Obecny protokół opisuje pneumatyczną platformę mikroprzepływową, która może być używana do efektywnego koncentracji mikrocząstek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pneumatycznie napędzana platforma mikroprzepływowa do zagęszczania mikrocząstek
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niniejszy artykuł przedstawia metodę wytwarzania i obsługi zaworu pneumatycznego do kontroli stężenia cząstek za pomocą platformy mikroprzepływowej. Platforma ta ma trójwymiarową (3D) sieć z zakrzywionymi kanałami płynów i trzema zaworami pneumatycznymi, które tworzą sieci, kanały i przestrzenie poprzez dupleksową replikację za pomocą polidimetylosiloksanu (PDMS). Urządzenie działa w oparciu o przejściową reakcję natężenia przepływu płynu kontrolowanego przez zawór pneumatyczny w następującej kolejności: (1) ładowanie próbki, (2) blokowanie próbki, (3) stężenie próbki i (4) uwalnianie próbki. Cząstki są blokowane przez deformację cienkiej warstwy membrany płyty zaworu sitowego (Vs) i gromadzą się w zakrzywionym kanale mikroprzepływowym. Płyn roboczy jest odprowadzany przez uruchomienie dwóch zaworów włączających/wyłączających. W wyniku operacji udało się przechwycić i odłączyć wszystkie cząstki o różnych powiększeniach. W przypadku zastosowania tej technologii ciśnienie robocze, czas wymagany do zagęszczenia i szybkość koncentracji mogą się różnić w zależności od wymiarów urządzenia i powiększenia wielkości cząstek.
Wprowadzenie
Ze względu na znaczenie analizy biologicznej, technologie mikroprzepływowych i biomedycznych systemów mikroelektromechanicznych (BioMEMS)1,2 są wykorzystywane do opracowywania i badania urządzeń do oczyszczania i zbierania mikromateriałów2,3,4. Wychwytywanie cząstek jest klasyfikowane jako aktywne lub pasywne. Aktywne pułapki zostały użyte dla zewnętrznych sił dielektrycznych5, magnetophoretic6, auditory7, visual8, lub thermal9 działających na niezależne cząstki, umożliwiając precyzyjną kontrolę ich ruchów. Wymagana jest jednak interakcja między cząstką a siłą zewnętrzną; W związku z tym przepustowość jest niska. W układach mikroprzepływowych kontrolowanie natężenia przepływu jest bardzo ważne, ponieważ siły zewnętrzne są przenoszone na cząstki docelowe.
Ogólnie, pasywne urządzenia mikroprzepływowe mają mikrofilary w mikrokanałach10,11. Cząstki są filtrowane poprzez interakcję z przepływającym płynem, a urządzenia te są łatwe do zaprojektowania i niedrogie w produkcji. Powodują one jednak zatykanie się cząstek w mikrofilarach, dlatego opracowano bardziej złożone urządzenia, aby zapobiec zatykaniu się cząstek12. Urządzenia mikroprzepływowe o złożonej strukturze są generalnie odpowiednie do zarządzania ograniczoną liczbą cząstek13,14,15,16,17,18.
Ten artykuł opisuje metodę wytwarzania i obsługi pneumatycznie napędzanej platformy mikroprzepływowej dla dużych stężeń cząstek, która przezwycięża niedociągnięcia18, jak wspomniano powyżej. Platforma ta może blokować i koncentrować cząstki poprzez deformację i aktywację cienkiej warstwy membrany płyty zaworu sitowego (Vs), która gromadzi się w zakrzywionych kanałach mikroprzepływowych. Cząstki gromadzą się w zakrzywionych kanałach mikroprzepływowych, a skoncentrowane cząstki mogą się rozdzielać poprzez odprowadzanie płynu roboczego poprzez uruchomienie dwóch zaworów włączających/wyłączających uszczelki PDMS18. Metoda ta umożliwia przetwarzanie ograniczonej liczby cząstek lub zagęszczenie dużej liczby małych cząstek. Warunki pracy, takie jak wielkość natężenia przepływu i ciśnienie sprężonego powietrza, mogą zapobiec niepożądanym uszkodzeniom komórek i zwiększyć wydajność wychwytywania komórek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Projektowanie platformy mikroprzepływowej do koncentracji cząstek
- Zaprojektuj pneumatyczną platformę mikroprzepływową składającą się z jednego zaworu pneumatycznego do przepływu płynu w sieci przepływu 3D i trzech zaworów pneumatycznych do obsługi zaworu sitowego (Vs), płynu (Vf) i zaworu cząstek (Vp) (Rysunek 1).
UWAGA: Vs blokuje skoncentrowane cząstki z cieczy, a Vf i Vp umożliwiają uwolnienie płynu i cząstek po stężeniu. Trzy porty pneumatyczne dostarczają sprężone powietrze z warstwy zasilającej płyn/pneumatykę (normalnie otwartą) i wylotu światła zaworu pneumatycznego w celu uruchomienia zaworu. Sieć kanałów mikroprzepływowych została zaprojektowana za pomocą programu CAD18,19. - Zaprojektuj kanał tak, aby był warstwą zasilania pneumatycznego i warstwą sieci kanałów 3D (Rysunek 2).
UWAGA: Sieć płynów jest połączona z zakrzywionymi kanałami w przedniej części i prostokątną komorą w tylnej części. Vs blokują wlot, a cząstki gromadzą się w obszarze zbierania zakrzywionego kanału płynu. Płyny wolne od cząstek (ciecze wolne od cząstek) są wypuszczane przez wylot Qf, a skoncentrowane cząstki przez wylot Qp (Rysunek 3). - Zgodnie z powyższymi warunkami przygotuj cztery rodzaje form SU-8.
UWAGA: Cztery formy obejmują formę, która umożliwia sterowanie zaworem za pomocą pneumatyki, dwie formy, które tworzą kanały płynu, oraz czystą formę bez kształtu (Rysunek 4 i Tabela 1). Cztery wymienione rodzaje form są wytwarzane przy użyciu standardowych procesów fotolitografii. Ta produkcja form składa się z formy SU-8 na płytce krzemowej, zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami18,19. Rysunek 5 przedstawia układ urządzenia.
2. Wykonanie platformy mikroprzepływowej do koncentracji cząstek
UWAGA: Rysunek 6 ilustruje produkcję platformy mikroprzepływowej, która koncentruje cząstki.
- Odtworzyć warstwę PDMS za pomocą przygotowanej formy pneumatycznego kanału zaworu SU-8 (krok 1.3) do pneumatycznego sterowania zaworem.
- Wlać 10 ml płynnego PDMS i 1 ml utwardzacza (patrz Tabela materiałów) do przygotowanej formy kanału zaworu pneumatycznego (krok 1.3) i aktywować termicznie w temperaturze 90 °C przez 30 minut.
- Po utwardzeniu struktur PDMS należy oddzielić formę SU-8 z kroku 2.1.1.
- Przebić trzy porty pneumatyczne 1.5 mm (Vs, Vf i Vp) w kanale zaworu pneumatycznego wyprodukowanego zgodnie z krokiem 2.1.2 za pomocą nakłucia 1.5 mm (patrz Tabela materiałów).
- Wlać 10 ml płynnego PDMS i 1 ml utwardzacza do przygotowanej czystej formy SU-8 przygotowanej w kroku 1.3 i wirować z prędkością 1,500 obr./min przez 15 s za pomocą powlekarki wirowej (patrz Tabela materiałów). Następnie aktywować na gorąco w temperaturze 90 °C przez 30 minut.
- Po utwardzeniu struktur PDMS oddziel formę SU-8 z kroku 2.1.4.
UWAGA: Warstwa membrany zaworu kontroluje przepływ płynu zgodnie z ciśnieniem pneumatycznym. - Traktować plazmę atmosferyczną (patrz Tabela Materiałów) strukturom PDMS przygotowanym w krokach 2.1.3 i 2.1.5 przez 20 sekund.
- Wyrównaj struktury PDMS poddane bezpośredniej obróbce plazmowej z kroku 2.1.6 zgodnie ze strukturą kanału, sprawdzając za pomocą mikroskopu.
- Połączyć wyrównane struktury PDMS przygotowane w kroku 2.1.7 przez ogrzewanie w temperaturze 90 °C przez 30 minut.
- Przebić otwór o średnicy 1.5 mm we wlocie kanału płynu (Qfp) i wylotach kanału płynu (Qf i Qp) w części kanału pneumatycznego, do której przyklejona jest cienka warstwa membrany, za pomocą nakłucia 1.5 mm.
- Replikuj obie strony warstwy PDMS za pomocą dwóch form SU-8, aby utworzyć kanał mikroprzepływowy. Użyj zakrzywionej i prostokątnej formy kanału mikroprzepływowego z przodu i formy kanału mikroprzepływowego z tyłu.
- Wlej 10 ml płynnego PDMS i 1 ml utwardzacza do zakrzywionej i prostokątnej formy kanału mikroprzepływowego i wiruj z prędkością 1,200 obr./min przez 15 s. Następnie utwórz formy do zakrzywionej komory płynu i kanałów płynu poprzez aktywację termiczną w temperaturze 90 °C przez 30 minut (Rysunek 6A).
- Oddziel warstwę PDMS, na której tworzy się kanał mikroprzepływowy, a następnie wykonaj aktywowaną termicznie formę pokrywającą uszczelnioną ścianę wentylacyjną, łącząc się z płytką szklaną poprzez obróbkę plazmy atmosferycznej przez 20 sekund (Rysunek 6B).
- Wlej 3 ml płynnego PDMS do kanału połączeniowego formy SU-8 (Rysunek 6C).
- Ułóż strukturę wytworzoną w kroku 2.2.2 z formą kanału połączeniowego w ciekłym PDMS na formie kanału mikroprzepływowego i susz nałożoną strukturę w temperaturze 130 °C przez 30 minut (Rysunek 6D).
UWAGA: Podczas utwardzania tylnej struktury, forma PDMS wytworzona w kroku 2.2.2 jest nadmuchiwana przez ciśnienie termiczne warstwy powietrza, a zdeformowana warstwa PDMS jest aktywowana termicznie ( Rysunek 6E) 16. - Po utwardzeniu wyjmij przednią formę SU-8 z warstwy sieci kanałów mikroprzepływowych i ostrożnie oderwij tylną formę PDMS (Rysunek 6F).
UWAGA: Warstwa sieci fluidycznej 3D umożliwia utworzenie przedniej zakrzywionej komory płynu i kanałów mikroprzepływowych. - Wlej 10 ml płynnego PDMS i 1 ml utwardzacza do czystej formy SU-8. Następnie aktywować na gorąco w temperaturze 90 °C przez 30 minut.
- Po utwardzeniu struktur PDMS oddziel formę SU-8.
UWAGA: Ten krok tworzy dodatkową warstwę uszczelniającą. - Traktować plazmę atmosferyczną strukturami PDMS przygotowanymi w krokach 2.2.3 i 2.2.7 przez 20 sekund.
- Wyrównaj struktury PDMS poddane bezpośredniej obróbce plazmowej zgodnie ze strukturą kanału, sprawdzając za pomocą mikroskopu.
- Połączyć wyrównane struktury PDMS poprzez ogrzewanie w temperaturze 90 °C przez 30 minut.
- Wyrównaj struktury PDMS przygotowane w krokach 2.1 i 2.2 zgodnie ze strukturą kanału i połącz je, traktując plazmę atmosferyczną przez 20 sekund.
3. Konfiguracja urządzenia
UWAGA: Rysunek 7 pokazuje wytwarzanie platformy mikroprzepływowej, która koncentruje cząsteczki.
- Ręcznie napełnij kanał mikroprzepływowy bezpęcherzykową wodą demineralizowaną za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml.
- Aby sterować P_Qfp i trzema zaworami pneumatycznymi (P_Vs, P_Vf i P_Vp), które sterują przepływem mikrogranulek, należy włożyć precyzyjny regulator ciśnienia z czterema lub więcej kanałami wyjściowymi (patrz Tabela materiałów) dla płynu roboczego (Qfp) do platformy mikroprzepływowej.
UWAGA: Precyzyjny regulator ciśnienia z czterema kanałami wyjściowymi można zastąpić wieloma precyzyjnymi regulatorami ciśnienia. W tym eksperymencie ciśnienie robocze P_Qfp wynosiło 10 kPa, P_Vs 15 kPa, a P_Vf i P_Vp wynosiły 18 kPa (Rysunek 8 i Tabela 2). Rysunek 8 pokazuje natężenie przepływu płynu roboczego w czasie, gdy cząstki są skupiane przez platformę mikroprzepływową z P_Vs 15 kPa, a Tabela 2 pokazuje wyniki uruchamiania zgodnie z zaworami pneumatycznymi. - Przygotować cząstki testowe polistyrenu karboksylowego o różnych rozmiarach w wodzie destylowanej (patrz Tabela materiałów).
UWAGA: Rozmiary cząstek użyte w tym eksperymencie wynosiły 24,9, 8,49 i 4,16 μm; W zależności od ciśnienia P_Vs można stosować cząstki o różnych rozmiarach. - Aby kontrolować natężenie przepływu płynu roboczego, napełnij szklaną butelkę do połowy wodą (płynem roboczym) i podłącz szklaną nakrętkę butelki do kanału wyjściowego sterownika i mikrozaworu.
UWAGA: Podłącz jedną rurkę do mikrozaworu, aby odbierać sprężone powietrze ze sterownika, a drugą rurkę do wstrzykiwania wody. - Obserwuj działanie platformy przez odwrócony mikroskop dla wszystkich operacji platformy i zmierz robocze natężenie przepływu w czasie na wylocie za pomocą przepływomierza cieczy (patrz Tabela materiałów).
4. Działanie urządzenia
- Wstrzyknąć mieszaninę cząstek/płynów pod ciśnieniem na wlocie (Qfp) za pomocą Vp (Rysunek 9A).
UWAGA: Przepływ cząstek i czystego płynu z wylotu przez połączone kanały jest kontrolowany odpowiednio przez Vp i Vf (Tabela 2). - Zastosuj ciśnienie do Vs przy 15 kPa i Vp przy 18 kPa, aby uruchomić zawór.
UWAGA: W tym czasie membrana jest zdeformowana, cząstki płynu Qfp są blokowane w przestrzeni styku między zakrzywionym kanałem płynu a zakrzywionym wspornikiem płynu, a niepożądany płyn Qfp jest uwalniany przez otwarty Qf (Rysunek 9B,C). - Gdy cząstki są zagęszczone, należy przyłożyć ciśnienie tylko do Vf.
UWAGA: W tym momencie, gdy ciśnienie jest wywierane tylko na Vf, zatkane cząstki są uwalniane przez Qp (Rysunek 9D).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rycina 8 przedstawia przepływność strumieni cieczy dla czteroelementowej operacji platformy, wspomnianej w Tabeli 2. Pierwszy etap to stan ładowania (stan a). Platforma została zaopatrzona w ciecz przy otwartych wszystkich zaworach, a strumień cieczy roboczej (Qf) i strumień cząstek (Qp) były niemal identyczne, ponieważ sieć kanałów mikroprzepływowych wykazuje symetrię strukturalną. W drugim etapie (stan b) sprężone powietrze zostało doprowadzone do Vs, aby zablokować cząstk...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Platforma ta zapewnia prosty sposób oczyszczania i zagęszczania cząstek o różnych rozmiarach. Cząstki są gromadzone i uwalniane przez pneumatyczne sterowanie zaworami i nie obserwuje się zatykania, ponieważ nie ma struktury pasywnej. Za pomocą tego urządzenia prezentowane jest stężenie cząstek o trzech rozmiarach. Jednak ciśnienie robocze, czas potrzebny do koncentracji i szybkość mogą się różnić w zależności od wymiarów urządzenia, wielkości cząstek, powiększenia i ciśnienia przy Vs 18,20,21.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez rząd Korei (Ministerstwo Nauki i ICT). (Nie. NRF-2021R1A2C1011380).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nakłucie 1,5 mm | Samodzielna produkcja | Samodzielna obróbka | To nakłucie zostało wykonane na prośbę producenta form w oparciu o Miltex® Dziurkacz do biopsji z tłokiem (15110-15) produkt. |
| 4-calowy wafel krzemowy / forma SU-8 | 4science | 29-03573-01 | 4-calowy (100) wafel krzemowy typu P / forma SU-8 |
| Cząstki usieciowane polistyrenu karboksylowego (24,9 i mu; m) | Spherotech | CPX-200-10 | Skoncentrowana próbka kulek1 |
| Przepływomierz | Sensirion | SLI-1000 | Pomiar przepływu |
| Szybka kamera | Photron | FASTCAM Mini | Obserwacja stężenia |
| Płyta grzejna | Jako jedna | HI-1000 | do utwardzania płynu PDMS |
| KOVAX-STRZYKAWKA 10 mL/strzykawka | Koreavaccine | 22G-10ML | Napełnij kanał mikroprzepływowy wodą demineralizowaną bez pęcherzyków. |
| Laboratorium Conona Treater/Plazma atmosferyczna | Electro-Technic | BD-20AC | Klejenie chipów/plazma atmosferyczna Płynny |
| polidimetylosiloksan, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Elementy mikroskopu chipowego |
| Olympus | IX-81 | Obserwacja stężenia | |
| Rurki PEEK | SAINT-GOBAIN PPL CORP. | AAD04103 | Wstrzyknij lub zbierz cząstki |
| polistyrenu (4,16 i mu; m) | Spherotech | PP-40-10 | Skoncentrowana próbka kulek3 |
| Cząstki polistyrenu (8,49 μ m) | Spherotech | PP-100-10 | Skoncentrowana próbka kulek2 |
| Regulator ciśnienia/μ flucon | AMED | μ flucon | Kontrola ciśnienia powietrza |
| Powlekarka wirowa | iNexus | ACE-200 | rozprowadza płyn PDMS na formie SU-8 |
Bibliografia
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7107), 368-373 (2006).
- Desitter, I., et al. A new device for rapid isolation by size and characterization of rare circulating tumor cells. Anticancer Research. 31 (2), 427-441 (2011).
- Hayes, D. F., et al. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clinical Cancer Research. 12 (14), 4218-4224 (2016).
- Choi, S., Park, J. K. Microfluidic system for dielectrophoretic separation based on a trapezoidal electrode array. Lab on a Chip. 5 (10), 1161-1167 (2005).
- Jung, Y., et al. Six-stage cascade paramagnetic mode magnetophoretic separation system for human blood samples. Biomedical Microdevices. 12 (4), 637-645 (2010).
- Li, P., et al. Acoustic separation of circulating tumor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 4970-4975 (2015).
- Lin, Y. H., Lee, G. B. Optically induced flow cytometry for continuous microparticle counting and sorting. Biosensors and Bioelectronics. 24 (4), 572-578 (2008).
- Gramotnev, D. K., et al. Thermal tweezers for surface manipulation with nanoscale resolution. Applied Physics Letters. 90 (5), 054108(2007).
- Huang, L. R., et al. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science. 304 (5673), 987-990 (2004).
- Yin, D., et al. Multi-stage particle separation based on microstructure filtration and dielectrophoresis. Micromachines. 10 (2), 103(2019).
- Yoon, Y., et al. Clogging-free microfluidics for continuous size-based separation of microparticles. Scientific Reports. 6 (1), 1-8 (2016).
- Alvankarian, J., Majlis, B. Y. Tunable microfluidic devices for hydrodynamic fractionation of cells and beads: a review. Sensors. 15 (11), 29685-29701 (2015).
- Irimia, D., Toner, M. Cell handling using microstructured membranes. Lab on a Chip. 6 (3), 345-352 (2006).
- Huang, S. B., et al. A tunable micro filter modulated by pneumatic pressure for cell separation. Sensors and Actuators B: Chemical. 142 (1), 389-399 (2009).
- Chang, Y. H., et al. A tunable microfluidic-based filter modulated by pneumatic pressure for separation of blood cells. Microfluidics and Nanofluidics. 12 (1-4), 85-94 (2012).
- Oh, C. K., et al. Fabrication of pneumatic valves with spherical dome-shape fluid chambers. Microfluidics and Nanofluidics. 19 (5), 1091-1099 (2015).
- Liu, W., et al. Dynamic trapping and high-throughput patterning of cells using pneumatic microstructures in an integrated microfluidic device. Lab on a Chip. 12 (9), 1702-1709 (2012).
- Jang, J. H., Jeong, O. C. Fabrication of a pneumatic microparticle concentrator. Micromachines. 11 (1), 40(2020).
- McDonald, J. C., et al. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic device. Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).
- Brivio, M., et al. A MALDI-chip integrated system with a monitoring window. Lab on a Chip. 5 (4), 378-381 (2005).
- Jeong, O. C., Konishi, S. The self-generated peristaltic motion of cascaded pneumatic actuators for micro pumps. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (8), 085017(2008).
- Taff, B. M., Voldman, J. A scalable addressable positive dielectrophoretic cell-sorting array. Analytical Chemistry. 77 (24), 7976-7983 (2005).
- Pamme, N., et al. On-chip free-flow magnetophoresis: Separation and detection of mixtures of magnetic particles in continuous flow. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 307 (2), 237-244 (2006).
- Harris, N. R., et al. Performance of a micro-engineered ultrasonic particle manipulator. Sensors and Actuators B: Chemical. 111, 481-486 (2005).
- Yoon, Y., et al. Clogging-free microfluidics for continuous size-based separation of microparticles. Scientific Reports. 6 (1), 1-18 (2016).
- Beattie, W., et al. Clog-free cell filtration using resettable cell traps. Lab on a Chip. 14 (15), 2657-2665 (2014).
- Cheng, Y., et al. A bubble- and clogging-free microfluidic particle separation platform with multi-filtration. Lab on a Chip. 16 (23), 4517-4526 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
