
  7. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  8. Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
  9. Borowiak, M., et al. Photoswitchable inhibitors of microtubule dynamics optically control mitosis and cell death. Cell. 162 (2), 403-411 (2015).
  10. Gaspari, R., Prota, A. E., Bargsten, K., Cavalli, A., Steinmetz, M. O. Structural basis of cis- and trans-Combretastatin binding to tubulin. Chem. 2 (1), 102-113 (2017).
  11. Thorn-Seshold, O., Meiring, J. Photocontrolling microtubule dynamics with photoswitchable chemical reagents. ChemRxiv. , (2021).
  12. Kopf, A., et al. Microtubules control cellular shape and coherence in amoeboid migrating cells. Journal of Cell Biology. 219 (6), 201907154(2020).
  13. Sawada, M., et al. PlexinD1 signaling controls morphological changes and migration termination in newborn neurons. The EMBO Journal. 37 (4), 97404(2018).
  14. Singh, A., et al. Polarized microtubule dynamics directs cell mechanics and coordinates forces during epithelial morphogenesis. Nature Cell Biology. 20 (10), 1126-1133 (2018).
  15. Kepiro, M., et al. Azidoblebbistatin, a photoreactive myosin inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (24), 9402-9407 (2012).
  16. Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
  17. White, M. D., Zenker, J., Bissiere, S., Plachta, N. Instructions for assembling the early mammalian embryo. Developmental Cell. 45 (6), 667-679 (2018).
  18. Zenker, J., et al. Expanding actin rings zipper the mouse embryo for blastocyst formation. Cell. 173 (3), 776-791 (2018).
  19. Theisen, U., et al. Microtubules and motor proteins support zebrafish neuronal migration by directing cargo. Journal of Cell Biology. 219 (10), 201908040(2020).
  20. Rulicke, T. Pronuclear microinjection of mouse zygotes. Methods in Molecular Biology. 254, 165-194 (2004).
  21. Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio-protocol. 11 (15), 4104(2021).
  22. Subramanian, G. N., et al. Oocytes mount a noncanonical DNA damage response involving APC-Cdh1-mediated proteolysis. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201907213(2020).
  23. Mihajlovic, A. I., Bruce, A. W. The first cell-fate decision of mouse preimplantation embryo development: integrating cell position and polarity. Open Biology. 7 (11), 170210(2017).
  24. Roostalu, J., et al. The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability. Elife. 9, 51992(2020).
  25. Gao, L., et al. In vivo photocontrol of microtubule dynamics and integrity, migration and mitosis, by the potent GFP-imaging-compatible photoswitchable reagents SBTubA4P and SBTub2M. BioRxiv. bioRxiv. , (2021).
  26. Tichy, A. M., Gerrard, E. J., Legrand, J. M. D., Hobbs, R. M., Janovjak, H. Engineering strategy and vector library for the rapid generation of modular light-controlled protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3046-3055 (2019).
  27. van Haren, J., Adachi, L. S., Wittmann, T. Optogenetic control of microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 2101, 211-234 (2020).
  28. Adikes, R. C., Hallett, R. A., Saway, B. F., Kuhlman, B., Slep, K. C. Control of microtubule dynamics using an optogenetic microtubule plus end-F-actin cross-linker. Journal of Cell Biology. 217 (2), 779-793 (2018).
  29. Kogler, A. C., et al. Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos. Developmental Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).
  30. Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
  31. Bukhari, S. N. A., Kumar, G. B., Revankar, H. M., Qin, H. L. Development of combretastatins as potent tubulin polymerization inhibitors. Bioorganic Chemistry. 72, 130-147 (2017).
  32. Gilazieva, Z., Ponomarev, A., Rutland, C., Rizvanov, A., Solovyeva, V. Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine. Cancers (Basel). 12 (10), 2727(2020).
  33. Scherer, K. M., et al. Three-dimensional imaging and uptake of the anticancer drug combretastatin in cell spheroids and photoisomerization in gels with multiphoton excitation. Journal of Biomedical Optics. 20 (7), 78003(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Manipulacja czasoprzestrzennaobrazowanie żywych komórekmikroskopia konfokalnapolimeryzacja mikrotubulśledzenie EB3-dTomatofotoprzekączalne inhibitory
Czasoprzestrzenna subkomórkowa manipulacja cytoszkieletu mikrotubul w żywym zarodku myszy przed implantacją za pomocą fotostatyn
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.