Artykuł metodologiczny

Końcowe pomiary H-refleksu u myszy

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63304

⸱

16 czerwca 2022

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Medicine and University Hospital Cologne, Department of Neurology, University of Cologne, 2Department for Animal Physiology, Institute for Zoology, Biocenter Cologne, University of Cologne, 3Cognitive Neuroscience, Institute of Neuroscience and Medicine (INM-3), Research Center Juelich

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Kliniczna ocena spastyczności oparta na odruchu Hoffmanna (H-odruch) i wykorzystująca elektryczną stymulację nerwów obwodowych jest uznaną metodą. W tym miejscu przedstawiamy protokół końcowej i bezpośredniej stymulacji nerwów w celu ilościowego określenia odruchu H w przedniej łapie myszy.

Streszczenie

Odruch Hoffmanna (H-odruch), jako elektryczny analog do odruchu rozciągania, umożliwia elektrofizjologiczną walidację integralności obwodów nerwowych po urazach takich jak uszkodzenie rdzenia kręgowego lub udar. Wzrost odpowiedzi H-odruchowej, wraz z objawami, takimi jak niedobrowolne skurcze mięśni, patologicznie zwiększony odruch rozciągania i hipertonia w odpowiednim mięśniu, jest wskaźnikiem spastyczności po udarze (PSS).

W przeciwieństwie do raczej niespecyficznych dla nerwów pomiarów przezskórnych, tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia odruchu H bezpośrednio na nerwie łokciowym i pośrodkowym przedniej łapy, który ma zastosowanie, z niewielkimi modyfikacjami, do nerwu piszczelowego i kulszowego tylnej łapy. Opierając się na bezpośredniej stymulacji i adaptacji do różnych nerwów, metoda stanowi niezawodne i wszechstronne narzędzie do walidacji zmian elektrofizjologicznych w modelach chorób związanych ze spastycznością.

Wprowadzenie

Odruch Hoffmanna (H-reflex), nazwany na cześć fizjologa Paula Hoffmanna, może być wywołany przez elektryczną stymulację nerwów obwodowych, które przenoszą aksony neuronów czuciowych i ruchowych powstających z tych samych mięśni i prowadzących do nich. Jest to elektrycznie indukowany analog monosynaptycznego odruchu rozciągania i ma tę samą ścieżkę1. W przeciwieństwie do rozciągania mięśni, odruch H wynika ze stymulacji elektrycznej. Gdy nerwy obwodowe są stymulowane elektrycznie przy niskim natężeniu prądu, włókna doprowadzające Ia są zwykle najpierw depolaryzowane ze względu na ich dużą średnicę aksonów2. Ich potencjały czynnościowe pobudzają neurony ruchowe alfa (αMN) w rdzeniu kręgowym, które z kolei wywołują potencjały czynnościowe, które przemieszczają się w dół aksonów αMN w kierunku mięśnia (Rysunek 1). Kaskada ta generuje odpowiedź mięśniową o małej amplitudzie, odzwierciedloną w tzw. fali H. Poprzez stopniowe zwiększanie intensywności bodźca, amplituda fali H wzrasta ze względu na rekrutację dodatkowych jednostek motorycznych. Z pewnej intensywności bodźca potencjały czynnościowe w cieńszych aksonach αMN są wywoływane bezpośrednio, co jest rejestrowane jako fala M. Ta fala M pojawia się z krótszym opóźnieniem niż fala H (Rysunek 2). Jeśli intensywność stymulacji jest dalej zwiększana, amplituda fali M staje się większa ze względu na rekrutację większej liczby aksonów αMN, podczas gdy fala H stopniowo staje się mniejsza. Załamek H może być tłumiony przy dużej intensywności bodźca ze względu na antydromiczną wsteczną propagację potencjałów czynnościowych w aksonach αMN. Te wyzwolone potencjały czynnościowe zderzają się z tymi ze stymulacji Ia i mogą się w ten sposób wzajemnie znosić. Przy supramaksymalnej intensywności bodźca potencjały czynnościowe ortodromiczne (w kierunku mięśnia) i antydromiczne (w kierunku rdzenia kręgowego) występują we wszystkich aksonach MN; pierwszy z nich powoduje powstanie maksymalnej amplitudy fali M (Mmax), podczas gdy drugi powoduje całkowite zniesienie H-reflex3.

Do oceny spastyczności po udarze (PSS) lub uszkodzenia rdzenia kręgowego (SCI), odruch H został wykorzystany do oceny neuronalnych podstaw ruchu i spastyczności u ludzi1. Lepsza kwantyfikacja zmiany w odruchu H między pomiarami i między badanymi jest osiągana dzięki zastosowaniu stosunku fali H i M (stosunek H/M). Alternatywnie, depresja zależna od szybkości (RDD) jest mierzona za pomocą zestawu rosnących częstotliwości (np. 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 i 5,0 Hz). RDD odzwierciedla integralność obwodów hamujących, które mogą być zakłócone przez udar lub SCI. Gdy wszystkie obwody nerwowe są nienaruszone, następuje jednolite, niezależne od częstotliwości tłumienie odruchu H. Jeśli jednak w wyniku udaru lub SCI dochodzi do zmniejszenia hamowania neuronalnego, tłumienie odruchu H zmniejsza się wraz ze wzrostem częstotliwości stymulacji4.

Prawidłowy zapis elektrofizjologiczny przy użyciu elektrod powierzchniowych może być trudny i może być uzależniony od zadań motorycznych, mechanizmów hamujących i pobudliwości αMN5. W zapisie przezskórnym u gryzoni elektrodę bodźcową umieszcza się w pobliżu nerwu piszczelowego, a elektrodę rejestrującą umieszcza się w pobliżu powiązanych mięśni łapy przedniej. Z naszego doświadczenia wynika jednak, że prawidłowe ułożenie elektrod przezskórnych (Rysunek 1A) jest jeszcze bardziej złożone i zmienne u gryzoni niż umieszczenie elektrod powierzchniowych u ludzi. Może to prowadzić do różnic w długości, częstotliwości i intensywności stymulacji niezbędnej do wywołania odruchu H. Te wyzwania metodologiczne mogą wyjaśniać, dlaczego istnieje tylko bardzo ograniczona liczba badań pomiaru H-refleksu (np. w eksperymentalnych modelach udarów3,4 i innych modelach spastyczności6. Precyzyjną (długotrwałą) stymulację i rejestrację odruchu H na poszczególnych nerwach można w zasadzie osiągnąć za pomocą wszczepialnych elektrod otaczających nerw docelowy7,8. Ze względu na trudną operację z potencjalnymi skutkami ubocznymi dla zwierzęcia i potencjalną niestabilnością sondy, podejście to nie stało się standardem w tej dziedzinie. Przedstawiona tutaj metoda wymaga również pewnej wiedzy chirurgicznej. Pozwala jednak na nowatorską, precyzyjną stymulację i rejestrację izolowanych nerwów in vivo przy użyciu niskich intensywności stymulacji, co pozwala uniknąć jednoczesnej stymulacji sąsiednich nerwów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z europejskimi i krajowymi przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami oraz wytycznymi instytucjonalnymi, i zostały zatwierdzone przez Landesamt für Natur-, Umwelt-, und Verbraucherschutz Nadrenia Północna-Westfalia (Az: 81-02.04.2019.A309). Protokół jest zoptymalizowany dla dorosłych myszy (ok. 8-16 tygodniowe myszy C57Bl/6J) i zapisu kończyn przednich. Można go łatwo dostosować, stymulując odpowiednie nerwy kończyny tylnej i rejestrując mięśnie tylnej łapy (Ryc. 1B). Opis elektrod rejestrujących i stymulujących znajduje się w Tabeli Materiałów. Należy pamiętać, że protokół jest używany tylko do pomiaru terminala.

1. Przygotowanie

  1. Zważyć zwierzę i rozpocząć znieczulenie, wstrzykując przez dozownik mieszaninę ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg).
  2. Trzymaj mysz w pudełku grzewczym, aż zostanie osiągnięta tolerancja chirurgiczna. Poczekaj kilka minut, aż mysz się uspokoi, oddech będzie stabilny, a odruchy nie będą miały odruchów. Sprawdź głębokość znieczulenia, mierząc brak reakcji na uszczypnięcie palca.
  3. Obróć mysz na plecy i umieść ją na poduszce grzewczej (optymalne byłoby ogrzewanie sterowane sprzężeniem zwrotnym za pomocą sondy temperatury doodbytniczej). Przymocuj przednie łapy taśmą. W tym miejscu należy upewnić się, że taśma jest umieszczona w taki sposób, aby elektrody pomiarowe można było łatwo włożyć do przednich łap.
  4. Włóż sondę doodbytniczą, aby zmierzyć temperaturę zwierzęcia i przymocuj ją taśmą. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu.

2. Chirurgia

UWAGA: Stabilny stan znieczulonego zwierzęcia, tj. oddychanie, temperatura i utrata odruchów, powinien być regularnie monitorowany przez cały czas trwania zabiegu. Procedura pomiaru załamka H nerwu bezpośredniego jest pokazana dla nerwu promieniowego/łokciowego/środkowego łapy przedniej łapy (Rysunek 3A). Pomiar można również dostosować do tylnej łapy (nerw kulszowy/piszczelowy) z modyfikacjami.

  1. Aby uzyskać lepszy przegląd obszaru operacyjnego, wcześniej usuń włosy za pomocą elektrycznej maszynki do golenia lub nożyczek w osobnym miejscu. Dla bardziej doświadczonych chirurgów jest to tylko opcjonalne.
    UWAGA: Dezynfekcja nie jest tutaj konieczna, ponieważ jest to eksperyment końcowy. Zwierzę zostanie później poddane eutanazji.
  2. Podnieś skórę pęsetą i wykonaj nacięcie o długości około 1 cm w skórze wzdłuż osi brzuszno-tylnej przedniej łapy (obszar nad pachą i klatką piersiową) za pomocą cienkich, zaokrąglonych nożyczek.
  3. Ostrożnie usuń tkankę łączną i odsłoń mięśnie i nerwy pod spodem. Usuń odsłonięty mięsień piersiowy głęboki za pomocą kleszczy, aby uzyskać dostęp do nerwu pośrodkowego (Rysunek 3E,F). Usuń niewielkie ilości krwi i płynu tkankowego z tkankami miękkimi.
  4. W następnym kroku ostrożnie przetnij pierś lub mięsień pachowy od góry do dołu, aby odsłonić pęczek nerwowy pod spodem. Uwolnij wiązkę nerwową z tkanki łącznej i mięśniowej na długości około 1,5 cm.
    UWAGA: W tym przypadku należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych biegnących równolegle do nerwu pośrodkowego. Podczas przecinania tkanki zawsze przecinaj wzdłuż nerwu, aby uniknąć jego zranienia. Jeśli tak się stanie, usuń wyciekający płyn i krew za pomocą wacika. Mikroskop stereoskopowy nie jest konieczny do całego eksperymentu, jednak może być przydatny do przygotowania nerwów.
  5. Ostrożnie oddziel nerw łokciowy i pośrodkowy przedniej łapy za pomocą wygiętej szklanej pipety (Rysunek 3E). Górny z dwóch nerwów to nerw łokciowy, a dolny to nerw pośrodkowy.
    UWAGA: Oddzielając nerwy od siebie, upewnij się, że naczynie krwionośne pod spodem nie jest uszkodzone.

3. Umiejscowienie elektrod

  1. Ułóż elektrody haka stymulacyjnego równolegle w odległości 0,5-1,0 mm i za pomocą mikromanipulatora umieść podwójny haczyk w bliskiej odległości od nerwu.
  2. Użyj szklanego haczyka jako narzędzia do podniesienia nerwu łokciowego na elektrody haka stymulacyjnego. Odciągnij elektrodę wraz z nerwem i oddziel ją od innych nerwów o około 1-2 mm za pomocą mikromanipulatora (Rysunek 3D, F).
  3. Umieść elektrody wzdłuż długiej osi łapy, aby zmniejszyć przesłuch między mięśniami.
    UWAGA: Rozmieszczenie elektrod jest bardzo ważne, ale trudne do standaryzacji ze względu na indywidualną anatomię. Wymaga doświadczonego chirurga, aby prawidłowo umieścić elektrody. Przewody można również przestawiać, jeśli amplituda sygnału jest niezadowalająca.
  4. Powierzchownie osusz haczyki elektrod przymocowane do nerwu i nałóż wazelinę za pomocą strzykawki, aby zapewnić izolację elektryczną od sąsiedniej tkanki.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby nałożyć wystarczającą ilość wazeliny na elektrodę, a także między dwoma haczykami, aby zapewnić izolację elektryczną i zapobiec wysychaniu nerwów.

4. Umiejscowienie elektrod rejestrujących i referencyjnych

  1. Aby zmierzyć odruch H, umieść elektrody EMG domięśniowo w przedniej łapie. Ponadto umieść elektrodę odniesienia podskórnie w kończynie tylnej (np. za pomocą szpilki minutowej), przytrzymywaną przez miniaturowy zacisk krokodylkowy (Rysunek 3B).
  2. Gdy stymulator jest włączony, obserwuj udaną stymulację jako drobne drgania przedniej łapy. Minimalny prąd stymulacyjny do wywołania fali M i drobnych widocznych drgań w przedniej łapie powinien mieścić się w zakresie 10-50 μA.
    UWAGA: Jeśli przy 50 μA nie są widoczne drgania, wyreguluj elektrody stymulacyjne i ponownie nałóż wazelinę. Ponadto u myszy nierzadko zdarza się, że fala M pojawia się przy niższej intensywności stymulacji niż fala H5.

5. Pomiar

  1. Powtórz stymulację nerwu 15 razy, z których każdy ma impulsy o długości 0,2 ms. Przy przerwach 2 min między zestawami bodźców częstotliwość wzrasta z 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 do 5 Hz.
    UWAGA: Te częstotliwości są niezbędne przy późniejszym obliczaniu RDD. Wszystkie dane EMG są rejestrowane, digitalizowane i analizowane za pomocą oprogramowania, np. oprogramowania Spike2 (CED, wersja 7.19). Największa amplituda fali H spodziewana jest przy 0,1 Hz. Im wyższa częstotliwość, tym mniejsza staje się amplituda fali H spowodowana RDD.
  2. Po eksperymencie należy złożyć zwierzę w ofierze zgodnie z protokołem instytutu IACUC. W tym eksperfuzji przezsercowej myszy przeprowadzono przy użyciu PBS i 4% PFA w głębokim znieczuleniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Z n = 15 prób stymulacji na każdą częstotliwość stymulacji i łapę, wybierz co najmniej n = 10 udanych rejestracji do analizy. Próby z błędami pomiarowymi (np. brak fali M) są wykluczane z analizy. Analizuj każdą próbę oddzielnie, a następnie wylicz średnią do późniejszych porównań grupowych/czasowych. Dla każdej próby rejestruje się opóźnienie między stymulacją a pojawieniem się fali M i fali H. Z naszego doświadczenia wynika, że fala M pojawia się około 2 ms po stymulacji, a fala H po 6-8 ms, ze względu na dłuższy czas ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W przeciwieństwie do wcześniej opisanych przezskórnych pomiarów H-odruchu u myszy6, zapewniamy bardziej bezpośredni i specyficzny dla nerwów pomiar. To nowe podejście można zastosować do nerwów kończyn przednich i tylnych (np. nerwu pośrodkowego, łokciowego i promieniowego oraz odpowiednio nerwu piszczelowego i kulszowego), dzięki czemu metoda ta może być stosowana jako narzędzie diagnostyczne do wielu modeli chorób (np. udar, stwardnienie rozsiane, stwardnienie zanikowe boczne, urazowe uszkodzeni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony T. Akaya z Uniwersytetu Dalhousie podczas wizyty MG w jego laboratorium. Prace te były finansowane przez Fundację Friebe (T0498/28960/16) oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) - Project-ID 431549029 - SFB 1451.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chłonny podkładKonwerter VWR115-0684
ADCambridge Electronic Design, Wielka BrytaniaCED 1401mikro
Warsztat wzmacniaczyInstytut Zoologiczny, UoC-Warsztaty
stymulatorów cyfrowychInstytut Zoologiczny, UoCMS 501
Elektrody EMGWarsztat Instytut Zoologiczny, UoCDwa skręcone, izolowane druty miedziane (50 µ m średnicy zewnętrznej) zostały przylutowane do męskiej wtyczki i podłączone do wzmacniacza różnicowego.
Maść do oczuBayerBepanthen
Szklana pipetaWarsztat Instytut Zoologiczny, UoC-Przygotujszklaną pipetę wygiętą w prosty szklany haczyk w płomieniu palnika Bunsena.
Skrzynka grzewczaMediHeatMediHeat V1200
Poduszka grzewczaWPI61840 Poduszka
Elektrody hakoweWarsztat Instytut Zoologiczny, UoC-Abywyprodukować elektrody, zegnij miniaturowe kołki ze stali nierdzewnej w haczyki na jednym końcu i włóż do kaniul, aby uzyskać bezpośredni kontakt mechaniczny. końcówkę kaniuli do przewodów miedzianych (długość ok. 50 cm), które są podłączone do urządzenia stymulującego lub nagrywającego.
KetaminaPfizerKetavet
Sonda doodbytniczaWPIRET-3
Jednostka izolacyjna stymulatoraWarsztat Instytut Zoologiczny, UoCMI 401
SterylizatorCellPoint ScientificGerminator 500Rutynowa przed- i pooperacyjna dezynfekcja sprzętu chirurgicznego powinna odbywać się poprzez sterylizację termiczną. Odkażaj narzędzia przez 15 s w podgrzewanej kąpieli z kulkami szklanymi (260° C).
Regulator temperaturyWPIATC200
Wazelina
BayerRompun
grzewcza Bayer-Xylazine

Bibliografia

  1. Palmieri, R. M., Ingersoll, C. D., Hoffman, M. A. The Hoffmann reflex: methodologic considerations and applications for use in sports medicine and athletic training research. Journal of Athletic Training. 39 (3), 268-277 (2004).
  2. Henneman, E., Somjen, G., Carpenter, D. O. Excitability and inhibitibility of motoneurons of different sizes. Journal of Neurophysiology. 28 (3), 599-620 (1965).
  3. Toda, T., Ishida, K., Kiyama, H., Yamashita, T., Lee, S. Down-regulation of KCC2 expression and phosphorylation in motoneurons, and increases the number of in primary afferent projections to motoneurons in mice with post-stroke spasticity. PLoS ONE. 9 (12), 114328(2014).
  4. Lee, S., Toda, T., Kiyama, H., Yamashita, T. Weakened rate-dependent depression of Hoffmann’s reflex and increased motoneuron hyperactivity after motor cortical infarction in mice. Cell Death & Disease. 5 (1), 1007(2014).
  5. Knikou, M. The H-reflex as a probe: Pathways and pitfalls. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 1-12 (2008).
  6. Wieters, F., et al. Introduction to spasticity and related mouse models. Experimental Neurology. 335, 113491(2020).
  7. Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
  8. Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. Journal of Neurophysiology. 111 (3), 694-703 (2014).
  9. Haghighi, S. S., Green, D. K., Oro, J. J., Drake, R. K., Kracke, G. R. Depressive effect of isoflurane anesthesia on motor evoked potentials. Neurosurgery. 26 (6), 993(1990).
  10. Chang, H. -Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 295 (4), 1248-1253 (2008).
  11. Nolan, J. P. Section 4: Nervous system (Br. J. Pharmacol). Clinical pharmacology. , 295-310 (2012).
  12. Struck, M. B., Andrutis, K. A., Ramirez, H. E., Battles, A. H. Effect of a short-term fast on ketamine-xylazine anesthesia in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (3), 344-348 (2011).
  13. Zandieh, S., Hopf, R., Redl, H., Schlag, M. G. The effect of ketamine/xylazine anesthesia on sensory and motor evoked potentials in the rat. Spinal Cord. 41 (1), 16-22 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Odruch Hoffmanapomiar odruchu Hwalidacja elektrofizjologicznaobwody neuronalneuszkodzenie rdzenia kr gowegomodel udarunerw okciowynerw po rodkowyelektrody elektromiograficznespastyczno mi niowa

Powiązane artykuły