Artykuł metodologiczny

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie hodowli 2D

DOI:

10.3791/63298

⸱

16 grudnia 2021

 , 
1College of Health and Life Sciences, Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation, 2Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI), Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodę zwiększania koekspresji czynników transkrypcyjnych PDX1 i NKX6.1 w progenitorach trzustki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w płaskich monowarstwach. Osiąga się to poprzez uzupełnienie świeżej macierzy, manipulowanie gęstością komórek i dysocjację komórek endodermalnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) są doskonałym narzędziem do badania wczesnego rozwoju trzustki i badania genetycznych czynników przyczyniających się do cukrzycy. Komórki wydzielające insulinę pochodzące z hPSC mogą być generowane do terapii komórkowej i modelowania chorób, jednak o ograniczonej wydajności i właściwościach funkcjonalnych. Progenitory trzustkowe pochodzące z hPSC, które są prekursorami komórek beta i innych komórek endokrynnych, gdy jednocześnie wyrażają dwa czynniki transkrypcyjne PDX1 i NKX6.1 określają prekursorów funkcjonalnych, wydzielających insulinę komórek beta zarówno in vitro, jak i in vivo. Progenitory trzustki pochodzące z hPSC są obecnie stosowane w terapii komórkowej u pacjentów z cukrzycą typu 1 w ramach badań klinicznych. Jednak obecne procedury nie generują wysokiego odsetka NKX6.1 i komórek progenitorowych trzustki, co prowadzi do kogeneracji niefunkcjonalnych komórek endokrynnych i niewielu komórek reagujących na glukozę i wydzielających insulinę. W ramach tych prac opracowano ulepszony protokół generowania progenitorów trzustki pochodzących z hPSC, które maksymalizują koekspresję PDX1 i NKX6.1 w monowarstwie 2D. Czynniki takie jak gęstość komórek, dostępność świeżej macierzy i dysocjacja komórek endodermalnych pochodzących z hPSC są modulowane, co zwiększa poziomy PDX1 i NKX6.1 w generowanych progenitorach trzustki i minimalizuje zaangażowanie w alternatywną linię wątroby. Badanie podkreśla, że manipulowanie fizycznym środowiskiem komórki podczas różnicowania in vitro może wpływać na specyfikację linii i ekspresję genów. W związku z tym obecnie zoptymalizowany protokół ułatwia skalowalne generowanie progenitorów koeksprymujących PDX1 i NKX6.1 na potrzeby terapii komórkowej i modelowania chorób.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cukrzyca to złożone zaburzenie metaboliczne, które dotyka miliony ludzi na całym świecie. Suplementacja insuliny jest uważana za jedyną opcję leczenia cukrzycy. Bardziej zaawansowane przypadki są leczone terapią zastępczą komórek beta, osiąganą poprzez przeszczepienie całej trzustki zwłok lub wysp trzustkowych1,2. Terapia transplantacyjna wiąże się z kilkoma kwestiami, takimi jak ograniczenie dostępności i jakości tkanki, inwazyjność procedur transplantacyjnych oraz ciągłe zapotrzebowanie na leki immunosupresyjne. Wymaga to odkrycia nowych i alternatywnych opcji terapii zastępczej komórkami beta2,3. Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) stały się ostatnio obiecującym narzędziem do zrozumienia biologii ludzkiej trzustki oraz niewyczerpującym i potencjalnie bardziej spersonalizowanym źródłem terapii transplantacyjnej4,5,6,7. hPSC, w tym ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i pluripotencjalne komórki macierzyste indukowane przez człowieka (hiPSC), mają wysoką zdolność do samoodnawiania się i dają początek każdemu typowi tkanki ludzkiego ciała. hESC pochodzą z wewnętrznej masy komórkowej zarodka, a hiPSC są przeprogramowywane z dowolnej komórki somatycznej4,8.

Protokoły ukierunkowanego różnicowania są zoptymalizowane do generowania komórek beta trzustki z hPSC, które sekwencyjnie kierują hPSC przez etapy rozwoju trzustki in vitro. Protokoły te generują organoidy wysp trzustkowych pochodzących z hPSC. Chociaż znacznie poprawiły się w zwiększaniu udziału komórek beta trzustki w tym obszarze, skuteczność protokołów jest bardzo zmienna. Nie wzrasta do więcej niż ~40% komórek NKX6.1+/INSULIN+ lub C-PEPTIDE +5,9,10,11,12,13. Jednak wygenerowane komórki beta nie są całkowicie identyczne z dorosłymi ludzkimi komórkami beta pod względem ich profili transkrypcyjnych i metabolicznych oraz odpowiedzi na glukozę4,5,14. Komórki beta pochodzące z hPSC nie mają ekspresji genów kluczowych markerów komórek beta, takich jak PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 i KCNK3 w porównaniu z dorosłymi ludzkimi wyspami wysepkowym5. Ponadto komórki beta pochodzące z hPSC mają zmniejszoną sygnalizację wapnia w odpowiedzi na glukozę. Są one zanieczyszczone współgenerowanymi komórkami polihormonalnymi, które nie wydzielają odpowiednich ilości insuliny w odpowiedzi na wzrost poziomu glukozy5. Z drugiej strony, progenitorzy trzustki pochodzący z hPSC, które są prekursorami wysp trzustkowych, mogą być generowane bardziej efektywnie in vitro w porównaniu z komórkami beta, a po przeszczepieniu in vivo mogą dojrzeć do funkcjonalnych, wydzielających insulinę komórek beta 15,16. Badania kliniczne koncentrują się obecnie na wykazaniu ich bezpieczeństwa i skuteczności po przeszczepieniu u pacjentów z cukrzycą typu 1.

Zauważalnie, ekspresja czynników transkrypcyjnych PDX1 (Homeobox 1 trzustki i dwunastnicy) oraz NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) w tej samej genetyce progenitorowej trzustki jest kluczowa dla zaangażowania w linię komórek beta5. Przodkowie trzustki, którzy nie wykazują ekspresji NKX6.1, powodują powstawanie polihormonalnych komórek endokrynnych lub niefunkcjonalnych komórek beta17,18. Dlatego wysoka koekspresja PDX1 i NKX6.1 w stadium progenitorowym trzustki jest niezbędna do ostatecznego wytworzenia dużej liczby funkcjonalnych komórek beta. Badania wykazały, że ciało zarodka lub hodowla 3D wzmacnia PDX1 i NKX6.1 w progenitorach trzustki, w których agregowane są komórki różnicujące, wahając się między 40%-80% populacji PDX1+/NKX6.1+12,19. Jednak w porównaniu z kulturami zawiesinowymi, kultury różnicujące 2D są bardziej opłacalne, wykonalne i wygodne do stosowania na wielu liniach komórkowych5. Niedawno wykazaliśmy, że kultury różnicowania jednowarstwowego dają ponad 90% współekspresji PDX1+/NKX6.1+ progenitorów trzustki pochodzących z hPSC20,21,22. Opisana metoda nadała wysoką zdolność replikacji wygenerowanym komórkom progenitorowym trzustki i zapobiegła alternatywnym specyfikacjom losu, takim jak linia wątrobowa21. Dlatego w niniejszym dokumencie protokół ten demonstruje wysoce skuteczną metodę różnicowania hPSC do prekursorów komórek beta trzustki współeksprymujących PDX1 i NKX6.1. Metoda ta wykorzystuje technikę dysocjacji endodermy pochodzącej z hPSC i manipulowania gęstością komórek, a następnie rozszerzonej sygnalizacji FGF i retinoidów, a także hamowania Hedgehog w celu promowania koekspresji PDX1 i NKX6.1 (Figura 1). Metoda ta może ułatwić skalowalne wytwarzanie prekursorów komórek beta trzustki pochodzących z hPSC do terapii transplantacyjnej i modelowania chorób.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie zostało zatwierdzone przez odpowiednią instytucjonalną komisję etyki badań i przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1964 roku i jej późniejszymi poprawkami lub porównywalnymi standardami etycznymi. Protokół został zatwierdzony przez Institutional Review Board (IRB) HMC (nr 16260/16) i Qatar Biomedical Research Institute (QBRI) (nr 2016-003). Ta praca jest zoptymalizowana pod kątem hESC, takich jak H1, H9 i HUES8. Próbki krwi pobrano od zdrowych osób ze szpitala Hamad Medical Corporation (HMC) za pełną świadomą zgodą. Komórki iPS są generowane z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z grupy kontrolnej, zdrowej osoby23.

1. Przygotowanie pożywki hodowlanej

  1. Przygotowanie pożywki hodowlanej ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC)
    1. Przygotować pożywkę hodowlaną hPSC z dostępnej na rynku pożywki do utrzymania i namnażania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez uzupełnienie 100 jednostek/ml penicyliny i 100 ug/ml streptomycyny (patrz tabela materiałów). Podwielokrotność i przechowywać całe podłoże w temperaturze -20 °C przez długi czas lub 4 °C do natychmiastowego użycia.
  2. Przygotować pożywkę różnicującą etap 1 (dla Definitive Endoderm (DE)).
    1. Przygotować podłoże podstawowe z pożywki MCDB 131, uzupełniając 0,5% albuminy surowicy bydlęcej wolnej od kwasów tłuszczowych (FFA-BSA), 1,5 g/l wodorowęglanu sodu (NaHCO3), 10 mM glukozy, 2 mM Glutamaxu, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (patrz tabela materiałów). Przefiltrować przygotowane media za pomocą filtra 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować pożywkę etapu 1 zawierającą CHIR99021 z pożywki podstawowej (przygotowanej w kroku 1.2.1), ogrzewając podłoże podstawowe w temperaturze 37 °C, a następnie uzupełniając 2 μM CHIR99021, 100 ng/ml aktywiny A, 10 μM inhibitora skały (Y-27632) i 0,25 mM witaminy C (patrz tabela materiałów). Dobrze wymieszaj uzupełnione podłoże i przykryj je folią aluminiową, aby chronić je przed światłem.
      UWAGA: To podłoże będzie używane tylko w pierwszym dniu różnicowania.
    3. Przygotuj pożywkę etapu 1 bez CHIR99021 z pożywki podstawowej, ogrzewając ją w temperaturze 37 °C i uzupełniając 100 ng/ml aktywiny A i 0,25 mM witaminy C i dobrze wymieszaj.
      UWAGA: Do tego podłoża można opcjonalnie dodać 5 ng/ml zasadowego FGF lub FGF2. Nośnik ten będzie używany przez pozostałe dni Etapu 1.
  3. Przygotuj pożywkę różnicującą Etap 2 (dla prymitywnej rurki jelitowej; PGT).
    1. Przygotować pożywkę różnicującą etapu 2 zawierającą inhibitor skał z pożywki podstawowej, ogrzewając ją w temperaturze 37 °C i uzupełniając 50 ng/ml FGF10, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 μM CHIR99021, 10 μM Y-27632 (inhibitor skały) i 0,25 mM witaminy C.
      UWAGA: Pożywkę tę stosuje się w dniu dysocjacji komórek endodermalnych.
    2. Przygotować pożywkę różnicującą etapu 2 bez inhibitora skały, postępując zgodnie z tą samą procedurą dla pożywki przygotowanej w kroku 1.3.1, z wyłączeniem inhibitora skały.
      UWAGA: Ta pożywka jest używana w drugim dniu etapu 2.
  4. Przygotuj pożywkę różnicującą etap 3 (dla tylnego jelita przedniego).
    1. Przygotuj pożywkę DMEM zawierającą 4,5 g / l glukozy, a następnie uzupełnij 1% penicyliny-streptomycyny i 2 mM Glutamax i użyj jako podłoża podstawowego dla etapów 3 i 4.
    2. Ogrzej pożywkę DMEM (przygotowaną w kroku 1.4.1) i uzupełnij 2 μM kwasu retinowego, 0,25 μM SANT-1, 50 ng/ml FGF10, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 mM witaminy C i 1% suplementu B27 bez witaminy A (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Ta pożywka jest używana przez 4 dni etapu 3 dla P2-D (protokół 2, zoptymalizowany, zdysocjowany) i 2 dni etapu 3 dla P1-ND (protokół 1, niezoptymalizowany, niezdysocjowany).
  5. Przygotuj pożywkę różnicującą etap 4 (dla progenitorów trzustki).
    1. Dodaj DMEM zawierający 4,5 g/l glukozy ze 100 ng/ml EGF, 10 mM nikotynamidu, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 mM witaminy C i 1% suplementu B27 bez witaminy A (patrz tabela materiałów). Używaj tego nośnika przez wszystkie dni etapu 4.
      UWAGA: Utrzymuj wszystkie odczynniki w odpowiednich temperaturach, a wszystkie cytokiny i wrażliwe odczynniki muszą być poddane porcjom. Rozmrozić poddane odczynniki i dodać do podłoża podstawowego w czasie zmiany pożywki różnicującej. Składy różnych pożywek różnicujących przedstawiono w tabeli 1.

2. Przygotowanie naczyń pokrytych matrycą membranową podłoża

  1. Rozmrozić dostępną w handlu matrycę podstawową (patrz tabela materiałów) i podwielokrotność na lodzie; zamrozić podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
  2. Przed pokryciem szalek z kultur tkankowych rozmrozić zamrożone porcje na lodzie. Dodać odpowiednią objętość roztworu matrycy membranowej do schłodzonego podłoża KO-DMEM/F-12 (KnockOut DMEM/F-12) (patrz tabela materiałów), aby osiągnąć pożądane rozcieńczone stężenie i dobrze wymieszać. Rozcieńczony roztwór matrycowy przechowywać w temperaturze 4 °C do natychmiastowego użycia.
  3. Pokryć powierzchnię płytek poddanych działaniu kultur tkankowych (patrz tabela materiałów) rozcieńczonym roztworem matrycy membranowej i umieścić płytki w temperaturze 37 °C na co najmniej 60 minut przed posiewem komórek. Użyć rozcieńczenia 1:50 roztworu macierzy błonowej w KO-DMEM/F-12 do posiewu komórek do eksperymentu różnicowania trzustki i 1:80 do ekspansji niezróżnicowanych hPSC.

3. Kultura niezróżnicowanych hPSC

  1. Przejdź przez hPSC, gdy kolonie osiągną konfluencję 70%-80%.
  2. Aby przejść, należy raz przepłukać hPSC ciepłym PBS, odessać za pomocą przenośnego aspiratora próżniowego wewnątrz kaptura do hodowli tkankowych i dodać 0,5 mM roztworu EDTA do PBS, aby pokryć powierzchnię kolonii. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1 minutę lub do momentu, gdy brzegi kolonii oderwą się od powierzchni płytki.
  3. Usunąć roztwór EDTA i zebrać odłączające się kolonie za pomocą pożywki hodowlanej hPSC za pomocą mikropipety P1000. Odwirować zebrane komórki przy sile 128 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i uzupełnić komórki pożywką hodowlaną hPSC zawierającą 10 μM Y-27632 (inhibitor skał)23,24.
    UWAGA: Przepuść hPSC w stosunku co najmniej 1:3 na szalkach pokrytych matrycą membranową 1:80. Jednak w celu eksperymentów różnicowania umieść hPSC na naczyniach pokrytych w skali 1:50.

4. Indukcja definitywnego zróżnicowania endodermy (DE) w hPSC (Etap 1)

  1. Gdy kolonie hPSC osiągną zbieg 70%-80%, umyj je dwukrotnie ciepłym PBS i odessaj za pomocą przenośnego aspiratora próżniowego wewnątrz kaptura do hodowli tkankowej, aby rozpocząć różnicowanie etapu 1.
  2. Dodać pożywkę różnicującą etapu 1 zawierającą CHIR99021 (z etapu 1.2.2) do kolonii, 2 ml na płytkę 6-dołkową i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  3. Następnego dnia zastąp zużyte podłoże podłożem różnicującym etap 1 bez CHIR99021 (krok 1.2.3).
  4. Co 24 godziny odsysać zużyte pożywki za pomocą przenośnego aspiratora próżniowego wewnątrz okapu do hodowli tkankowych i zastąpić je świeżą pożywką różnicującą Etap 1 bez CHIR99021,
    UWAGA: Etap 1 może zostać przedłużony do 4 dni. Długość etapu 1 zależy od używanej linii hPSC i powinna być odpowiednio zoptymalizowana.

5. Analiza immunofluorescencyjna DE pochodzącego z hPSC (Etap 1)

  1. W celu immunofluorescencji odessać zużytą pożywkę za pomocą przenośnego aspiratora próżniowego wewnątrz okapu do hodowli tkankowych z dołków i dwukrotnie przemyć ciepłym PBS. Zakręć płytką, aby pozbyć się wszelkich resztek komórek.
  2. Przykryj powierzchnię studzienek 4% paraformaldehydu (PFA), aby utrwalić komórki DE; na przykład dodaj 250 uL PFA na studzienkę 24-dołkowej płytki. Umieść płytkę na wytrząsarce 2D o masie 20 x g na 20 minut.
  3. Po utrwaleniu przemyć komórki DE solą fizjologiczną z tris-bufferem z 0,5% Tween (TBST) (patrz Tabela Materiałów) i umieścić płytkę na wytrząsarce o masie 20 x g na 10 minut. Powtórz ten krok jeszcze raz.
  4. Przepuszczalność utrwalonych komórek poprzez dodanie dużej objętości soli fizjologicznej buforowanej fosforanami z 0,5% Triton X-100 (PBST); na przykład dodać 1 ml PBST na dołek 24-dołkowej płytki i umieścić płytkę z powrotem na wytrząsarce przy 20 x g na 20 minut.
  5. Świeżo przygotuj 5%-6% BSA w PBST jako bufor blokujący i dodaj go do przepuszczalnych komórek. Inkubować płytkę przez co najmniej 1 godzinę w roztworze blokującym na wytrząsarce.
  6. Rozcieńczyć razem pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko SOX17 i FOXA2 (patrz tabela materiałów) w 2%-3% BSA w roztworze PBST. Dodać połączone przeciwciała do zablokowanych komórek i umieścić płytkę na wytrząsarce w temperaturze 4 °C przez noc na niskich prędkościach, delikatnie wstrząsając.
    UWAGA: SOX17 i FOXA2 są dobrze znanymi znacznikami DE25,26.
  7. Następnego dnia odessać przeciwciała pierwotne za pomocą przenośnego filtra próżniowego i umyć studzienki trzykrotnie TBST, każdy myjąc przez 10 minut na wytrząsarce.
  8. Przygotować rozcieńczenie 1:500 sprzężonych przeciwciał drugorzędowych Alexa fluor 488 i 568 (patrz tabela materiałów) przeciwko gatunkom, w których wyhodowano przeciwciała pierwszorzędowe.
  9. Dodaj kombinację przeciwciał drugorzędowych do zabarwionej studzienki i przykryj płytkę folią aluminiową, aby chronić przed światłem. Umieść płytkę na shakerze na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  10. Odessać roztwór przeciwciała wtórnego za pomocą przenośnego filtra próżniowego i przemyć zabarwione studzienki TBST na wytrząsarce przez 10 minut, przykrywając płytkę folią. Powtórz krok prania w sumie trzy razy.
  11. Przygotować 1 μg/ml rozcieńczenia Hoechst 33342 w PBS w celu wybarwienia jąder. Dodaj roztwór Hoechst do studzienek i umieść płytkę na wytrząsarce na 2-3 minuty.
  12. Zassać roztwór Hoechsta za pomocą przenośnego filtra próżniowego i dwukrotnie przepłukać studzienki PBS.
  13. Na koniec dodaj PBS do barwionych komórek i zobrazuj je za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów) w ciemności. Utrzymuj płytkę przykrytą folią, gdy nie obrazujesz, aby zminimalizować wybielanie fluoroforem.
    UWAGA: Alternatywnie do oceny skuteczności DE można zastosować cytometrię przepływową, jak opisano w kroku 9.2.

6. Wytwarzanie prymitywnej rurki jelitowej (PGT) z hPSC (Etap 2)

UWAGA: Jeśli analiza immunofluorescencyjna w kroku 5.13 zostanie określona jako koekspresja SOX17-FOXA2 na poziomie 80% i wyższym, eksperyment przechodzi do etapu 2. Jeśli wydajność wynosi <80%, wydłuż czas trwania etapu 1 do 4 dni.

  1. W 1. dniu etapu 2 należy zdysocjować komórki endodermalne pochodzące z hPSC za pomocą TrypLE lub Accutase (patrz Tabela materiałów) w celu uzyskania zoptymalizowanego protokołu P2-D. Przemyć przylegające komórki ciepłym PBS i dodać ciepły 1 ml roztworu tryple lub akutazy na zagłębienie płytki 6-dołkowej przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO 2 lub do momentu, gdy komórki zaczną się od siebie odłączać.
  2. Oddzielić oderwane arkusze lub monowarstwę komórek w studzienkach, a następnie zebrać je razem w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml, używając podstawowych pożywek etapu 1/2 bez cytokin zawierających co najmniej 0,5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) lub surowicy KnockOut (KOSR) (patrz tabela materiałów).
  3. Wirować komórki w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Dodać 1 ml sterylnego PBS i ponownie zawiesić osad w pojedynczych komórkach.
  4. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika (patrz Tabela materiałów), ładując zalecaną objętość komórek do szkiełka komory. Wirować zawieszone komórki w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  5. Zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki różnicującej etapu 2 zawierającej inhibitor skały o gęstości 2,5-3,5 x 105 komórek/cm2,
    UWAGA: Ta liczba może sprowadzić się do współczynnika podziału 1:2 dla większości linii komórkowych, w zależności od szybkości proliferacji. Całkowita objętość wyniesie 2 ml pożywki z zawieszonymi komórkami w 1 dołku na płytce 6-dołkowej.
  6. Zawiesinę komórek należy umieścić na płytkach pokrytych matrycą membranową w skali 1:50 (przygotowanych w kroku 2) i inkubować je w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  7. 24 godziny później zastąp pożywkę pożywką Stage 2 differentiation bez inhibitora Rock (przygotowaną w kroku 1.3.2).

7. Generowanie tylnego jelita przedniego z hPSC (Etap 3)

  1. Odessać zużyte pożywki etapu 2 za pomocą przenośnego aspiratora próżniowego wewnątrz kaptura do hodowli tkankowych i umyć komórki ciepłym PBS.
  2. Dodać do komórek pożywki różnicujące etapu 3 z kroku 1.4 i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. Po 24 godzinach zastąp zużyte podłoża świeżo przygotowanymi pożywkami różnicującymi etap 3. Powtarzaj to w sumie przez 4 dni dla protokołu P2-D (zoptymalizowanego) i tylko 2 dni dla niezdysocjowanego P1-ND.

8. Wytwarzanie progenitorów trzustki z hPSC (Etap 4)

  1. Po 4 dniach leczenia w Etapie 3 umyj komórki ciepłym PBS, delikatnie zakręć płytką i odessaj za pomocą przenośnego aspiratora próżniowego. Następnie dodaj do komórek pożywki różnicujące etapu 4 z kroku 1.5.
  2. Po 24 godzinach zastąp zużyte pożywki świeżo przygotowanymi pożywkami Stage 4. Powtarzaj to w sumie przez 4 dni.

9. Ocena efektywności różnicowania wytwarzania komórek progenitorowych trzustki z hPSC

  1. Przeprowadzić analizę immunofluorescencyjną komórek progenitorowych trzustki pochodzących z hPSC (etap 4) pod kątem ekspresji PDX1 i NKX6.1.
    UWAGA: PDX1 i NKX6.1 są dobrze znanymi markerami progenitorowymi trzustki17,18.
    1. Wykonaj utrwalanie, przepuszczalność, blokowanie oraz inkubację i płukanie przeciwciał zgodnie z krokiem 5.
    2. Wybarwić progenitory trzustkowe pochodzące z hPSC kombinacją przeciwciał PDX1 i NKX6.1 (patrz tabela materiałów) rozcieńczonych w 2%-3% BSA w PBST.
    3. Stosować rozcieńczenia w stosunku 1:500 odpowiednich przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z fluorem Alexa 488 i 568 (patrz tabela materiałów).
  2. Przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej komórek progenitorowych trzustki pochodzących z hPSC pod kątem ekspresji PDX1 i NKX6.1.
    UWAGA: Analiza cytometrii przepływowej markerów trzustkowych w wygenerowanych progenitorach trzustki pochodzących z hPSC umożliwia ilościowe określenie komórek współekspresyjnych PDX1 i NKX6.1.
    1. Pod koniec etapu 4 umyj komórki dwukrotnie ciepłym PBS i dodaj tyle trypLE lub Akutazy, aby pokryć powierzchnię studzienek, na przykład 1 ml trypLE lub Accutazy na dołek na płytce 6-dołkowej. Umieść płytkę w inkubatorze na 5-7 minut lub do momentu, gdy komórki oderwą się od powierzchni.
    2. Oddziel przylegające arkusze komórek w studzience za pomocą mikropipety P1000 przed zebraniem ich w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml.
    3. Odwirować komórki w progenitorach trzustki pochodzących z hPSC w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant. Umyj komórki PBS, dysocjując je na pojedyncze komórki. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika (patrz Tabela materiałów) i zanotuj stężenie w liczbie komórek na ml.
    4. Wirować w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Dodać 200 μl schłodzonego PBS do osadu i dysocjować.
    5. Dodać kroplami 2 ml schłodzonego 80% etanolu, umieszczając probówkę na wirze z niską i średnią prędkością (400 x g w temperaturze pokojowej). Zamknąć szczelnie nakrętki i umieścić probówki lekko przechylone na wytrząsarce w temperaturze 4 °C przez noc.
    6. Wirować komórki w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i przemyć PBS w celu dysocjacji wszelkich grudek utrwalonych komórek.
    7. Zablokować utrwalone komórki 5%-6% roztworem BSA w PBST przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez noc na wytrząsarce.
    8. Barwnik dla markerów progenitorowych trzustki, wykonując poniższe czynności.
      1. Rozmieść 2 000 000 komórek na warunek, w tym odpowiednie kontrole izotypu w zależności od podklasy IgG gatunku gospodarza przeciwciała pierwszorzędowego, niebarwione i drugorzędowe kontrole przeciwciał w 96-dołkowej dolnej płytce V lub probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
      2. Obracać płytkę przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i obrócić płytkę szybkim ruchem, aby odrzucić supernatant bez utraty granulek. Przygotować pierwszorzędowe rozcieńczenia przeciwciał w 3% roztworze BSA (patrz Tabela Materiałów).
        UWAGA: Stężenie przeciwciał pierwszorzędowych może wynosić od 1:50 do 1:200.
      3. Inkubować zabarwione komórki przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce, delikatnie wstrząsając przy niskiej prędkości.
      4. Przepłukać poplamione komórki trzykrotnie TBST, pipetując komórki w górę iw dół w studzienkach. Odkręcić i odrzucić supernatant jak w kroku 9.2.8.2.
      5. Dodać rozcieńczenie 1:500 przeciwciał drugorzędowych (przeciwciała sprzężone z Alexa fluor 488 i 647) przygotowanych w PBS (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      6. Przepłukać poplamione komórki TBST co najmniej dwa razy, pipetując komórki w górę i w dół. Odkręcić płytkę i odrzucić supernatant jak w kroku 9.2.8.2.
      7. Zebrać wybarwione komórki w co najmniej 100 μl PBS i przenieść je do chronionych przed światłem probówek FACS (patrz tabela materiałów). Próbki należy pobrać na maszynie do cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki pokazują, że zoptymalizowany protokół P2-D (Rysunki 1A) zwiększył efektywność różnicowania progenitorów trzustki poprzez zwiększenie koekspresji PDX1 i NKX6.1 (Rysunek 2A,B i Rysunek 3A). W szczególności wyniki wykazały, że dysocjacja komórek endodermalnych i ich ponowne posiew na świeżej macierzy błonowej wraz z dłuższym czasem trwania etapu 3 zwiększyły ekspresję NKX6.1 w progenitorach trzustki pochodzących z hPSC (zoptymalizowany proto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W pracy opisano ulepszony protokół generowania komórek progenitorowych trzustki z hPSC o wysokiej koekspresji PDX1 i NKX6.1. Dysocjacja i ponowne powlekanie endodermy pochodzącej z hPSC w połowie gęstości na świeżej matrycy skutkowało wyższymi PDX1 i NKX6.1 w progenitorach trzustki pochodzących z hPSC.

Chociaż koktajl czynników wzrostu dla każdego etapu jest bardzo podobny do P1-ND27, wykazano, że bardziej rozszerzone leczenie etapu 3, w tym sygnalizacja FGF i retinoidó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z grantu z Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
15 mL, stożkowe, probówki wirówkoweThermo Scientific339651
20X TBS Tween 20Thermo Scientific28360
24-dołkowe płytki hodowlane, płaskie dno z pokrywkąCostar3524
50 mL, stożkowe, probówki wirówkoweThermo Scientific339652
6-dołkowe płytki hodowlane, wielotalerzoweThermo Scientific
Technologie komórek macierzystychAccutase0-7920
Activin AR& D338-ACOdtworzony w 4 mM HCl
przeciwciałie anty NKX6.1, mysi monoklonalnyDSHBF55A12-CRozcieńczony do 1:100 dla cytometrii przepływowej i 1:2000 dla barwienia immunologicznego
Przeciwciało anty-PDX1, poliklonalne Abcamab47308rozcieńczone do 1:100 dla cytometrii przepływowej i 1:1000 dla barwienia immunologicznego
B27 minus Vit AThermoFisher12587010
Albumina surowicy bydlęcej, frakcja szoku cieplnego, bez kwasów tłuszczowychSigmaA7030
CHIR 99021Tocris4423Rozpuszczony w DMSO
DMEM, wysoka zawartość glukozyThermoFisher41965047
Przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) o wysokiej adsorbcji krzyżowej, Alexa Fluor 568InvitrogenA10037
Przeciwciało drugorzędowe o wysokiej adsorpcji krzyżowej przeciwko królikowi IgG (H + L) osła, Alexa Fluor 488A-21206
DPBS 1XThermoFisher14190144
EGFThermoFisherPHG0313Rozpuszczony w 0,1% BSA w PBS
FGF10R& D345-FGRozpuszczony w PBS
GlukozaSigma AldrichG8644
Hoechst 33258Sigma23491-45-4
Mikroskop odwróconyOlympusIX73
KnockOut DMEM/F-12 (1X)Gibco12660-012
Zamiennik surowicy KnockOut SRGibco10828-028
Kwas L-askorbinowy (witamina C)SigmaA92902Rozpuszczony w wodzie destylowanej
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Podstawna membrana MatrixCorning354230Podwielokrotność rozmrożonego bulionu i zamrozić w temperaturze -20C.
MCDB131ThermoFisher10372019
Mysz anty-SOX17ORIGENECF500096Rozcieńczony w stosunku 1:100 do cytometrii przepływowej i 1:2000 do barwienia immunologicznego
mTeSR PlusStem Cell Technologies85850Wymieszać podłoże podstawowe z suplementem. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 & C przez dłuższy czas lub przy 4 & stopniach; C do natychmiastowego użytku
Jednostki filtrujące Nalgene, 0,2 i mikro; m PESThermoFisher566-0020
NikotynamidSigma72340Rozpuszczony w wodzie destylowanej
NOGGINR& D6057-NGRozpuszczony w 0,1% BSA w
PBS Roztwór paraformaldehydu 4% w PBSChemCruzsc-281692
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)ThermoFisher15140122
Przenośny aspirator
Królik anty-FOXA2Technologia sygnalizacji komórkowej3143Rozcieńczony do 1:100 dla cytometrii przepływowej i 1:500 dla cytometrii przepływowej barwienie immunologiczne
Kwas retinowySigma AldrichR2625Odtworzony w DMSO
Inhibitor skał (Y-27632)ReproCell04-0012-02Odtworzony w DMSO
Probówki z polistyrenu okrągłodennego FACS z nakrętkami, STERYLNEStellar ScientificFSC-9010
SANT-1Sigma AldrichS4572Rozpuszczony w DMSO
Sód wodorowęglanSigmaS5761-500G
StemFlexThermoFisherA3349401Wymieszaj podłoże podstawowe z suplementem. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 & C przez dłuższy czas lub przy 4 & stopniach; C do natychmiastowego użycia
Szkiełko do analizy komórkowej TALIInvitrogenT10794
Tali cytometr obrazowy automatyczny licznik komórekInvitrogenT10796
Triton X-100Sigma9002-93-1
TrypLE 100 mLThermoFisher12563011
Tween 20SigmaP2287
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575-038
140685próżniowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
  2. Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy. Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).
  3. Vaithilingam, V., Tuch, B. E. Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments. Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).
  4. Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).
  5. Memon, B., Abdelalim, E. M. Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors. Cells. 9 (2), 283(2020).
  6. Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152(2021).
  7. Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease. Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).
  8. Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
  9. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  10. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  11. Nair, G. G., et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).
  12. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  13. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  14. Hrvatin, S., et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).
  15. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  16. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  17. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  18. Bruin, J. E., et al. Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).
  19. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  20. Memon, B., Abdelalim, E. M. Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Methods in Molecular Biology. , (2020).
  21. Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15(2018).
  22. Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83(2018).
  23. Ali, G., et al. Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease. Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).
  24. Elsayed, A. K., et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2. Stem Cell Research. 42, 101705(2020).
  25. Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling. Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).
  26. Schroeder, I. S., et al. Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).
  27. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  28. Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency. Cell Death & Disease. 12 (1), 103(2021).
  29. Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells. Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).
  30. Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development. Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).
  31. Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
  32. Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
  33. Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis. Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).
  34. Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D. Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).
  35. Lin, H. Y., et al. Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK. Journal of Biomedical Science. 17, 56(2010).
  36. Boretti, M. I., Gooch, K. J. Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).
  37. Boretti, M. I., Gooch, K. J. Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).
  38. Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact. Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).
  39. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), 82076(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dwuwymiarowy system hodowlikom rki progenitorowe trzustkikoekspresja PDX1 NKX6 1kom rki wydzielaj ce insulinterapia kom rkowa cukrzycydysocjacja kom rek endodermycytometria przep ywowamikroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły