Artykuł metodologiczny

Indukcja zapalenia jelit przez adoptywny transfer transgenicznych limfocytów T CD4 + CBir1 TCR do myszy z niedoborem odporności

DOI:

10.3791/63293

⸱

16 grudnia 2021

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole opisany jest model adoptywnego transferowego zapalenia jelita grubego dla antygenu mikrobioty jelitowej z limfocytów T. Limfocyty T CD4 + izoluje się od myszy transgenicznych CBir1 TCR. Są one specyficzne dla immunodominującego antygenu mikrobioty jelitowej CBir1 flageliny, który jest przenoszony do myszy biorcy Rag1-/-, prowadząc do zapalenia jelit.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz ze wzrostem częstości występowania, choroby zapalne jelit (IBD), które są przewlekłymi chorobami wpływającymi na przewód pokarmowy, stanowią znaczne obciążenie zdrowotne i finansowe dla jednostek i społeczeństwa. Dlatego tak ważne jest zbadanie mechanizmów leżących u podstaw patogenezy i rozwoju IBD. W tym miejscu opisano model zapalenia jelita grubego opartego na transferze limfocytów T specyficzny dla mikrobioty jelitowej. Witelelina CBir1 została uznana za immunodominujący antygen bakteryjny jelita grubego u pacjentów z eksperymentalnym zapaleniem jelita grubego i pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna. Transgeniczne naiwne limfocyty T CD4 + CBir1 TCR, specyficzne dla flageliny CBir1, mogą indukować przewlekłe zapalenie jelita grubego po adoptywnym przeniesieniu do myszy Rag1 z niedoborem odporności. Nasilenie choroby ocenia się za pomocą histopatologii. Określa się również fenotypy limfocytów T CD4 + w blaszce właściwej okrężnicy. Model ten jest bardzo podobny do rozwoju IBD, który stanowi idealny model mysi do badania mechanizmów kierujących patogenezą IBD i testowania potencjalnych leków do leczenia IBD.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby zapalne jelit (IBD), głównie choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) i wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC), charakteryzują się przewlekłym, rzutowo-remisyjnym zapaleniem przewodu pokarmowego, dotykającym miliony ludzi na całym świecie1. Za rozwój i patogenezę IBD zaangażowanych jest kilka czynników, w tym podatność genetyczna, mikrobiota jelitowa, odpowiedzi immunologiczne, dieta i styl życia2. Jednak dokładny mechanizm IBD nadal nie jest w pełni poznany.

Jednym ze szczególnych zainteresowań jest interakcja między mikrobiotą jelitową a odpowiedziami immunologicznymi gospodarza w regulacji stanu zapalnego jelit3. Mikrobiota jelitowa dostarcza szereg immunostymulujących cząsteczek i antygenów, które mogą aktywować odpowiedź immunologiczną4. Podczas gdy równowaga między efektorowymi limfocytami T a regulatorowymi limfocytami T (Treg) ma kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy jelit, nadmierna odpowiedź limfocytów T CD4+ błony śluzowej jelit na antygeny mikrobioty jelitowej przyczynia się do zapalenia jelit5,6,7. Jako immunodominujący antygen mikrobioty jelitowej, flagelina CBir1 jest związana z patogenezą ludzkiego CD8,9. Co więcej, transfer transgenicznych limfocytów T CBir1 TCR (Tg) indukuje zapalenie jelit u myszy z niedoborem odporności6, bardzo przypominając ludzkie IBD, co wskazuje, że ten model transferu limfocytów T pomaga badać mechanizmy ludzkiego IBD.

Ta praca opisuje szczegółowy protokół wywoływania zapalenia jelita grubego u myszy Rag1-/- poprzez adoptywny transfer limfocytów T CD4+ CBir1 TCR Tg i ocenę ciężkości choroby. Poza tym przedstawiono oczekiwane wyniki oraz omówiono kluczowe etapy procedury i rozwiązywania problemów, co pomoże naukowcom zbadać mechanizmy patogenezy zapalenia jelit i przetestować potencjalne leki stosowane w leczeniu IBD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Komitetem ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Oddziału Medycznego Uniwersytetu Teksańskiego. Myszy CBir1 TCR Tg zostały dostarczone przez dr Charlesa Elsona z University of Alabama w Birmingham. Myszy CBir1 TCR Tg mogą być samicami lub samcami, ale powinny być w wieku 8-12 tygodni. Myszy Rag1-/- na tle C57BL/6 uzyskano z Jackson Laboratory10. Myszy Rag1-/- muszą być dopasowane do płci i wieku, można użyć samca lub samicy, ale powinny być w wieku 8-12 tygodni. Cały protokół jest podsumowany w Rysunek 1.

1. Przygotowanie myszy biorcy

  1. Przygotuj myszy Rag1-/- na tle C57BL/6, wyhodowane w tym samym specyficznym obiekcie dla zwierząt wolnym od patogenów. Oblicz liczbę myszy w grupie według analizy mocy11.
    UWAGA: Myszy Rag1-/- nie mają dojrzałych limfocytów T i limfocytów B10.
  2. Oznacz myszy uderzeniem w ucho.
  3. Zważ myszy w tym samym dniu transferu limfocytów T.

2. Przygotowanie odczynników i roztworów

UWAGA: Używane odczynniki są toksyczne lub stanowią zagrożenie biologiczne i wymaga środków ostrożności i środków bezpieczeństwa.

  1. Przygotuj bufor myjący: dodaj 5 ml 100x penicyliny-streptomycyny do 500 ml pożywki RPMI 1640. Dokładnie wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować bufor do lizy Tris-NH4cl.
    1. Przygotować część A. Rozpuść 2,06 g zasady Tris w 100 ml podwójnie destylowanej wody (ddH2O) i dostosuj wartość pH do 7,2 za pomocą HCl.
    2. Przygotować część B. Rozpuścić 7,47 g NH4Cl w 800 ml ddH2O.
    3. Dokładnie wymieszaj A i B. Zmierz pH i dostosuj je do 7,2, jeśli nie.
    4. Dostosuj całkowitą objętość do 1000 ml. Autoklaw, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotuj bufor izolacji.
    1. Dodać 2,5 g BSA i 500 μl EDTA (0,5 M, pH 8,0) do 500 ml 1x PBS. Dokładnie wymieszaj.
    2. Przefiltruj roztwór przez próżniowy filtr jednorazowego butelki o średnicy 0,22 μm (patrz Tabela materiałów). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotuj bufor FACS. Dodać 1 ml FBS i 50 μl EDTA (0,5 M, pH 8,0) do 50 ml buforu myjącego (przygotowanego w kroku 2.1). Dokładnie wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotować kompletne podłoże. Dodaj 5 ml FBS do 45 ml buforu myjącego. Dokładnie wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  6. Przygotować bufor EDTA-PBS.
    1. Obliczyć potrzebną objętość buforu EDTA-PBS. Objętość (ml) = liczba myszy x 20.
    2. Dodaj odpowiednią ilość FBS, EDTA i HEPES do PBS (2% FBS, 0,5 mM EDTA, 10 mM HEPES w PBS) (patrz Tabela materiałów).
    3. Dokładnie wymieszać i wstępnie ogrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  7. Przygotować bufor do wytrawiania.
    1. Oblicz potrzebną objętość buforu mineralizacyjnego. Objętość (ml) = liczba myszy x 10.
    2. Dodaj odpowiednią objętość FBS, kolagenazy IV i DNazy I w buforze myjącym (2% FBS, 0,5 mg/ml kolagenazy IV i 10 U/ml DNazy I w buforze myjącym) (patrz tabela materiałów).
    3. Dokładnie wymieszać i wstępnie ogrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  8. Przygotuj roztwór Percoll.
    1. Przygotuj 100% Percoll. Dodaj 5 ml 10x PBS do 45 ml oryginalnego Percollu (patrz Tabela Materiałów).
    2. Przygotować 2% FBS w buforze do mycia. Dodaj 1 ml FBS do 49 ml buforu myjącego.
    3. Ujednolicić objętość 40 % roztworu perkolu i 75 % roztworu perkolu. Objętość 40% roztworu Percoll (ml) = liczba myszy x 4; Objętość 75% roztworu Percoll (ml) = liczba myszy x 2,
      UWAGA: Odczynniki/roztwory przygotowane w krokach 2.1-2.5 zostaną użyte w krokach 3-4, a te przygotowane w krokach 2.6-2.8 zostaną użyte w kroku 9. Wszystkie odczynniki/roztwory użyte w kroku 9 powinny być świeżo przygotowane. Zaleca się wykonanie 5% dodatkowego bufora dla wszystkich kroków.

3. Izolacja limfocytów T śledziony CBir1 TCR Tg CD4+

  1. Eutanazja myszy / myszy CBir1 TCR Tg przez zwichnięcie szyjki macicy z eutanazją CO2 (30% -70% wskaźnik wyparcia gaz-powietrze). Zwilż myszy 70% etanolem.
  2. Wykonaj nacięcie ~1 cm lewej części brzucha, odciągnij skórę od tkanki mięśniowej brzucha, wykonaj nacięcie ~3 cm w tkance mięśniowej brzucha i usuń śledzionę sterylnymi nożyczkami i kleszczami. Umieść śledzionę w naczyniu hodowlanym zawierającym 5 ml wstępnie zimnego buforu do płukania (przygotowanego w kroku 2.1).
  3. Zmiel śledzionę szorstką powierzchnią dwóch sterylnych szkiełek podstawowych. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, przepuszczając przez sitko do komórek o pojemności 100 μm (patrz tabela materiałów). Przepłukać szkiełka podstawowe i naczynie hodowlane 5 ml wstępnie zimnego buforu myjącego i przenieść bufor myjący do probówki.
  4. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 350 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 5 ml wstępnie podgrzanego buforu do lizy Tris-NH4Cl (przygotowanego w kroku 2.2) na śledzionę. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 10 ml wstępnie zimnego buforu myjącego do probówki.
  5. Odwirować zawiesinę komórek o sile 350 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 10 ml buforu izolacyjnego do zimnej temperatury (przygotowanego w kroku 2.3).
  6. Policz komórki. Dokładnie wymieszać 10 μl zawiesiny komórkowej z 10 μl błękitu trypanowego. Załadować 10 μl mieszaniny na szkiełko, włożyć szkiełko do automatycznego licznika komórek (patrz Tabela materiałów) i uzyskać żywy numer komórki12.
    UWAGA: Na tym etapie można uzyskać około 1 x 108 komórek od jednej myszy dawcy.
  7. Odwirować pozostałą zawiesinę komórkową z etapu 3.6 przy 350 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić wszystkie supernatanty.
  8. Dokładnie wymieszaj cząsteczki magnetyczne CD4 przeciwko myszom (patrz tabela materiałów), bezpośrednio dodaj 50 μl cząstek na 10-7 komórek i dokładnie wymieszaj z granulkami komórek. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Można tutaj użyć dowolnego innego komercyjnego zestawu do wzbogacania limfocytów T CD4 +.
  9. Przenieść zawiesinę cząstek komórkowych do sterylnej probówki zbiorczej. Dodać 3,5 ml buforu izolacyjnego przed zimnem do probówki.
  10. Umieść probówkę na magnesie do separacji komórek (patrz tabela materiałów) na 8 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą pipety transferowej o pojemności 3 ml.
  11. Wyjmij probówkę z magnesu do separacji komórek (patrz tabela materiałów), ponownie zawieś ogniwa za pomocą 3.5 ml wstępnie zimnego bufora izolacyjnego i umieść probówkę na magnesie na 4 minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą pipety transferowej o pojemności 3 ml.
  12. Powtórz krok 3.11.
  13. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml wstępnie zimnego buforu FACS (przygotowanego w kroku 2.4).

4. Oczyszczanie limfocytów T CD4+ CBir1 TCR Tg

  1. Policz komórki wykonując krok 3.6.
  2. Jeśli stężenie komórek wynosi >107/ml, dodaj objętość buforu FACS, aby upewnić się, że stężenie w komórce wynosi ≤ 107/mL.
    UWAGA: Na tym etapie można uzyskać od ~1 × 10>7 komórek od jednej myszy dawcy.
  3. Zabarwić markery powierzchniowe 10 μl anty-mysiego CD4-APC, 10 μl anty-mysiego CD25-Percp/Cy5.5 i 10 μl anty-mysiego CD62L-PE13,14 (patrz Tabela materiałów). Delikatnie wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
  4. Umyj komórki 2 ml wstępnie zimnego buforu FACS. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 350 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odessać wszystkie supernatanty za pomocą pipety transferowej o pojemności 3 ml.
  5. Powtórz krok 4.4.
  6. Zawiesić komórki do stężenia 40 x 106/ml w buforze FACS przed zimnem.
    UWAGA: Aby zapobiec zatkaniu sortownika, przepuść komórki przez sitko o średnicy 70 μm.
  7. Dodać 0,1 μg/ml DAPI.
    UWAGA: DAPI służy do wykluczania martwych komórek.
  8. Przygotować 15 ml probówek wirówkowych zawierających 4 ml kompletnej pożywki (przygotowanej w kroku 2.5) w celu zebrania posortowanych komórek.
  9. Załaduj komórki do sortera. Sortuj pojedyncze żywotne naiwne limfocyty T CD4 + (komórki DAPI- CD4 + CD25 - CD62L +) w trybie czystości (rozmiar dyszy: 70 μm; Ciśnienie: 70 PSI; Szybkość zdarzeń: 8000-12000 zdarzeń/s; Sprawność: wyższa niż 90%) (Rysunek 2).
    UWAGA: Naϊve Limfocyty T CD4 + wyrażają wysoką ekspresję CD62L i nie mają markera aktywacji CD2513,14.
  10. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 350 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odessać wszystkie supernatanty za pomocą pipety transferowej o pojemności 3 ml.
  11. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl 1x PBS.
  12. Policz komórki zgodnie z krokiem 3.6
    UWAGA: Na tym etapie można uzyskać od ~5 ×10 6 komórek od jednej myszy dawcy.

5. Transfer komórek do myszy biorcy

  1. Ponownie zawiesić limfocyty T CBir1 TCR Tg naϊve CD4 + do stężenia 5 x 106 / ml, dodając 1x PBS.
  2. Ogrzej myszy Rag-/- pod lampą grzewczą (patrz Tabela materiałów) przez 4 minuty i unieruchamiaj myszy za pomocą ogranicznika dla myszy.
  3. Przenieść dożylnie 200 μl zawiesiny komórkowej do żyły ogonowej myszy Rag-/- za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml (27 G) (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Komórki od jednej myszy dawcy wystarczą, aby przenieść się do około pięciu myszy biorców.

6. Monitorowanie objawów klinicznych podczas progresji zapalenia jelita grubego

  1. Waż myszy co tydzień i zwiększaj obserwację do dwóch razy w tygodniu, gdy myszy zaczną tracić >5% pierwotnej wagi.
  2. Obserwuj reakcję/ruch myszy po delikatnej stymulacji.
  3. Obserwuj inne nieprawidłowości kliniczne, tj. postawę i konsystencję stolca.

7. Pobieranie okrężnicy i ocena histopatologiczna

  1. Poświęć myszy biorcy przez zwichnięcie szyjki macicy za pomocą CO2 w momencie utraty masy ciała >20% pierwotnej masy lub 6 tygodni po transferze komórek. Zwilż myszy 70% etanolem.
  2. Wykonaj nacięcie skóry brzusznej linii środkowej ~1 cm, odciągnij skórę od tkanki mięśniowej brzucha, wykonaj nacięcie ~3 cm w tkance mięśniowej brzucha, zidentyfikuj jelito ślepe i usuń całą okrężnicę sterylnymi nożyczkami i kleszczami. Zwilż okrężnicę wstępnie zimnym PBS w naczyniu hodowlanym.
  3. Naciąć okrężnicę wzdłuż i spłukać ją wstępnie zimnym PBS. Wytnij 1/3 okrężnicy wzdłuż.
  4. Umieść pasek okrężnicy w ręczniku papierowym stroną ze światłem skierowaną do góry. Wykonaj szwajcarskie zwijanie za pomocą wykałaczki15.
  5. Umieść okrężnicę Swiss w kasecie i umieść ją w 10% buforowanej formalinie przez 24 godziny16, a następnie odwodnij za pomocą automatycznego procesora (patrz Tabela materiałów) i zatapiaj parafinę.
  6. Wyciąć skrawki tkanek o grubości 5 μm na mikrotomie, zamontowanym na szkiełkach podstawowych i wykonać barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) 17 (patrz Tabela materiałów).
  7. Określić wyniki histopatologiczne, łącząc wyniki dla każdego z sześciu parametrów, aby uzyskać maksymalnie 12 punktów. zapalenie blaszki właściwej (normalne, 0; łagodne, 1; umiarkowane, 2; ciężkie, 3); utrata komórek kubkowych (normalna, 0; łagodna, 1; umiarkowana, 2; ciężka, 3); nieprawidłowa krypta (normalna, 0; hiperplastyczna, 1; dezorganizacja, 2; utrata krypty, 3); ropnie krypty (nieobecne, 0; obecne, 1); erozja błony śluzowej i owrzodzenie (normalne, 0; łagodne, 1; umiarkowane, 2; ciężkie, 3); i zmiana podśluzówkowa (brak, 0; błona podśluzówkowa, 1; przezścienna, 2)18.

8. Izolacja i barwienie komórek blaszki właściwej jelita

  1. Po kroku 7.3 pokrój kolejne 2/3 okrężnicy na 0,5-1 cm kawałki i umyj je wstępnie schłodzonym PBS.
  2. Przenieść segmenty jelita grubego do 20 ml wstępnie ogrzanego buforu EDTA-PBS w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Inkubować w temperaturze 37 °C z prędkością 250 obr./min, wytrząsając przez 30 min.
  3. Odwirować probówkę, wyrzucić supernatanty, przepuszczając ją przez sterylne sito (średnica: 0,01 cala) i ponownie zawiesić segmenty okrężnicy w 20 ml wstępnie zimnego PBS w probówce o pojemności 50 ml.
  4. Powtórz krok 8.3 dwa razy.
  5. Umieść segmenty jelita grubego w probówce C (patrz Tabela materiałów) zawierającej 10 ml wstępnie podgrzanego buforu do wytrawiania.
  6. Umieścić probówkę na maszynie dysocjacyjnej (patrz Tabela Materiałów) i inkubować w programie "37C_m_LPDK_1" przez 25 minut.
    UWAGA: "37C_m_LPDK_1" to standardowy, wstępnie ustawiony program w maszynie dysocjacyjnej używany do mieszania próbek i utrzymywania ich w temperaturze 37 °C.
  7. Sprawdź, czy tkanka jest całkowicie strawiona, co oznacza, że żaden fragment tkanki nie znajduje się w buforze trawiennym. Jeśli nie, powtórz program "37C_m_LPDK_1".
  8. Zebrać sklarowany osad, przepuszczając przez metalowe sito i sitko o pojemności 100 μl. Spłucz 10 ml wstępnie schłodzonego PBS.
  9. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 350 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odessać wszystkie supernatanty.
  10. Ponownie zawiesić komórki w 4 ml 40% roztworu Percollu i dokładnie wymieszać (przygotowanego w kroku 2.8).
  11. Przenieś zawieszone komórki do 2 ml 75% roztworu perkolu w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
  12. Odwirować zawiesinę komórek przy 850 x g przez 20 minut w temperaturze 20 °C (Rampa przyspieszenia: 0; Rampa hamowania: 0).
  13. Ostrożnie usuń tłuszcz z górnej warstwy za pomocą pipety transferowej o pojemności 3 ml i przenieś warstwę komórek do 20 ml buforu myjącego w probówce o pojemności 50 ml.
  14. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 350 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić wszystkie supernatanty i ponownie zawiesić komórki w 1 ml gotowej pożywki.
  15. Policz komórki wykonując krok 3.6.
  16. Wysiewaj komórki na 24-dołkowej płytce, aktywuj je 50 ng/ml 13-octanu forbolu-12-mirystynianu i 750 ng/ml jonomycyny przez 2 godziny, a następnie inkubuj z 5 μg/ml Brefeldiny A przez 3 godziny (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Stosowane odczynniki są toksyczne, a obchodzenie się z nimi wymaga środków ostrożności i środków bezpieczeństwa.
  17. Przenieść komórki do probówki FACS, dodać 2 ml buforu FACS i odwirować komórki przy 350 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  18. Inkubuj komórki z 12,5 μg/ml anty-mysiego CD16/3219 cala (patrz tabela materiałów) bufora FACS, aby zablokować receptory Fc na 5 minut w temperaturze pokojowej.
  19. Bejca do markera żywego/martwego i powierzchniowego.
    1. Przemyć komórki 2 ml buforu FACS i odwirować je w sile 350 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić sklarowany osad.
    2. Wybarwić komórki żywym barwnikiem i markerami powierzchniowymi (tj. przeciwciałami anty-mysimi CD3 i anty-mysimi przeciwciałami CD4)20 (patrz Tabela Materiałów) w buforze FACS w optymalnym stężeniu przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
      UWAGA: Stosowane odczynniki są toksyczne, a obchodzenie się z nimi wymaga środków ostrożności i środków bezpieczeństwa.
  20. Wykonaj barwienie komórkowe i jądrowe.
    1. Dodać 2 ml buforu FACS i odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 350 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    2. Przepuszczalność i utrwalenie komórek poprzez ponowne zawieszenie komórek za pomocą 200 μl roztworu roboczego Transcription Factor Fix (patrz Tabela materiałów) przez 40 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Dodać 2 ml buforu do permu i odwirować zawiesinę komórkową o sile 350 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    4. Inkubować komórki z markerami komórkowymi i jądrowymi (tj. przeciwciałami anty-mysim IFNγ, anty-mysim IL-17A i anty-mysimi przeciwciałami Foxp3)20 w buforze Perm (patrz Tabela materiałów) przez 30 min-1 h w temperaturze pokojowej.
    5. Dodać 2 ml buforu do permu i odwirować zawiesinę komórkową o sile 350 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    6. Dodać 1 ml buforu FACS i odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 350 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  21. Zawiesić komórki za pomocą 200 μl buforu FACS i uruchomić próbki na cytometrze przepływowym (patrz tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Około 5 x 106 limfocytów T CDir1 TCR Tg na śledzionę zostało wyizolowanych od dorosłej myszy CBir1 TCR Tg. Transfer CBir1 TCR Tg naϊve CD4 + T limfocyty T wywołane przewlekłym zapaleniem jelita grubego u biorcy Rag1-/- myszy. Po transferze komórek monitorowano objawy kliniczne w celu oceny postępu zapalenia jelit, w tym utraty masy ciała, konsystencji stolca i zgarbionej postawy. Zgodnie z oczekiwaniami, myszy zaczęły tracić na wadze około trzech tygodni po przeniesien...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż każdy krok jest niezbędny do odtworzenia tego modelu zapalenia jelita grubego, istnieje kilka krytycznych kroków. Biorce myszy Rag-/- powinny otrzymać odpowiednie żywotne limfocyty T CD4 + w celu wywołania zapalenia jelit. Użyliśmy śledziony do izolacji naiwnych limfocytów T CD4 + zamiast MLN. Ponieważ wydajność naiwnych limfocytów T CD4 + w MN jest znacznie niższa niż w śledzionie. CD62L ulega silnej ekspresji w naiwnych limfocytach T, a CD44 i CD25 są markera...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów finansowych, zawodowych lub osobistych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez granty National Institutes of Health DK125011, AI150210 i DK124132, University of Texas System STARs award (Y.C.) oraz James W. McLaughlin Fellowship Fund z The University of Texas Medical Branch w Galveston (W.Y.). Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m próżniowy jednorazowy filtr butelkowyMilliporeSigmaSCGPS05RE
100x Penicylina-StreptomycynaCorning30-002-CI
100-&mikro; m Filtr siatkowyBD Biosciences352360
Pipeta transferowa 3 mlFisherbrand13-711-9CM
Anti-Mouse CD16/32Biolegend101302
Anti-Mouse CD25-Percp/Cy5.5Biolegend102030
Anti-Mouse CD3-Percp/Cy5.5Biolegend100327
Anti-Mouse CD4 APCBiolegend
Anty-Mysie cząstki magnetyczne CD4BD Biosciences551539
Anti-Mouse CD4-BV421Biolegend100544
Anti-Mouse CD62L-PEBiolegend104408
Anti-Mouse Foxp3-PEThermoFisher12-5773-82
Anti-Mouse IFNγ-FITCBiolegend505806
Anty-mysz IL-17A-PE/Cy7Biolegend506922
Automatyczny licznik komórekBio-radTC20
Brefeldin ABD Biosciences555029
BSA Fisher BioreagentsProbówka BP1600-1
CMiltenyi130-093-237
Magnes do separacji komórekBD Biosciences552311
Kolagenaza IVSigma-AldrichC5138
DAPISigma-AldrichD9542
DysocjatorMiltenyi130-096-427
DNaza ISigma-Aldrich
EDTACorning46-034-CI
EDTA (0,5 m, PH 8,0)Corning46-034-CI
FBSR& D SystemsS11550
Cytometr przepływowyBD BiosciencesLSD Fortessa Lampa grzewcza
CoverShieldBR40
Hematoksylina i Eozyna (H& E) Zestaw do barwieniaAbcamab245880
Strzykawki insulinoweBD Biosciences329412
IonomycynaThermoFisherI24222
Żywy/martwy zestaw do naprawy martwych komórek w bliskiej podczerwieniThermoFisherL10119
MaxQ 6000 Inkubowane/chłodzone wytrząsarki sztaplowaneThermoFisherSHKE6000
NH4ClThermo ScientificA687-500
PercollGE Healthcare17-0891-01
13-octan forbolu-12-mirystynianuSigma-AldrichP8139
RPMI 1640 ŚredniSH3002702Cytiva HyClone
BD BiosciencesArial Fusion
Automatyczny procesor tkanekThermoFisherSTP120
Kaseta do zatapiania/przetwarzania tkanekFisher Healthcare22048142
Tris BaseThermo ScientificBP154-1
Zestaw czynnika transkrypcyjnego prawdziwej jądrowej (w tym bufor do trwałej ondulacji)Biolegend424401
100516 sortownik

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (12), 720-727 (2015).
  2. Ananthakrishnan, A. N. Epidemiology and risk factors for IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 205-217 (2015).
  3. Yang, W., Cong, Y. Gut microbiota-derived metabolites in the regulation of host immune responses and immune-related inflammatory diseases. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 866-877 (2021).
  4. Pickard, J. M., Zeng, M. Y., Caruso, R., Núñez, G. Gut microbiota: Role in pathogen colonization, immune responses, and inflammatory disease. 279 (1), 70-89 (2017).
  5. Russler-Germain, E. V., Rengarajan, S., Hsieh, C. S. Antigen-specific regulatory T-cell responses to intestinal microbiota. Mucosal Immunology. 10 (6), 1375-1386 (2017).
  6. Chen, L., et al. Microbiota metabolite butyrate differentially regulates Th1 and Th17 cells' differentiation and function in induction of colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 25 (9), 1450-1461 (2019).
  7. Cong, Y., Weaver, C. T., Lazenby, A., Elson, C. O. Bacterial-reactive T regulatory cells inhibit pathogenic immune responses to the enteric flora. Journal of Immunology. 169 (11), 6112-6119 (2002).
  8. Lodes, M. J., et al. Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease. Journal of Clinical Investigation. 113 (9), 1296-1306 (2004).
  9. Targan, S. R., et al. Antibodies to CBir1 flagellin define a unique response that is associated independently with complicated Crohn's disease. Gastroenterology. 128 (7), 2020-2028 (2005).
  10. Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68 (5), 869-877 (1992).
  11. Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
  12. Kwizera, R., et al. Evaluation of trypan blue stain in the TC20 automated cell counter as a point-of-care for the enumeration of viable cryptococcal cells in cerebrospinal fluid. Medical Mycology. 56 (5), 559-564 (2018).
  13. Boyman, O., Létourneau, S., Krieg, C., Sprent, J. Homeostatic proliferation and survival of naïve and memory T cells. European Journal of Immunology. 39 (8), 2088-2094 (2009).
  14. Chai, J. G., et al. Regulatory T cells, derived from naïve CD4+CD25- T cells by in vitro Foxp3 gene transfer, can induce transplantation tolerance. Transplantation. 79 (10), 1310-1316 (2005).
  15. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161(2016).
  16. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161(2016).
  17. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  18. Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 7 (8), 4557-4576 (2014).
  19. Tuijnman, W. B., Van Wichen, D. F., Schuurman, H. J. Tissue distribution of human IgG Fc receptors CD16, CD32 and CD64: An immunohistochemical study. APMIS. 101 (4), 319-329 (1993).
  20. Yang, W., et al. Intestinal microbiota-derived short-chain fatty acids regulation of immune cell IL-22 production and gut immunity. 11 (1), 4457(2020).
  21. Reinoso Webb, C., et al. Differential susceptibility to t cell-induced colitis in mice. Role of the Intestinal Microbiota. Inflammatory Bowel Disease. 24 (2), 361-379 (2018).
  22. Bamias, G., et al. Down-regulation of intestinal lymphocyte activation and Th1 cytokine production by antibiotic therapy in a murine model of Crohn's disease. Journal of Immunology. 169 (9), 5308-5314 (2002).
  23. Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. Z. Induction of murine intestinal inflammation by adoptive transfer of effector CD4+ CD45RB high T cells into immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. (98), e52533(2015).
  24. Atale, N., Gupta, S., Yadav, U. C., Rani, V. Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques. Journal of Microscopy. 255 (1), 7-19 (2014).
  25. Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F. The gut microbiota in IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (10), 599-608 (2012).
  26. Sun, M., et al. Microbiota-derived short-chain fatty acids promote Th1 cell IL-10 production to maintain intestinal homeostasis. Nature Communications. 9 (1), 3555(2018).
  27. Feng, T., et al. Th17 cells induce colitis and promote Th1 cell responses through IL-17 induction of innate IL-12 and IL-23 production. Journal of Immunology. 186 (11), 6313-6318 (2011).
  28. Chiaranunt, P., Tometich, J. T., Ji, J. T Cell Proliferation and Colitis Are Initiated by Defined Intestinal Microbes. 201 (1), 243-250 (2018).
  29. Feng, T., Cao, A. T., Weaver, C. T., Elson, C. O., Cong, Y. Interleukin-12 converts Foxp3+ regulatory T cells to interferon-γ-producing Foxp3+ T cells that inhibit colitis. Gastroenterology. 140 (7), 2031-2043 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

nieswoiste zapalenia jelitlimfocyty T CD4model zapalenia jelita grubegomyszy z nokautem genu Rag1antygen mikrobioty jelitowejhistopatologiablaszka w a ciwabarwienie hematoksylin i eozyn

Powiązane artykuły