Montaż i charakterystyka zewnętrznego sterownika do generowania subkilohercowego przepływu oscylacyjnego w mikrokanałach

Summary

Protokół demonstruje wygodną metodę wytwarzania harmonicznego przepływu oscylacyjnego od 10 do 1000 Hz w mikrokanałach. Odbywa się to poprzez połączenie sterowanej komputerowo membrany głośnika z mikrokanałem w sposób modułowy.

Abstract

Technologia mikroprzepływowa stała się standardowym narzędziem w laboratoriach chemicznych i biologicznych zarówno do analizy, jak i syntezy. Wstrzykiwanie próbek ciekłych, takich jak odczynniki chemiczne i kultury komórkowe, odbywa się głównie poprzez stałe przepływy, które są zwykle napędzane przez pompy strzykawkowe, grawitację lub siły kapilarne. Zastosowanie komplementarnych przepływów oscylacyjnych jest rzadko brane pod uwagę w zastosowaniach, pomimo jego licznych zalet, jak ostatnio wykazano w literaturze. Znacząca bariera techniczna utrudniająca implementację przepływów oscylacyjnych w mikrokanałach jest prawdopodobnie odpowiedzialna za brak jej powszechnego przyjęcia. Zaawansowane komercyjne pompy strzykawkowe, które mogą wytwarzać przepływ oscylacyjny, są często droższe i działają tylko dla częstotliwości mniejszych niż 1 Hz. W tym miejscu zademonstrowano montaż i działanie niedrogiego urządzenia głośnikowego typu plug-and-play, które generuje przepływ oscylacyjny w mikrokanałach. Harmoniczne przepływy oscylacyjne o wysokiej wierności o częstotliwościach w zakresie 10-1000 Hz można osiągnąć wraz z niezależną kontrolą amplitudy. Amplitudy w zakresie 10-600 μm można osiągnąć w całym zakresie pracy, w tym amplitudy > 1 mm przy częstotliwości rezonansowej, w typowym mikrokanale. Chociaż częstotliwość oscylacji jest określana przez głośnik, pokazujemy, że amplituda oscylacji jest wrażliwa na właściwości płynu i geometrię kanału. W szczególności amplituda oscylacji zmniejsza się wraz ze wzrostem długości obwodu kanału i lepkości cieczy, a amplituda wzrasta wraz ze wzrostem grubości i długości lampy głośnikowej. Dodatkowo, aparat nie wymaga żadnych wcześniejszych funkcji do zaprojektowania na mikrokanale i można go łatwo odłączyć. Może być stosowany jednocześnie ze stałym przepływem wytwarzanym przez pompę strzykawkową w celu generowania przepływów pulsacyjnych.

Introduction

Precyzyjna kontrola natężenia przepływu cieczy w mikrokanałach jest kluczowa dla zastosowań lab-on-a-chip, takich jak produkcja kropel i enkapsulacja¹, mixing^2,3, oraz sortowanie i manipulowanie zawieszonymi cząstkami^4,5,6,7. Najczęściej stosowaną metodą kontroli przepływu jest pompa strzykawkowa, która wytwarza wysoce kontrolowane stałe przepływy, dozując albo stałą objętość cieczy, albo stałe objętościowe natężenie przepływu, często ograniczone do całkowicie jednokierunkowego przepływu. Alternatywne strategie wytwarzania przepływu jednokierunkowego obejmują użycie głowicy grawitacyjnej⁸, sił kapilarnych⁹ lub przepływu elektroosmotycznego¹⁰. Programowalne pompy strzykawkowe pozwalają na zależne od czasu dwukierunkowe sterowanie natężeniem przepływu i dozowanymi objętościami, ale są ograniczone do czasów reakcji większych niż 1 s ze względu na bezwładność mechaniczną pompy strzykawkowej.

Kontrola przepływu w krótszych skalach czasowych odblokowuje mnóstwo ^{6,11,12,13,14,15} możliwości niedostępnych w inny sposób ze względu na jakościowe zmiany w fizyce przepływu. Najbardziej praktycznym sposobem wykorzystania tej zróżnicowanej fizyki przepływu są fale akustyczne lub przepływy oscylacyjne o przedziałach czasowych od ^10-1 do ^10-9 s lub 10¹ -10⁹ Hz. Dostęp do górnego końca tego zakresu częstotliwości uzyskuje się za pomocą urządzeń wykorzystujących masowe fale akustyczne (BAW; 100 kHz-10 MHz) i powierzchniowe fale akustyczne (SAW; 10 MHz-1 GHz). W typowym urządzeniu BAW całe podłoże i kolumna płynu są wibrowane poprzez przyłożenie sygnału napięciowego do połączonego piezoelektryka. Umożliwia to stosunkowo wysoką przepustowość, ale powoduje również nagrzewanie przy wyższych amplitudach. Jednak w urządzeniach SAW granica faz ciało stałe-ciecz jest oscylowana przez przyłożenie napięcia do pary elektrod międzypalcowych wzorowanych na podłożu piezoelektrycznym. Ze względu na bardzo krótkie długości fal (1 μm-100 μm) cząstki o wielkości zaledwie 300 nm mogą być precyzyjnie manipulowane przez falę ciśnienia generowaną w urządzeniach SAW. Pomimo możliwości manipulowania małymi cząstkami, metody SAW ograniczają się do lokalnej manipulacji cząstkami, ponieważ fala szybko słabnie wraz z odległością od źródła.

W zakresie częstotliwości 1-100 kHz, przepływy oscylacyjne są zwykle generowane za pomocą elementów piezo-elementów, które są połączone z mikrokanałem polidimetylosiloksanu (PDMS) nad zaprojektowaną wnęką^16,17. Membrana PDMS nad wzorzystą wnęką zachowuje się jak wibrująca membrana lub bęben, który zwiększa ciśnienie płynu w kanale. W tym zakresie częstotliwości długość fali jest większa niż rozmiar kanału, ale amplitudy prędkości oscylacji są małe. Najbardziej użytecznym zjawiskiem w tym reżimie częstotliwości jest generowanie akustycznych/lepkich przepływów strumieniowych, które są prostowanymi przepływami stałymi spowodowanymi nieliniowością nieodłącznie związaną z przepływem cieczy o bezwładności¹⁸. Stałe strumienie zwykle objawiają się jako szybkie przeciwbieżne wiry w pobliżu przeszkód, ostrych narożników lub mikropęcherzyków. Wiry te są przydatne do mieszania^19,20 i oddzielania cząstek o wielkości 10 μm od strumienia przepływu²¹.

Dla częstotliwości w zakresie 10-1000 Hz, zarówno prędkość składowej oscylacyjnej, jak i związany z nią stały strumień lepki są znaczne pod względem wielkości i użyteczne. Silne przepływy oscylacyjne w tym zakresie częstotliwości mogą być używane do inercyjnego ogniskowania²², ułatwiają generowanie kropel²³ i mogą generować warunki przepływu (liczby Womersleya), które naśladują przepływ krwi w badaniach in vitro. Z drugiej strony przepływy strumieniowe są przydatne do mieszania, wychwytywania cząstek i manipulacji. Przepływ oscylacyjny w tym zakresie częstotliwości może być również realizowany za pomocą elementu piezo-połączonego z urządzeniem, jak opisano powyżej²³. Istotną przeszkodą w realizacji przepływów oscylacyjnych przez połączony element piezoelektryczny jest to, że wymaga to wcześniejszego zaprojektowania funkcji. Co więcej, połączone elementy głośnika nie są rozłączne, a nowy element musi być połączony z każdym urządzeniem²⁴. Jednak takie urządzenia mają tę zaletę, że są kompaktowe. Alternatywną metodą jest użycie elektromechanicznego zaworu przekaźnikowego²⁰. Zawory te wymagają do działania pneumatycznych źródeł ciśnienia i niestandardowego oprogramowania sterującego, a tym samym zwiększają barierę techniczną dla testowania i wdrażania. Niemniej jednak takie urządzenia umożliwiają zastosowanie zadanej amplitudy i częstotliwości ciśnienia.

W tym artykule opisana jest budowa, działanie i charakterystyka przyjaznej dla użytkownika metody generowania przepływów oscylacyjnych w zakresie częstotliwości 10-1000 Hz w mikrokanałach. Metoda ta oferuje wiele korzyści, takich jak ekonomiczny montaż, łatwość obsługi i gotowość do współpracy ze standardowymi kanałami mikroprzepływowymi i akcesoriami, takimi jak pompy strzykawkowe i rurki. Dodatkowo, w porównaniu z poprzednimi podobnymi podejściami²⁵, metoda oferuje użytkownikowi selektywną i niezależną kontrolę częstotliwości i amplitud oscylacji, w tym modulacji między przebiegami sinusoidalnymi i niesinusoidalnymi. Cechy te pozwalają użytkownikom na łatwe wdrażanie przepływów oscylacyjnych, a tym samym ułatwiają ich powszechne zastosowanie w szerokim zakresie obecnie istniejących technologii i zastosowań mikroprzepływowych w dziedzinie biologii i chemii.

Protocol

1. Szybkie projektowanie i produkcja prototypów form

1. Otwórz program AutoCAD na komputerze. Wybierz pozycję Plik na pasku zadań, a następnie wybierz pozycję Otwórz i przejdź do pliku modelu trójwymiarowego (3D) formy kanału o rozszerzeniu .dxf lub .dwg
.
2. Zaznacz cały model, klikając i przeciągając wokół niego ramkę. Wyeksportuj projekt jako plik .stl, wybierając Plik |Eksportuj, a następnie Inne formaty i wybierz .stl z listy rozwijanej.
3. Prześlij plik do precyzyjnej drukarki stereolitograficznej (SLA) z żywicy, takiej jak Formlabs FORM3. Wlej żywicę do komory na żywicę i rozpocznij drukowanie oraz wyprodukuj formę z najmniejszymi krokami w osi Z (25 mikronów dla żywicy Formlabs CLEAR).
4. Poczekaj na zakończenie automatycznego drukowania części.
   UWAGA: W ten sposób można wytwarzać formy o cechach tak małych jak 0,1 mm.
5. Po wyjęciu części z żywicy mieszaj ją w izopropanolu przez 5 minut, aby usunąć pozostałą żywicę.
6. Osuszyć formę powietrzem lub azotem przez 2 min.
   UWAGA: Konwencjonalne wytwarzanie form mikroprzepływowych z płytkami krzemowymi i fotolitografia z dowolnymi fotorezystami SU8 lub KMPR mogą być również wykorzystywane do produkcji form o mniejszych cechach.
7. Wysuszoną pleśń utwardzać w temperaturze 60 °C w świetle UV maksymalnie przez 1 godzinę.

2. Produkcja mikrokanałów PDMS

1. Umieść formę na arkuszu folii aluminiowej. Aby złagodzić rozwarstwienie PDMS, spryskaj formę silikonowym środkiem do usuwania pleśni w 1 lub 2 przejściach.
2. Wlej żywicę PDMS i środek sieciujący do jednorazowego kubka w proporcji wagowej 10:1 i wymieszaj jednorazową łyżką.
3. Wlej powstałą mieszaninę na formę, aby uzyskać film o wymaganej grubości. Aby zapobiec deformacji dużych ścianek kanałów, należy zachować grubość PDMS większą niż 5 mm lub 3-4 razy większą niż maksymalna grubość elementu.
4. Umieść formę z wylanym PDMS w komorze odgazowywania i zamknij pokrywę. Upewnij się, że O-ring hermetycznie zamyka komorę.
5. Zamknij zawór wydechowy i włącz pompę zgrubną podciśnienia, aby rozpocząć odgazowanie.
6. Wlaną mieszaninę odgazowuje się w pompie próżniowej przez ponad 4-6 cykli, z których każdy trwa około 5 minut. Ręcznie usuń wszelkie pozostałe pęcherzyki (w narożnikach i rowach) za pomocą cienkiego drutu.
7. Ustaw temperaturę piekarnika na 80 °C i pozwól mu się nagrzać. Umieść mieszaninę w piekarniku w temperaturze 80 °C na 2 godziny do utwardzenia.
8. Wyjmij utwardzoną formę z piekarnika i pozostaw w temperaturze pokojowej na 10 minut do ostygnięcia.
9. Za pomocą skalpela ostrożnie wytnij krawędzie formy. Aby uzyskać optymalne rozwarstwienie, użyj strzykawki do wstrzyknięcia izopropanolu między formę a utwardzonym PDMS.
10. Oderwij utwardzony PDMS od formy i pokrój go na osobne urządzenia za pomocą żyletki. Rozmiar każdego urządzenia musi mieścić się w zakresie od 10 mm x 10 mm do 30 mm x 70 mm, aby można je było połączyć ze szkiełkiem.
11. Wykonaj otwór o średnicy 1,0-3,0 mm na wlocie i wylocie za pomocą stempla do biopsji.
12. Włącz ręczny generator plazmy o częstotliwości radiowej (RF). Aby aktywować szkiełko podstawowe, należy kilkakrotnie równomiernie przesuwać drut elektrodowy po czystym, suchym szkiełku podstawowym przez 2 minuty. Zachowaj odstęp między przewodem a szkłem około 5 mm. Umieścić utwardzoną PDMS od strony urządzenia w kontakcie z aktywowanym szkiełkiem, a następnie umieścić w piecu o temperaturze 80 °C na 2 godziny.
13. Przytnij rurki wlotowe i wylotowe z polietylenu na wymaganą długość i włóż je do otworów wlotowych i wylotowych.
14. Aby zapobiec odłączaniu się rurki podczas pracy, nałóż uszczelniacz silikonowy na powierzchnię styku i pozostaw do utwardzenia na 2 godziny, aby zabezpieczyć rurkę.

3. Zespół sterownika oscylacyjnego

1. Clamp końcówki zacisku krokodylkowego pary przewodów krokodylkowych do styków głośnika. Tutaj zastosowano głośnik o mocy 15 W z membraną o średnicy 8 cm, chociaż można również zastosować inne głośniki.
2. Umieść układ kontrolera aux na pojemniku izolacyjnym. Włóż końcówki kołków do gniazd śrubowych układu kontrolera aux i mocno dokręć śrubokrętem, aby zapewnić łączność.
3. Podłącz jeden koniec aux do układu kontrolera, a drugi koniec do portu aux w komputerze lub smartfonie.
4. Podłącz zasilacz prądu stałego (DC) 12 V do zasilacza. Włącz układ kontrolera, podłączając koncentryczną końcówkę zasilacza prądu stałego do gniazdka elektrycznego.
5. Korzystając z przeglądarki internetowej, przejdź do strony internetowej generatora tonów online (np. https://www.szynalski.com/tone-generator/ ).
6. Wpisz żądaną częstotliwość (5-1200 Hz) w aplikacji online. Przewiń pasek głośności do wymaganej wartości (np. 100%).
7. Kliknij symbol Wave-Type Generator i wybierz żądany przebieg (sinusoidalny, kwadratowy, trójkątny, piłokształtny). Należy pamiętać, że domyślnie jest to przebieg sinusoidalny. Naciśnij przycisk Odtwórz, aby uruchomić głośnik.

4. Montaż adaptera

UWAGA: Kompletny zestaw adaptera głośnik-lampa jest zilustrowany na schemacie w Rysunek 1.

1. Zamocuj głośnik (Rysunek 1(I)) na wydrukowanym w 3D uchwycie głośnika (Rysunek 1(II)) (patrz speakermount.stl w pliku uzupełniającym 1), przyklejając taśmę na zakrzywionej powierzchni i po obu stronach uchwytu.
2. Ustaw głośnik pionowo z powierzchnią stożka głośnika skierowaną do góry. Umieść wydrukowany w 3D adapter (Rysunek 1(III)) (patrz speakertubeadapter.stl w pliku uzupełniającym 2) koncentrycznie na stożku głośnika.
3. Nałóż obficie uszczelniacz silikonowy wzdłuż krawędzi adaptera i pozostaw do utwardzenia na 2 godziny.
4. Umieść głośnik i uchwyt głośnika na mikroskopie stage i przyklej taśmę, aby zapobiec ruchowi podczas pracy.
5. Odetnij końcówkę mikropipety o pojemności 200 μl w odległości około 2 cm od jej wąskiego końca i wyrzuć szerszą połowę końcówki. Wąski stożkowy koniec posłuży jako uszczelka klinowa do odwracalnego mocowania.
6. Podłącz rurkę polietylenową (Rysunek 1(V)) do wylotu mikrokanalika (Rysunek 1(VI)) najpierw przewlekając przez końcówkę mikropipety (Rysunek 1(IV)), a następnie przez koncentryczny koniec adaptera i na końcu na zewnątrz z boku.
7. Mocno wciśnij wąską końcówkę końcówki pipety w koncentryczny koniec adaptera, aby uzyskać odłączane szczelne uszczelnienie.

5. Działanie eksperymentalnego zestawu dla przepływów oscylacyjnych w mikrokanałach

1. Dodać cząstki znacznikowe do fiolki z 22% wagowo-wagowym (w/w) roztworem glicerolu, aby uzyskać neutralnie pływającą zawiesinę o ułamku objętościowym 0,01%-0,1% polistyrenu w płynie w temperaturze 20 °C. Mieszać energicznie, wstrząsając, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.
2. Załadować strzykawkę wlotową o pojemności 1 ml z 1 ml próbki. Zamontować i przymocować załadowaną strzykawkę do automatycznej pompy strzykawkowej. Włóż igłę strzykawki do rurki wlotowej urządzenia, aby uzyskać wodoszczelne uszczelnienie.
3. Upewnij się, że rurka wylotowa jest poprowadzona przez zespół adaptera i do zbiornika (patrz poprzednia sekcja dotycząca montażu adaptera).
4. Włączyć pompę strzykawkową. Korzystając z ekranu dotykowego, wybierz typ strzykawki jako Becton-Dickinson 1 mL. Następnie wybierz opcję Zaparz. Następnie wybierz żądane natężenie przepływu (0-1 ml/min) lub objętość przepływu (< 1 ml).
5. Zainicjuj stały przepływ za pomocą pompy strzykawkowej. Poczekaj, aż wypłynie wystarczająca ilość płynu, a rurka wylotowa zostanie napełniona płynem aż do głośnika.
   UWAGA: Amplituda oscylacji dla danego ustawienia nie będzie się zmieniać przy stałym przepływie transportu, jeśli rura wylotowa jest zalana.
6. Wybierz wymaganą częstotliwość, amplitudę i przebieg w aplikacji generatora tonów, jak opisano w kroku 3.5 i naciśnij przycisk Odtwórz, aby wygenerować przepływ oscylacyjny wewnątrz mikrokanału.

6. Obserwacja i pomiar amplitudy

1. Zamontuj urządzenie na mikroskopie. Ustaw konfigurację optyczną, wybierając soczewkę obiektywu o powiększeniu od 10x do 40x, dostosowując płaszczyznę ogniskowej i ustawiając stolik.
2. Aby uzyskać pomiary w dobrze zdefiniowanej płaszczyźnie ogniskowej, należy upewnić się, że głębia ostrości soczewki obiektywu jest 5-krotnie mniejsza lub więcej niż głębokość kanału.
3. Aby obserwować przepływ oscylacyjny, należy użyć szybkiej kamery o częstotliwości odświeżania co najmniej dwukrotnie większej niż częstotliwość oscylacji obliczona przy użyciu twierdzenia o próbkowaniu Nyquista. Aby uzyskać praktycznie użyteczną rozdzielczość przebiegu, zmierz co najmniej 10 punktów w danym okresie, używając liczby klatek na sekundę > 10 razy większej niż częstotliwość oscylacji.
4. Alternatywnie, aby obserwować tylko wyprostowane lub długotrwałe efekty przepływów pulsacyjnych, należy wykonać obrazowanie stroboskopowe, ustawiając częstotliwość obserwacji na dowolny idealny dzielnik częstotliwości oscylacji.
5. Zarówno w przypadku obrazowania bezpośredniego, jak i stroboskopowego, należy używać aparatu wyposażonego w migawkę globalną, aby uniknąć efektu galaretki. W obu przypadkach czas ekspozycji powinien być znacznie krótszy niż okres oscylacji (o współczynnik 10 lub więcej), aby zapobiec powstawaniu smug.
6. Aby zmierzyć amplitudę drgań bez szybkiej kamery, nagrywaj z szybkością klatek utrzymywaną na poziomie bliskim, ale nie równym stroboskopowej liczbie klatek na sekundę (np. 49 klatek/s dla sygnału 50 Hz). Powoduje to znacznie spowolnioną oscylację, na podstawie której można dokładnie zmierzyć amplitudę.
7. Obserwuj i zapisuj pomiary amplitudy.

Results

Aby zilustrować możliwości i wydajność powyższej konfiguracji, przedstawiono reprezentatywne wyniki przepływu oscylacyjnego w prostym liniowym mikrokanale o przekroju kwadratowym. Szerokość i wysokość kanału wynoszą 110 μm, a jego długość 5 cm. Po pierwsze, opisujemy ruch sferycznych cząstek znacznikowych z polistyrenu i sposób, w jaki można je wykorzystać do sprawdzenia wierności sygnału oscylacyjnego, a także osiągalnego zakresu amplitud oscylacji. Następnie omawiamy wpływ określonych właściwości płynów lub materiałów ...

Discussion

Zademonstrowaliśmy montaż (patrz kroki krytyczne protokołu 3 i 4) i działanie (patrz kroki krytyczne protokołu 5 i 6) zewnętrznego aparatu opartego na głośniku do generowania przepływu oscylacyjnego o częstotliwościach w zakresie od 10 do 1000 Hz w urządzeniach mikroprzepływowych. Śledzenie cząstek zawieszonych w zawiesinie cząstek znacznikowych jest wymagane w celu określenia wierności ruchu harmonicznego, a także w celu kalibracji zakresu amplitud oscylacji osiągalnych w zakresie częstotliwości roboczych. Krzywa amplit...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zespół sterownika Oscillatory Driver
Alligator-to-pin	Adafruit	3255	Mały zacisk krokodylkowy do męskiego przewodu połączeniowego (12)
Aux	Adafruit	2698	3,5 mm męski/męski stereo 1 m
Układ kontrolera	Damgoo	TPA3116	50w+50w 2-kanałowy wzmacniacz audio (bluetooth i AUX)
DC adapter	Adafruit	798	Zasilacz impulsowy regulowany 12 V DC 1A
Końcówka do mikropipet	VWR Signature	37001-532	Końcówka do mikropipet 200 ul
Uszczelniacz silikonowy	Loctite	908570	Przezroczysty wodoodporny uszczelniacz silikonowy (80 ml)
Głośnik	Drok	6843996	4,5 cala 4 Ohm 40 W
Uchwyt			głośnikowyWydrukowano 3D z 'speakermount.stl' w plikach uzupełniających
		głośnik-tubus	wydrukowano 3D z 'speaketubeadapter.stl' w plikach uzupełniających
Produkcja mikrokanałów
Stempel do biopsji	Miltex	15110	Dziurkacz do biopsji z tłokiem (1 - 4 mm)
Odgazowywacz
Jednorazowy kubek
Jednorazowa łyżka
Szkiełka szklane	VWR Signature	16004-430	3 "x 1" wstępnie czyste o grubości 1 mm
Forma			Si - SU-8 lub druk 3D
Piekarnik	Fischer Scientific		Isotemp
PDMS żywica i środek sieciujący	Dow Chemical	4019862	Żywica i środek sieciujący Sylgard 184 PDMS (500 g)
Rurki polietylenowe	Becton Dickinson Intramedic	427440	Rurki polietylenowe (PE 60 - PE 200)
Żyletki	VWR	55411-050	Przemysłowe żyletki jednoostrzowe Generator
plazmy RF	Produkty elektrotechniczne	BD - 20	Generator wysokiej częstotliwości
Silikonowe uwalnianie formy	CRC	03301	Uwalnianie formy silikonowej klasy spożywczej (16 uncji)
< mocna > obserwacja i charakteryzacja< / silna>
Kamera	Edgertronic		SC2 +
Obiektyw	Nikon		Plan Fluor 10x
	Mikroskop ręczny Nikon		Ti Eclipse
Igły	Becton Dickinson	305175	Strzykawka PrecisionGlide 20G
	Becton Dickinson	1180100555	Monoject 1 ml
Pompa strzykawkowa	Aparat		Programowalna pompa strzykawkowa z podwójną strzykawką
Cząstki smugowe	Spherotech	PP-10-10	Cząstki znacznikowe polistyrenu 1 um