Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Podsumowanie

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Streszczenie

Wczesne zarodki Drosophila to duże komórki zawierające szeroki wachlarz konwencjonalnych i specyficznych dla zarodków organelli. W ciągu pierwszych trzech godzin embriogenezy organelle te przechodzą dramatyczne ruchy napędzane przez cytoplazmatyczne strumienie oparte na aktynie i napędzany motorycznie transport wzdłuż mikrotubul. Opracowanie wielu małych, specyficznych dla organelli sond fluorescencyjnych (FP) umożliwia wizualizację szerokiej gamy różnych struktur zawierających lipidy w dowolnym genotypie, umożliwiając obrazowanie na żywo bez konieczności stosowania genetycznie kodowanego fluoroforu. Protokół ten pokazuje, jak wstrzykiwać niezbędne barwniki i sondy molekularne do zarodków Drosophila w celu monitorowania transportu określonych organelli za pomocą obrazowania na żywo. Podejście to demonstruje się poprzez znakowanie kropelek lipidów (LD) i śledzenie ich ruchu masowego za pomocą prędkości obrazu cząstek (PIV). Protokół ten zapewnia strategię podatną na badanie innych organelli, w tym lizosomów, mitochondriów, pęcherzyków żółtkowych i ER, a także do śledzenia ruchu poszczególnych LD wzdłuż mikrotubul. Stosowanie dostępnych na rynku barwników przynosi korzyści płynące z separacji na fioletowo-niebieskie i dalece czerwone obszary spektrum. Dzięki wielokrotnemu znakowaniu organelli i/lub elementów cytoszkieletu za pomocą mikroiniekcji, wszystkie zasoby genetyczne Drosophila są dostępne do badań nad transportem bez konieczności wprowadzania białek znakowanych fluorescencyjnie. W przeciwieństwie do genetycznie kodowanych fluoroforów, które mają niską wydajność kwantową i łatwo wybielają, wiele dostępnych barwników pozwala na szybkie i jednoczesne wychwytywanie kilku kanałów o wysokiej wydajności fotonów.

Wprowadzenie

Niezbędne barwniki i sondy molekularne są potężnymi narzędziami do obrazowania na żywo określonych struktur komórkowych i organelli. W zarodku Drosophila wiele różnych organelli wykazuje lokalizację sterowaną przez cytoszkielet^1,2,3,4, ale zastosowanie tych małych cząsteczek jest trudne, ponieważ skorupka jaja jest nieprzepuszczalna dla wielu z nich. Protokół ten opisuje metodę stosowania sond fluorescencyjnych (FP) w żywych zarodkach za pomocą mikroiniekcji w celu wykrycia transportu organelli na dużą skalę. Procedura obejmuje przygotowanie roztworu do wstrzykiwań, pobranie komórek jajowych i przygotowanie zarodków, mikroiniekcję, obrazowanie i analizę obrazu.

Dramatyczne przestrzenne przegrupowania organelli są powszechne w wielu zwierzęcych oocytach, jajach i zarodkach, częściowo z powodu dużych rozmiarów tych komórek. Na przykład w zarodku Drosophila kropelki lipidów (LD) i pęcherzyki żółtkowe przemieszczają się w kierunku środka zarodka tuż przed komórkowaniem⁵. Ruch ten zależy od mikrotubul i pozostawia obszar ~40 μm na całym obwodzie zarodka pozbawiony dwóch organelli. Podczas wcześniejszych etapów rozszczepienia wiele organelli jest transportowanych przez przepływy cytoplazmatyczne, które są napędzane przez skurcze oparte na aktynie i miozynie na powierzchni zarodka⁶. Chociaż zarodki wielu gatunków wykazują podobne przegrupowania, zarodek Drosophila jest szczególnie odpowiedni do śledzenia tych procesów za pomocą obrazowania, ponieważ rozwija się zewnętrznie w standardowej laboratoryjnej "temperaturze pokojowej", jest stosunkowo przezroczysty, wystarczająco mały, aby zmieścić się w większości zestawów mikroskopowych i może być manipulowany za pomocą potężnych narzędzi genetycznych.

Dla niektórych organelli dostępne są fluorescencyjnie znakowane białka, które specjalnie opisują te struktury. Na przykład LSD-2 (znany również jako dPLIN2) jest białkiem, które w zarodkach jest specyficznie ukierunkowane na LDs⁷. Dostępne są linie muchowe, które przenoszą albo indukowane transgeny kodujące fuzję między białkiem zielonej fluorescencji (GFP) a LSD-2⁸, albo pułapkę genową, w której żółte białko fluorescencyjne (YFP) jest wprowadzane do regionu kodującego endogennego genu LSD-2^9,10. Podejście to ma jednak ograniczenia, w tym to, że te białka fuzyjne mają niską wydajność kwantową i mają tendencję do łatwego wybielania. Ponadto jednoczesne znakowanie wielu różnych struktur może być trudne: w przypadku wielu organelli obecnie dostępny jest tylko jeden rodzaj znacznika fluorescencyjnego (często GFP lub mCherry), więc obrazowanie dwóch organelli w tym samym czasie może wymagać nowych transgenów lub insercji; Ponadto, nawet jeśli dostępne są kompatybilne znaczniki, wprowadzenie ich do jednego szczepu może wymagać czasochłonnych krzyżówek. Sprawia to również, że korzystanie z wielu potężnych zasobów genetycznych jest mniej wygodne, np. jeśli dwa markery organelli, czynnik napędzający Gal4 i indukowalny konstrukt RNAi muszą być obecne u tej samej matki.

Zasadniczo, te ograniczenia można przezwyciężyć za pomocą FPs, w tym niezbędnych barwników (np. LysoTracker do oznaczania lizosomów), sond molekularnych (np. SiR-tubulina do oznaczania mikrotubul) i fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek biologicznych (np. C12 BODIPY do badania metabolizmu kwasów tłuszczowych¹¹). Ze względu na zastosowanie w hodowanych komórkach, są one zazwyczaj dobrze zweryfikowane jako potężne narzędzia do badania biologii komórkowej. FP są wszechstronne, mają doskonałe właściwości fotograficzne i są kompatybilne z białkami fluorescencyjnymi. Wiele barwników można mieszać i nakładać jednocześnie, często z korzyścią płynącą z separacji na fioletowo-niebieskie i dalekie czerwone obszary widma oraz małych przesunięć Stokesa, zapobiegając przedostawaniu się kanału. Małe przesunięcia Stokesa pozwalają na jednoczesne uchwycenie wielu kanałów obrazowania, umożliwiając śledzenie kilku organelli jednocześnie. Wreszcie, można je również stosować do znakowania organelli w zarodkach innych gatunków Drosophila, a nawet innych owadów, w których nie są dostępne białka znakowane fluorescencyjnie.

Jednak większość z tych FP nie może przejść przez skomplikowaną skorupę jajową zarodka Drosophila. Składa się z pięciu warstw: trzech zewnętrznych warstw kosmówkowych (kosmówki), które zapobiegają uszkodzeniom mechanicznym, oraz woskowej warstwy otaczającej błonę witelinową, która tworzy barierę chemiczną¹². Dla uproszczenia połączenie warstwy woskowej i membrany witelinowej będzie poniżej określane jako "membrana witelinowa". Aby ominąć skorupkę jaja, protokół ten dostosowuje sprawdzone podejście do mikroiniekcji zarodka w celu wprowadzenia FP do zarodka Drosophila. Protokół opisuje, w jaki sposób monitorować przepływ cytoplazmatyczny LD w zarodkach w fazie rozszczepienia. Obejmuje przygotowanie igieł iniekcyjnych i klatek do pobierania komórek jajowych, proces pobierania komórek jajowych oraz mechaniczne usuwanie kosmówki. Omówiono w nim, jak mikrowstrzykiwać i obrazować zarodki oraz jak analizować masowy przepływ LD za pomocą prędkości obrazowania cząstek (PIV, zaadaptowane z⁶). Zawiera porady dotyczące rozwiązywania problemów, aby zapewnić przeżycie zarodka i stworzyć najlepszy system do obrazowania. Omówiono również, w jaki sposób protokół może być modyfikowany w celu jednoczesnego obrazowania LD i mikrotubul lub zastosowania go do badania innych organelli, w tym lizosomów, mitochondriów, pęcherzyków żółtkowych i retikulum endoplazmatycznego (ER).

Protokół

1. Przygotuj niezbędne materiały

UWAGA: Te przygotowania najlepiej wykonywać kilka dni lub tygodni wcześniej.

1. Przygotuj igły do wstrzykiwań.
   UWAGA: Igły można przechowywać przez czas nieokreślony w zakrytym pojemniku. Igły muszą być wystarczająco cienkie, aby dostarczyć ~ 700 fL, a jednocześnie wystarczająco mocne, aby przebić błonę witelinową.
   1. Umieść kapilar w uchwycie kapilary na ściągaczu igieł. Zabezpiecz kapilarę nakrętkami motylkowymi. Wyrównaj środek kapilary z elementem grzejnym tak, aby powstały dwie symetryczne igły.
   2. Wybierz odpowiednie ustawienia na ściągaczu igłowym zgodnie z instrukcjami producenta.
   3. Przeprowadź kontrolę jakości za pomocą lunety sekcyjnej.
      UWAGA: Końcówki igieł powinny być tak cienkie, jak to możliwe. Pęknięte, postrzępione lub o dużym otworze końcówki igieł są odrzucane.
   4. Przygotuj partie po 10 igieł (o wartości 5 naczyń włosowatych) na raz.
   5. Umieść odkształcalną szpachlę, która została zwinięta w cylinder, na środku dna pojemnika z pokrywką. Ostrożnie wciśnij igły w kit tak, aby utrzymywał je poziomo, a końcówki igieł były bezpiecznie zawieszone w powietrzu, aby zapobiec uszkodzeniu. Przykryj pokrywką i przechowuj do użycia.
2. Przygotuj talerze do zbierania jajek. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Talerze do zbierania jaj to małe talerze agarowe uzupełnione sokiem owocowym, aby zachęcić do składania jaj. Sposób ich przygotowania jest opisany w wielu protokołach, w tym¹³.
3. Przygotuj klej heptanowy.
   UWAGA: Ten klej jest usuwany z taśmy dwustronnej i służy do bezpiecznego mocowania zarodków do szkiełka nakrywkowego. Zapobiega to unoszeniu się zarodka w nieostrości podczas wstrzykiwania i obrazowania. Klej można przygotować z kilkudniowym lub tygodniowym wyprzedzeniem.
   1. Zwiń taśmę dwustronną do rozmiaru większego niż piłeczka golfowa i umieść ją na dnie szklanego pojemnika o pojemności ~50 ml ze szczelnie zamykającą się pokrywką. Owiń taśmę szczelnie, aby była wystarczająca ilość kleju.
   2. W dygestorium napełnij szklany pojemnik heptanem, aby zakryć całą taśmę. Przechowywać pojemnik szczelnie zamknięty, gdy nie jest używany.
      UWAGA: Heptan jest łatwopalny w postaci cieczy i pary. Może powodować podrażnienie oczu, skóry i dróg oddechowych. Wdychanie oparów może powodować senność, zawroty głowy i uszkodzenie płuc. Trzymaj heptan z dala od źródeł zapłonu i przechowuj go w dobrze wentylowanym miejscu przeznaczonym dla materiałów łatwopalnych i z dala od niekompatybilnych substancji.
   3. Pozostaw klej heptanowy na noc lub dłużej. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, umieść pojemnik na noc na wytrząsarce lub innym mieszadle, aby pomóc w rozpuszczeniu kleju.
      UWAGA: Sama taśma pozostanie, ale klej rozpuści się w heptanie. W kroku 5.1.2 klej nakłada się na szkiełko nakrywkowe; Heptan odparowuje, pozostawiając klej.
   4. Przetestuj preparat kleju heptanowego, umieszczając jego kroplę na szkiełku podstawowym i upewniając się, że po odparowaniu heptanu pozostała lepka pozostałość. Jeśli pozostałości kleju nie są później widoczne, dodaj więcej taśmy do szklanego pojemnika i powtórz poprzedni krok.
      UWAGA: Raz przygotowany klej może być używany przez miesiące, a nawet lata.
4. Przygotować roztwór podstawowy BODIPY493/503 o stężeniu 1 mg/ml (3,8 mM), rozcieńczając otrzymany w handlu preparat w czystym bezwodnym roztworze DMSO. Trzymaj go pod przykryciem, aby chronić go przed światłem i wodą. Przechowywać przez czas nieokreślony w temperaturze -20 °C lub krótkotrwale w temperaturze 4 °C.

2. Przygotuj klatki do zbierania jaj

UWAGA: Zrób to co najmniej dzień (najlepiej 2 lub 3 dni) przed planowanym wstrzyknięciem.

1. Przygotuj pastę drożdżową.
   UWAGA: Pasta drożdżowa uzupełnia białko i inne niezbędne składniki odżywcze, które nie znajdują się w talerzach z sokiem jabłkowym. Wspomaga produkcję jaj i składanie jaj.
   1. Dodaj 2-10 g suchych drożdży piekarskich, a następnie 1 ml wody z kranu do małej zlewki. Wymieszaj za pomocą szpatułki.
   2. Dodawaj wodę z kranu w odstępach co 1 ml, aż do uzyskania pożądanej konsystencji pasty do zębów.
   3. Przykryj mieszaninę i przechowuj w temperaturze 4 °C.
2. Ustaw klatki na muchy do zbierania jaj.
   UWAGA: Wymagane są samce i samice much o pożądanym genotypie: 10-50 samic w wieku poniżej 2 tygodni i podobna liczba samców. Dostępnych jest wiele różnych opcji klatek na muchy, w tym opcje domowej roboty^14,13. Ważne jest, aby rozmiar talerzy z sokiem jabłkowym był dopasowany do wielkości klatek na muchy.
   1. Umieść niewielką warstwę pasty drożdżowej na talerzu z sokiem jabłkowym. Trzymaj go pod przykryciem i pozwól mu osiągnąć temperaturę pokojową, ponieważ muchy nie złożą jaj na talerzu, jeśli jest zbyt zimno.
   2. Przenieś muchy do klatki do pobierania zarodków, zamknij płytką z drożdżowym sokiem jabłkowym i przymocuj płytkę do klatki pobierania zarodków.
   3. Pozwól nowo przeniesionym muchom zaaklimatyzować się w klatce przez 1-2 dni, codziennie wymieniając talerz na świeży. Jeśli wszystkie drożdże zostaną zjedzone do następnego dnia, zwiększ ilość pasty drożdżowej do przyszłych zbiorów.
      UWAGA: Jest to ważny krok w kierunku zwiększenia wydajności jaj, ponieważ dobrze odżywione samice składają więcej jaj.

3. W dniu wstrzyknięcia przygotuj roztwór do wstrzykiwań i załaduj go do igły

1. Jako roztwór do wstrzykiwań należy użyć roztworu podstawowego BODIPY 493/503 (3,8 mM w DMSO).
2. Umieścić na pojedynczej igłę 1 μl roztworu do wstrzykiwań za pomocą końcówek do ładowania igły.
   UWAGA: Staraj się, aby płyn dotarł aż do końcówki bez zatrzymywania pęcherzyków powietrza. Przygotuj się na szybką wymianę załadowanej igły w przypadku przypadkowego złamania.
   1. Przymocować końcówkę ładującą do mikropipety i pobrać 1 μl roztworu do wstrzykiwań do końcówki. Używając rękawiczek, trzymaj igłę w jednej ręce z końcówką skierowaną na zewnątrz, aby zminimalizować ryzyko złamania.
   2. Ostrożnie włożyć końcówkę ładującą do igły i docisnąć ją do końcówki igły. Dozować płyn w pobliżu końcówki igły. Po wyjęciu pipety trzymaj igłę pionowo końcówką w dół, aż płyn spłynie do końcówki.
3. Przechowuj załadowane igły w osobnym pojemniku z kitem, jak powyżej (patrz krok 1.1.5).
   UWAGA: Igły należy przygotować z wyprzedzeniem (do kilku godzin) po wstrzyknięciu, ale nie należy ich używać po upływie więcej niż jednego dnia.
4. Trzymaj igły z dala od światła otoczenia, aby zapobiec wybielaniu barwników. Przykryj pojemnik do przechowywania folią aluminiową, nie uszkadzając końcówek igieł. Upewnij się, że całe światło jest zasłonięte.

4. Pobieranie zarodków do iniekcji

UWAGA: Czas pobierania zależy od tego, na jakim etapie zarodków należy wykonać zastrzyk. Zgodnie z poniższym schematem czasowym, zarodki w momencie przygotowania do wstrzyknięcia będą miały od 0 do 90 minut, co odpowiada etapom rozszczepienia¹⁵.

1. W dniu wstrzyknięcia należy przygotować talerze z sokiem jabłkowym z drożdżami, jak w kroku 2.2.1. Jeśli planowanych jest N serii wstrzyknięć, należy przygotować N + 2 płytki. Przechowuj te talerze w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Oprócz płytek N do pobierania zarodków do wstrzykiwań, jedna płytka jest potrzebna jako płytka do pobrania wstępnego, a druga do karmienia much w klatce po zakończeniu pobierania.
2. Zastąp płytkę na klatce świeżą płytką drożdżową (płytka do pobrania przed pobraniem) i pozostaw ją na klatce na 1-2 godziny.
3. Wymień płytkę na klatce na świeżą płytkę (płytkę zbiorczą). Wyrzuć płytkę do pobrania pobrania, ponieważ będzie ona zawierać zarodki starsze niż pożądane. Następnie pozwól muchom złożyć jaja przez 1,5 godziny < br /> UWAGA: Ponieważ dobrze odżywione muchy zazwyczaj składają jaja wkrótce po zapłodnieniu jaj, 1,5-godzinny czas pobierania zapewnia, że pod koniec pobierania większość zarodków na płytce ma od 0 do 90 minut, tj. jest w fazie rozszczepienia. Samice much, które nie były karmione świeżymi drożdżami od poprzedniego dnia, będą miały tendencję do zatrzymywania zapłodnionych jaj przez nieokreślony czas przed złożeniem. W związku z tym na płytce przed pobraniem mogą znajdować się zarodki, które zostały zapłodnione przed rozpoczęciem pobierania, a zatem są starsze niż 60 minut, czasami znacznie starsze.
4. Zamień talerz na klatce na świeży talerz drożdżowy. Przykryj talerz zbiorczy, aby zabłąkane muchy nie składały na nich jaj.

5. Przygotowanie zarodków do mikroiniekcji

1. Zbierz potrzebne materiały.
   1. Przymocuj kawałek taśmy dwustronnej do szklanego szkiełka. Unikaj dotykania taśmy palcami, ponieważ zmniejsza to jej lepkość.
      UWAGA: Ten szkiełko będzie używane do usuwania kosmówki, a nie do obrazowania.
   2. Za pomocą pipety transferowej lub mikropipety (p200 lub p1000) umieść małą kroplę (200 μl lub mniej) kleju heptanowego mniej więcej na środku prostokątnego szkiełka nakrywkowego (60 x 25 mm). Pozwól heptanowi odparować (zajmuje to mniej niż minutę).
      UWAGA: Szkiełko nakrywkowe będzie używane do mocowania zarodków do wstrzykiwań i obrazowania. Wymiary są dobrane tak, aby pasowały do regulowanego metalowego uchwytu mikroskopu konfokalnego.
   3. Zamontuj komorę osuszania, szczelną komorę (np. pudełko na kanapki Tupperware) zawierającą kulki osuszające. Używaj tylko kulek osuszających, które nie zostały uwodnione.
      UWAGA: Aby upewnić się, że zarodki przyjmą roztwór do wstrzykiwań, zarodek musi być lekko wysuszony w celu zmniejszenia ciśnienia wewnętrznego. Odbywa się to poprzez umieszczenie szkiełka nakrywkowego z odkorionowanymi, wystawionymi na działanie powietrza zarodkami w komorze wysuszającej.
2. Mechanicznie usuń kosmówkę.
   1. Przykryj odpowiednio starą płytkę zarodkową cienką warstwą oleju halowęglowego 27, aby skorupka jajka stała się przezroczysta.
      UWAGA: Zarodki stają się przezroczyste w ciągu kilkudziesięciu sekund¹⁵. Jeśli ten krok nie przebiegnie sprawnie, talerze z sokiem jabłkowym mogą być zbyt mokre i należy je wysuszyć przed użyciem.
   2. Obejrzyj płytkę pod lunetą separacyjną z transoświetleniem (tj. światłem przechodzącym przez płytkę do okularów), aby potwierdzić stadium zarodków.
   3. Selekcja zarodków w fazie rozszczepienia.
      UWAGA: Zarodki w fazie rozszczepienia są całkowicie nieprzezroczyste; Kolejne stadia blastodermy można rozpoznać po paśmie przezroczystej cytoplazmy wokół nieprzezroczystego środka¹⁵. Dobre wprowadzenie do tego, jak rozpoznać różne stadia embrionalne, jest dostępne na stronie internetowej (podanej w reference¹⁶) prowadzonej przez Society of Developmental Biology.
   4. Za pomocą cienkiej pęsety chwyć zarodek w pożądanym stadium za jego grzbietowe przydatki i przenieś go na przygotowane szkiełko pokryte kawałkiem taśmy dwustronnej. Umieść zarodek na taśmie. Zminimalizuj przenoszenie oleju.
   5. Tak delikatnie, jak to możliwe, przetocz zarodek po powierzchni taśmy, delikatnie popychając zarodek bokiem końcówki pęsety. Nie szturchaj zarodka bezpośrednio ostrymi końcówkami pęsety.
      UWAGA: Jeśli przyłożona siła jest zbyt mała, zarodek nie będzie się toczył. Jeśli jest zbyt wysoki, pęknie. Znalezienie odpowiedniej siły pośredniej wymaga doświadczenia, dlatego ten krok należy wcześniej przećwiczyć.
   6. Kontynuuj zwijanie zarodka, aż kosmówka przejściowo przylgnie do taśmy i pęknie.
   7. Gdy kosmówka pęknie, kontynuuj toczenie, aby oddzielić zarodek (nadal wewnątrz błony witeliny) od kosmówki, ponieważ kosmówka pozostaje przyklejona do taśmy.
   8. Upewnij się, że kosmówka została całkowicie usunięta, obserwując utratę przydatków grzbietowych z zarodka.
   9. Zwiń zarodek z powrotem na kosmówkę, która jest mniej przyczepna niż taśma. Delikatnie pocieraj zarodek pęsetą, aż przyczepi się do pęsety w celu transferu.
   10. Przenieś zarodek na szkiełko nakrywkowe za pomocą kleju heptanowego i doprowadź go do kontaktu z klejem, co zwykle odrywa go od pęsety.
   11. Dostosuj orientację zarodka na szkiełku nakrywkowym.
       1. Zanurz boczną powierzchnię zarodka w kleju.
          UWAGA: Powierzchnia zarodka osadzona w kleju to ta, która zostanie zobrazowana. Osadzenie powierzchni bocznej jest najprostsze, ale można to dostosować w zależności od osobistych preferencji lub pytania biologicznego, na które należy odpowiedzieć.
       2. Ustawić długą oś zarodka prostopadle do długiej osi szkiełka nakrywkowego.
       3. Jeśli zarodek nie układa się w preferowanej orientacji, wyczyść pęsetę, aby usunąć olej, który mógłby oderwać zarodek od kleju. Następnie delikatnie spróbuj przetoczyć zarodek na miejsce.
   12. Przygotować żądaną liczbę zarodków do wstrzyknięcia w sposób opisany powyżej.
       UWAGA: W miarę upływu czasu od usunięcia kosmówki, otaczające powietrze zacznie wysuszać zarodki, a zatem efekt kroku 5.3 będzie nierówny dla zarodków na szkiełku nakrywkowym, które zostały zdekorionowane w różnym czasie. Zazwyczaj 1-3 zarodki są najbardziej łatwe do opanowania.
3. Wysuszyć zarodki.
   1. Umieścić szkiełko nakrywkowe z zarodkami w przygotowanej komorze osuszania i zapieczętować je.
   2. Pozwól zarodkom wyschnąć przez 5-12 minut.
      UWAGA: Czas wykonania tego kroku zależy od temperatury i wilgotności otoczenia, dlatego należy go określić empirycznie.
   3. Wyjmij szkiełko nakrywkowe z komory i umieść na nim kroplę oleju Halocarbon Oil 700, całkowicie zakrywając zarodki, aby zapobiec dalszemu wysuszeniu.
   4. Zbadaj zarodki na lunecie preparucyjnej, aby ocenić prawidłowe wysuszenie.
   5. Jeśli zarodki są tylko lekko pomarszczone, ale nie opróżnione, przystąp do mikroiniekcji (krok 6).
   6. Jeśli zarodki nie są wystarczająco lub nadmiernie wysuszone, wróć do kroku 5.2 i przygotuj nową partię zarodków, ponieważ nie można usunąć oleju Halocarbon Oil 700. Jeżeli zarodki były nadmiernie wysuszone, skróć czas suszenia następnej partii zarodków o 3 minuty; Jeśli były niedostatecznie wysuszone, wydłuż czas suszenia o 3 minuty.

6. Mikroiniekcja zarodków

UWAGA: Upewnij się, że zestaw do mikroiniekcji zawiera mikroskop odwrócony, mikromanipulator do przytrzymywania i pozycjonowania igły iniekcyjnej oraz komercyjny mikrowtryskiwacz do dostarczania kontrolowanych objętości.

1. Włącz mikrowtryskiwacz i wprowadź preferowane ustawienia.
   UWAGA: W przypadku tego protokołu zaleca się korzystanie z wyjścia ruchu liniowego i szybkiego ustawienia, ale wiele innych będzie działać. Operator powinien określić osobiste preferencje.
2. Załadować igłę do mikromanipulatora. Aby zapobiec uszkodzeniu igły podczas ładowania szkiełka nakrywkowego zawierającego zarodki, należy przesunąć ją z drogi do bezpiecznej pozycji.
3. Umieść szkiełko nakrywkowe na scenie, z zarodkami na wierzchu, w kierunku igły. Następnie ostrożnie przesunąć igłę z powrotem na miejsce do wstrzyknięcia, tak aby jej końcówka znajdowała się znacznie powyżej stopnia.
4. Umieść obiektyw 4x na ścieżce światła. Za pomocą pokrętła ostrości na mikroskopie ustaw ostrość zarodków.
   UWAGA: Będzie to płaszczyzna ogniskowa używana do wstrzykiwania i będzie regulowana tylko minimalnie do przodu.
5. Za pomocą elementów sterujących stolika przesuń zarodki poziomo do środka pola widzenia.
   1. Odsuń się od zarodków, trzymając je na krawędzi pola widzenia, przygotowując się do opuszczenia igły. Pozostań w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, aby upewnić się, że igła jest opuszczona do właściwej pozycji.
6. Opuść końcówkę igły do właściwej płaszczyzny ogniskowej i upewnij się, że jest widoczna w polu view razem z zarodkami.
   1. Używając elementów sterujących mikromanipulatora i patrząc z góry (jeszcze nie przez okulary), powoli wrzuć końcówkę igły do oleju, celując w obszar, na który wskazuje obiektyw. Ponieważ olej jest dość lepki, idź powoli, aby uniknąć uszkodzenia igły.
   2. Gdy igła będzie widoczna przez okulary, kontynuuj korzystanie z elementów sterujących mikromanipulatora, aż końcówka igły znajdzie się w ostrości i w środku pola widzenia.
   3. Przesuwając stolik, przywróć zarodki do środka pola widzenia. Użyj kontroli stolika, elementów sterujących mikromanipulatora i pokrętła ostrości, aby precyzyjnie dostroić położenie zarodka i końcówki igły względem siebie, gdy oba są ostre. Należy dążyć do wykonania iniekcji jak najbliżej szkiełka nakrywkowego.
7. Przeprowadzić kontrolę jakości igły.
   1. Aby upewnić się, że igła jest funkcjonalna, należy dozować część roztworu do wstrzykiwań do oleju Halocarbon Oil 700 otaczającego zarodek, widocznego jako pęcherzyk w oleju.
   2. Jeśli nic nie wypływa z igły, stopniowo zwiększaj ciśnienie na wtryskiwaczu. Jeśli to nie zadziała, zaopatrz się w nową igłę.
8. Wstrzyknąć zarodek.
   UWAGA: Dopuszczalne objętości wstrzyknięć wahają się od ~0,06-1 pL. Dolna granica jest wyznaczana przez to, co można zwizualizować wchodząc do zarodka. Górna granica jest wyznaczana przez uraz, jaki wstrzyknięcie wywiera na zarodek.
   1. Wstrzyknąć wzdłuż bocznych krawędzi zarodka, ponieważ jest to najmniej inwazyjne.
   2. Korzystając z elementów kontrolnych stopnia, przesuwaj zarodek w kierunku końcówki igły, aż ta ostatnia delikatnie nakłuje zarodek i wejdzie do niego.
   3. W tym samym czasie należy rozpocząć przepływ roztworu do wstrzykiwań i obserwować, czy w miejscu końcówki igły nie pojawia się przejściowa przezroczysta plama, która wskazuje na pomyślne przeniesienie płynu do zarodka.
   4. Monitoruj zarodek. Jeśli zarodek opiera się igłą i pęka (cytoplazma wytryskuje) po wejściu, wróć do kroku 5 i wydłuż czas suszenia. Jeśli zarodek przylega płasko do szkiełka nakrywkowego i wydaje się wiotki podczas wstrzyknięcia, należy powrócić do kroku 5 i skrócić czas wysychania.
   5. Jeśli do zarodka nie dostał się żaden barwnik, należy upewnić się, że barwnik może nadal swobodnie wypływać z igły, jak w kroku 6.7. Jeśli barwnik nie płynie, wymień igłę. Jeśli barwnik wypłynie, wstrzyknij nowy zarodek i zacznij uwalniać barwnik tuż przed nakłuciem zarodka przez igłę.
      UWAGA: Nie zaleca się wielokrotnego wstrzykiwania tego samego zarodka, ponieważ powoduje to pęknięcie poprzedniej rany/miejsca wstrzyknięcia.
9. Powtarzaj, aż wszystkie zarodki zostaną wstrzyknięte.

7. Obraz zarodków

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje laserowy skaningowy mikroskop konfokalny.

1. Umieścić szkiełko nakrywkowe w metalowym uchwycie mikroskopu konfokalnego tak, aby zarodki były obrazowane bezpośrednio od dołu przez szkiełko nakrywkowe; nad szkiełkiem nakrywkowym znajduje się tylko olej i żadna inna bariera.
2. Jako etap kontroli jakości, najpierw zobrazuj za pomocą funkcji epifluorescencji w mikroskopie konfokalnym, z obiektywem 40x. Przed kontynuowaniem upewnij się, że fluorofor jest widoczny w zarodku.
3. Jeśli pożądana płaszczyzna obrazowania różni się od miejsca wstrzyknięcia, należy odczekać wystarczająco dużo czasu, aby barwnik dyfundował do obszaru docelowego.
   UWAGA: W przypadku BOPIPY 493/503 czas ten zazwyczaj wynosi od 30-60 min. Ponieważ czas dyfuzji zależy w dużej mierze od barwnika, inne barwniki mogą wymagać optymalizacji miejsca wstrzyknięcia i czasu oczekiwania.
4. Używaj różnych obiektywów do obrazowania w różnych skalach. Użyj obiektywu 40x, aby zobrazować cały zarodek i obiektywu 63x, aby zobrazować podsekcje w mniejszych skalach.
5. W przypadku obrazowania na żywo w fazach syncytialnych przed komórkalizacją, należy na początek zastosować następujące warunki: rozmiar obrazu 512 x 512 pikseli, średnia linii 3, liczba klatek na sekundę 0,1 klatki na sekundę (tj. 1 klatka rejestrowana co 10 s). Dostosuj warunki do możliwości zastosowanego mikroskopu.
   UWAGA: Te warunki pozwalają na uzyskanie ~500+ obrazów z BOPIPY 493/503 i uchwycenie większości ruchu.

8. Analizuj przepływ LD, najpierw używając FIJI do przygotowania szeregu czasowego obrazów, a następnie pythona do analizy PIV

1. Zoptymalizuj pozyskiwanie obrazów.
   1. Wykonaj iniekcje pożądanego barwnika na odpowiednim etapie. Powtarzaj ten krok, aż zmienność z dnia na dzień będzie znikoma.
   2. Zoptymalizuj ustawienia akwizycji obrazu, w tym powiększenie, powiększenie, rozdzielczość i liczbę klatek na sekundę.
      UWAGA: Istnieje kompromis między wysoką jakością obrazów (rozdzielczość + uśrednianie linii) a szybkością akwizycji (liczbą klatek na sekundę).
2. Przygotuj dane na FIDŻI.
   1. Uzyskaj szereg czasowy wysokiej jakości do analizy.
   2. Otwórz jedną klatkę szeregów czasowych, aby wygenerować maskę z FIDŻI. Zduplikuj obraz. Przekonwertuj Typ obrazu na 8-bitowy.
   3. Określ granicę zarodka za pomocą narzędzia Wielokąt lub Zaznaczanie odręczne. Użyj opcji Wyczyść na zewnątrz, aby ustawić wartości pikseli poza zaznaczeniem na 0. Wyczyść, a następnie odwróć w obrębie zaznaczenia, aby ustawić wartość pikseli w zaznaczeniu na wartość maksymalną (255).
   4. Usuń zaznaczenie, a następnie użyj polecenia Histogram, aby upewnić się, że obecne są tylko wartości pikseli od 0 do 255.
   5. Zapisz tę nową maskę obrazu dla określonego szeregu czasowego.
   6. Otwórz szereg czasowy, który Cię interesuje. Wybierz, które dziesięć klatek najlepiej uchwyci interesujący Cię czas, na przykład 9. cykl jądrowy na początku skurczu kory mózgowej. Zduplikuj dziesięć interesujących Cię ramek, tworząc substack.
   7. Użyj funkcji Stack to Images, aby wygenerować 10 obrazów do analizy za pomocą PIV.
   8. Zapisz poszczególne pliki w sposób, który zachowuje ich kolejność (SeriesX_1, SeriesX_2, SeriesX_3 ...).
3. Wykorzystaj przygotowaną maskę i poszczególne ramki do analizy PIV, korzystając z dostarczonego przykładowego skryptu w języku python (dane uzupełniające) lub niestandardowego skryptu wygenerowanego przez użytkownika.
   UWAGA: Dostarczony skrypt jest oparty na aplikacji OpenPIV^{17 w Pythonie}. Wyświetla odległość w pikselach, które można przekonwertować przy użyciu szerokości pikseli i liczby klatek na sekundę w celu wygenerowania prędkości lub prędkości.
4. Generuj powtórzenia, wykonując poprzednie kroki dla dodatkowych zarodków i kompilując wartości wyjściowe.

Wyniki

Po wstrzyknięciu barwnik będzie zlokalizowany wyłącznie w miejscu wprowadzenia końcówki igły. Następnie barwnik będzie dyfundował z miejsca wstrzyknięcia, zależnie od jego właściwości dyfuzyjnych. Rycina 1 przedstawia wstrzyknięcie BODIPY 493/503 krótko po podaniu (panel A) oraz 24 min później (panel B). Po 24 min barwnik dotarł mniej więcej do połowy osi długiej zarodka.

Analizę ruchliwości organelli można przeprowadzić za pomocą iniekcji barwników i obrazowania poklatkowego. W Rycina 2do zarodka wstrzyknięto jednocześnie BODIPY 493/503 (Rysunek 2A) oraz LysoTracker Red (Rycina 2B) i obrazowano przy użyciu wzbudzenia laserowego odpowiednio przy 488 i 596 nm. Następnie wykonano obrazowanie time-lapse tego embrionu (jedna klatka co 30 s przez 30 min, analizowano 5 min). Seria czasowa została następnie poddana analizie PIV, której wynik przedstawiono poprzez linie prądu w Rysunek 2A,BNależy zauważyć, że linie prądu nie reprezentują trajektorii poszczególnych cząstek; przepływ cytoplazmatyczny jest wnioskowany na podstawie analizy wszystkich cząstek w danym obszarze cytoplazmy. Dzięki znakowaniu dwóch niezależnych struktur komórkowych (kropel lipidowych i organelli kwaśnych), analiza PIV wykazuje podobne przepływy, przy czym oba znaczniki zbiegają się w centralnym regionie zarodka, gdzie cytoplazma przepływa do wnętrza zarodka.⁶.

Obecnie dostępne białka fluorescencyjne (FP) umożliwiają znakowanie wielu innych organelli oraz struktur komórkowych. Rycina 3 przedstawia znakowanie retikulum endoplazmatycznego poprzez ER tracker Green. ER tracker zapewnia dobrą rozdzielczość obrazowania otoczki jądrowej, co umożliwia wizualizację głównych etapów cyklu komórkowego. Obrazowanie ER tracker Green odbywa się przy użyciu wzbudzenia o długości fali 488 nm.

Znakowanie mitochondriów jest trudne, ponieważ większość przetestowanych barwników zdaje się zatrzymywać w pierwszym mitochondrium, do którego wnikną. Z drugiej strony nie wykryto oznak toksyczności barwnika, co umożliwiło śledzenie znakowanych mitochondriów podczas celularyzacji oraz 15. cyklu jądrowego ektodermy. Rysunek 4 przedstawia komórkę ektodermy kilka godzin po wstrzyknięciu Mitoview 633 (długość fali wzbudzenia 633 nm).

Barwniki BODIPY, Lysotracker oraz LipidSpot są stabilne i mogą być wykorzystywane do pozyskania ponad 500 obrazów w rozdzielczości 512 x 512, przy średniej liczbie linii 3 i szybkościach klatek od 1/s do 0,1/s. Marker ER tracker Green, SiR-tubulin oraz wspomniane barwniki mitochondrialne są mniej stabilne i pozwalają na uzyskanie ok. 50–200 obrazów w tych samych warunkach.

Zaczynając od stadiów blastodermy, krople lipidowe (LDs) poruszają się dwukierunkowo wzdłuż mikrotubul, napędzane przez motory o przeciwnej polaryzacji: kinezynę-1 oraz dyneinę cytoplazmatyczną⁵. Ruch ten można zwizualizować poprzez wspólne znakowanie LDs i mikrotubul poprzez wstrzyknięcie zarówno BODIPY 493/503, jak i SiR-Tubulin (Rysunek 5). Ponieważ LDs często zmieniają kierunek ruchu (przełączając się między kinezyną-1 a dyneiną cytoplazmatyczną), wyższa częstotliwość klatek podczas akwizycji pozwala lepiej uchwycić krytyczne szczegóły motylości LDs.

Obrazowanie na żywo autofluorescencyjnych pęcherzyków żółtka jest możliwe bez konieczności wstrzykiwania barwników (Rycina 6). Jednakże autofluorescencja jest słaba, a laser wzbudzający wykazuje działanie fototoksyczne. W związku z tym obrazowanie na żywo autofluorescencyjnego żółtka charakteryzuje się niskim stosunkiem sygnału do szumu w porównaniu do metody z wstrzykiwaniem barwnika.

Rycina 1: Dyfuzja BODIPY 493/503 przez embrion. Barwnik wstrzyknięto wzdłuż krawędzi bocznej w kierunku końca przedniego (prawy górny róg); dyfunduje on z miejsca wstrzyknięcia do wnętrza embrionu, znakując LDs. (A) Barwnik przedyfundował przez fragmenty embrionu sąsiadujące z miejscem wstrzyknięcia. (B) Około 24 min/2 cykle jądrowe później barwnik przedyfundował poza punkt środkowy embrionu. Pasek skali: 100 µm. Klatkę o wymiarach 1024 x 1024 (średnia liniowa 4) pozyskiwano co 30 s. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2: Cyfrowa welocymetria obrazowa cząstek (PIV) dla LD i organelli kwaśnych. Zarodek został wstrzyknięty zarówno BODIPY 493/503, jak i LysoTracker Red. (A) Kanał BODIPY. (B) Kanał LysoTracker Red. (A',B') Schematy linii prądu wygenerowane przez analizę PIV dwóch kanałów na podstawie 10 następujących po sobie klatek, w tym tych pokazanych w A i B. A' odpowiada przepływowi LD, a B' odpowiada przepływowi organelli kwaśnych. Należy zauważyć, że zarówno A' , jak i B' wykazują zbieżność po lewej stronie środka, gdzie zawartość zarodka wypływa poza płaszczyznę widzenia, w stronę centrum zarodka. Należy również zauważyć, że BODIPY dyfundował bardziej niż LysoTracker, ponieważ różne barwniki mają różne właściwości dyfuzyjne. Pasek skali: 100 µm. Klatka 1024 x 1024 (średnia liniowa 4) była pozyskiwana co 30 s. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 3: ER tracker znakuje podziały jąder syncytialnych. Zarodek w stadium blastodermy syncytialnej został mikroiniekcyjnie wprowadzony z ER tracker, a fragment jego powierzchni obrazowano w czasie. (A) Formowanie wrzeciona podczas podziału jądra. (B) Odszczepienie otoczki jądrowej podczas tego samego podziału. (C) Następująca po nim interfaza. (D) Początek kolejnego podziału jest sygnalizowany przez pojawienie się centrosomów (wystąpienie okrągłych obszarów wolnych od ER, zaznaczonych grotami strzałek). Zauważalny jest stopniowy blaknięcie barwnika. Długość fali wzbudzenia: 488 nm. Pasek skali: 5 µm. A: klatka początkowa, B: upłynęły 3 min, C: upłynęło 10 min, D: upłynęło 13 min. Klatkę o rozmiarze 1024 x 1024 (uśrednianie linii 4) pozyskiwano co 30 s. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Oznakowanie mitochondriów za pomocą Mitoview 633. Zarodek został wstrzyknięty Mitoview 633 podczas stadium blastodermy syncytialnej i obrazowany 4 h później, po celularyzacji. Obraz przedstawia komórkę neuroektodermalną zarodka w fazie wydłużania pasma zarodkowego. Pasek skali: 5 µm. Klatkę o rozmiarze 1024 x 1024 (średnia z 4 linii) pozyskiwano co 30 s. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 5: Współoznaczenie LD i mikrotubul. Zarodek w fazie komórkowania został wstrzyknięty mieszaniną BODIPY 493/503 (żółty A,B,C) i SiR Tubulin (magenta A',B',C'). A'', B'', C'' przedstawiają nałożone kanały. Panele A, A' i A'' pokazują klatkę początkową, panele B, B' i B'' pokazują klatkę po 5 s, a panele C, C' i C'' pokazują klatkę po 10 s. Pasek skali: 5 µm. Klatkę o rozmiarze 512 x 512 (średnia z 3 linii) pozyskiwano co 2,5 s. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 6: Obrazowanie autofluorescencji pęcherzyka żółtkowego podczas etapów podziałów syncytialnych. (A) Na początku akwizycji. (B) Po 8 min. (C) Po 16 min. Długość fali wzbudzenia: 405 nm. Zastosowano niską intensywność wzbudzenia, aby utrzymać zarodek przy życiu. Pasek skali: 100 µm. Klatkę 1024 x 1024 (średnia linii 4) pozyskiwano co 30 s. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dane uzupełniające. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Zarodek Drosophila jest potężnym i wygodnym modelem do badania podstawowych pytań z zakresu biologii komórkowej i organizmu. Jego względna prostota, potężna genetyka i niewielkie rozmiary sprawiają, że jest to doskonały system do obrazowania zarówno procesów komórkowych, jak i rozwoju. W tym przypadku standardowy protokół mikroiniekcji jest dostosowany do możliwości stosowania FP w zarodkach. Takie podejście pozwala na obrazowanie fluorescencyjne określonych struktur komórkowych bez konieczności stosowania genetycznie kodowanych fluoroforów, co otwiera wiele środowisk genetycznych na obrazowanie. Połączenie wielu barwników oraz strategicznie dobranych białek znakowanych fluorescencyjnie może otworzyć wielokanałowe obrazowanie na żywo obejmujące całe spektrum światła widzialnego.

Krytyczne kroki w protokole:
Ten protokół używa BODIPY 493/503 do oznaczania LD. Takie podejście można łatwo dostosować do oznaczania innych struktur komórkowych. Dla późniejszej analizy obrazu jednym z najważniejszych czynników jest stosunek sygnału do szumu, czyli jasność barwnika w porównaniu z sygnałem tła. Lizosomy zostały z powodzeniem zobrazowane (LysoTracker Red, 1 mM), a także mitochondria (Mitoview 633, 200 μM), ER (ER tracker Green, 10 μM) i mikrotubule (tubulina SiR, 200 nM w DMSO), jak pokazano na rysunku 2, rysunku 3, rysunku 4, rysunku 5. Ponadto pęcherzyki żółtkowe są autofluorescencyjne i emitują niebieskie światło po wzbudzeniu UV (obraz wykorzystujący 405 nm jako długość fali wzbudzenia (ryc. 6)). W przypadku innych barwników należy dążyć do tego, aby stężenie barwnika było 100-1,000 razy większe niż to, co byłoby potrzebne do barwienia żywych komórek hodowanych; Jest to podobne do stężenia roztworu podstawowego, który zostałby rozcieńczony w pożywce do hodowli komórkowych. Ponieważ protokół ten wymaga wstrzyknięcia 100 fL, a zarodek Drosophila ma około 9 nL w objętości¹⁸, te stężenia barwnika uśrednią się do wewnętrznego stężenia embrionalnego poniżej 1/100 tego, co jest obecne w pożywce do hodowli komórkowych. Tymczasowo stężenie miejscowe będzie wyższe w miejscu wstrzyknięcia, co jest najbardziej istotne w przypadku FP, które nie dyfundują dobrze (tj. Barwniki mitochondrialne i tubulina SiR). W przypadku tych FP zacznij od zalecanych wysokich stężeń; W przypadku zaobserwowania nieoczekiwanej śmierci, należy stopniowo rozcieńczyć dwukrotnie, aż do osiągnięcia akceptowalnego kompromisu między przeżyciem a siłą sygnału.

W przypadku jednoczesnego wstrzykiwania wielu barwników, oba barwniki powinny być albo w tym samym rozpuszczalniku, albo zarówno rozpuszczalniki, jak i barwniki powinny być kompatybilne z mieszaniną (stężenia alkoholu przekraczające ~10% nie są zalecane).

Jakość igieł ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia tej procedury, ponieważ końcówka musi być tak delikatna, jak to tylko możliwe. W przeciwnym razie uszkodzenie rany po wstrzyknięciu może zagrozić późniejszemu rozwojowi zarodka. Ponieważ komercyjne ściągacze igieł różnią się między sobą, ważne jest, aby postępować zgodnie z sugestiami producenta i wypróbowywać wiele parametrów ciągnięcia, aż do uzyskania pożądanego kształtu. Bardzo ważne jest, aby wykonać krok kontroli jakości 1.1.3, ponieważ praca z pękniętą, postrzępioną lub dużą końcówką igły sprawi, że udane wstrzyknięcie będzie trudniejsze lub nawet niemożliwe.

Zarodek musi zostać częściowo wysuszony, aby podczas wstrzyknięcia można było dodać dodatkowe objętości płynu. Jeśli zarodek jest niedostatecznie wysuszony, igła nie wejdzie łatwo, a cytoplazma wytryśnie podczas penetracji igły lub wstrzykiwania roztworu. Jeśli zarodek jest nadmiernie wysuszony, będzie wyglądał na opróżniony i nie będzie się prawidłowo rozwijał. Dokładny czas schnięcia zależy od lokalnych warunków, np. wilgotności powietrza, i może się zmieniać z dnia na dzień. Musi być ona określona empirycznie dla każdej sesji.

Zdolność zarodka do przeżycia po mikroiniekcji zależy w decydującym stopniu od jakości igły, prawidłowego wysuszenia i ograniczenia objętości wstrzyknięcia do mniej niż 1 pL (najlepiej 100 fL). Dopóki te parametry są zoptymalizowane, nie widać znaczącej toksyczności, gdy opisane barwniki są wstrzykiwane w zalecanych stężeniach. Jeśli zarodki przetrwają etapy suszenia i wstrzykiwania, zazwyczaj rozwijają się pomyślnie do wydłużenia pasma zarodkowego, wyjątkiem są sondy mikrotubul i ER, które powodowały defekty celularyzacji na wysokich poziomach (wstrzyknięcie 100 fL stężenia wyjściowego każdego z nich). Testy nie wykazały żadnych oczywistych wad rozwojowych, gdy DMSO, woda i mieszaniny tych dwóch substancji zostały wstrzyknięte w zalecanych ilościach, ze wskaźnikiem przeżycia zarodka poprzez wydłużenie pasma zarodkowego o ~ 75% lub więcej. Objętości iniekcji większe niż ponad 1 pL powodowały ubytki i zarodki, którym wstrzyknięto ~4 objętości pL, rozwijały się krócej niż 1 h. W związku z tym objętości iniekcji muszą być utrzymywane na niskim poziomie, co oznacza, że stężenia barwnika muszą być wysokie.

Ogólnie rzecz biorąc, zaleca się wstrzyknięcia wzdłuż bocznej krawędzi zarodka, ponieważ powodują one najmniejsze uszkodzenia. Jednak może być konieczne dostosowanie miejsca wstrzyknięcia w zależności od właściwości dyfuzyjnych zastosowanych FP. BODIPY 493/503 i LysoTracker dyfundują szybciej po całym zarodku niż Lipid Spot 610 (inny barwnik do oznaczania LD), podczas gdy SiR-Tubulin i Mitoview 633 nigdy nie dyfundują w pełni przez zarodek (obrazowanie dopiero po 7 godzinach od wstrzyknięcia). W związku z tym może być konieczne wstrzyknięcie w miejsce zainteresowania lub w jego pobliżu. Podczas wstrzykiwania w przednią lub tylną część skóry zaleca się użycie szczególnie cienkiej igły.

Akwizycja obrazu opiera się na mikroskopii konfokalnej w celu optycznego przekrojenia i rozdzielenia małych organelli i wszystkich składników cytoszkieletu. Techniki wymagające analizy wielu obrazów (np. STORM lub PALM) nie zadziałają, ponieważ zawartość embrionalna jest w ruchu, a fluorofory nie są zoptymalizowane pod kątem fotoprzełączania. Mikroskopia epifluorescencyjna nie ma rozdzielczości bocznej i osiowej, aby dostrzec większość organelli i mniejszych struktur komórkowych. Z tych powodów zdecydowanie zaleca się użycie mikroskopu konfokalnego lub zastosowanie technologii arkuszy świetlnych.

Powtarzalność analizy obrazu zależy w dużej mierze od spójnych danych obrazowych. Aby uzyskać jak największe szanse na sukces, konieczna jest optymalizacja techniki iniekcji i pozyskiwania obrazu. Ustalenie i przećwiczenie techniki, w której interesujący nas barwnik (barwniki), miejsce wstrzyknięcia, wiek zarodka, objętość wstrzyknięcia i konfiguracja akwizycji są spójne, pozwoli wygenerować najbardziej wiarygodne dane do analizy obrazu.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów z metodą
Protokół ten demonstruje metodę analizy masowego przepływu LD w zarodkach w fazie rozszczepienia przy użyciu prędkości obrazu cząstek. To samo podejście można zastosować do innych organelli, innych etapów rozwoju i innych metod analizy. Na przykład rycina 2 przedstawia analizę LD i organelli kwaśnych przepływających w syncytialnych etapach embriogenezy, uwidocznionych przez jednoczesne wstrzyknięcie BODIPY 493/503 i LysoTracker Red. Osiągnięto dalsze udane obrazowanie ruchu LD u zarodków do 7 godzin po zapłodnieniu; Zarodki te zachowują ranę po wstrzyknięciu, ale są w stanie rozwijać się przez kilka godzin.

Dane zebrane za pomocą tego protokołu zostały wykorzystane do pomiaru prędkości obrazu cząstek, ale dostępnych jest wiele innych technik analizy. Na przykład programy do śledzenia cząstek, takie jak te, które można znaleźć w ImageJ, Imris lub śledzenie ręczne, mogą być używane do uzyskiwania prędkości i kierunków poruszających się struktur. Należy pamiętać, że większość takich programów śledzących jest zbudowana do pracy z danymi z planarnych systemów hodowli komórek i nie zawsze dobrze dostosowuje się do struktur 3D, takich jak zarodek Drosophila . Ponadto, aby wygenerować najlepszej jakości dane śledzenia cząstek, konieczne byłoby zobrazowanie wielu płaszczyzn Z; Powinno to być wykonalne, jeśli czasy akwizycji stosu obrazów są mniejsze niż ~2 s. Ten punkt odniesienia powinien być osiągalny na konfokalnych płytach wirujących, kratownicowych arkuszach świetlnych i najnowszych systemach konfokalnych ze skanowaniem laserowym. Jednak możliwość śledzenia cząstek dla licznych organelli, takich jak LD, mitochondria i lizosomy, jest niska, ponieważ ilość pozytywnego sygnału w polu widzenia jest zbyt wysoka dla obecnych metod śledzenia. Możliwe może być śledzenie mniej obfitych struktur, takich jak jądra lub pęcherzyki żółtkowe. PIV do analizy przepływu działa dobrze w przypadku LD i organelli kwaśnych w fazach rozszczepienia, ponieważ oba organelle poruszają się swobodnie. Organelle, takie jak jądra komórkowe, ER i mitochondria, są przywiązane do innych struktur komórkowych, a zatem nie poruszają się swobodnie i nie nadają się do analizy oprogramowania, która zakłada swobodny ruch. Badacz powinien wybrać techniki najlepiej dopasowane do interesujących go organelli.

Podczas etapów blastodermy syncytialnej i komórkowej LD (a także niektóre inne organelle) poruszają się wzdłuż promieniście zorientowanych mikrotubul⁵. W związku z tym możliwe jest znalezienie widoków przekrojowych (jak na rysunku 5), w których pojedyncze mikrotubule są ostre na duże odległości, co umożliwia śledzenie cząstek w 2D. Ponieważ te płaszczyzny optyczne znajdują się głęboko w zarodku, ogólna siła sygnału jest zmniejszona, a stosunek sygnału do szumu jest zmniejszony.

W celu analizy śledzenia, obrazowanie tak szybkie, jak to możliwe, może ujawnić kluczowe szczegóły ruchu, a tym samym ruchliwej maszynerii. Na przykład ruch kropelek lipidowych jest mieszaniną dwóch stanów ruchliwych, zwolnionego-krótkiego ruchu (~200 nm/s; średnia odległość podróży ~100 nm) i ruchu szybkiego-długiego (~450 nm/s; średnia odległość podróży ~1,000 nm)¹⁹; Tak więc, jeśli zdjęcia są wykonywane co sekundę lub nawet rzadziej, stan wolny-krótki staje się niewykrywalny. Jednak częste obrazowanie powoduje również bielenie fluoroforem i fototoksyczność. W związku z tym warunki obrazowania muszą być dostosowane w zależności od konkretnego pytania, na które należy odpowiedzieć.

Ograniczenia metody
W zależności od pożądanego barwnika, metoda może być ograniczona przez zgodność między rozpuszczalnością barwnika a toksycznością roztworu do wstrzykiwań. Alkohole takie jak izopropanol i etanol są trudne do przenoszenia w igle ze względu na ich niższą lepkość i wydają się uszkadzać składniki komórkowe i zabijać zarodek.

Metoda ta nie nadaje się również do wizualizacji najwcześniejszych etapów embriogenezy, ponieważ przygotowanie zarodków do wstrzyknięcia zajmuje 30+ minut. W temperaturze pokojowej początkowe cykle komórkowe zarodka trwają zaledwie ~10 minut każdy; Tak więc, nawet jeśli ktoś miałby wybrać nowo zapłodnioną komórkę jajową w kroku 5.2.3, pierwsze kilka cykli komórkowych byłoby już zakończonych, zanim zarodek byłby gotowy do obrazowania.

Oświetlenie światłem w zakresie UV/niebieskim jest znacznie bardziej fototoksyczne niż w przypadku dłuższych fal. W takich warunkach (np. w celu śledzenia autofluorescencyjnych pęcherzyków żółtka; Rysunek 6) należy ograniczyć czas obrazowania (co prowadzi do krótszych szeregów czasowych) lub użyć mniejszej mocy lasera (co skutkuje zmniejszonym stosunkiem sygnału do szumu).

Po celularyzacji barwniki wstrzyknięte w określone miejsce mają tendencję do słabej dyfuzji, ponieważ muszą przechodzić przez wiele błon komórkowych. Ogranicza to obszar obserwacji w późniejszych stadiach rozwojowych.

Znaczenie metody w odniesieniu do istniejących/alternatywnych metod
Ruch LD i innych organelli zawierających lipidy we wczesnych zarodkach można uwidocznić za pomocą genetycznie kodowanych fluoroforów, technik bezznacznikowych oraz poprzez wprowadzenie FP. To ostatnie można osiągnąć poprzez przepuszczalność błony witeliny¹² lub omówione tutaj podejście do mikroiniekcji.

Genetycznie kodowane fluorofory są wszechstronnymi markerami, których poziomy są zazwyczaj wysoce powtarzalne z zarodka na zarodek. Mają jednak niższą wydajność kwantową i łatwiej wybielają niż FP. Zazwyczaj są one dostępne tylko w jednej lub dwóch oznaczonych wersjach (np. GFP lub mCherry), co ogranicza wybór, które struktury mogą być obrazowane jednocześnie. Z drugiej strony FP często występują w dużej różnorodności; na przykład dostępne są różne barwniki specyficzne dla kropelek lipidów z widmami emisyjnymi od Autodot w widmie UV/niebieskim do Lipidtox i LipidSpot 610 w widmie dalekiej czerwieni. FP mogą być również bezpośrednio stosowane do dowolnego szczepu będącego przedmiotem zainteresowania, a zatem nie wymagają budowy szczepu, aby na przykład wprowadzić pożądany marker organelli do zmutowanego szczepu będącego przedmiotem zainteresowania. Ta zaleta jest szczególnie wyraźna, gdy wiele struktur ma być etykietowanych jednocześnie; Zamiast czasochłonnych krzyżówek obejmujących wiele pokoleń, można to osiągnąć w ciągu jednego dnia, mieszając odpowiednie barwniki i wprowadzając je w tym samym czasie. Wreszcie, jeśli procesy komórkowe mają być badane za pomocą hamowania farmakologicznego, leki i barwniki mogą być wprowadzane razem.

Metody bezznacznikowe są bardzo skutecznymi metodami wykrywania określonych struktur komórkowych. Na przykład, LD mogą być specyficznie wykryte we wczesnych zarodkach za pomocą mikroskopii trzeciej generacji²⁰ lub mikroskopii im. Femtosekundowej Stymulowanej Utraty Ramanowskiej²¹. Podobnie jak FP, podejścia te mogą być stosowane w dowolnym tle genetycznym, a ponieważ nie powodują wybielania, potencjalnie pozwalają na szybsze pozyskiwanie obrazu. Jednak są one zazwyczaj ograniczone do określonych organelli, a zatem same w sobie nie obsługują obrazowania multipleksowego; Wymagają również specjalistycznych mikroskopów.

Istnieją dwie ogólne strategie wprowadzania małych cząsteczek do zarodków. Jednym z nich jest zastosowane tutaj podejście oparte na mikroiniekcjach; Drugi to obróbka chemiczna (terpenowa) w celu przepuszczalności błony witelinowej. To ostatnie podejście¹² jest mniej skomplikowane niż mikroiniekcja, ale również bardziej zmienne w zależności od zarodka. Ponadto po przepuszczalności ochrona zapewniana przez błonę witeliny jest zagrożona, a właściwy zarodek jest dostępny dla podłoża zewnętrznego, co utrudnia utrzymanie go przy życiu. Mikroiniekcja jest znacznie mniej podatna na wykolejenie rozwoju embrionalnego niż przepuszczalność. Przepuszczalność jest jednak zalecana, jeśli wiele zarodków musi być monitorowanych jednocześnie, np. w celu przeprowadzenia badań przesiewowych leków. Aby śledzić ruch struktur komórkowych i uzyskać powtarzalne serie obrazów nadające się do analizy obrazu, metodą z wyboru jest mikroiniekcja.

Znaczenie i potencjalne zastosowania metody w poszczególnych obszarach badawczych
Zarodek Drosophila jest ważnym systemem modelowym do badania wielu procesów komórkowych, biologicznych i rozwojowych ^1,5,6. Znakowanie organelli białkami fluorescencyjnymi w znacznym stopniu przyczyniło się do zrozumienia, w jaki sposób rozwija się wczesny zarodek, jak przemieszczają się różne organelle i jak taki transport jest modulowany rozwojowo i genetycznie. Jednak ich skłonność do wybielania i wyzwania związane z generowaniem szczepów, w których wiele organelli jest oznaczonych różnymi kolorami, ograniczają zastosowanie tego podejścia. Zastosowanie FP wprowadzonych przez mikroiniekcję rozwiązuje wiele z tych wyzwań i może być nawet łączone z białkami znakowanymi fluorescencyjnie. Technika ta pozwala na obrazowanie wielu organelli, struktur komórkowych i składników cytoszkieletu w dowolnym tle genetycznym. W rezultacie za pomocą obrazowania na żywo można porównać kilka genotypów, co umożliwia określenie wpływu mutacji na transport wielu organelli.

Protokół ten demonstruje podejście polegające na wstrzykiwaniu FP w przypadku zarodków Drosophila melanogaster, ale zasadniczo podejście to ma zastosowanie do wszystkich jaj owadów, dla których ustalono techniki mikroiniekcji, w tym innych gatunków Drosophila, świerszczy²² i mszyc²³.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AUTODO	abcepta	SM1000a	Plami kropelki lipidów na fioletowo-niebiesko
BODIPY 493/503	ThermoFisher	D3922	Plami kropelki lipidów na zielono
Kulki osuszające – Środek osuszający bezwodny wskazujący Drierite	WA Hammond Drierite Company	21001
Mikroskop preparacyjny SteREO DiscoveryV20 z podstawą transilluminacyjną	Zeiss	4350030000000000
Taśma dwustronna-Trwała taśma dwustronna	Scotch (3M)	-	Sprzedawana przez wielu dostawców
ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)	ThermoFisher	E34251	Plami ER/ koperta jądrowa
Femptotip II	Eppendorf	H129354N	Gotowy do użycia
Kapilary szklane -Szkło cienkie z 1,0 mm 4 cale	World Precision Instruments	TW100F-4	Należy pociągnąć
Szkiełko nakrywkowe	-		Kup odpowiedni współczynnik załamania światła dla swojej soczewki
obiektywu Szkiełka szklane -Podwójnie matowe szkiełka mikroskopowe wstępnie oczyszczone	FisherBrand	12-550-343
Olej halowęglowy 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Olej halowęglowy 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML
Heptan bardziej ekologiczna alternatywa bezwodny, 99%	Sigma-Aldrich	246654-1L	Heptan jest uważany za toksyczny przez amerykański
mikroskop konfokalny	Leica	Sp5	Wiele różnych rodzajów konfokalnych Mikroskopy będą działać.
LipidSpot 610	Biotium	#70069	Plami kropelki lipidów na daleką czerwień
LysoTracker Red	ThermoFisher	L7528	Barwi lizosomy na czerwono
MitoView 633	Biotium	#70055	Plami mitochondria
Końcówki do pipet z igłą - końcówki do mikroładowarek 20uL	Eppendorf	# 5242956.003
P-1000, ściągacz	do mikropipet nowej generacjiSutter Instruments	P-1000	Używane ustawienia to ciepło-470, ciąg-70, prędkość-60, opóźnienie-90, ciśnienie-200, rampa-479 przy 1x1. Odnoszą się one do intensywności i długości nagrzewania, czasu siły ciągnącej oraz tego, czy siła jest przykładana liniowo. W tych warunkach jedna kapilara generuje dwie użyteczne igły z drobnymi otworami na końcu.
SiR-tubulina	Cytosketon Inc	CY-SC014	Wykonane przez Spirochrome; Cytoskeleton Inc. jest dystrybutorem w Ameryce Północnej. Barwi mikrotubule na dalekiej czerwieni
TransferMan	Eppendorf	5178 NK
ViaFluor 405	Biotium	#70064	Mikrotubule barwią się na fioletowo/niebiesko

OSHA