Artykuł metodologiczny

System mikrofizjologiczny do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka podczas stanu zapalnego

DOI:

10.3791/63312

⸱

9 grudnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, Temple University, 2Department of Bioengineering, Temple University, 3Department of Bioengineering, University of Toledo, 4Biomedical Technology, CFD Research Corporation, 5Center for Inflammation and Lung Research, Department of Microbiology, Immunology and Inflammation, Lewis Katz School of Medicine, Temple University, 6Department of Radiation Oncology, Lewis Katz School of Medicine, Temple University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole, do badania interakcji między komórkami leukocytów w chorobie zapalnej stosuje się biomimetyczne badanie mikropłynów, które może odtworzyć fizjologicznie istotne środowisko mikrokrążenia i odtworzyć całą kaskadę adhezji/migracji leukocytów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje między komórkami leukocytów i śródbłonka odgrywają ważną rolę w chorobach zapalnych, takich jak sepsa. Podczas stanu zapalnego nadmierna migracja aktywowanych leukocytów przez śródbłonek naczyń do kluczowych narządów może prowadzić do niewydolności narządów. Opracowano i zwalidowano fizjologicznie istotny biomimetyczny test mikroprzepływowy (bMFA) przy użyciu kilku technik eksperymentalnych i obliczeniowych, które mogą odtworzyć całą kaskadę toczenia/adhezji/migracji leukocytów w celu zbadania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka. Sieci mikronaczyniowe uzyskane z obrazów in vivo u gryzoni zdigitalizowano przy użyciu podejścia Systemu Informacji Geograficznej (GIS) i zmikrofabrykowano za pomocą polidimetylosiloksanu (PDMS) na szkiełku mikroskopowym. Aby zbadać wpływ szybkości ścinania i topologii naczyń krwionośnych na interakcje między leukocytami a komórkami śródbłonka, opracowano model obliczeniowej dynamiki płynów (CFD) w celu wygenerowania odpowiedniej mapy szybkości ścinania i prędkości w całej sieci. bMFA umożliwia ilościowe określenie interakcji leukocytów-komórek śródbłonka, w tym prędkości toczenia, liczby przylegających leukocytów w odpowiedzi na różne szybkości ścinania, liczby migrowanych leukocytów, przepuszczalności komórek śródbłonka, ekspresji cząsteczek adhezyjnych i innych ważnych zmiennych. Ponadto, dzięki wykorzystaniu próbek pochodzących od ludzi, takich jak ludzkie komórki śródbłonka i leukocyty, bMFA zapewnia narzędzie do szybkich badań przesiewowych potencjalnych środków terapeutycznych w celu zwiększenia ich klinicznej translacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stan zapalny jest reakcją gospodarza na infekcję i uraz, a śródbłonek odgrywa ważną rolę w reakcji zapalnej1,2,3. Rozregulowanie stanu zapalnego jest podstawową przyczyną wielu patologii chorobowych, takich jak sepsa, choroby układu krążenia, astma, nieswoiste zapalenie jelit, rak i COVID-19. Interakcje między leukocytami a komórkami śródbłonka odgrywają kluczową rolę w tych chorobach zapalnych. Podczas stanu zapalnego uwalnianie PAMPS (wzorców molekularnych związanych z patogenami) z patogenów lub DAMPS (wzorców molekularnych związanych z uszkodzeniem) z uszkodzonych tkanek aktywuje komórki odpornościowe do uwalniania cytokin/chemokin i innych mediatorów prozapalnych, które prowadzą do aktywacji śródbłonka, co powoduje zmiany w funkcji bariery śródbłonka naczyń krwionośnych i zwiększoną przepuszczalność3,4. Zwiększona aktywacja komórek śródbłonka podczas stanu zapalnego powoduje zwiększoną interakcję leukocytów-komórek śródbłonka, co prowadzi do nadmiernej migracji aktywowanych leukocytów przez śródbłonek naczyń do kluczowych narządów1,5,6,7.

Rekrutacja leukocytów jest inicjowana przez chemicznie zróżnicowane chemoatraktanty złożone z bioaktywnych lipidów, cytokin, chemokin i składników dopełniacza8,9. Rekrutacja leukocytów to wieloetapowy proces, który obejmuje pięć odrębnych etapów: 1) marginesowanie i wychwytywanie/przyłączanie leukocytów, 2) toczenie, 3) mocne zatrzymanie, 4) rozprzestrzenianie się i pełzanie oraz 5) wynaczynienie/migracja (Rysunek 1). Każdy etap tego procesu wymaga przesłuchu między leukocytami a komórkami śródbłonka w celu zaaranżowania tego dynamicznego zjawiska1,9. Ostatecznie zatrzymane leukocyty wynaczyniają się do tkanek objętych stanem zapalnym w śródbłonku w wieloetapowym procesie kontrolowanym przez równoczesne sygnały zależne od chemoatraktantu, zdarzenia adhezyjne i hemodynamiczne siły ścinające1,9,10,11,12.

Biorąc pod uwagę centralną rolę stresu ścinającego w regulacji funkcji komórek śródbłonka oraz znaczenie interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka13, w ciągu ostatnich kilku dekad opracowano kilka modeli in vitro do badania różnych aspektów kaskady migracji leukocytów w bardziej kontrolowanym środowisku14. Tradycyjne urządzenia fluidyczne do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka można podzielić na dwie szerokie kategorie14: a) urządzenia do badania toczenia leukocytów, adhezji i ekspresji cząsteczek adhezyjnych, takie jak równoległe komory przepływu płytkowego oraz b) urządzenia do badania migracji leukocytów w warunkach statycznych, takich jak komory transwell. Systemy takie jak równoległe komory przepływowe zostały wykorzystane do zbadania roli cząsteczek adhezyjnych i ich ligandów w kaskadzie adhezji pod wpływem sił ścinających15. Jednak istotną wadą jest to, że te uproszczone, wyidealizowane urządzenia (np. kanał prosty) nie są w stanie odtworzyć skali i geometrii mikrokrążenia in vivo (np. Kolejne rozwidlenia naczyń, morfologia naczyń) i wynikające z nich warunki przepływu (np. zbiegające się lub rozchodzące się przepływy w rozwidleniach). W rezultacie, urządzenia te mogą jedynie modelować adhezję, ale nie transmigrację. Komory Transwell mogą badać transmigrację tylko w warunkach statycznych, bez uwzględniania cech geometrycznych in vivo i warunków przepływu. W związku z tym te tradycyjne modele nie naśladują mikrośrodowiska żywych tkanek ani nie rozwiązują kaskady adhezji i migracji w jednym teście6.

Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy i przeprowadziliśmy obszerną walidację nowatorskiego biomimetycznego testu mikroprzepływowego 3D (bMFA) (Rysunek 2), który realistycznie odtwarza in vivo sieci mikronaczyniowe na chipie16,17,18. Protokół mikrofabrykacji tego urządzenia został opublikowany wcześniej17 i jest tutaj tylko pobieżnie opisany. Mikrokrążenie mięśni cremaster myszy zostało zdigitalizowane przy użyciu zmodyfikowanego podejścia Systemu Informacji Geograficznej (GIS)19. Następnie syntetyczna sieć mikronaczyniowa została wygenerowana na polidimetylosiloksanie (PDMS) przy użyciu procesów miękkiej litografii opartych na zdigitalizowanej sieci mikronaczyniowej14,17,20,21,22. Krótko mówiąc, zdigitalizowane obrazy sieciowe zostały wydrukowane na kliszy Mylar, która została następnie wykorzystana jako maska do narysowania dodatniego fotorezystu SU-8 na płytce krzemowej w celu stworzenia wzorców do produkcji. Mikrofabrykowane filary (średnica 10 μm, wysokość 3 μm) zostały użyte do stworzenia porów o wysokości 3 μm i szerokości 100 μm, optymalnym rozmiarze dla migracji leukocytów23,24,25, łącząc kanały naczyniowe i przedziały tkankowe. PDMS został przygotowany zgodnie z instrukcjami producenta i zalany opracowanymi wzorcami. Następnie PDMS został odgazowany i pozostawiony do utwardzenia przez noc w piecu (65 °C) w celu wytworzenia uzupełniających się mikrokanałów w PDMS. Następnie utwardzony PDMS został oderwany od mastera SU-8, a następnie wykrawany przez porty wlotów/wylotów. Następnie PMDS został połączony plazmowo ze szklanym szkiełkiem. Powierzchnia urządzenia mikroprzepływowego składa się ze szkła natywnego i PDMS. Aby ułatwić przyczepianie, rozprzestrzenianie się i proliferację komórek, wymagane jest powlekanie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). bMFA obejmuje sieć mikronaczyniową i przedział tkankowy połączony porami o wysokości 3 μm i szerokości 100 μm (Rysunek 2). Ten system mikroprzepływowy odtwarza całą kaskadę adhezji/migracji leukocytów w fizjologicznie odpowiednim środowisku 3D kompletnej sieci mikrokrążenia z łączącymi się naczyniami i rozwidleniami, w tym krążeniem, marginesowaniem, walcowaniem, adhezją i migracją leukocytów do zewnątrznaczyniowego przedziału tkankowego w jednym systemie14,16,17,21,26.

Należy zauważyć, że nawet gdy natężenie przepływu na wlocie bMFA jest stałe, warunki przepływu w sieci różnią się w różnych miejscach i nie mogą być obliczone za pomocą prostego wzoru matematycznego. Opracowano model oparty na obliczeniowej dynamice płynów (CFD) w celu obliczenia różnych parametrów przepływu (np. naprężenia ścinającego, szybkości ścinania, prędkości) w różnych miejscach sieci. Ten model CFD został wykorzystany do symulacji wzorców perfuzji barwnika i parametrów przepływu w bMFA. Walidacja krzyżowa z wynikami eksperymentalnymi sugerowała, że opory przepływu w sieci są dobrze przewidywane przez model obliczeniowy (Rysunek 3)17. Ten model CFD został następnie wykorzystany do oszacowania profilu prędkości i szybkości ścinania w każdym naczyniu bMFA (Rysunek 4), umożliwiając analizę wpływu przepływu ścinającego i geometrii na toczenie, adhezję i migrację leukocytów16. Leukocyty preferencyjnie przylegają w pobliżu rozwidleń i w obszarach o niskim ścinaniu in vivo, a te przestrzenne wzorce adhezji leukocytów zostały z powodzeniem zademonstrowane w bMFA przy użyciu neutrofili (Ryc. 5)16. W pracy opisano protokół przygotowania bMFA do badania interakcji leukocytów-komórek śródbłonka w warunkach zapalnych z wykorzystaniem ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc (HLMVEC) i ludzkich neutrofili. Systemy mikrofizjologiczne, takie jak bMFA, mogą być wykorzystywane do badania interakcji komórek śródbłonka z różnymi typami komórek, takimi jak neutrofile, monocyty, limfocyty i komórki nowotworowe18,27,28,29,30. bMFA może być obsiany pierwotnymi komórkami śródbłonka z różnych narządów (np. płuc vs. mózgu) i różnych gatunków (np. ludzkimi i mysimi komórkami śródbłonka), a także liniami komórek śródbłonka21,27,31,32. bMFA może być używany do badania wielu odpowiedzi komórkowych, interakcji komórka-komórka, funkcji bariery, dostarczania leków i toksyczności leków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Heparynizowana krew ludzka jest pobierana do izolacji neutrofili od zdrowych dorosłych dawców (mężczyzn i kobiet, w wieku od 21 do 60 lat), po uzyskaniu świadomej zgody zatwierdzonej przez Institutional Review Board of Temple University (Filadelfia, PA, USA).

1. Gruntowanie i powlekanie urządzenia ludzką fibronektyną

UWAGA: bMFA ma dwa porty wlotowe i dwa porty wylotowe podłączone do komory naczyniowej. Ma również jeden port podłączony do przedziału tkankowego (Rysunek 2).

  1. Włóż rurkę (OD 0.06" i ID 0.02") (tabela materiałóws) do wszystkich portów z wyjątkiem jednego portu wlotowego z precyzyjnymi kleszczami. Clamp dwa porty wylotowe i port komory na chusteczki za pomocą zacisków szczękowych. Upewnij się, że każda rurka ma długość ~1 cal.
  2. Rozcieńczyć ludzką fibronektynę do 100 μg/ml PBS z roztworu podstawowego fibronektyny (1 mg/ml). Załadować strzykawkę o pojemności 1 ml przygotowanym roztworem fibronektyny. Podłączyć strzykawkę do igły 24 G i rurki o długości ~4 cali.
    UWAGA: Aby zapobiec sieciowaniu, nie należy nadmiernie mieszać/pipetować ludzkiej fibronektyny. Inne matryce zewnątrzkomórkowe (ECM), takie jak kolagen, mogą być stosowane do różnych typów komórek.
  3. Włóż rurkę do otwartego portu wlotowego, popchnij tłok, aż ludzka fibronektyna wyjdzie z drugiego portu wlotowego, a następnie zaciśnij go. Powtórz ten proces dla pozostałych portów, aż wszystkie kanały, przedział tkankowy i rurki zostaną wypełnione roztworem ludzkiej fibronektyny. Wyjmij igłę, ale trzymaj rurkę o długości 4 cali włożoną i odciśniętą.
    UWAGA: Upewnij się, że rurka jest wypełniona fibronektyną przed jej zaciśnięciem.
  4. W celu odgazowania podłącz odciśniętą rurkę do zbiornika sprężonego azotu za pomocą podkładu pneumatycznego, ustaw ciśnienie na ~5 psi i uruchom przez ~15 minut.
  5. Po 15 minutach sprawdź pod mikroskopem, czy w urządzeniu nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza. Jeśli w kanale lub komorze tkankowej znajdują się pęcherzyki powietrza, ponownie podłącz urządzenie do podkładu pneumatycznego w celu ponownego odgazowania, tj. powtórz krok 1.4.
    UWAGA: Mikroskop odwrócony jest używany na wszystkich etapach związanych z mikroskopią w tym protokole.
  6. Wyjmij urządzenie z podkładu pneumatycznego. Inkubować urządzenie w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie przepłukać wszystkie kanały i komorę tkankową wstępnie ogrzanymi pożywkami hodowlanymi HLMVEC (tabela materiałów), podobnie jak w kroku 1.3. bMFA jest teraz gotowy do wysiewania komórek.
    UWAGA: Przed wyjęciem/włożeniem rurki z portu należy najpierw umieścić kroplę wody za pomocą pipety wokół podstawy rurki portu dopływowego, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do urządzenia.

2. Wypełnianie bMFA za pomocą HLMVEC

  1. Hodowla HLMVEC do 60%-80% konfluencji zgodnie z protokołem dostawcy w kolbie T-25.
  2. Odessać pożywkę hodowlaną HLMVEC z kolby do hodowli komórkowych. Umyć dwukrotnie PBS.
  3. Dodać 2 ml wstępnie ogrzanego roztworu trypsyny-EDTA (37 °C) do kolby T-25. Inkubować przez 3-5 minut w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) do momentu odłączenia większości komórek od kolby.
    UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od typu komórek i stężenia trypsyny-EDTA.
  4. Dodać 2 ml roztworu neutralizującego trypsynę (TNS, 37 °C) do kolby w celu zneutralizowania trypsyny-EDTA.
  5. Delikatnie postukaj w kolbę, aby pomóc w dysocjacji komórek. Następnie przenieś roztwór zawiesiny komórkowej do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  6. Wirować przez 5 minut przy 150 x g w celu osadzenia komórek śródbłonka. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 3 ml pożywki do hodowli komórkowych. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
  7. Wirować ponownie przez 5 minut przy 150 x g, aby granulować komórki. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki do pożądanej gęstości wysiewu 20 x 106/mL.
    UWAGA: W zależności od typów komórek i zbieżności, z dwóch kolb T-25 można zebrać około 2 x 106 komórek śródbłonka, a przy gęstości wysiewu 20 x 106 / ml, 100 μl zawiesiny komórek (2 x 106 komórek śródbłonka), wystarcza do zasiania 5 urządzeń.
  8. Zamontuj strzykawkę o pojemności 1 ml w programowalnej pompie strzykawkowej, przymocuj rurkę do igły.
  9. Wciągnąć ~ 20 μl zawiesiny komórek do rurki, upewniając się, że zawiesina komórek znajduje się tylko w rurce, a nie w cylindrze strzykawki.
  10. Zdejmij clamp z portu wylotowego urządzenia. Podłącz rurkę do jednego wlotu urządzenia. Upewnij się, że do kanału nie dostały się pęcherzyki powietrza.
  11. Uruchomić pompę przy natężeniu przepływu 4-8 μl/min. Obserwuj urządzenie pod mikroskopem.
  12. Gdy kanały zostaną wypełnione komórkami, zatrzymaj pompę, clamp wylot i przetnij rurkę dolotową.
    UWAGA: Uważaj, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza do urządzenia.
  13. Umieścić urządzenie w inkubatorze na 4 godziny w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C.
  14. Po 4 godzinach inkubacji przygotować kolejną strzykawkę wypełnioną świeżą pożywką do hodowli komórkowych. Zamontuj strzykawkę na pompie strzykawkowej, podłącz strzykawkę do portu wlotowego i wyjmij zacisk z portu wylotowego.
  15. Przepuszczaj świeże media przez urządzenie przez około 5 minut z prędkością 4-8 μl/min, aby wypłukać pływające/nieprzyłączone komórki.

3. Hodowla komórkowa pod przepływem przez 48 godzin

  1. Przygotować strzykawkę wypełnioną świeżą pożywką do hodowli komórkowych. Zamontować strzykawkę w pompie strzykawkowej, podłączyć strzykawkę do jednego portu wlotowego i pozostawić otwarty wylot. Umieścić urządzenie w inkubatorze (5% CO2, 37 °C).
  2. Zaprogramować pompę strzykawkową do hodowli komórek śródbłonka pod przepływem, postępując zgodnie z poniższymi instrukcjami podanymi w Tabeli 1.
  3. Sprawdź bMFA pod mikroskopem po 48 godzinach hodowli w przepływie. HLMVEC powinien pokrywać kanały naczyniowe tworzące pełne światło (Rysunek 6).
    UWAGA: Dla różnych typów ogniw mogą być wymagane inne reżimy przepływu.

4. Cytokina i/lub leczenie terapeutyczne

UWAGA: Jako przykład, ta sekcja opisuje użycie bMFA do zbadania wpływu leczenia komórek czynnikiem martwicy nowotworów alfa (TNF-α) i nowym inhibitorem przeciwzapalnym (inhibitor peptydu kinazy białkowej C delta-TAT, PKCδ-i)18,27,32,33,34,35,36.

  1. Przygotuj trzy różne urządzenia bMFA, korzystając z powyższego protokołu (sekcja 1-3).
  2. Załadować trzy strzykawki o pojemności 1 ml odpowiednio pożywką do hodowli komórkowych (TNF-α) (10 ng/ml), TNF-α (10 ng/ml) + PKCδ-i (5 μM).
    UWAGA: Cytokiny są odtwarzane w pożywkach do hodowli komórkowych.
  3. Podłącz trzy strzykawki do trzech urządzeń bMFA. Traktować HLMVEC buforem TNF-α lub inhibitorem TNF-α + przez 4 godziny w dawce 0,1 μl/min.
    UWAGA: W oparciu o określone wymagania badania, inne cytokiny lub koktajle cytokin (np. TNF-α + Interleukina 1 beta (IL1-β) + Interferon-gamma (IFN-γ)) mogą być stosowane w leczeniu komórek śródbłonka.

5. Izolacja ludzkich neutrofili

  1. Używaj wszystkich odczynników w temperaturze pokojowej (RT). Odczynniki obejmują pożywkę do izolacji leukocytów, 1x bufor HEPES z Ca2 + / Mg2 + (Tabela 2), 6% Dekstran w soli fizjologicznej (0,9% NaCl), 3,6% roztwór NaCl i woda dejonizowana (DI) woda.
  2. Odpipetować 20 ml pożywki do izolacji leukocytów do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i ostrożnie nałożyć 25 ml krwi na pożywkę do izolacji leukocytów. Wirować przez 40 min przy 427 x g przy RT.
    UWAGA: Wykonuj ten krok powoli i ostrożnie, aby uniknąć mieszania krwi i pożywki izolacyjnej leukocytów.
  3. Odessać do ~ 5 ml powyżej warstwy czerwonych krwinek (RBC). Biała warstwa kożucha na wierzchu RBC to głównie neutrofile.
  4. Dodaj bufor HEPES, aby podwoić bieżący wolumin (istniejący wolumin: bufor HEPES = 1:1).
  5. Dodaj ilość 6% Dextran, co będzie stanowić 20% końcowej objętości. (bieżąca objętość/4 = objętość dodanych 6% dekstranu).
  6. Delikatnie odwróć probówkę kilka razy, aby dobrze wymieszać i pozwól RBC osiadać (~25 min).
  7. Ostrożnie odpipetować górną warstwę (warstwę bogatą w neutrofile) i przenieść do nowej probówki o pojemności 50 ml, uważając, aby nie zanieczyścić osadzonymi krwinkami czerwonymi.
  8. Wirować przez 10 minut przy 315 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 8 ml buforu HEPES.
  9. Aby zlizować resztki krwinek czerwonych, dodaj 24 ml wody DI i delikatnie mieszaj przez 50 s. Natychmiast dodaj 8 ml 3,6% roztworu NaCl, mieszaj i wiruj przez 10 minut przy 315 x g w temperaturze pokojowej.
  10. Usunąć sklarat nadsączy, przemyć osad komórkowy 15 ml buforu HEPES i odwirować przez 5 minut przy stężeniu 315 x g. Zawiesić osad w buforze HEPES.

6. Eksperyment adhezji i migracji neutrofili z bMFA

  1. Ponownie zawiesić wyizolowane ludzkie neutrofile (15 milionów) w 999 μl buforu HEPES.
  2. Dodać 1 μL CFDA-SE (karboksyfluoresceinianu dioctanu sukcynimidylu estru) barwnika (10 mM) do zawiesiny neutrofili w celu uzyskania stężenia roboczego 10 μM CFDA-SE i inkubować przez 10 minut w temperaturze suchej masy. Przepłukać komórki dwukrotnie buforem HEPES, wirując przez 5 minut przy 315 x g.
  3. Policz neutrofile za pomocą hemocytometru i ponownie zawiesić na 2 milionach neutrofili/ml za pomocą pożywek do hodowli komórkowych, odpowiednio TNF-α (10 ng/ml) i TNF-α (10 ng/ml) + PKCδ-i (5 μM); inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej przed rozpoczęciem eksperymentu.
  4. Przygotować strzykawkę wypełnioną 1 μM N-formyl-met-leu-phe (fMLP), chemoatraktantem do badania, w pożywce do hodowli komórkowych. Weź bMFA i otwórz jeden port wlotowy i jeden port wylotowy.
    UWAGA: Te warunki eksperymentalne są wykorzystywane do naśladowania stanów sepsy, które obejmują ogólnoustrojową odpowiedź zapalną z wysokimi poziomami krążących cytokin/chemokin. Ponadto fMLP, peptyd pochodzący z bakterii Gram-ujemnych, jest używany do modelowania obecności bakterii w płucach (tj. w przedziale tkankowym).
  5. Wyjmij rurkę portu komory na chusteczki i włóż rurkę fMLP. Wstrzyknąć ~ 20 μl fMLP do przedziału tkankowego dla wszystkich bMFA, z wyjątkiem tego traktowanego samą pożywką do hodowli komórkowych. Następnie odetnij rurkę i zaciśnij ją.
  6. Napełnić strzykawkę ~200 μl zawiesiny neutrofili i zamontować strzykawkę na pompie strzykawkowej.
  7. Umieść urządzenie na odwróconym stoliku mikroskopu (tabela materiałów).
  8. Uruchom pompę przy natężeniu przepływu 1 μl/min i poczekaj, aż niewielka kropla zawiesiny neutrofili wydostanie się z rurki. Włóż rurkę do portu wlotowego. Zobacz Rysunek 7, aby zapoznać się z konfiguracją.

7. Pobieranie obrazów

  1. Użyj funkcji skanowania dużego obrazu w oprogramowaniu do analizy obrazu mikroskopu (tabela materiałów), aby uzyskać mapę adhezji w bMFA (Rysunek 8) 10 minut po rozpoczęciu eksperymentu. Większość neutrofili dostaje się do bMFA w ciągu pierwszych 10 minut.
    UWAGA: Utrzymuj światło fluorescencyjne wyłączone, gdy nie robisz zdjęć, aby zmniejszyć fotowybielanie.
  2. W ciągu następnej godziny wykonaj zdjęcia poklatkowe (1 zdjęcie co 5 minut) przedziału tkankowego (Rysunek 8B,C) w celu analizy migracji w celu uzyskania mapy migracji.

8. Cyfrowa analiza obrazu

  1. Aby uzyskać mapę adhezji, policz liczbę przylegających neutrofili w każdym naczyniu. Dla każdego rozwidlenia utwórz okrągły obszar zainteresowania (ROI) o średnicy równej dwukrotności średnicy naczynia i policz liczbę przylegających neutrofili.
  2. Użyj ręcznego zliczania lub automatycznej funkcji zliczania obiektów, aby określić ilościowo liczbę przylegających neutrofili w każdym naczyniu i regionie bifurkacji.
  3. Użyj mapy szybkości ścinania sieci wygenerowanej za pomocą CFD simulation17, aby określić szybkość ścinania w każdym zbiorniku. Następnie wykreśl liczbę przylegających neutrofili w danym naczyniu w stosunku do szybkości ścinania w tym naczyniu, aby utworzyć mapę szybkości ścinania w bMFA, jak pokazano na Rysunek 9A.
  4. Neutrofile są liczone jako migrujące, jeśli przeszły przez śródbłonek do przedziału tkankowego. Policz liczbę migrowanych neutrofili po 10 minutach, 15 minutach, 30 minutach i 60 minutach. Wykreśl liczbę migrujących neutrofili w czasie, jak pokazano na rysunku Rysunek 9B.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po 48 godzinach hodowli pod przepływem ścinającym w bMFA, komórki śródbłonka pokryły powierzchnię kanałów naczyniowych w bMFA i wyrównały się w kierunku przepływu (Rysunek 6). Mikroskopia konfokalna wykazała, że wszystkie powierzchnie kanałów naczyniowych były pokryte komórkami śródbłonka, tworząc pełne światło 3D w bMFA18.

Korzystając z tego protokołu, można uzyskać mapę adhezji neutrofili, pokazującą, że istnieje znaczna adhezja neutrofili ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

bMFA odtwarza topografię i warunki przepływu sieci mikronaczyniowych in vivo i może być stosowany do badania interakcji leukocytów-komórek śródbłonka i funkcji śródbłonka in vitro w fizjologicznie realistycznych warunkach. W mikrokrążeniu myszy lub człowieka geometria sieci mikronaczyniowych jest samopodobna i fraktalna, a liczba Reynoldsa << 1, co wskazuje, że geometria naczyń nie wpływa znacząco na wzorce przepływu. Dlatego bFMA może być używany do badania interakcji leukocytów-śródbłonka u różnych ga...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health, Grant Number: GM114359 and GM134701 (M.F.K. and L.E.K.), 1F31AI164870-01 (J.C.L.), oraz Defense Threat Reduction Agency, Grant Number: HDTRA11910012 (M.F.K. and L.E.K.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 mlFisher Scientific14-823-30
Biomimetyczny test mikroprzepływowy (bMFA)SynVivoSMN1-C001Wyłącznie w SynVivo
igłaJensen GlobalJG24-0,5
Chlorek wapniaFisher ScientificC70-500
CFDA, SEThermoFisherC1157
Dekstran, 250 000, PowderSpectrum Chemical Mfg. CorpDE-130
Ficoll-Paque PremiumGE Health Care17-5442-02Pożywka do izolacji leukocytów
fMLPSigma-AldrichF3506
HepesFisher ScientificAAJ1692630
Ludzka fibronektynaFisher Scientific33-016-015stosowanie zalecanego przez dostawcę ECM dla różnych komórek linie
Pożywka do hodowli komórek śródbłonka mikronaczyniowego-2 BulletKitLonzacc-3202Pożywka do hodowli komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc ludzkiego płuca (HLMVEC).
Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka płucLonzacc-2527zastosowanie vedor remommended trypsyna-EDTA i TNS
Chlorek magnezuFisher ScientificBP214-500
Nikon Eclipse Ti2Nikon Instruments Inc.
Mikroskop NIS-elements, 5.20.01Nikon Instruments Inc.Oprogramowanie do obrazowania
PBSFisher ScientificMT21040CV
PhD Ultra Pompa strzykawkowaAparat Harvard70-3007Pompa strzykawkowa
Wodorotlenek potasuFisher Scientific02-003-763
Rekombinowany ludzki TNF-alfaR& D Systems210-TA
Zacisk ślizgowySynVivo
Chlorek soduFisher ScientificS640-500
Synvivo Podkład pneumatycznySynVivo
Trypsyna-EDTA, roztwór neutralizacji trypsyny (TNS)Lonzacc-5034
Rurka TygonFisher Scientific50-206-8921Rurka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  2. Yang, Q., Wijerathne, H., Langston, J. C., Kiani, M. F., Kilpatrick, L. E. Emerging approaches to understanding microvascular endothelial heterogeneity: A roadmap for developing anti-inflammatory therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7770(2021).
  3. Joffre, J., Hellman, J., Ince, C., Ait-Oufella, H. Endothelial responses in sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202, 361-370 (2020).
  4. Ince, C., et al. The endothelium in sepsis. Shock. 45, Augusta, Ga. 259-270 (2016).
  5. Ruparelia, N., Chai, J. T., Fisher, E. A., Choudhury, R. P. Inflammatory processes in cardiovascular disease: a route to targeted therapies. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 133-144 (2017).
  6. Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. Experimental approaches to evaluate leukocyte-endothelial cell interactions in sepsis and inflammation. Shock. 53, Augusta, Ga. 585-595 (2020).
  7. Langer, H. F., Chavakis, T. Leukocyte-endothelial interactions in inflammation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (7), 1211-1220 (2009).
  8. Sadik, C. D., Luster, A. D. Lipid-cytokine-chemokine cascades orchestrate leukocyte recruitment in inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 91 (2), 207-215 (2012).
  9. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature Medicine. 17, 1381-1390 (2011).
  10. Maniatis, N. A., Orfanos, S. E. The endothelium in acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. Current Opinion in Critical Care. 14, 22-30 (2008).
  11. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).
  12. Molteni, R., Fabbri, M., Bender, J. R., Pardi, R. Pathophysiology of leukocyte-tissue interactions. Current Opinion in Cell Biology. 18, 491-498 (2006).
  13. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
  14. Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
  15. Zou, X., et al. PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 289, 415-424 (2005).
  16. Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Analytical Chemistry (Journal). 86, 8344-8351 (2014).
  17. Prabhakarpandian, B., et al. Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion. Biomedical Microdevices. 10 (4), 585-595 (2008).
  18. Soroush, F., et al. A novel microfluidic assay reveals a key role for protein kinase C delta in regulating human neutrophil-endothelium interaction. Journal of Leukocyte Biology. 100, 1027-1035 (2016).
  19. Roth, N. M., Kiani, M. F. A "geographic information systems" based technique for the study of microvascular networks. Annals of Biomedical Engineering. 27, 42-47 (1999).
  20. Prabhakarpandian, B., Wang, Y. I., Rea-Ramsey, A., Sundaram, S., Kiani, M. F., Pant, K. Bifurcations: Focal points of particle adhesion in microvascular networks. Microcirculation. 18, 380-389 (2011).
  21. Rosano, J., et al. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
  22. Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent. Microvascular Research. 80, 384-388 (2010).
  23. Yona, S., Hayhoe, R., Avraham-Davidi, I. Monocyte and neutrophil isolation and migration assays. Current Protocols in Immunology. 88 (1), 11-14 (2010).
  24. Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Experimental Cell Research. 307 (2), 418-426 (2005).
  25. Chen, H. -C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).
  26. Deosarkar, S. P., Prabhakarpandian, B., Wang, B., Sheffield, J. B., Krynska, B., Kiani, M. F. A novel dynamic neonatal blood-brain barrier on a chip. PloS one. 10, 142725(2015).
  27. Soroush, F., et al. Neutrophil-endothelial interactions of murine cells is not a good predictor of their interactions in human cells. The FASEB Journal. 34, 2691-2702 (2020).
  28. Soroush, F., et al. Protein Kinase C-Delta (PKCδ) tyrosine phosphorylation is a critical regulator of neutrophil-endothelial cell interaction in inflammation. Shock. 51 (5), 538-547 (2019).
  29. Soroush, F., Tang, Y., Zaidi, H. M., Sheffield, J. B., Kilpatrick, L. E., Kiani, M. F. PKCδ inhibition as a novel medical countermeasure for radiation-induced vascular damage. The FASEB Journal. 32, 6436-6444 (2018).
  30. Pradhan, S., et al. A microvascularized tumor-mimetic platform for assessing anti-cancer drug efficacy. Scientific Reports. 8 (1), 3171(2018).
  31. Tang, Y., et al. A biomimetic microfluidic tumor microenvironment platform mimicking the EPR effect for rapid screening of drug delivery systems. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
  32. Tang, Y., et al. Protein kinase C-delta inhibition protects blood-brain barrier from sepsis-induced vascular damage. Journal of Neuroinflammation. 15, 309(2018).
  33. Mondrinos, M. J., et al. Pulmonary endothelial protein kinase C-delta (PKCd) regulates neutrophil migration in acute lung inflammation. The American Journal of Pathology. 184, 200-213 (2014).
  34. Kilpatrick, L. E., et al. Protection against sepsis-induced lung injury by selective inhibition of protein kinase C-d (d-PKC). Journal of Leukocyte Biology. 89, 3-10 (2011).
  35. Mondrinos, M. J., et al. Biodistribution and efficacy of targeted pulmonary delivery of a protein kinase C-d inhibitory peptide: Impact on Indirect lung Injury. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355, 86-98 (2015).
  36. Liverani, E., Mondrinos, M. J., Sun, S., Kunapuli, S. P., Kilpatrick, L. E. Role of protein kinase C-delta in regulating platelet activation and platelet-leukocyte interaction during sepsis. PloS one. 13, 0195379(2018).
  37. Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of shear adhesion map using SynVivo synthetic microvascular networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51025(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Interakcja leukocyt w z r db onkiembiomimetyczny test mikroprzep ywowymodel choroby zapalnejmigracja neutrofiliprzepuszczalno kom rek r db onkamikroskopia konfokalnaanaliza szybko ci cinaniaekspresja cz steczek adhezyjnychobliczeniowa mechanika p yn w

Powiązane artykuły