Artykuł metodologiczny

Izolacja i profilowanie ludzkich pierwotnych komórek śródbłonka tętnic krezkowych na poziomie transkryptomu

DOI:

10.3791/63307

⸱

14 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Diabetes Complications and Metabolism, City of Hope, 2Department of Bioengineering, University of California San Diego, 3Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences, City of Hope

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje izolację, hodowlę i profilowanie komórek śródbłonka z ludzkiej tętnicy krezkowej. Dodatkowo opracowano metodę przygotowania tętnicy człowieka do transkryptomiki przestrzennej. Proteomika, transkryptomika i testy funkcjonalne mogą być wykonywane na izolowanych komórkach. Protokół ten można zastosować do każdej tętnicy średniej lub dużej wielkości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki śródbłonka (EC) są kluczowe dla funkcjonowania naczyń krwionośnych i całego ciała poprzez ich dynamiczną reakcję na sygnały środowiskowe. Wyjaśnienie transkryptomu i epigenomu EC ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia ich roli w rozwoju, zdrowiu i chorobie, ale jest ograniczone pod względem dostępności izolowanych komórek pierwotnych. Najnowsze technologie umożliwiły wysokoprzepustowe profilowanie transkryptomu i epigenomu EC, co doprowadziło do identyfikacji nieznanych wcześniej subpopulacji komórek EC i trajektorii rozwojowych. Podczas gdy kultury EC są użytecznym narzędziem w badaniu funkcji i dysfunkcji EC, warunki hodowli i wielokrotne pasaże mogą wprowadzać zmienne zewnętrzne, które zmieniają właściwości natywnego EC, w tym morfologię, stan epigenetyczny i program ekspresji genów. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, w niniejszej pracy przedstawiono metodę izolowania ludzkich pierwotnych EC od tętnic krezkowych dawcy w celu uchwycenia ich rodzimego stanu. EC w warstwie wewnętrznej są dysocjowane mechanicznie i biochemicznie za pomocą określonych enzymów. Powstałe w ten sposób komórki można bezpośrednio wykorzystać do sekwencjonowania masowego RNA lub jednokomórkowego RNA lub posiać je do hodowli. Ponadto opisano przebieg pracy w celu przygotowania ludzkiej tkanki tętniczej do transkryptomiki przestrzennej, w szczególności dla dostępnej na rynku platformy, chociaż metoda ta nadaje się również do innych technik profilowania transkryptomu przestrzennego. Metodologia ta może być stosowana do różnych naczyń pobranych od różnych dawców w stanie zdrowia lub choroby, aby uzyskać wgląd w regulację transkrypcyjną i epigenetyczną EC, co jest kluczowym aspektem biologii komórek śródbłonka.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki śródbłonka (EC) wyściełające światło naczyń krwionośnych są kluczowymi regulatorami napięcia naczyniowego i perfuzji tkanek. EC są niezwykłe pod względem zdolności do reagowania na środowisko zewnątrzkomórkowe i przystosowywania się do zmian w dynamice i składzie przepływu krwi. Te dynamiczne odpowiedzi są pośredniczone przez sieć wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych, w tym modulacje transkrypcyjne i potranskrypcyjne z rozdzielczością czasoprzestrzenną. Rozregulowanie tych odpowiedzi jest związane z wieloma patologiami, w tym między innymi z chorobami układu krążenia, cukrzycą i rakiem1,2.

Duża część badań wykorzystuje linie komórkowe lub modele zwierzęce do badania transkryptomu EC. To pierwsze jest przydatnym narzędziem, biorąc pod uwagę względną łatwość użycia i niedrogość. Jednak hodowla seryjna może wprowadzić zmiany fenotypowe do EC, takie jak cechy fibroblastyczne i brak polaryzacji, odłączając je od stanu in vivo3. Komórki pierwotne, np. ludzka żyła pępowinowa EC (HUVEC) są popularnym wyborem od lat 80. XX wieku, ale pochodzą z rozwojowego łożyska naczyniowego, które nie istnieje u dorosłych, a zatem jest mało prawdopodobne, aby w pełni reprezentowały dojrzałe EC. Zwierzęta, zwłaszcza modele mysie, lepiej reprezentują fizjologiczne lub patofizjologiczne środowisko EC i umożliwiają badanie transkryptomów w wyniku zaburzeń genetycznych. Mysie EC można izolować z różnych tkanek, w tym z aorty, płuc i tkanki tłuszczowej za pomocą procedur opartych na enzymach4,5,6,7. Jednak izolowane komórki nie mogą być używane do wielu przejść, chyba że zostaną przekształcone6 i często mają ograniczoną liczbę, co wymaga łączenia wielu zwierząt5,8,9.

Pojawienie się nowych technologii badających architekturę naczyń na poziomie transkryptomicznym, szczególnie w przypadku rozdzielczości pojedynczej komórki, umożliwiło nową erę biologii śródbłonka, ujawniając nowe funkcje i właściwości ECs5, 10,11,12,13,14. Bogaty zasób stworzony przez badaczy Tabula Muris zebrał profile transkryptomiczne pojedynczych komórek 100 000 komórek, w tym EC, w 20 różnych narządach myszy15, które ujawniły zarówno wspólne geny markerów EC, jak i unikalne sygnatury transkryptomiczne z różnicami między i wewnątrz tkanek5,13. Niemniej jednak istnieją wyraźne różnice między myszą a człowiekiem w genomie, epigenomie i transkryptomie, zwłaszcza w regionach niekodujących16,17,18. Te wyżej wymienione wady podkreślają znaczenie analizy EC przy użyciu próbek ludzkich w celu uzyskania wiernego profilu EC w ich naturalnym stanie pod względem zdrowia i choroby.

Większość metod izolacji EC opiera się na fizycznej dysocjacji poprzez homogenizację, drobne cięcie i mielenie tkanki przed inkubacją z enzymami proteolitycznymi przez różne czasy. Enzymy i warunki różnią się również znacznie w zależności od typu tkanki, od trypsyny po kolagenazę, stosowane samodzielnie lub w połączeniu19,20,21. Często stosuje się dalsze wzbogacanie lub oczyszczanie oparte na przeciwciałach w celu zwiększenia czystości EC. Zazwyczaj przeciwciała przeciwko markerom błonowym EC, np. CD144 i CD31 są sprzężone z kulkami magnetycznymi i dodawane do zawiesiny komórkowej22,23. Taka strategia może być ogólnie zaadaptowana do izolacji EC z wielu tkanek ludzkich i mysich, w tym technik wprowadzonych w tym protokole.

W swoim stanie naturalnym, EC oddziałują z wieloma typami komórek i mogą istnieć w niszach naczyniowych, gdzie bliskość komórek jest kluczowa dla ich funkcjonowania. Podczas gdy badania nad sekwencjonowaniem RNA pojedynczej komórki i pojedynczego jądra (scRNA i snRNA-seq) miały kluczowe znaczenie dla ostatnich przełomów w opisie heterogeniczności EC, proces dysocjacji zaburza kontekst tkankowy i kontakt komórka-komórka, które są również ważne dla zrozumienia biologii EC. Opracowane w 2012 roku i nazwane Metodą Roku 202024, przestrzenne profilowanie transkryptomu zostało wykorzystane do profilowania globalnej ekspresji genów przy zachowaniu cech przestrzennych w różnych tkankach, w tym brain25, tumor26 i tkanka tłuszczowa27. Technologie te mogą być ukierunkowane przy użyciu specjalistycznych sond specyficznych dla określonych sekwencji RNA przyłączonych do odczynników powinowactwa lub znaczników fluorescencyjnych, wykrywając w ten sposób wybrane geny w rozdzielczości subkomórkowej28,29,30,31. Mogą być również nieukierunkowane32,33, zazwyczaj wykorzystując przestrzennie kodowane oligonukleotydy do wychwytywania RNA, które razem przekształcają się w cDNA w celu późniejszego przygotowania biblioteki sekwencyjnej, a zatem mają tę zaletę, że dedukują ekspresję genów w całej tkance w bezstronny sposób. Jednak rozdzielczość przestrzenna nie jest obecnie osiągana na poziomie pojedynczej komórki przy użyciu dostępnych na rynku technologii. Można to do pewnego stopnia przezwyciężyć dzięki integracji danych z danymi scRNA-seq, co ostatecznie pozwala na mapowanie transkryptomu pojedynczej komórki w złożonym kontekście tkankowym, zachowując jednocześnie oryginalną informację przestrzenną34.

Tutaj, opisano przepływ pracy do profilowania transkryptomu EC za pomocą ludzkiej tętnicy krezkowej górnej, tętnicy obwodowej, która została wykorzystana do badania rozszerzenia naczyń krwionośnych, przebudowy naczyń krwionośnych, stresu oksydacyjnego i stanu zapalnego35,36,37. Opisano dwie techniki: 1) izolowanie i wzbogacanie EC z błony wewnętrznej naczyń krwionośnych, łącząc dysocjację mechaniczną i trawienie enzymatyczne, odpowiednie do sekwencjonowania transkryptomu pojedynczej komórki lub późniejszej hodowli in vitro; 2) przygotowanie odcinków tętniczych do przestrzennego profilowania transkryptomu (Ryc. 1). Te dwie techniki mogą być wykonywane niezależnie lub komplementarnie w celu profilowania EC i otaczających je komórek. Co więcej, ten przepływ pracy można dostosować do zastosowania na dowolnej średniej lub dużej tętnicy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania tkanek ludzkich zostały przeprowadzone na niezidentyfikowanych próbkach uzyskanych z Southern California Islet Cell Resource Center w City of Hope. Zgody na przeprowadzenie badań nad wykorzystaniem pośmiertnych tkanek ludzkich uzyskano od najbliższej rodziny dawców, a zgoda etyczna na to badanie została udzielona przez Institutional Review Board of City of Hope (IRB nr 01046).

1. Fizyczna dysocjacja (szacowany czas: 1-2 h)

  1. Umieść świeżą tętnicę na 10-centymetrowym naczyniu i przemyj sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (D-PBS) firmy Dulbecco.
  2. Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek preparacyjnych usuń tłuszcz i zewnętrzną tkankę łączną, aż naczynie będzie czyste. Zmierz długość naczynia za pomocą linijki umieszczonej na zewnątrz naczynia i zrób zdjęcia do rekordów (Rysunek 1A).
  3. Wstępnie podgrzej odpowiedni bufor do trawienia do 37 °C: dla sekwencji scRNA użyj enzymu dysocjacji komórek; do testów hodowli komórkowych użyj 1-6 mg/ml kolagenazy D, 3 mg/ml proteazy pochodzenia bakteryjnego, 100 mM HEPES, 120 mM NaCl, 50 mM KCl, 5 mM glukozy, z 1 mM CaCl26,38 (pH 7,0, nie wymaga regulacji) dodano 5 minut przed użyciem.
  4. Weź tętnicę krezkową (zwykle o średnicy 6-8 mm) i przetnij wzdłuż nożyczkami, aby otworzyć światło naczynia w pionie.
  5. Za pomocą igieł przymocuj naczynie do czarnego wosku we wszystkich czterech rogach, pozostawiając odsłoniętą błonę wewnętrzną (Rysunek 1B).
  6. Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanego buforu wytrawiającego do błony wewnętrznej. Weź sterylny skalpel i delikatnie zeskrob światło naczynia dwukrotnie.
    UWAGA: Celem tej procedury jest dysocjacja warstwy wewnętrznej, która może wymagać praktyki. Należy przyłożyć wystarczającą siłę, aby usunąć śródbłonek, ale nie na tyle, aby usunąć również głębsze warstwy tkanki, co zmniejszy reprezentację EC.
  7. Przenieść bufor wytrawiający do probówki o pojemności 5 ml. Dodać 1 ml buforu wytrawiającego do błony wewnętrznej i ostrożnie pipetować w górę i w dół, aby zebrać pozostałe komórki i dodać do probówki o pojemności 5 ml. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, obracając się z prędkością 150 obr./min przez 5 min.
  8. Dodaj 2 ml pożywki M199 (lub D-PBS, jeśli postępujesz z sekwencją scRNA) do zawiesiny komórkowej, aby wygasić reakcję enzymatyczną. Delikatnie wymieszać i odwirować w temperaturze 4 °C, 600 x g przez 5 min.
  9. Usunąć supernatant i przechowywać go oddzielnie do hodowli jako kontrolę w celu obserwacji, czy wszystkie komórki zostały wychwycone w osadzie w kroku 1.8. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki M199 (lub D-PBS, jeśli kontynuujesz sekwencję scRNA).
  10. Ocenić żywotność komórek, mieszając 10 μl błękitu trypanowego z 10 μl zapasu komórkowego. Obserwuj morfologię komórek i policz komórki za pomocą hemocytometru.
    UWAGA: W tym momencie komórki mogą być używane do kwantyfikacji białek lub RNA lub hodowane in vitro przy użyciu pożywek hodowlanych EC zgodnie ze standardowymi protokołami39. Alternatywnie można je przygotować do sekwencjonowania zgodnie z opisem w następnej sekcji.
  11. W celu hodowli pokryj dwie studzienki na płytce 6-dołkowej, pipetując 500 μl odczynnika przyłączającego do studzienek przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu odczynnika przyłączającego i umyciu sterylnym D-PBS, należy dozować cały zapas komórek do jednego dołka, a supernatant przechowywany jako kontrolę do drugiego dołka.

2. Przygotowanie do badań scRNA-seq (szacowany czas: 3-4 h)

  1. Odwirować materiał komórkowy z kroku 1.11 w temperaturze 4 °C, 600 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad za pomocą pipety P1000 i końcówki o szerokim otworze w 1 ml 0,04% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w D-PBS. Dobrze wymieszaj, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
  2. Przepuść roztwór przez sitko o wielkości 40 μm, aby usunąć resztki komórek. Jeśli pozostaną zanieczyszczenia, przepuść przez drugie sitko do 4 ml 0,04% BSA w D-PBS.
  3. Wirować w temperaturze 4 °C, 600 x g przez 5 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl 0,04% BSA w D-PBS za pomocą pipety P1000 z końcówką do pipety o szerokim otworze. Dobrze wymieszaj, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
  4. Ocenić żywotność komórek, mieszając 10 μl materiału komórkowego z 10 μl błękitu trypanowego. Za pomocą hemocytometru obserwuj morfologię, określ, czy występuje zawiesina pojedynczej komórki bez klastrów, sprawdź, czy nie ma resztek tkanek i oblicz liczbę żywych i martwych komórek.
  5. Jeśli komórki są skupione lub pozostały zanieczyszczenia, powtórzyć mycie 0,04% BSA w D-PBS lub ponownie przepuścić przez sitko 40 μm.
    UWAGA: Chociaż zmniejszy to wydajność, ważne jest, aby komórki znajdowały się w czystej zawiesinie jednokomórkowej dla optymalnego sekwencjonowania.
  6. Zawiesina jednokomórkowa może być używana do sekwencjonowania scRNA.

3. Przestrzenne profilowanie transkryptomu (szacowany czas: 3-4 h)

  1. Dodaj izopentan (2-metylobutan) do metalowego kanistra i schładzaj w ciekłym azocie (LN2) lub suchym lodzie (preferowany jest LN2, ponieważ obniży temperaturę niż suchy lód). Wlej związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) do studzienek oznaczonych plastikowych krioform, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków i usuwać te, które się pojawiają. Pozostaw kriomold na suchym lodzie do ostygnięcia.
  2. Wyciąć co najmniej dwa odcinki koronalne o długości 1 cm od naczynia. Za pomocą długich (12") kleszczy zanurz tkankę w izopentanie do momentu zamrożenia. Szybko zanurz tkankę w OCT w orientacji z widocznym światłem pośrodku. Zadbaj o to, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, zwłaszcza te znajdujące się przy chusteczce.
  3. Za pomocą długich (12") kleszczy chwyć krioformy i przytrzymaj je w metalowym kanistrze. Podczas gdy podstawa form powinna znajdować się w cieczy, nie powinna być zbyt głęboka, aby izopentan mógł spływać po tkance. Obserwuj zamarzanie, OCT stanie się stopniowo biały od zewnątrz w ciągu 1-2 minut.
  4. Skrawki te należy przechowywać w szczelnie zamkniętym pojemniku w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy.
    UWAGA: Próbki należy zawsze utrzymywać na suchym lodzie i nie dopuszczać do więcej niż jednego cyklu zamrażania i rozmrażania. Tkanka ta może być wykorzystana do analizy histologicznej, fluorescencji RNA/DNA hybrydyzacji in situ (FISH) lub transkryptomiki przestrzennej, która zostanie teraz opisana.
  5. Ustawić temperaturę kriostatu na -20 °C dla komory i -10 °C dla głowicy próbki. Równowagi osadzone w OCT sekcje naczyń, noże, szczotki i szkiełka do -20 °C w kriostacie przez około 30 minut. Podczas wyrównywania wyczyść maszynę i wszystkie urządzenia, które mogą stykać się z sekcjami, w tym ostrze, 70% etanolem, a następnie roztworem do odkażania RNazy.
  6. Dołączyć próbkę, dozując niewielką ilość OCT na okrągły blok kriostatu i umieszczając próbkę na wierzchu przed jej zamrożeniem. Umieść klocek na środku łba próbki i przykręć go za pomocą wysokiego czarnego uchwytu po lewej stronie. Odciąć nadmiar OCT otaczającego naczynie.
  7. Ustawiając grubość cięcia na 10 μm na kriostacie, wytnij około 60 sekcji i umieść je we wstępnie schłodzonej probówce o pojemności 1,5 ml. Sekcje te zostaną wykorzystane do oceny jakości RNA. Po wyjęciu z kriostatu natychmiast dodaj 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA i wiruj, aż skrawki całkowicie się rozpuszczą.
  8. Dodaj 200 μl chloroformu i mieszaj, aż roztwór będzie przypominał truskawkowy koktajl mleczny. Wirować przy 11 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Zbierz fazę wodną (klarowna faza na wierzchu białych i różowych warstw) i dodaj do niej 500 μl izopropanolu. Wymieszać, odwracając probówki ponad 10 razy i umieścić w temperaturze -80 °C na co najmniej 20 minut.
  10. Wirować przy 11 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Rozpuścić oczyszczony osad RNA w 5 μl wody wolnej od RNaz. Sprawdź numer integralności RNA (RIN).
    UWAGA: Preferowane są próbki o RIN ≥ 7, ale dopuszczalne jest RIN ≥ 6. Liczba skrawków tkanki i objętość roztworu do rozpuszczania RNA może wymagać optymalizacji w zależności od zastosowanego systemu, aby zapewnić, że końcowe stężenie RNA mieści się w zakresie funkcji RIN, aby umożliwić dokładną ocenę RIN.
  11. Przećwicz prawidłowe cięcie i umieszczanie skrawków w ramach odniesienia za pomocą zwykłych szkiełek przed przystąpieniem do dostępnej na rynku optymalizacji tkanek lub preparatów do ekspresji genów. Można to osiągnąć, rysując kwadraty o wymiarach 6,5 mm x 6,5 mm na zwykłym szkiełku podstawowym, schładzając do -20 °C w kriostacie i umieszczając sekcje w tym obszarze wychwytywania.
  12. Wytnij odcinki 10 μm z założoną płytką zabezpieczającą, odwróć i ostrożnie spłaszcz, delikatnie dotykając sekcji przez otaczający OCT.
  13. Używając szczotek do kriostatu bez RNaz, umieść wycinek tkanki w kwadracie, używając tylko otaczającego OCT. Natychmiast umieść jeden palec (w rękawiczkach) z tyłu obszaru przechwytywania, aby stopić sekcję do szkiełka.
  14. Po przyklejeniu się sekcji umieść szkiełko na kriobarze, aby umożliwić zamrożenie sekcji. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć fałdowania tkanek i pokrywania się tkanek poza wyznaczonymi krawędziami ramy odniesienia. W razie potrzeby pokrój tkankę na połówki lub ćwiartki wzdłuż światła za pomocą ostrza, aby upewnić się, że sekcja naczynia mieści się w ramie o wymiarach 6,5 mm x 6,5 mm.
  15. Wyciąć 10 μm skrawki tkanki zgodnie z 3.12-3.14 na szkiełkach do optymalizacji tkanek lub ekspresji genów. Przenieś szkiełko do szkiełka umieszczonego na suchym lodzie. Przechowuj slajdy w temperaturze -80 °C przez okres do 4 tygodni przed przystąpieniem do publikowania protokołów przestrzennych33,34.

4. Analiza danych sekwencjonowania (szacowany czas: do 1 tygodnia w zależności od znajomości oprogramowania)

UWAGA: Tylko dla przestrzennej analizy transkryptomicznej, przejdź do kroku 4.8. Dane sekwencyjne scRNA są przetwarzane przy użyciu ustandaryzowanego potoku dostosowanego do ludzkiego transkryptomu referencyjnego hg38. Pakiet R Seurat (v3.2.2) służy do analizowania danych sekwencyjnych scRNA zgodnie z opublikowanymi wytycznymi40.

  1. Filtruj przy użyciu dobrze znanych wskaźników kontroli jakości: rzadkie komórki z bardzo dużą liczbą genów (potencjalnie wielokrotności) i komórki z wysokim procentem mitochondriów (komórki niskiej jakości lub umierające często wykazują zanieczyszczenie mitochondrialne) są usuwane.
  2. Normalizuj dane przy użyciu "sctransform", metody poprawiającej integrację próbki w porównaniu z normalizacją logarytmu. Te znormalizowane dane są używane do redukcji wymiarowości i grupowania, podczas gdy znormalizowane logarytmicznie poziomy ekspresji są używane do analizy na podstawie poziomów ekspresji genów, takich jak klasyfikacja typów komórek41.
  3. Wybierz geny markerowe dla każdego typu komórki, na przykład cząsteczkę adhezji komórek śródbłonka płytek krwi-1 (PECAM1) i czynnik von Willebranda (VWF) dla EC, lumikan (LUM) i prokolagen C-Endopeptidas Enhancer (PCOLCE) dla fibroblastów, gen translokacji komórek B 1 (BTG1) i CD52 dla makrofagów, C1QA i C1QB dla monocytów oraz łańcuch ciężki miozyny 11 (MYH11) i transgelina (TAGLN) dla komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych36.
  4. Oblicza średni poziom wyrażenia w pojedynczych komórkach między każdą parą markerów, aby mieć pojedynczy znacznik o średnim poziomie wyrażenia skojarzonym z każdą komórką type42.
  5. Zastosuj model mieszaniny Gaussa (GMM) z dwoma składnikami do danych ekspresji każdego markera w pojedynczych komórkach, aby rozdzielić komórki na dwa zestawy, a mianowicie o wysokiej ekspresji markera i niskiej ekspresji markera. W ten sposób dla każdego znacznika każda pojedyncza komórka jest przypisana do jednego z dwóch komponentów42.
  6. Użyj wzbogacenia statystycznego dla zestawu genów markerowych, dokładnego testu Fishera, aby przypisać typ komórki do każdego klastra. W ten sposób uzyskuje się zestaw wartości p dla każdego klastra, z których każda odpowiada typowi komórki. Typ komórki o najniższej wartości p jest przypisany do tego klastra.
  7. Przetwarzanie przestrzennych danych transkryptomicznych przy użyciu potoków Space Ranger, co skutkuje przestrzennym odkodowaniem kreskowym i generowaniem wskaźników kontroli jakości (QC), w tym całkowitych wyrównanych odczytów do ludzkiego transkryptomu hg38, mediany liczby unikalnego identyfikatora molekularnego (UMI) lub genów na spot35.
    UWAGA: Pakiet R Seurat (v3.2.2) jest używany do analizowania danych przetwarzanych przez Space Ranger zgodnie z opublikowanymi wytycznymi40.
  8. Normalizuj dane za pomocą "sctransform", metody, która, jak wykazano, poprawia dalszą analizę w porównaniu z normalizacją logarytmiczną, biorąc pod uwagę niejednorodność tkanki i bardzo wysoką wariancję zliczeń w plamach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza EC z tętnicy krezkowej za pomocą kombinacji mechanicznej i enzymatycznej dysocjacji lub kriokonserwacji do użycia w różnych dalszych testach jest przedstawiona tutaj (Rysunek 1). EC można profilować w tętnicach krezkowych, wykonując następujące kroki: A) mechaniczna dysocjacja od błony wewnętrznej połączona z trawieniem kolagenazy do komórek hodowlanych; B) wytwarzanie zawiesiny jednokomórkowej do sekwencjonowania scRNA; lub C) przekroje tętnicy mogą być osadzone w OCT w celu kriosekcji w celu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany przepływ pracy szczegółowo opisuje zestaw technik profilowania EC z pojedynczego fragmentu ludzkiej tętnicy z rozdzielczością jednokomórkową i przestrzenną. W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków i czynników ograniczających. Jednym z kluczy do profilowania transkryptomu jest świeżość tkanki i integralność RNA. Ważne jest, aby przed przetwarzaniem utrzymać tkanki na lodzie w jak największym stopniu, aby zminimalizować degradację RNA. Zazwyczaj tkanki pośmiertne są przetwarzane w okresie od 8 do 14 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.Z. jest założycielem i członkiem zarządu Genemo, Inc.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty NIH R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (dla Z.B.C.); DP1DK126138 i DP1HD087990 (do S.Z.); stypendium Fundacji Elli Fitzgerald oraz Wanek Family Project (dla Z.B.C.); oraz grant sieci nasion Human Cell Atlas (dla Z.B.C. i S.Z.). Badania opisane w tej publikacji obejmowały prace wykonane w Integrative Genomics Core w City of Hope wspieranym przez National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer P30CA033572. Autorzy chcieliby podziękować dr Ismailowi Al-Abdullahowi i dr Meirigeng Qi z zespołu transplantacji wysp trzustkowych w City of Hope za izolację tkanek ludzkich, dr Dongqiang Yuan z City of Hope za pomoc w analizie scRNA-seq oraz dr Marc Halushka z Division of Cardiovascular Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine za jego nieocenione spostrzeżenia na temat histologii naczyniowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroprobówka wirówkowa 1,5 mlUSA Scientific1615-5500
10 cm naczynieGenesee Scientific25-202
23G igłyBD305145
2-metylobutanThermo FisherAC327270010
40 µ m Filtr siatkowyFisher14100150
4200 System TapeStationAgilent TechnologiesG2991BA
Probówka 5 mlThermo Fisher14282300
6-dołkowa płytkaGreiner Bio-One07-000-208
Współczynnik przyłączeniaZastosowania komórek123-500Odczynnik przyłączeniowy w protokole
woskMożna użyć dowolnego komercyjnego czarnego wosku
Surowica bydlęca Albumina poddana szokowi cieplnemuFisherBP1600-100
CaCl2FisherBP510
WirówkaEppendorf
ChloroformFisherC607
Kolagenaza DRoche11088866001
KriostatSzczotki
Leica Cryostat
D-GlucoseFisherD16-1
DimetylosulfotlenekFisherMT25950CQC
Dispase IIRoche4942078001Proteaza pochodzenia bakteryjnego w protokole
Jednorazowe bezpieczne skalpeleMyco Instrumentation6008TR-10
D-PBSThermo Fisher14080055
EtanolFisherBP2818-4
Surowica bydlęca płoduFisher 10437028
Fisher267110
HEPESSigma AldrichH3375-100g
Bufor do próbek D1000 o wysokiej czułościAgilent Technologies5067-5603
Taśma sitowa D1000 o wysokiej czułościInkubator
C 5% CO2
IsopropanolFisherBP26324
KClFisherP217-3
Ciekły azot
Medium 199Sigma AldrichM2520-10X
Kanister
MikroskopLeicaDo oceny morfologii komórki
Pożywka do hodowli śródbłonka mikronaczyniowegoZastosowania komórkowe111-500
NaClFisherS271-1
New Brunswick Innova 44/44R Wytrząsarka orbitalnaEppendorf
Optymalna temperatura cięcia związekFisher4585
Krioformy plastikoweFisher22363553
Taśmasitowa RNAAgilent Technologies5067-5576
Ekran RNA Bufor próbki taśmyAgilent Technologies5067-5577
RNase ZAPThermo FisherAM9780
Woda wolna od RNazTakaraRR036BWoda wolna od RNaz (2) w zestawie
Sterylne kleszcze długie 12"FST91100-16
Sterylne kleszcze drobneFST11050-10
Sterylne cienkie nożyczkiFST14061-11
Superfrost PLUS Gold SlidesOdczynnik Fisher1518848
TRIzolFisher15596018
Trypan BlueCorningMT25900CI
TrypLE Express Enzyme (1X) czerwień fenolowaThermo Fisher12605010Enzym dysocjacji komórek w protokół
Zestaw akcesoriów Visium10X GenomicsPN-1000215
Pakiet bramki Visium, 2rxns10X GenomicsPN-1000316
Slajd do przestrzennej ekspresji genów Visium i Zestaw odczynników, 4 rxns10X GenomicsPN-1000184
Hemocytometr Agilent Technologies 5067-5584 Utrzymywany w temperaturze 37 stopni;metalowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
  2. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  3. Hillen, H. F., Melotte, V., van Beijnum, J. R., Griffioen, A. W. Endothelial cell biology. Angiogenesis Assays: A Critical Appraisal of Current Techniques. , John Wiley & Sons. Chichester, West Sussex, UK. 1-38 (2007).
  4. Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
  5. Kalucka, J., et al. Single-cell transcriptome atlas of murine endothelial cells. Cell. 180 (4), 764-779 (2020).
  6. Tang, X., et al. Suppression of endothelial AGO1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
  7. Ni, C. W., Kumar, S., Ankeny, C. J., Jo, H. Development of immortalized mouse aortic endothelial cell lines. Vascular Cell. 6 (1), 7(2014).
  8. Kalluri, A. S., et al. Single-cell analysis of the normal mouse aorta reveals functionally distinct endothelial cell populations. Circulation. 140 (2), 147-163 (2019).
  9. Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nature Medicine. 25, 1280-1289 (2019).
  10. Widyantoro, B., et al. Endothelial cell-derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition. Circulation. 121 (22), 2407-2418 (2010).
  11. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
  12. Stuart, T., Satija, R. Integrative single-cell analysis. Nature Reviews Genetics. 20, 257-272 (2019).
  13. Paik, D. T., et al. Single-cell RNA sequencing unveils unique transcriptomic signatures of organ-specific endothelial cells. Circulation. 142 (19), 1848-1862 (2020).
  14. Palikuqi, B., et al. Adaptable haemodynamic endothelial cells for organogenesis and tumorigenesis. Nature. 585 (7825), 426-432 (2020).
  15. The Tabula Muris Consortium. et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  16. Hezroni, H., et al. Principles of long noncoding RNA evolution derived from direct comparison of transcriptomes in 17 species. Cell Reports. 11 (7), 1110-1122 (2015).
  17. Washietl, S., Kellis, M., Garber, M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals. Genome Research. 24 (4), 616-628 (2014).
  18. Chen, J., et al. Evolutionary analysis across mammals reveals distinct classes of long non-coding RNAs. Genome Biology. 17 (19), 19(2016).
  19. Drake, B. L., Loke, Y. W. Isolation of endothelial cells from first trimester decidua using immunomagnetic beads. Human Reproduction. 6, 1156-1159 (1991).
  20. McDouall, R. M., Yacoub, M., Rose, M. L. Isolation, culture and characterization of MHC class II-positive microvascular endothelial cells from the human heart. Microvascular Research. 51, 137-152 (1996).
  21. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protocols. 2 (2), 100489(2021).
  22. Springhorn, J. P., Madri, J. A., Squinto, S. P. Human capillary endothelial cells from abdominal wall adipose tissue: isolation using an anti-pecam antibody. In Vitro Cellular Developmental Biology Animal. 31 (6), 473-481 (1995).
  23. Hewett, P. W., Murray, J. C. Immunomagnetic purification of human microvessel endothelial cells using Dynabeads coated with monoclonal antibodies to PECAM-1. European Journal of Cell Biology. 62 (2), 451-454 (1993).
  24. Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nature Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
  25. Maynard, K. R., et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex. Nature Neuroscience. 24 (3), 425-436 (2021).
  26. Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
  27. Bäckdahl, J., et al. Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin. Cell Metabolism. 33 (9), 1869-1882 (2021).
  28. Wang, J., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  29. Codeluppi, S., et al. Spatial organization of the somatosensory cortex revealed by osmFISH. Nature Methods. 15, 932-935 (2018).
  30. Eng, C. H. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568, 235-239 (2019).
  31. Eng, C. H. L., Shah, S., Thomassie, J., Cai, L. Profiling the transcriptome with RNA SPOTs. Nature Methods. 14, 1153-1155 (2017).
  32. Rodriques, S. G., et al. Slide-seq: a scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
  33. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  34. Rao, A., et al. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
  35. Sachidanandam, K., et al. Differential effects of diet-induced dyslipidemia and hyperglycemia on mesenteric resistance artery structure and function in type 2 diabetes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 328 (1), 123-130 (2009).
  36. Calandrelli, R., et al. Stress-induced RNA-chromatin interactions promote endothelial dysfunction. Nature Communications. 11 (1), 5211(2020).
  37. Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in Type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), 23337(2011).
  38. Asterholm, I., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
  39. Marin, V., et al. Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 254 (1-2), 183-190 (2001).
  40. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  41. Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biology. 20 (1), 296(2019).
  42. Bonnycastle, L. L., et al. Single-cell transcriptomics from human pancreatic islets: sample preparation matters. Biology Methods Protocols. 5 (1), (2020).
  43. Espitia, O., et al. Implication of molecular vascular smooth muscle cell heterogeneity among arterial beds in arterial calcification. PLoS One. 13 (1), 0191976(2018).
  44. Engelbrecht, E., et al. Sphingosine 1-phosphate-regulated transcriptomes in heterogenous arterial and lymphatic endothelium of the aorta. eLife. 9, 52690(2020).
  45. Hu, H., et al. Single-cell transcriptomic atlas of different human cardiac arteries identifies cell types associated with vascular physiology. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1408-1427 (2021).
  46. van Beijnum, J., et al. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  47. Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nature Communications. 12 (1), 1088(2021).
  48. Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nature Protocols. 15 (4), 1484-1506 (2020).
  49. Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell RNA-Seq data. Science Advances. 7 (16), (2020).
  50. Sanchez-Ferras, O., et al. A coordinated progression of progenitor cell states initiates urinary tract development. Nature Communications. 12 (1), 2627(2021).
  51. Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nature Communications. 12 (1), 1771(2021).
  52. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
  53. Moffit, J. R., et al. High-throughput MERFISH. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 11046-11051 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mesenteric ArteryCell IsolationTranscriptome ProfilingSingle Cell RNASpatial TranscriptomicsCell ViabilityImmunofluorescence StainingRNA ExtractionHematoxylin Eosin Staining

Powiązane artykuły