Hodowla limfocytów w symulowanej mikrograwitacji przy użyciu rotacyjnego systemu hodowli komórek

Summary

To jest przewodnik krok po kroku dotyczący korzystania z dostępnego na rynku systemu rotacyjnej hodowli komórkowej do hodowli limfocytów w symulowanej mikrograwitacji przy użyciu specjalistycznych jednorazowych naczyń hodowlanych. Ta metoda hodowli może być stosowana do każdej hodowli komórek zawiesinowych.

Abstract

Biorąc pod uwagę obecne ograniczenia prowadzenia badań biologicznych w kosmosie, istnieje kilka opcji poddania hodowli komórkowej symulowanej mikrograwitacji (SMG) na Ziemi. Opcje te różnią się metodami, zasadami i przydatnością do stosowania z hodowlą komórek zawiesinowych. W tym miejscu opisano metodę hodowli komórkowej polegającą na poddaniu limfocytów symulowanej mikrograwitacji przy użyciu dostępnego na rynku systemu rotacyjnej hodowli komórek, znanego również jako klinostat 2D lub urządzenie o obrotowych ściankach (RWV). Ta metoda hodowli komórkowej wykorzystuje zasadę uśrednionego w czasie unieważniania wektora grawitacji do symulacji mikrograwitacji poprzez obracanie komórek wokół osi poziomej. Komórki hodowane w tym systemie mogą być zbierane i wykorzystywane w wielu różnych testach eksperymentalnych w celu oceny wpływu symulowanej mikrograwitacji na funkcję komórkową i fizjologię. Technika hodowli może się nieznacznie różnić w zależności od rodzaju użytej komórki lub linii, ale opisana tutaj metoda może być zastosowana do dowolnej hodowli komórek zawiesinowych.

Introduction

Wykazano, że loty kosmiczne wpływają na wiele aspektów ludzkiej fizjologii, w tym na układ odpornościowy. Wiele badań wykazało dysregulację immunologiczną w wyniku lotów kosmicznych in vivo i ekspozycji na symulowaną mikrograwitację (SMG) in vitro^1,2,3,4. Jednym z głównych aspektów środowiska kosmicznego, który wpływa na fizjologię człowieka, jest mikrograwitacja. Mikrograwitacja odnosi się do "nieważkości" doświadczanej z powodu niskich sił grawitacyjnych w środowisku kosmicznym⁵. W miarę jak ludzkość przygotowuje się do dłuższych misji kosmicznych na Księżyc i Marsa, należy przeprowadzić więcej badań, aby złagodzić poważne zagrożenia dla zdrowia astronautów.

Prawdziwe warunki mikrograwitacji dla badań naukowych można osiągnąć w przestrzeni kosmicznej na pokładzie Międzynarodowej Stacji Kosmicznej (ISS) lub w nanosatelitach wystrzelonych na orbitę; jednak te opcje mogą być niezwykle kosztowne i skomplikowane do zorganizowania. Biorąc pod uwagę obecne ograniczenia w prowadzeniu badań biologicznych w kosmosie, istnieje kilka opcji wywołania prawdziwej mikrograwitacji i pistoletu maszynowego na Ziemi. Istnieją operacje na dużą skalę, które mogą wytwarzać krótkie okresy prawdziwej mikrograwitacji na Ziemi, w tym wieże zrzutowe, loty paraboliczne i rakiety sondażowe. Jednak metody te nie są zbyt odpowiednie do badania wpływu mikrograwitacji na systemy biologiczne, głównie ze względu na krótkie okresy leczenia mikrograwitacją (tj. sekundy do 20 minut). Metody te są omówione bardziej szczegółowo w innym miejscu^5,6. Opcje, które są odpowiednie do biologicznej hodowli komórek, obejmują urządzenia na małą skalę, takie jak klinostatyki 2D lub urządzenia z obrotowymi naczyniami ściennymi (RWV) oraz klinostatyki 3D lub maszyny do losowego pozycjonowania (RPM). Urządzenia te mogą być ustawione w inkubatorach do hodowli komórkowych utrzymywanych w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 i} obracają hodowlę komórkową wokół osi poziomej (2D) lub wokół dwóch prostopadłych osi (3D) ⁵. Należy jednak podkreślić, że te metody hodowli wytwarzają SMG, w przeciwieństwie do prawdziwej mikrograwitacji, która jest najbardziej możliwa do osiągnięcia w kosmosie w kontekście badań biologicznych.

Celem obecnego artykułu jest nakreślenie etapów poddawania limfocytów SMG za pomocą komercyjnie dostępnego urządzenia RWV (Tabela Materiałów), które podpada pod klasyfikację 2D klinostatu. Chociaż producent udostępnia ogólny protokół obsługi tego urządzenia, niniejszy artykuł ma na celu bardziej szczegółowe omówienie kroków rozwiązywania problemów i optymalizacji. W tym artykule omówiono również teorię działania tego urządzenia w celu produkcji SMG w hodowli komórek zawiesinowych, w szczególności w przypadku limfocytów. W tym kontekście hodowla komórek zawiesinowych odnosi się do komórek rosnących swobodnie w uzupełnionych pożywkach hodowlanych, bez przylegania do dodatkowego rusztowania. W zawiesinowej hodowli komórkowej hoduje się wiele typów komórek, w tym limfocyty. Limfocyty to komórki układu odpornościowego, w tym komórki T, B i NK (Natural Killer), które znajdują się w narządach limfatycznych i krwiobiegu⁷.

Opisany tutaj klinostat RWV 2D działa na zasadzie uśrednianego w czasie unieważniania wektora grawitacji5^,6,8,9, przy czym wektor grawitacji jest losowo wybierany poprzez obrót kultury komórkowej na osi poziomej. Osiąga się to poprzez dopasowanie prędkości obrotowej naczynia hodowlanego do prędkości sedymentacji komórek. Tak długo, jak prędkość obrotowa naczynia hodowlanego jest dobrze dopasowana do prędkości sedymentacji komórek, komórki są utrzymywane w swobodnym spadku i nie są zdolne do sedymentacji, jak ma to miejsce w środowisku kosmicznym. Po początkowej fazie przyspieszania, pożywka w naczyniu hodowlanym ostatecznie osiąga z czasem "rotację ciała stałego". Ta rotacja pozioma indukuje również przepływ laminarny w naczyniu do hodowli komórkowej. Tworzy to środowisko "niskiego ścinania", biorąc pod uwagę, że naprężenie ścinające indukowane na komórki przez przepływ laminarny jest znacznie mniejsze niż w przypadku przepływu turbulentnego. Biorąc jednak pod uwagę, że klinostat nie jest systemem doskonałym, wprowadza się pewne małe, laminarne ruchy płynu, które powodują minimalne naprężenia ścinające w komórkach. W związku z tym komórki zawieszone w pożywce są ciągnięte przez ten przepływ podczas obracania. Podczas obrotu poziomego wektor grawitacji działa na komórki i wprowadza je w trajektorię oscylacyjną, jak pokazano na rysunku Rysunek 1. Innym małym źródłem naprężeń ścinających jest spowodowane "opadaniem" komórek przez pożywkę, powodując przepływ laminarny wokół komórek. Gdy naczynie hodowlane obraca się wokół osi poziomej, wektor grawitacji doświadczany przez komórki również się obraca. Z biegiem czasu ten wirujący wektor grawitacji zbliża się średnio do zera; zjawisko to nazywa się uśrednionym w czasie unieważnieniem wektora grawitacji i indukuje stan SMG^5,6,8,9. To urządzenie zostało użyte do zbadania wpływu SMG na wiele typów komórek, z których niektóre są opisane w bibliografii^10,11,12. Więcej przykładów można znaleźć na stronie producenta urządzenia.

To urządzenie RWV korzysta ze specjalistycznych "naczyń o wysokim współczynniku kształtu" (HARV) dostępnych przez producenta urządzenia. Każdy z tych HARV mieści 10 ml hodowli komórkowej; jednak dostępne są również HARV o pojemności 50 ml. Można użyć HARV o pojemności 10 ml lub 50 ml, w zależności od liczby komórek potrzebnych do wykonania dalszych testów eksperymentalnych, co opisano w dalszej części dyskusji. HARV są wykonane z poliwęglanu i zawierają silikonową membranę natleniającą, która umożliwia wymianę gazową podczas hodowli komórkowej. Utrzymuje to pH pożywki komórkowej i pozwala na efektywne oddychanie komórkowe. Na czole naczynia znajduje się główny port napełniania i dwa zaślepione porty strzykawki (Rysunek 2A). Po załadowaniu kultury komórkowej przez główny port napełniania, dwie strzykawki są ładowane do naczynia, aby pomóc w usuwaniu pęcherzyków. W przypadku korzystania z naczyń o pojemności 10 ml dobrze sprawdzają się dwie strzykawki o pojemności 3 ml. Jedna strzykawka jest dołączona do urządzenia pusta, z całkowicie wciśniętą strzykawką, a druga jest wypełniona 3 ml hodowli komórkowej (Rysunek 2E). Są one używane w połączeniu do usuwania pęcherzyków z naczynia, co jest ważne dla utrzymania leczenia SMG. Ogólnie rzecz biorąc, zaleca się ustanowienie dwóch kontroli ujemnych, które można określić jako kontrolę "kolbową" i kontrolę "1G". Kontrola "Kolby" odpowiada komórkom, które są hodowane w standardowej kolbie do hodowli komórek w zawiesinie T25. Kontrola 1G odpowiada komórkom, które są hodowane w specjalistycznym naczyniu hodowlanym o pojemności 10 ml, które jest po prostu umieszczane w inkubatorze (tj. bez poddawania ich działaniu SMG). Zapoznaj się z sekcją Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji na temat elementów sterujących.

Opisana tutaj metoda jest odpowiednia dla każdego badacza, który chce badać wpływ SMG na limfocyty, ze szczególnym naciskiem na komórki NK za pomocą linii komórkowej NK92¹³. Wyniki tych badań mogą pomóc nam lepiej zrozumieć i złagodzić niekorzystny wpływ lotów kosmicznych na ludzki układ odpornościowy.

Protocol

UWAGA: Następujące kroki powinny być wykonane w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego.

1. Przygotowanie naczyń do hodowli komórkowej

1. Wyjmij naczynia hodowlane z plastikowego opakowania. Oznacz każde naczynie na brzegu zgodnie z typem komórki/linią, która jest używana, czy jest to kontrola (1G) czy leczenie (SMG) oraz wszelkie inne istotne informacje.
2. Ustabilizuj naczynie i ostrożnie otwórz otwór napełniania, nie dotykając kołka/O-ringu zaślepki portu napełniania. Umieść nakrętkę na podkładce etanolowej, z kołkiem/O-ringiem skierowanym do góry, podczas napełniania naczynia. Nie zdejmować nasadek z portów strzykawki.
   UWAGA: Jeśli kołek/O-ring zostanie przypadkowo dotknięty, spryskaj kołek nasadki 70% etanolem i pozostaw go (skierowanego do góry) na kilka chwil podczas napełniania naczynia. Gdy będziesz gotowy do ponownego zamknięcia otworu napełniania, podnieś nakrętkę świeżą chusteczką papierową, aby dokładnie wysuszyć nakrętkę przed ponownym umieszczeniem jej na naczyniu.
3. Załadować naczynie 10 ml odpowiedniej kompletnej pożywki do hodowli komórkowej za pomocą sterylnej pipety serologicznej i ostrożnie umieścić nakrętkę z powrotem w porcie napełniania.
   UWAGA: W tym przypadku użyto linii komórkowej NK92 NK, która została wyhodowana w pożywce GM1, jak wcześniej zweryfikowano w badaniu klinicznym z wykorzystaniem komórek NK92 jako terapii komórkowej¹⁴. Stosowane podłoża hodowlane zależą od hodowanej linii komórkowej lub typu komórki. Sprawdź stronę internetową dostawcy, aby uzyskać poprawną recepturę pożywki dla używanej linii komórkowej lub typu komórki.
4. Upewnij się, że zaślepki portu strzykawki i port napełniania są dobrze zamknięte, a napełnione naczynia umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ , wykonując kolejne kroki w celu przygotowania naczyń do hodowli komórkowej.
   UWAGA: Ten etap zalewania pomaga zminimalizować tworzenie się dużych pęcherzyków, aby ułatwić usuwanie pęcherzyków w dalszej części kroku 6.

2. Przygotowanie hodowli komórek wyjściowych do konfiguracji leczenia SMG

1. Gdy nie są używane, przechowuj interesujące je ogniwa w temperaturze niższej niż -130 °C lub, najlepiej, w fazie parowej ciekłego azotu.
2. Co najmniej 1 tydzień przed planowanym leczeniem należy rozmrozić komórki i przeprowadzić ich hodowlę, korzystając z odpowiedniej receptury pożywki do hodowli komórkowych, którą można znaleźć na stronie internetowej dostawcy. Zaplanuj, ile komórek jest potrzebnych do przygotowania leczenia (szczegóły poniżej w kolejnych krokach) i upewnij się, że hodowle rozpoczynają się wystarczająco wcześnie, aby umożliwić wystarczającą proliferację i adaptację do hodowli.
3. Przechowywać kulturę komórkową w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Więcej szczegółów na temat standardowej praktyki hodowli komórkowej można znaleźć w innym miejscu¹⁵.
4. W dniu planowanego leczenia SMG należy określić początkowe stężenie i żywotność początkowej hodowli komórkowej.
   1. Do oznaczania stężenia początkowej hodowli komórkowej należy stosować preferowaną metodę (np. hemocytometr, ViCell, cytometria przepływowa itp.). Zwróć uwagę na stężenie żywotnych komórek (komórki na ml) i żywotność (%) komórek, upewniając się, że żywotność jest idealnie większa niż 85%. Protokół korzystania z hemocytometru można znaleźć w innym miejscu¹⁶.
5. Określ odpowiednią gęstość/stężenie wysiewu komórek w kulturze komórkowej do leczenia SMG, biorąc pod uwagę optymalny zakres koncentracji komórek dla danego typu/linii komórek, ich czas podwojenia i długość leczenia SMG. Więcej informacji na ten temat można znaleźć w sekcji Dyskusja.
   UWAGA: Z doświadczenia wynika, że optymalny zakres stężeń dla komórek NK92 wynosi od 0,3 x 10⁶ do 1,2 x 10⁶ komórek/ml. Ogólnie rzecz biorąc, komórki te mają czas podwojenia 48-72 godzin i są karmione co 2-3 dni. Biorąc pod uwagę, że długość leczenia wynosiła 72 godziny, komórki wysiewano na dolnym końcu ich optymalnego zakresu przy 0,4-0,5 x 10⁶ komórek/ml. Dostawca zaleca również taką gęstość wysiewu przy rozpoczynaniu początkowej hodowli komórek ze świeżej fiolki z komórkami NK92.
6. Określ objętość hodowli komórek podstawowych, która jest potrzebna do przygotowania leczenia i kontroli.
   UWAGA: Potrzeba 10 ml hodowli komórkowej na grupę eksperymentalną. Jeżeli utworzono trzy grupy doświadczalne (tj. jedną grupę badawczą: "SMG" i dwie kontrole ujemne: "kolbę" i "1G"), kolejne 10 ml hodowli komórkowej wystarcza do porcjowania do probówki o pojemności 15 ml używanej do ładowania strzykawek HARV. Jest to w sumie 40 ml, które może się wahać w zależności od konkretnego projektu eksperymentalnego.
7. Określ liczbę komórek potrzebnych do skonfigurowania leczenia.
   1. Oblicz całkowitą liczbę potrzebnych komórek, mnożąc wybraną gęstość wysiewu (komórki/ml) przez całkowitą potrzebną objętość (ml).
      UWAGA: Z doświadczenia z NK92 przygotowuje się 40 ml podstawowej hodowli komórkowej zgodnie z powyższym opisem przy stężeniu wysiewu 0,4-0,5 x 10⁶ komórek/ml. W związku z tym do ukończenia typowej konfiguracji leczenia potrzebne są komórki 16-20 x 10⁶ NK92. W przypadku linii komórkowej NK92 użycie nieco większej liczby komórek jest lepsze niż nieco mniejszej liczby komórek, aby utrzymać wysoką żywotność przez cały okres leczenia.
8. Określ objętość początkowej hodowli komórkowej do odwirowania.
   1. Biorąc pod uwagę, że stężenie komórek jest reprezentowane jako komórki/ml, podziel całkowitą liczbę komórek (komórek) potrzebnych do eksperymentu przez zmierzone stężenie początkowe kultury komórkowej (komórki/ml).
      UWAGA: Na przykład, jeśli potrzebne jest 16 x 10⁶ komórek, a początkowe stężenie kultury wynosi 0,8 x 10⁶ komórek/ml, należy odwirować 20 ml kultury.
9. Wykonaj końcową hodowlę komórek podstawowych.
   1. Odwirować odpowiednią liczbę komórek przy 300 x g przez 8 minut w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
   2. Ostrożnie przelać supernatant do pojemnika na odpady i delikatnie przesunąć probówkę, aby ponownie zawiesić osad w małej pozostałej objętości.
   3. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości ogrzanej (37 °C) kompletnej pożywki, aby doprowadzić kulturę do pożądanej gęstości wysiewu. Objętość ta została obliczona w kroku 2.6.
   4. Bezpiecznie zakryj probówkę o pojemności 50 ml i delikatnie odwróć ją kilka razy, aby dokładnie wymieszać zawiesinę komórek.
      UWAGA: Jeśli do przeprowadzenia pełnego eksperymentu potrzeba więcej niż 50 ml, najlepiej jest odwirować całkowitą liczbę potrzebnych komórek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i ponownie zawiesić ją w połowie potrzebnej objętości. Następnie dobrze wymieszaj i rozcieńcz w stosunku 1:2 w osobnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Na przykład, jeśli potrzebne jest 100 ml przy 0,4 x 10⁶ komórek/ml, odwiruj 40 x 10⁶ komórek w probówce o pojemności 50 ml, ponownie zawieś w 50 ml pożywki, przenieś 25 ml do innej probówki o pojemności 50 ml, a następnie uzupełnij obie 25 ml świeżej pożywki.

3. Załadunek naczyń z hodowlą komórkową

1. Pobrać naczynia zagruntowane pożywką z inkubatora.
2. Jeżeli używana jest kontrola "Kolba", należy załadować kolbę do hodowli zawiesinowej T25 10 ml kultury komórkowej z podstawki przygotowanej powyżej. Należy również dodać 10 ml podstawowej hodowli komórkowej do oddzielnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml, która zostanie użyta do załadowania strzykawek.
3. Odkręć zaślepki portu strzykawki, aby wyjąć je z naczynia i upewnij się, że kurki są w pozycji otwartej (Rysunek 2C).
4. Ustabilizuj naczynie i ostrożnie otwórz otwór napełniania, nie dotykając kołka/O-ringu zaślepki portu napełniania. Umieść nakrętkę na podkładce etanolowej, z kołkiem/O-ringiem skierowanym do góry, podczas napełniania naczynia. Ostrożnie odkręcić nakrętki z otworów strzykawki.
5. Upewnij się, że kurki są w pozycji otwartej (Rysunek 2C). Ostrożnie wylać pożywkę z naczynia do pojemnika na odpady, usunąć pożywkę za pomocą pipety serologicznej lub odessać za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura podłączonej do systemu próżniowego, nie dotykając membrany natleniającej.
6. Szczelnie zamknij stożkową probówkę o pojemności 50 ml, w której znajduje się podstawowa kultura komórkowa i delikatnie odwróć ją kilka razy, aby dokładnie wymieszać zawartość.
7. Pobrać 10 ml bulionu hodowli komórkowych z probówki o pojemności 50 ml za pomocą świeżej sterylnej pipety serologicznej. Podnieś naczynie i przechyl je tak, aby otwór napełniania był skierowany do góry, a następnie ostrożnie wlej materiał z kultur komórkowych do naczynia przez otwór napełniania.
   UWAGA: Zachowaj ostrożność i obserwuj objętość, aby posiew nie rozlał się przez porty strzykawki podczas przechylania naczynia.
8. Staraj się napełnić naczynie do samej górnej krawędzi otworu napełniania bez rozlewania; przechyl naczynie z powrotem w dół podczas napełniania, aby uniknąć rozlania. Należy uważać, aby nie dotknąć pipetą membrany natleniającej, ponieważ jest ona bardzo delikatna.
   UWAGA: Proces napełniania zbiornika może wymagać pewnej praktyki; Uzbrój się w cierpliwość i idź powoli. Jeśli przy otworze otworu do napełniania utworzy się film bąbelkowy, będzie to przeszkadzać w załadunku naczynia. Jeśli tak się stanie, delikatnie uderz w naczynie, aby zerwać uszczelkę utworzoną przez folię bąbelkową.
9. Po załadowaniu naczynia ostrożnie załóż z powrotem korek portu wlewu, uważając, aby nie dotknąć kołka/O-ringu.
10. Umieścić na strzykawkach.
    UWAGA: Na czole naczynia znajdują się dwa porty strzykawki (Rysunek 2A). Jedna będzie trzymać pustą strzykawkę, a druga będzie trzymać strzykawkę pełną hodowli komórkowej (Rysunek 2E).
    1. Najpierw podłączyć pustą strzykawkę o pojemności 3 ml do jednego z portów strzykawki, upewniając się, że strzykawka jest całkowicie wciśnięta.
       UWAGA: Napompuj strzykawki kilka razy przed podłączeniem ich do naczynia, ponieważ na początku są nieco ciasne. Zrób to wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego, aby zachować sterylność.
    2. Szczelnie zamknij stożkową probówkę o pojemności 15 ml z 10 ml porcjowanej hodowli komórkowej i delikatnie odwróć ją kilka razy, aby dokładnie wymieszać zawartość.
    3. Następnie ostrożnie zanurzyć do połowy drugą strzykawkę o pojemności 3 ml w hodowli komórkowej i pobrać trochę hodowli. Aby zminimalizować pęcherzyki powietrza w górnej części strzykawki, należy całkowicie wlać je z powrotem do probówki, a następnie pobrać 3 ml kultury.
    4. Podłączyć napełnioną strzykawkę do pozostałego portu strzykawki i ostrożnie zdezynfekować strzykawki oraz wokół portu napełniania za pomocą podkładki etanolowej. Nie dopuścić do przedostania się etanolu na membranę natleniającą. Teraz naczynie jest gotowe do pozbycia się pęcherzyków.
       UWAGA: Druga napełniona strzykawka do drugiego naczynia jest trudniejsza do załadowania, biorąc pod uwagę głębokość probówki 15 ml. Pomaga przechylić rurkę podczas napełniania strzykawki, aby utrzymać szczelność między napełnianą strzykawką a hodowlą komórkową.
    5. Powtórz kroki 3.3-3.10 dla pozostałych zbiorników. Jeśli w stożkowej probówce o pojemności 50 ml dla ostatniego naczynia pozostała nieznacznie niewystarczająca ilość hodowli komórkowej (np. 9,5 ml zamiast 10 ml), odzyskaj pozostałą ilość z stożkowej probówki o pojemności 15 ml użytej do załadowania strzykawek.
       UWAGA: Poniższe kroki nie muszą odbywać się w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego, ponieważ naczynie jest teraz zamkniętym, sterylnym systemem.

4. Usuwanie bąbelków z naczyń

UWAGA: Bąbelki są nieuniknione w tej konfiguracji i muszą być konsekwentnie usuwane przez cały czas leczenia (Rysunek 3). Więcej informacji na ten temat można znaleźć w sekcji Dyskusja.

1. Upewnij się, że zawory odcinające port strzykawki są w pozycji zamkniętej (Rysunek 2D), aby ograniczyć migrację komórek i pęcherzyków ze strzykawek do naczyń. Jest to szczególnie ważne w późniejszym okresie leczenia (omówione poniżej). Aby zebrać początkowe bąbelki, odwróć naczynie do góry nogami i kilka razy uderz w jego bok.
2. Szybko odwróć naczynie z powrotem do góry, a następnie pod lekkim kątem skierowanym w bok, tak aby wszystkie bąbelki unosiły się na górną stronę naczynia (Rysunek 3B).
3. Manewruj bąbelkami pod portem za pomocą pustej strzykawki i obserwuj, jak zaczynają wchodzić do portu. Otwórz oba zawory odcinające port strzykawki (Rysunek 2C).
4. Delikatnie uderzyć w naczynie, aby pęcherzyki powietrza uniosły się do pustej strzykawki. Powoli zasysaj większe pęcherzyki pustą strzykawką, jednocześnie ostrożnie wciskając pełną strzykawkę, aby utrzymać ciśnienie w naczyniu, aby membrana natleniająca nie pękła.
   UWAGA: Większe pęcherzyki będą musiały zostać zassane, podczas gdy małe pęcherzyki i mikropęcherzyki można zachęcić do unoszenia się do strzykawki, manewrując nimi w portach strzykawki i delikatnie uderzając w naczynie. Po kilku godzinach leczenia bardzo ważne jest, aby zminimalizować "zanieczyszczenie krzyżowe" między komórkami w strzykawkach a komórkami w naczyniu hodowlanym. Dzieje się tak, ponieważ komórki w strzykawkach nie otrzymują takiej samej ilości natlenienia lub ekspozycji na SMG, jak komórki w naczyniu.
5. Powtórz kroki 4.2-4.4 kilka razy, aby upewnić się, że wszystkie pęcherzyki zostały usunięte. Usuń wszystkie pęcherzyki, w tym mikropęcherzyki, z naczyń.
   UWAGA: Bąbelki można łatwo zobaczyć przez membranę natleniającą (tył naczynia), gdy naczynie jest skierowane na źródło światła (okno, światło itp.). Wykonując kroki 4.2 i 4.3, przyjrzyj się bąbelkom poruszającym się z tyłu naczynia, aby pomóc w wizualizacji trudniejszych do zobaczenia pęcherzyków.
6. Gdy pęcherzyki zostaną skutecznie usunięte, zamknij kran portu strzykawki. Strzykawki powinny być założone podczas leczenia, aby umożliwić późniejsze usunięcie pęcherzyków, upewniając się, że objętość w obu strzykawkach jest w przybliżeniu równa.

5. Mocowanie naczynia do obrotowej podstawy

1. Ostrożnie przetrzyj powierzchnię obrotowej podstawy i taśmowego 70% etanolem.
2. Upewnij się, że dołączony taśmowy jest podłączony do zasilacza. Umieść obrotową podstawę w inkubatorze i przymocuj taśmowy do podstawy. Upewnij się, że zasilacz jest trzymany w pobliżu, ale na zewnątrz inkubatora. Rysunek 4 przedstawia obrotową podstawę i zasilacz dla kontekstu.
3. Przymocuj naczynie zabiegowe SMG, wyrównując gwinty naczynia z obrotowym kołkiem i delikatnie obracając obrotowy kołek na podstawie w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Upewnij się, że naczynie jest dobrze zamocowane. Upewnij się, że inkubator utrzymuje wilgotność bliską 100%, napełniając tackę na wodę wystarczającą ilością wody z autoklawizowanej odwróconej osmozy (RO).
4. Wybierz odpowiednią prędkość obrotową (obr./min). Dostosuj prędkość obrotową do prędkości sedymentacji komórek, tak aby komórki w ogóle nie "spadały przez media", ale obracały się po małej ścieżce orbitalnej. Zjawisko to jest wizualizowane jako schemat ideowy w Rysunek 1.
   UWAGA: Firma zaleca rozpoczęcie rotacji przy 8-10 obr./min dla limfocytów. W tym przypadku komórki NK92 zostały obrócone z prędkością 11 obr./min, jak pokazano w poprzednim artykule¹⁷. W zależności od wielkości komórki, prędkość obrotowa powinna być zwiększona dla większych komórek i zmniejszona dla mniejszych komórek. Ten sam wzorzec ma zastosowanie, jeśli użyte komórki mają tendencję do zlepiania się podczas hodowli. Więcej informacji na ten temat można znaleźć w sekcji Dyskusja.

6. Leczenie

1. Wybierz odpowiednią długość leczenia dla aplikacji badawczej, która może zależeć od tego, jakie parametry funkcji/fizjologii komórek są badane. Więcej informacji na ten temat można znaleźć w sekcji Dyskusja.
   UWAGA: W tym przypadku komórki NK92 poddano 72-godzinnej obróbce SMG, w oparciu o wyniki poprzednich badań^18,19. Bąbelki nieuchronnie będą tworzyć się przez cały czas trwania zabiegu i będą musiały zostać usunięte. Obrót można na krótko zatrzymać i ponownie uruchomić, aby to ułatwić. Zobacz krok 7.1, aby dowiedzieć się, jak bezpiecznie usunąć naczynie z pistoletem maszynowym.
2. W pierwszym dniu przygotowania do leczenia należy co kilka godzin sprawdzać, czy nie tworzą się pęcherzyki, powtarzając kroki 4.2-4.6. Po pierwszym dniu należy w razie potrzeby sprawdzać naczynia krwionośne (co najmniej raz dziennie), powtarzając kroki 4.2-4.6, aż do zakończenia zabiegu.

7. Pobieranie komórek z naczyń

1. Po upływie planowanej długości zabiegu należy zatrzymać obrót i zdemontować aparat. Wyjmij naczynie zabiegowe SMG, delikatnie przytrzymując naczynie nieruchomo, jednocześnie obracając obrotowy kołek urządzenia w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara.
2. Przenieś kolbę kontrolną, naczynie kontrolne 1G i naczynie SMG poddane działaniu środka do sterylnej szafy bezpieczeństwa biologicznego.
3. Weź każde naczynie (tylko 1G i SMG; nie kolbę) i odwróć je do góry nogami, tak aby było skierowane w dół i delikatnie uderz w nie, aby wszystkie komórki znalazły się w zawieszeniu. Następnie obróć naczynie na bok z portem napełniania skierowanym do dołu i ponownie uderz w naczynie, aby zachęcić komórki do wyjścia w kierunku portu napełniania w celu wydajnego zasysania.
4. Z każdym naczyniem należy obchodzić się indywidualnie. Odkręcić strzykawki od dwóch portów i wyrzucić je do odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne. Otworzyć kurki na portach strzykawki.
5. Ostrożnie zdjąć korek portu napełniania i pobrać zawartość za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 10 ml, przechylając naczynie podczas opróżniania. Dozować zawartość grup "Kolba", "1G" i "SMG" do indywidualnie oznakowanych stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
6. Zamknij każdą tubkę i delikatnie odwróć je kilka razy, aby upewnić się, że są odpowiednio wymieszane. Stosować preferowaną metodę określania stężenia i żywotności otrzymanej kultury komórkowej w celu przygotowania do użycia w kolejnych testach doświadczalnych.

Results

Ta metoda hodowli jest uważana za skuteczną, jeśli 1) proliferacja komórek jest w przybliżeniu spójna we wszystkich grupach kontrolnych (a najlepiej we wszystkich grupach eksperymentalnych), 2) proliferacja jest odpowiednia, biorąc pod uwagę gęstość wysiewu, długość leczenia i czas podwojenia typu/linii komórek, oraz 3) żywotność pobranych komórek wynosi 85% lub więcej (Tabela 1). Idealnie byłoby, gdyby powstałe komórki były tak zdrowe, jak byłyby w standardowej hodowli komórkowej, zwłaszcza do wykorzyst...

Discussion

W miarę jak ludzkość przygotowuje się do dłuższych misji kosmicznych na Księżyc i Marsa, należy przeprowadzić więcej badań, aby złagodzić poważne zagrożenia dla zdrowia astronautów. Jednym z głównych aspektów środowiska kosmicznego, który wpływa na fizjologię człowieka, jest mikrograwitacja. W tym miejscu opisano metodę hodowli komórkowej służącą do poddawania limfocytów działaniu SMG przy użyciu dostępnego na rynku rotacyjnego systemu hodowli komórek.

Ten protokół zawiera kilka krytycznych kr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Jednorazowe naczynie o wysokim współczynniku kształtu (HARV) (10 ml)	Synthecon	D-410	Naczynia hodowlane sterylizowane gamma (4 w pudełku)
Strzykawki z końcówką Luer-Lok (3 ml)	309657 BD		Do podłączenia do 10 mL
HARV NK92 Linia komórkowa	ATCC	CRL-2407
Obrotowy system hodowli komórek (RCCS)	Synthecon	RCCS-4D	Obrotowe naczynie ścienne; Klinostat 2D
Probówki stożkowe Sarsedt 15 ml	Fisher Scientific	50-809-220
Probówki stożkowe Sarsedt 50 ml	Fisher Scientific	50-809-218
Sterylne pipety serologiczne Sarsedt	Fisher Scientific	86.1254.001
Kolby do hodowli zawiesinowych T25	Sarsedt	83.3910.502	Do kontroli kolb