Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Solidne różnicowanie ludzkich iPSC w czystą populację adipocytów w celu zbadania zaburzeń związanych z adipocytami

4.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63311

⸱

9 lutego 2022

 ,  , 
1Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI), Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF), 2College of Health and Life Sciences, Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół pozwala na generowanie czystej populacji adipocytów z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Kwas retinowy służy do różnicowania iPSC w mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), które są wykorzystywane do produkcji adipocytów. Następnie stosuje się podejście sortowania oparte na barwieniu czerwienią nilową w celu uzyskania czystych adipocytów.

Streszczenie

Ostatnie osiągnięcia w technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) pozwoliły na generowanie różnych typów komórek, w tym adipocytów. Jednak obecne metody różnicowania mają niską skuteczność i nie wytwarzają jednorodnej populacji adipocytów. Tutaj obchodzimy ten problem, stosując metodę opartą w całości na retinoe trans do produkcji mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) z wysoką wydajnością. Regulując szlaki rządzące proliferacją, przeżyciem i adhezją komórek, nasza strategia różnicowania umożliwia wydajne generowanie ciał embrionalnych (EB), które różnicują się w czystą populację multipotencjalnych MSCs. Duża liczba MSCs generowanych tą metodą stanowi idealne źródło do generowania adipocytów. Wyzwaniem pozostaje jednak niejednorodność próbki wynikająca z różnicowania adipocytów. Dlatego zastosowaliśmy metodę opartą na czerwieni nilowej do oczyszczania dojrzałych adipocytów zawierających lipidy za pomocą FACS. Ta strategia sortowania pozwoliła nam ustalić niezawodny sposób modelowania zaburzeń metabolicznych związanych z adipocytami przy użyciu puli adipocytów o zmniejszonej niejednorodności próbki i zwiększonej funkcjonalności komórek.

Wprowadzenie

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) działają jako efektywny zasób przejściowy do produkcji komórek pochodzenia mezodermalnego, takich jak adipocyty, osteocyty i chondrocyty, które mogą być dalej wykorzystywane do modelowania ich odpowiednich zaburzeń genetycznych. Jednak poprzednie podejścia opierały się na pozyskiwaniu tych MSCs z dorosłych tkanek 1, co wiązało się z wyzwaniem uzyskania ich w dużej liczbie od dawców oraz ograniczeniem utrzymania ich funkcjonalnej żywotności w nieoptymalnych warunkach hodowli in vitro1,2. Przeszkody te spowodowały duże zapotrzebowanie na posiadanie protokołu do wytwarzania MSC in vitro. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) mogą być wykorzystywane jako cenne źródło MSCs, wykazując cechy MSC3,4,5. MSCs pochodzące z iPSC mogą być stosowane jako opcja terapeutyczna w wielu chorobach. Ponadto zdolność MSC pochodzących z iPSC do generowania adipocytów sprawia, że są one cennym modelem ludzkim in vitro do badania ludzkiej adipogenezy, otyłości i zaburzeń związanych z adipocytami.

Obecne protokoły różnicowania adipocytów można podzielić na dwie grupy, z których jedna obejmuje różnicowanie adipocytów za pomocą chemicznych lub białkowych koktajli, co daje wynikową wydajność 30%-60%6,7,8,9, podczas gdy drugi obejmuje manipulację genetyczną w celu solidnej indukcji kluczowych czynników transkrypcyjnych regulujących rozwój adipocytów, aby uzyskać wydajność 80%-90%10,11. Jednak manipulacja genetyczna nie podsumowuje naturalnego procesu różnicowania adipocytów i często maskuje subtelne paradygmaty pojawiające się podczas adipogenezy, co czyni ją nieskuteczną dla celów modelowania chorób12,13. Dlatego przedstawiamy sposób na sortowanie dojrzałych adipocytów pochodzenia chemicznego od niedojrzałych poprzez fluorescencyjne znakowanie adipocytów zawierających lipidy za pomocą czerwieni nilowej.

Tutaj prezentujemy protokół polegający na przejściowej inkubacji ciał embrionalnych pochodzących z iPSC (EBs) z kwasem all-trans retinowym w celu wytworzenia dużej liczby szybko proliferujących MSCs, które mogą być dalej wykorzystywane do generowania adipocytów14. Przedstawiamy również sposób sortowania dojrzałych adipocytów pochodzenia chemicznego z puli różnicowania heterogenicznego poprzez fluorescencyjne znakowanie ich kropelek lipidów za pomocą barwnika lipofilowego; Nil czerwony. Pozwoliłoby to na wygenerowanie czystej populacji dojrzałych adipocytów o zwiększonej funkcjonalności w celu dokładnego modelowania zaburzeń metabolicznych związanych z adipocytami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone przez odpowiednią instytucjonalną komisję etyki badań i przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1964 roku i jej późniejszymi poprawkami lub porównywalnymi standardami etycznymi. Protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (IRB) HMC (nr 16260/16) i QBRI (nr 2016-003). Ta praca jest również zoptymalizowana pod kątem hESC, takich jak H1 i H9. Próbki krwi pobrano od osób zdrowych za pełną świadomą zgodą. iPSC są generowane z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) zdrowych osób.

1. Hodowla i utrzymanie iPSC

  1. Przygotować płyty pokryte membraną podstawną, odtwarzając matrycę powłoki w knockout-DMEM w stosunku 1:80 i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować pożywkę hodowlaną iPSC, dodając 50 ml 10 pożywek uzupełniających komórki macierzyste do 500 ml pożywki bazowej komórek macierzystych wraz z 5 ml 100 pożywki penicyliny-streptomycyny (P/S) i przechowywać w temperaturze 4 °C przez krótki czas lub w temperaturze -20 °C przez długi czas.
  3. Wyłożyć płytki matrycą powlekającą-1 ml dla płytki 6-dołkowej, 500 μl dla płytki 12-dołkowej, 250 μl dla płytki 24-dołkowej i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny.
  4. Przed użyciem usunąć podwielokrotność pożywki hodowlanej iPSC i wstępnie ogrzać ją w temperaturze pokojowej.
  5. Rozmrozić fiolkę z iPSC (ESC lub iPSC) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2-3 ml pożywki hodowlanej.
  6. Odwirować probówkę o sile 120 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej (RT-23 °C).
  7. Usunąć supernatant i dodać 2 ml świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej 10 μM inhibitorem ROCK (Y-27632). Umieścić komórki w jednym dołku na pokrytej matrycą płytce 6-dołkowej i umieścić płytkę w temperaturze 37 °C.
  8. Po 24 godzinach wyjmij pożywkę i zastąp ją świeżą pożywką hodowlaną.
  9. Zmieniaj pożywkę codziennie, aż komórki osiągną zbieżność 80%-90%.
  10. Po osiągnięciu konfluencji przejdź komórki, wykonując czynności opisane poniżej.
    1. Usuń pożywkę i umyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
    2. Dodać odczynnik dysocjacyjny iPSC (patrz tabela materiałów) – 500 μl dla dołka na płytce 6-dołkowej, 250 μl dla dołka na płytce 24-dołkowej – i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37 °C.
    3. Usunąć odczynnik dysocjacyjny i inkubować komórki na sucho przez 1 minutę w temperaturze 37 °C.
    4. Zebrać komórki za pomocą pożywki hodowlanej - 1 ml dla dołka na płytce 6-dołkowej i 250 μl dla dołka na płytce 24-dołkowej - w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 120 x g przez 4 min.
    5. Ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej-2 ml dla dołka na płytce 6-dołkowej i 500 μl dla dołka z 24-dołkową płytką uzupełnioną 10 μM inhibitorem ROCK i umieścić je na świeżych płytkach pokrytych matrycą przy 40% zbiegu.

2. Różnicowanie iPSC na MSC

  1. Przygotować pożywkę różnicującą MSC, dodając 15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% P/S do DMEM + pirogronianu o niskiej stężeniu glukozy i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Po osiągnięciu 80% konfluencji użyj iPSC do tworzenia ciała zarodka (EB), postępując zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
    1. Przemyć komórki DPBS i inkubować je z pożywką dysocjacyjną/EDTA-500 μl dla dołka na płytce 6-dołkowej, 250 μl dla dołka na płytce 24-dołkowej.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 minutę, odessać odczynnik dysocjacyjny i utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C przez dodatkowy 1 minutę. Aby rozpocząć różnicowanie MSC, wymagane jest ~10-12 x 106 komórek.
    3. Zebrać komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml za pomocą pożywki hodowlanej. Upewnij się, że jesteś bardzo delikatny podczas zbierania, aby zapobiec pojedynczemu tworzeniu się komórek i umożliwić tworzenie się EB. Odwirować komórki przy 120 x g przez 4 min.
    4. Zawiesić komórki w 3 ml pożywki różnicującej MSC zawierającej 10 μM inhibitora ROCK.
    5. Wymieszaj i rozprowadź 0,5 ml/dołek w 24-dołkowej płytce o bardzo niskim mocowaniu.
      UWAGA: Użycie bardzo niskiej płytki mocującej zachęciłoby do agregacji komórek w EB, a nie do ich przyczepienia na powierzchni.
    6. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  3. Po 24 godzinach wywołaj uzyskane EB za pomocą leczenia wysokim kwasem retinowym (RZS), postępując zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
    1. Dodać 10 μM RA do 3 ml pożywki różnicującej MSC. Zbierz EB do probówki o pojemności 15 ml i pozwól im osiąść przez 15 minut.
    2. Usunąć supernatant z EB i dodać pożywkę różnicującą MSC uzupełnioną 10 μM RA.
    3. Delikatnie zawiesić i rozprowadzić 0,5 ml / dołek w tej samej 24-dołkowej płytce o bardzo niskim nasadce.
    4. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Nie przeszkadzaj EBs przez następne 48 godzin.
    5. Po 48 godzinach zbierz EB do probówki o pojemności 15 ml i pozwól im osiąść przez 15 minut.
    6. Usunąć supernatant z EB i dodać pożywkę różnicującą MSC uzupełnioną 0,1 μM RA.
    7. Delikatnie zawiesić i rozprowadzić 0,5 ml / dołek w tej samej 24-dołkowej płytce o bardzo niskim nasadce.
    8. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Nie przeszkadzaj EBs przez następne 48 godzin.
  4. Usuń RA dodany do komórek, wykonując czynności opisane poniżej.
    1. Po 48 godzinach od ostatniego zabiegu RZS należy pobrać EB i pozostawić je na 15 minut.
    2. Usunąć supernatant i dodać pożywkę DMEM o niskiej zawartości glukozy bez cytokin.
    3. Delikatnie zawiesić i rozprowadzić 0,5 ml/dołek w 24-dołkowej płytce o bardzo niskim nasadce. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  5. Na płytce należy umieścić EB pochodzące z iPSC, wykonując czynności opisane poniżej.
    1. Po upływie 48 godzin od poprzedniego kroku (krok 2.4) zebrać EB do probówki o pojemności 15 ml i pozostawić na 15 minut.
    2. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 2 ml świeżej pożywki różnicującej MSC.
    3. Przenieść do dwóch dołków 6-dołkowej płytki pokrytej membraną podstawną, pokrytej matrycą.
    4. Zmieniaj nośnik co drugi dzień przez dodatkowe 5 dni.
    5. Po 5 dniach usuń zużytą pożywkę i zastąp ją świeżą pożywką różnicującą MSC zawierającą 2,5 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF).
  6. Przejdź przez platerowane EB, gdy osiągną zbieżność 80%-90%, wykonując czynności opisane poniżej.
    1. Przemyć komórki DPBS, dodać trypsynę-EDTA-500 μl do dołka z 6-dołkową płytką i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
    2. Zebrać komórki za pomocą pożywki różnicującej MSC w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze 750 x g przez 4 minuty.
    3. Zawiesić w pożywce różnicującej MSC z 2,5 ng/ml bFGF i ułożyć komórki na płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej w stosunku 1:3.
    4. Powtórz przejście, gdy komórki osiągną zbieg 70%-80%. Oczekuje się, że zyska 3-6 milionów komórek przez 2-3 przejścia.

3. Analiza metodą cytometrii przepływowej MSC pochodzących z iPSC

UWAGA: Po przejściu 2-3 przejść, komórki powinny być dostępne dla efektywności różnicowania MSC. Różnicowanie zostanie uznane za udane, jeśli komórki wyrażają markery różnicowania MSC-CD44, CD73, CD90 i CD105 z ponad 90% wydajnością i nie wyrażają wysokich poziomów markerów krwiotwórczych - CD14, CD19, CD34 i CD45. Dostęp do wydajności tych markerów można uzyskać, wykonując poniższe czynności.

  1. Przejść przez komórki, wykonując czynności opisane powyżej (krok 2.6) i uzyskać 1 x 105 komórek w jednym dołku 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.
  2. Odwirować płytkę o sile 375 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.
  3. Zawiesić 1 x 105 komórek w 100 μl zimnego DPBS z 1 μl sprzężonego przeciwciała (Ab) (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30-40 minut, zapobiegając ekspozycji na światło.
  4. Zawiesić kolejne 1 x 105 komórek w 100 μl zimnego DPBS z odpowiednią kontrolą izotypową sprzężonego Ab w stężeniu 1:100 ) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30-40 minut, zapobiegając ekspozycji na światło.
  5. Po inkubacji odwirować płytkę o masie 375 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant przez potrząśnięcie płytką nad zlewem.
  6. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl zimnego DPBS.
  7. Odwirować komórki w temperaturze 375 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  8. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl zimnego DPBS i zebrać w ciemnych, zimnych probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml i trzymać je na lodzie do czasu analizy przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS).
  9. W przypadku analizy FACS rozmieść ogniwa przy użyciu rozpraszania bocznego (SSC-A) i rozpraszania do przodu (FSC-A), aby wykluczyć zanieczyszczenia. Ponadto rozmieść bramkowane komórki, używając wysokości rozproszenia do przodu (FSC-H) w porównaniu z obszarem rozproszonym do przodu (FSC-A), aby odróżnić pojedyncze punkty od dubletów z populacji żywych komórek.
    UWAGA: Komórki bramkowano względem przesunięcia kontroli izotypu dla każdego markera, a do analizy wykorzystano co najmniej 10 000 zdarzeń bramkowanych z każdej barwionej próbki.

4. Różnicowanie MSCs w adipocyty

  1. Przygotować podstawowe podłoże do różnicowania adipocytów, dodając 10% zamiennik surowicy nokautującej (KOSR), 1% glutaminy, 1% P/S, 4,5 ng/μL glukozy do minimalnej niezbędnej pożywki (MEM)-alfa i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Pozwól MSCs osiągnąć konfluencję powyżej 90%. Kontynuuj ich hodowlę przez kolejne 48 godzin, aby umożliwić im przejście okresu zatrzymania wzrostu.
  3. Przygotować kompletną pożywkę do różnicowania adipocytów, dodając 100 μg/ml 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX), 1 μM deksametazonu, 0,2 U/ml insuliny, 100 μM indometacyny i 10 μM rozyglitazonu do podłoża podstawowego.
  4. Usunąć pożywkę różnicującą MSC i umyć komórki za pomocą DPBS.
  5. Dodać pełną pożywkę do różnicowania adipocytów - 2 ml dla dołka na płytce 6-dołkowej i 1 ml dla dołka na płytce 12-dołkowej - i inkubować komórki w temperaturze 37 °C. Zmieniaj pożywkę do całkowitego różnicowania co drugi dzień przez 14 dni.

5. Ocena efektywności różnicowania adipocytów

  1. W 14 dniu różnicowania sprawdź skuteczność różnicowania poprzez barwienie komórek pod kątem markerów dojrzewania adipocytów, FABP4 i adiponektyny.
  2. Usuń pożywkę i umyj komórki DPBS.
  3. Utrwalić komórki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) - 200 μl w dołku na 24-dołkowej płytce - i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  4. Wyrzuć PFA i przemyj solą fizjologiczną z 0,5% teen (TBST) i umieść na shakerze w temperaturze pokojowej na 15 minut. Powtórz proces dwukrotnie.
  5. Utrwalone komórki przepuścić roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami z 0,5% Triton X-100 (PBST) i umieścić na wytrząsarce w temperaturze pokojowej na 15-20 minut.
  6. Odrzucić PBST i dodać bufor blokujący (5%-6% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBST) - 500 μl dla studzienki na płytce 6-dołkowej i 250 μl dla studzienki z płytką 12-dołkową - i inkubować w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przez 40-60 minut.
  7. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko FABP4, adiponektynie w 2%-3% BSA, w stężeniu 1:500 (patrz tabela materiałów). Dodać te przeciwciała do siebie tylko wtedy, gdy są hodowane u różnych zwierząt i umieścić płytkę na wytrząsarce w temperaturze 4 °C przez noc.
  8. Usuń przeciwciała pierwszorzędowe i umyj komórki trzykrotnie TBST (po 15 minut) i umieść je na shakerze w temperaturze pokojowej.
  9. Przygotuj przeciwciała drugorzędowe Alexa Fluor w PBST (1:500). Inkubować komórki w drugorzędowych kombinacjach przeciwciał (zgodnie z gatunkami, w których hoduje się przeciwciało pierwszorzędowe) przez 60 minut w temperaturze pokojowej i przykryć płytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem.
  10. Wyrzucić przeciwciała drugorzędowe, przemyć trzykrotnie TBST i umieścić płytkę na shakerze.
  11. Aby wybarwić jądra, dodać 1 μg/ml Hoechst 33342-200 μl do dołka z 24-dołkową płytką rozcieńczoną w PBS i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Odrzucić roztwór Hoechsta i dodać PBS-500 μl do dołka z 24-dołkową płytką do komórek. Utrzymuj płytki przykryte przed światłem do czasu wizualizacji za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.

6. Sortowanie adipocytów za pomocą czerwieni nilowej

  1. Przygotować roztwór roboczy czerwieni nilowej, dodając 1 mg/ml roztworu podstawowego czerwieni nilowej w DMSO i przechowywać w temperaturze -20 °C. Bezpośrednio przed użyciem rozmrozić czerwony wywar Nilowy i rozpuścić go w DPBS do uzyskania stężenia roztworu roboczego 300 nM.
  2. W 14 dniu różnicowania adipocytów lub po nim wyrzuć pożywkę z komórek i przemyj za pomocą DPBS.
  3. Dodać czerwony roztwór roboczy Nilu -1 ml do studzienki z 6-dołkową płytką i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
  4. Usunąć roztwór czerwieni nilowej i dodać trypsynę-EDTA -500 μl do studzienki z 6-dołkową płytką i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 minuty.
  5. Zebrać komórki za pomocą DMEM zawierającego 5% FBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Wirować przy 750 x g przez 4 min.
  6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w DPBS-1 ml dla 1 x 106 komórek. Wirować przy 750 x g przez 4 min.
  7. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w DPBS-1 ml dla 1 x 106 komórek. Użyj sortera FACS, aby wyizolować czerwone komórki Nilu za pomocą kanału FL1.
  8. Ponownie hoduj posortowane komórki w pożywkach różnicujących adipocyty lub zbierz posortowane komórki w celu izolacji RNA i białka.
  9. Wyekstrahuj RNA z posortowanych komórek i przeprowadź względną analizę ilościową markerów różnicowania adipocytów, w tym FABP4, PPARG i C/EBPA. Komórki czerwono-dodatnie Nilu wykazują znaczną regulację ekspresji genów co najmniej dwukrotnego wzrostu w porównaniu z komórkami niesortowanymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat i morfologia komórek podczas różnicowania mezenchymalnego: Różnicowanie iPSC w MSC obejmuje różne etapy rozwoju, obejmujące formowanie EB, różnicowanie w MSC oraz ekspansję MSC (Rycina 1). Podczas tych etapów rozwoju komórki przyjmują różną morfologię ze względu na różne substancje stymulujące, którym są poddawane. Po zainicjowaniu różnicowania komórki są wysiewane w zawiesinie i powinny być okrągłe, z wyraźnymi granicami komórkowymi, o średnicy od małej do średniej (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten ma ogromne znaczenie ze względu na jego zdolność do dostarczania MSCs o wysokiej wydajności i wydajności. Ta masowa produkcja MSCs była możliwa dzięki przejściowej inkubacji EB pochodzących z iPSC z 10 μM RA14,15. Przejściowe leczenie 10 μM RZS zwiększyło wydajność MSC od 11,2 do 1542 razy14,15, przy czym protokół ten ma zastosowanie zarówno do iPSC, jak i hPSC. Przy tej dawce i czasie trwani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana z grantu z Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi była wspierana przez stypendium GSRA z Qatar National Research Fund (QNRF).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AdiponektynaAbcamab22554Marker dojrzewania adipocytów
anty-CD105BD Pharmingen560839Marker różnicowania MSC
anty-CD14Pharmingen561712Marker różnicowania MSC
anty-CD19Pharmingen555415Marker różnicowania MSC
anty-CD34BD Pharmingen555824Marker różnicujący
MSC anty-CD44abcamab93758Marker różnicujący MSC
anty-CD45BD Pharmingen
560975		Marker różnicowania MSC
anty-CD73BD Pharmingen550256Marker różnicowania MSC
anty-CD90BD Pharmingen555596Marker różnicowania MSC
bFGFR& D233-FPSuplement do pożywek hodowlanych MSC
C/EBPAAbcamab40761Marker dojrzewania adipocytów
DexamethasoneTorics1126Suplement pożywki różnicującej adipocyty
FABP4Abcamab93945Marker dojrzewania adipocytów
Surowica bydlęca płoduThermoFisher10082147Suplement pożywki hodowlanej MSC
GlutamaxThermoFisher35050-061Suplement pożywki hodowlanej MSC
IBMXSigma AldrichI5879Suplement pożywek różnicujących adipocyty
IndometacynaSigma AldrichI7378Suplement pożywki różnicującej adipocyty
Insulina Sigma Aldrich91077CSuplement pożywki różnicującej adipocyty
Nokaut DMEMThermoFisher12660012Pożywka bazowa do przygotowania matrigelu
DMEM o niskiej zawartości glukozyPożywkaThermoFisher11885084
MatrigelCorning354230Matryca powlekająca
MEM-alfaThermoFisher12561056Pożywki różnicujące adipocyty
NileredSigma Aldrich19123Marker sortujący dla adipocytów
PenicylinaThermoFisher15140122Suplement pożywki MSC/Adipocyte
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiBuforpłukania14190144
ThermoFisher Pierce™ 20X TBS Bufordo płukaniaThermo Fisher28358
PPARGCell Signaling Technology2443Marker dojrzewania adipocytów
ReLeSRStem Cell Technologie5872Odczynnik dysocjacyjny
Kwas retinowySigma AldrichR2625MSC Suplement pożywek różnicujących
Inhibitor skałTocris1254/10hPSC suplement do pożywek
hodowlanych RoziglitazonSigma AldrichR2408Suplement do różnicowania adipocytów
StemFlexThermoFisherA334901hPSC pożywka hodowlana
TritonThermo Fisher28314Odczynnik do permebealizacji
TrypsynaThermoFisher25200072Odczynnik dysocjacyjny
Tween 20Sigma AldrichP7942Bufor do płukania
hodowlana MSC do

Bibliografia

  1. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12(2011).
  2. Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846(2009).
  3. Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
  4. Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
  5. Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161(2005).
  6. Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
  7. Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
  8. van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
  9. Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
  10. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  11. Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
  12. Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
  13. Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
  14. Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
  15. Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2020).
  16. Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
  17. Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
  18. Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
  19. di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1(2015).
  20. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
  21. De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6(2018).
  22. Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932(2018).
  23. Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, Pt 3 607-613 (2003).
  24. Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
  25. Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
  26. Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
  27. Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
  28. Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
  29. Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
  30. Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
  31. Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785(2012).
  32. Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536(2018).
  33. Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
  34. Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
  35. Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
  36. Lapid, K., Graff, J. M. Form(ul)ation of adipocytes by lipids. Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).
  37. Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
  38. Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
  39. Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

R nicowanie ludzkich iPSCmezenchymalne kom rki macierzyster nicowanie adipocyt wsortowanie Nile Redczysta populacja adipocyt wcia a embrionalnesortowanie FACSmarkery dojrzewania adipocyt wadipocyty zawieraj ce lipidy
Solidne różnicowanie ludzkich iPSC w czystą populację adipocytów w celu zbadania zaburzeń związanych z adipocytami
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.