Artykuł metodologiczny

Specyficzna dla reszty wymiana proliny przez analogi proliny w białkach fluorescencyjnych: jak "chirurgia molekularna" kręgosłupa wpływa na fałdowanie i stabilność

DOI:

10.3791/63320

⸱

3 lutego 2022

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 2Department of Chemistry, University of Manitoba, 3Institute of Physics, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby przezwyciężyć ograniczenia klasycznej mutagenezy ukierunkowanej, analogi proliny ze specyficznymi modyfikacjami zostały włączone do kilku białek fluorescencyjnych. Pokazujemy, jak zastąpienie wodoru przez fluor lub pojedynczego przez wiązania podwójne w resztach proliny ("chirurgia molekularna") wpływa na podstawowe właściwości białek, w tym ich fałdowanie i interakcję ze światłem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastąpienie reszt proliny (Pro) w białkach przez tradycyjną mutagenezę ukierunkowaną przez którykolwiek z pozostałych 19 kanonicznych aminokwasów jest często szkodliwe dla fałdowania białek, a w szczególności dojrzewania chromoforów w białkach zielonej fluorescencji i pokrewnych wariantach. Rozsądną alternatywą jest manipulowanie translacją białka w taki sposób, aby wszystkie reszty Pro zostały zastąpione przez analogi, metoda znana jako selektywne włączenie ciśnienia (SPI). Wbudowane modyfikacje chemiczne mogą być wykorzystywane jako rodzaj "chirurgii molekularnej" do precyzyjnej analizy mierzalnych zmian, a nawet racjonalnego manipulowania różnymi właściwościami białek. W niniejszej pracy wykazano przydatność metody SPI do badania roli prolin w organizacji typowej struktury β-beczkowej wariantów spektralnych białka zielonej fluorescencji (GFP) z 10-15 prolinami w swojej sekwencji: wzmocnione białko zielonej fluorescencji (EGFP), NowGFP i KillerOrange. Pozostałości Pro są obecne w odcinkach łączących między poszczególnymi β-pasmami i stanowią pokrywy zamykające rusztowanie beczki, odpowiadając tym samym za izolację chromoforu od wody, czyli właściwości fluorescencyjne. Eksperymenty z selektywnym włączaniem ciśnienia z (4R)-fluoroproliną (R-Flp), (4S)-fluoroproliną (S-Flp), 4,4-difluoroproliną (Dfp) i 3,4-dehydroproliną (Dhp) przeprowadzono przy użyciu prolino-auksotroficznego szczepu E. coli jako gospodarza ekspresji. Odkryliśmy, że białka fluorescencyjne z S-Flp i Dhp są aktywne (tj. fluorescencyjne), podczas gdy pozostałe dwa analogi (Dfp i R-Flp) wytwarzają dysfunkcyjne, nieprawidłowo sfałdowane białka. Kontrola profili absorpcji i emisji fluorescencji UV-Vis wykazała niewiele charakterystycznych zmian w białkach zawierających analogi Pro. Badanie profili kinetycznych fałdowania w wariantach EGFP wykazało przyspieszony proces ponownego fałdowania w obecności S-Flp, podczas gdy proces ten był podobny do typu dzikiego w białku zawierającym Dhp. Badanie to pokazuje zdolność metody SPI do wytwarzania subtelnych modyfikacji reszt białkowych na poziomie atomowym ("chirurgia molekularna"), które można zastosować do badania innych białek będących przedmiotem zainteresowania. Ilustruje on wyniki substytucji proliny z bliskimi analogami chemicznymi na właściwości fałdowania i spektroskopowe w klasie białek fluorescencyjnych z β beczkami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klasyczna mutageneza ukierunkowana na miejsce pozwala na permutację dowolnej istniejącej sekwencji białka kodowanej przez gen poprzez manipulację kodonami na poziomie DNA. Aby zbadać fałdowanie i stabilność białek, często pożądane jest zastąpienie podobnych aminokwasów podobnymi odpowiednikami. Jednak tradycyjna mutageneza białek jest zdecydowanie ograniczona do strukturalnie podobnych zamienników wśród kanonicznych aminokwasów, takich jak Ser/Ala/Cys, Thr/Val, Glu/Gln, Asp/Asn, Tyr/Phe, które są obecne w standardowym repertuarze kodów genetycznych. Z drugiej strony, nie ma takich możliwości dla innych kanonicznych aminokwasów, takich jak Trp, Met, His lub Pro, które często odgrywają istotną rolę strukturalną i funkcjonalną w białkach1. Idealnym podejściem do badania tych oddziaływań w kontekście wysoce specyficznej wewnętrznej architektury białek i ich procesu fałdowania jest generowanie niezakłócających modyfikacji izosterycznych. Rzeczywiście, gdy izosteryczne analogi aminokwasów tych kanonicznych aminokwasów, znanych również jako aminokwasy niekanoniczne (ncAA), są wprowadzane do białek, pozwalają na subtelne zmiany nawet na poziomie pojedynczych atomów lub grup atomów, takich jak H/F, CH2/S/Se/Te znanych jako "mutacje atomowe"2. Taka "chirurgia molekularna" wytwarza zmienione białka, których właściwości wynikają wyłącznie z wymiany pojedynczych atomów lub grup atomów, które w sprzyjających przypadkach mogą być analizowane, a wykryte zmiany mogą być racjonalizowane. W ten sposób zakres syntezy białek w celu badania fałdowania i struktury białek wykracza daleko poza klasyczną mutagenezę DNA. Należy zauważyć, że białka generowane przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce są zwykle określane jako "mutanty", podczas gdy białka z podstawionymi aminokwasami kanonicznymi są określane jako "warianty" 3, "alloproteins"4, lub "kongenery białkowe"5.

Białko zielonej fluorescencji (GFP), po raz pierwszy zidentyfikowane w organizmie morskim Aequorea victoria, wykazuje jasnozieloną fluorescencję po wystawieniu na działanie światła ultrafioletowego do niebieskiego6,7. Obecnie GFP jest powszechnie stosowany jako bardzo czułe narzędzie do znakowania do rutynowej wizualizacji ekspresji genów i lokalizacji białek w komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. GFP okazał się również przydatny w różnych badaniach biofizycznych8,9,10 i biomedical11,12, a także w inżynierii białek13,14,15. Wnikliwa analiza struktury GFP pozwoliła na stworzenie licznych wariantów charakteryzujących się zróżnicowaną stabilnością i maksimami fluorescencji16,17. Większość wariantów GFP stosowanych w biologii komórkowej i molekularnej to białka monomeryczne zarówno w roztworze, jak i w klasie crystal18. Ich główna organizacja strukturalna jest typowa dla wszystkich członków rodziny GFP, niezależnie od ich pochodzenia filogenetycznego, i składa się z 11 β-nici tworzących tzw. β-beczkę, podczas gdy załamana α-helisa biegnie przez środek lufy i nosi chromofor (Rysunek 1A). Autokatalityczne dojrzewanie chromoforu (Rysunek 1B) wymaga precyzyjnego umiejscowienia otaczających go łańcuchów bocznych w centralnym miejscu białka; wiele z tych łańcuchów bocznych jest wysoce konserwatywnych w innych wariantach GFP19. W większości białek fluorescencyjnych z meduz, takich jak Aequorea victoria, chromofor emitujący zieleń składa się z dwóch pierścieni aromatycznych, w tym pierścienia fenolowego Tyr66 i pięcioczłonowej heterocyklicznej struktury imidazolinonu (Figura 1B). Chromofor, odpowiednio osadzony w matrycy białkowej, odpowiada za charakterystyczną fluorescencję całego białka. Znajduje się w centrum konstrukcji, podczas gdy struktura beczki izoluje ją od medium wodnego20. Wystawienie chromoforu na działanie wody spowodowałoby wygaszenie fluorescencji, tj. utratę fluorescencji21.

Prawidłowe zagięcie struktury przypominającej beczkę jest niezbędne do ochrony chromoforu przed wygaszaniem fluorescencji22. Pozostałości proliny (Pro) odgrywają szczególną rolę w organizacji strukturalnej GFP23. Nie będąc w stanie utrzymać nici β, stanowią pętle łączące odpowiedzialne za utrzymanie struktury białka jako całości. Nic dziwnego, że 10-15 reszt proliny znajduje się zarówno w GFP pochodzących z Aequorea, jak i Anthoathecata; Niektóre z nich są wysoce konserwatywne w innych typach fluorescencyjnych białek β-beczkowych. Oczekuje się, że proliny będą miały decydujący wpływ na właściwości składania ze względu na ich szczególne cechy geometryczne. Na przykład w GFP pochodzących z Aequorea, z dziesięciu reszt proliny (Rysunek 2A), dziewięć tworzy trans-, a tylko jedna tworzy wiązanie cis-peptydowe (Pro89). Pro58 jest niezbędny, tzn. nie można go stosować zamiennie z pozostałymi 19 aminokwasami kanonicznymi. Pozostałość ta może być odpowiedzialna za prawidłowe pozycjonowanie reszty Trp57, która została uznana za kluczową dla dojrzewania chromoforu i ogólnego składania GFP24. Fragment PVPWP z trzema resztami proliny (Pro54, Pro56, Pro58) i Trp57 jest zasadniczą częścią "dolnej powieki" w strukturze GFP z Rysunek 1A. Motyw strukturalny PVPWP znajduje się w kilku białkach, takich jak cytochromy i eukariotyczne kanały potasowe aktywowane napięciem25. Substytucja proliny do alaniny w pozycjach 75 i 89 jest również szkodliwa dla ekspresji i fałdowania białek oraz znosi dojrzewanie chromoforów. Pro75 i Pro89 są częścią "górnej pokrywy" zakopującej chromofor (Rysunek 1A) i są zachowane w 11-niciowych β-beczkowych białkach fluorescencyjnych23. Te dwie "pokrywki" utrzymują chromofor z dala od wodnego rozpuszczalnika, nawet jeśli stabilna struktura trzeciorzędowa została częściowo złamana26. Taka specyficzna architektura molekularna chroni fluorofor przed kolizyjnym (dynamicznym) wygaszaniem fluorescencji, np. przez wodę, tlen lub inne dyfuzyjne ligandy.

Aby przeprowadzić inżynierię molekularną struktury GFP, należy wprowadzić podstawienia aminokwasów w podstawowej strukturze białka. Na GFP przeprowadzono liczne mutacje, które zapewniły wariantom podwyższoną stabilność, szybkie i niezawodne fałdowanie oraz zmienne właściwości fluorescencji17. Niemniej jednak w większości przypadków mutacja reszt proliny jest uważana za ryzykowne podejście ze względu na fakt, że żaden z pozostałych 19 kanonicznych aminokwasów nie jest w stanie prawidłowo przywrócić profilu konformacyjnego reszty proliny27. W związku z tym opracowano alternatywne podejście, w którym reszty proliny są zastępowane innymi strukturami opartymi na prolinie, nazwanymi analogami proliny28. Ze względu na swoją unikalną cykliczną strukturę chemiczną, prolina wykazuje dwie charakterystyczne przemiany konformacyjne (Rysunek 1C): 1) marszczenie się pierścienia proline, szybki proces pociągający za sobą organizację kręgosłupa, który wpływa przede wszystkim na kąt skrętu φ, oraz 2) izomeryzację wiązania peptydowego cis/trans, powolny proces wpływający na fałdowanie kręgosłupa pod kątem skrętu ω. Ze względu na swój powolny charakter, to ostatnie przejście jest powszechnie odpowiedzialne za etapy ograniczające szybkość w procesie fałdowania całego białka. Wykazano wcześniej, że izomeryzacja wiązania peptydowego cis / trans wokół niektórych reszt proliny charakteryzuje się powolnymi etapami fałdowania wariantów GFP. Na przykład, tworzenie wiązania cis-peptydowego w Pro89 charakteryzuje się powolnym krokiem w procesie składania, ponieważ opiera się na przejściu wiązania z trans do cis29. Szybsze ponowne fałdowanie można osiągnąć po zastąpieniu Pro89 pętlą peptydową all-trans, tj. poprzez zniesienie zdarzenia izomeryzacji cis-to-trans<sup class="xref">30. Oprócz izomeryzacji cis/trans, przejścia fałdowania mogą również generować głębokie zmiany w fałdowaniu białek ze względu na organizację szkieletu i upakowanie we wnętrzu białka27,31.

Modyfikacje chemiczne powodują zmianę wewnętrznych przemian konformacyjnych reszt proliny, wpływając tym samym na zdolność białka do fałdowania. Niektóre analogi proliny są szczególnie atrakcyjnymi kandydatami do substytucji proliny w białkach, ponieważ umożliwiają manipulację i badanie właściwości fałdowania. Na przykład (4R)-fluoroprolina (R-Flp), (4S)-fluoroprolina (S-Flp), 4,4-difluoroprolina (Dfp) i 3,4-dehydroprolina (Dhp) to cztery analogi (Rysunek 1D), które różnią się minimalnie od proliny zarówno pod względem objętości cząsteczkowej, jak i polarności32. W tym samym czasie każdy analog wykazuje wyraźne marszczenie pierścienia: S-Flp stabilizuje marszczenie C4-endo, R-Flp stabilizuje marszczenie C 4-exo, Dfp nie wykazuje widocznej preferencji marszczenia, podczas gdy Dhp znosi marszczenie (Rysunek 1D)33. Stosując te analogi w strukturze białka, można manipulować przejściem konformacyjnym reszt proliny, a tym samym wpływać na właściwości powstałych wariantów GFP.

W tej pracy postanowiliśmy włączyć wyznaczony zestaw analogów proliny (Rysunek 1D) do struktury wariantów GFP za pomocą metody selektywnego włączania ciśnienia (SPI, Rysunek 3)34. Zastąpienie reszt aminokwasowych ich najbliższymi analogami izostrukturalnymi jest koncepcją biotechnologiczną stosowaną w projektowaniu białek35,36. Tak więc wpływ analogów proliny w białku modelowym ilustruje ich potencjał do wykorzystania jako narzędzia w inżynierii białek37. Produkcję białek zawierających pożądane analogi prowadzono w zmodyfikowanych szczepach E. coli, które nie są w stanie wytwarzać proliny (auksotrofia proliny). W ten sposób mogą zostać zmuszeni do zaakceptowania wymiany substratów w procesie biosyntezy białek38. Ta globalna substytucja proliny jest możliwa dzięki naturalnej elastyczności substratów endogennych syntetaz aminoacylo-tRNA39, kluczowych enzymów katalizujących estryfikację tRNA odpowiednimi aminokwasami40. Ogólnie rzecz biorąc, jak opisano w Rysunek 3, wzrost komórek odbywa się w określonym podłożu, aż do osiągnięcia środkowej fazy wzrostu logarytmicznego. W kolejnym kroku aminokwas, który ma zostać zastąpiony, jest wewnątrzkomórkowo wytracany z systemu ekspresji podczas fermentacji, a następnie wymieniany przez pożądany analog lub ncAA. Ekspresja białka docelowego jest następnie indukowana w celu włączenia aminokwasów niekanonicznych specyficznych dla reszt. Substytucja pokrewnego aminokwasu jego analogiem zachodzi w sposób obejmujący cały proteom. Chociaż ten efekt uboczny może mieć negatywny wpływ na wzrost szczepu gospodarza, jakość produkcji białka docelowego w większości nie jest zagrożona, ponieważ w ekspresji rekombinowanej zasoby komórkowe są głównie kierowane do produkcji białka docelowego41,42. Dlatego ściśle regulowany, indukowalny system ekspresji i silne promotory są kluczowe dla wysokiej efektywności inkorporacji43. Nasze podejście opiera się na wielokrotnym wprowadzaniu ncAA specyficznych dla reszt w odpowiedzi na kodony zmysłowe (reprzydział kodonów zmysłowych), przy czym w obrębie genu docelowego liczbą pozycji do insercji analogu Pro można manipulować za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce44. Podobne podejście zostało zastosowane w naszym poprzednim raporcie na temat otrzymywania rekombinowanych peptydów o właściwościach przeciwdrobnoustrojowych45. W niniejszej pracy zastosowaliśmy metodę SPI, która pozwala na zastąpienie wszystkich reszt proliny przez pokrewne analogi, w celu wytworzenia białek, od których oczekuje się, że będą miały odrębne właściwości fizykochemiczne, nieobecne w białkach syntetyzowanych z kanonicznym repertuarem aminokwasów. Charakteryzując profil fałdowania i fluorescencji otrzymanych wariantów, staramy się pokazać efekty podstawień atomowych w wariantach GFP.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wprowadzenie plazmidów ekspresyjnych do kompetentnych proauksotroficznych komórek E. coli

  1. Wymieszać 1 ng każdego plazmidu próbki, pQE-80L H 6-EGFP, pQE-80L H6-NowGFP i pQE-80L H6-KillerOrange, z 50 μl chemicznie kompetentnych lub elektrokompetentnych komórek proauksotroficznego szczepu pochodzącego z E. coli K12 JM83 (Addgene #50348 lub ATCC #35607) w celu transformacji metodą szoku cieplnego lub elektroporacji zgodnie z dostępnymi protokołami46, 47.
    UWAGA: Wektor ekspresyjny pQE-80L EGFP-H6 koduje odpowiednio C-końcowe 6xHis-tagowane ulepszone białko zielonej fluorescencji (EGFP), wektory ekspresyjne pQE-80L H 6-NowGFP i pQE-80L H6-KillerOrange kodują N-końcowy 6xHis-tagowany NowGFP48 lub N-terminalnie 6xHis-tagged KillerOrange49, każdy w szkielecie plazmidowym pQE-80L. Wszystkie geny docelowe są pod kontrolą bakteryjnego promotora T5 regulowanego przez operatora lac. Oporność na ampicylinę wykorzystano jako marker selekcyjny, a colE1 jako początek replikacji. Więcej informacji na temat plazmidu pQE-80L można znaleźć w Tabeli Materiałów. Alternatywne proauksotroficzne E. coli pochodzące ze szczepów K-12 i B mogą być również stosowane do ekspresji i powinny przynieść podobne wyniki. Obliczona masa cząsteczkowa pojedynczo protonowanych ([M+H]+) białek typu dzikiego znakowanychH 6 (po dojrzewaniu chromoforu) wynosi 27 745,33 Da (EGFP-H6), 27 931,50 Da (H 6-NowGFP) i 27 606,09 Da (H6-KillerOrange). Pierwszorzędowe struktury docelowych białek podano w tabeli 1 (podkreślenie His-tag). Glutamina (Q) w sekwencji znacznika Hisa NowGFP została zidentyfikowana przez sekwencjonowanie DNA po subklonowaniu cDNA NowGFP otrzymanego od Pletneva i wsp.51 do plazmidu pQE-80L. Nie utrudnia oczyszczania białek ani właściwości białka fluorescencyjnego.
  2. Odzyskać komórki w 950 μl pożywki SOC w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  3. Rozprowadzić 50 μl odzyskanych komórek na płytkach z agarem Luria (LA) (patrz materiał dodatkowy) zawierających glukozę (10 g/l) i ampicylinę (100 μg/ml).
  4. Inkubować płytki pożywki LA w temperaturze 37 °C przez noc lub w temperaturze 30 °C przez 24 godziny.

2. Produkcja rekombinowanych białek fluorescencyjnych typu dzikiego (zawierających kanoniczną prolinę) i procedura selektywnego włączania ciśnienia (SPI) do produkcji białek fluorescencyjnych z analogami proliny (S-Flp, R-Flp, Dfp, Dhp)

  1. Nocna hodowla pro-auksotroficznego szczepu E. coli pochodzącego z K12 JM83 zawierającego pQE-80L EGFP-H6, pQE-80L H 6-NowGFP i pQE-80L H 6-KillerOrange
    1. Użyj sterylnej końcówki pipety lub pętli do zaszczepiania, aby wybrać pojedynczą kolonię z płytki z pożywką LA i ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki bulionu lizogenicznego (LB) (patrz Materiał uzupełniający; zawierający 10 g/l glukozy, 100 μg/ml ampicyliny) w sterylnej probówce do hodowli polistyrenu o pojemności 14 ml.
      UWAGA: Do inokulacji zaleca się świeżo przekształcone kolonie. Komórki na płytkach LA (z kroku 2.2) przechowywane w temperaturze 4 °C należy zużyć w ciągu kilku dni.
    2. Hodować kulturę komórkową przez noc w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 200-250 obr./min.
  2. Produkcja rekombinowanych EGFP-H6, H 6-NowGFP i H6-KillerOrange z natywną proliną i odpowiednimi wariantami białka z analogami proliny
    1. Zaszczepić 200 ml świeżej pożywki NMM (7,5 mM (NH4)2SO4, 50 mM K2HPO4 i 22 mM KH2PO4, 8,5 mM NaCl, 1 mMMgSO4, 20 mM D-glukozy, 1 μg/ml FeCl2, 1 μg/ml CaCl2, 10 μg/ml tiaminy, 10 μg/ml biotyny, 0,01 μg/ml pierwiastki śladowe (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4), pH ~7,2) ze wszystkimi kanonicznymi l-aminokwasami (50 mg/L); patrz materiał dodatkowy) uzupełniony 100 μg/ml ampicyliny z 2 ml nocnej hodowli w 2-litrowej kolbie Erlenmeyera.
      UWAGA: W zależności od rodzaju białka, alternatywne podłoża uprawowe, takie jak MOPS medium52, sole glukozowo-mineralne medium53, Davis minimal medium54, M9 minimal medium55 lub GMML56 mogą być testowane w celu optymalizacji wydajności białka.
    2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 220 obr./min przez ~3 h 30 min.
    3. Mierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) w spektrofotometrze co 30 minut, aż do osiągnięcia wartości OD600 ~ 0,7.
      UWAGA: Do oznaczania OD600 w spektrofotometrze kuweta powinna mieć długość ścieżki 1 cm. Do pomiaru referencyjnego ("zero") używa się odpowiedniego podłoża uprawowego. Czas inkubacji do osiągnięcia wartości OD600 wynoszącej ~ 0,7 może zależeć od objętości hodowli. 3 h 30 min to wartość przybliżona. W wariancie podetapów protokołu 2.2.1-2.2.3., hodowla z podkroku 2.1.2. stosuje się do inokulacji świeżej pożywki NMMΔPro (patrz materiał uzupełniający) uzupełnionej ograniczonym stężeniem proliny (np. 5 mg/L zamiast 50 mg/l), a komórki hoduje się przez noc w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 220 obr./min. Następnego dnia oznaczenie OD600 wykonuje się co 30 minut, aż różnice między pomiarami będą mniejsze niż 0,05. Maksymalna wartość OD600 powinna wynosić około 1 (± 0,3). Początkowe, ograniczone stężenie proliny można dostosować w zależności od odmiany ekspresji i podłoża uprawowego (patrz Dyskusja).
    4. Wirować zawiesinę komórek przez 10 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C.
    5. Delikatnie zdekantować supernatant do odpadów.
    6. Etap mycia: Zawiesić komórki w 50 ml lodowatego podłoża NMMΔAA (bez aminokwasów, patrz materiał uzupełniający) lub NMMΔPro (bez proliny, patrz materiał uzupełniający), ostrożnie pipetując.
      UWAGA: Na tym etapie płukania można użyć jednego z dwóch podanych, ponieważ ważne jest tylko pozbycie się resztki proliny z pożywki inkubacyjnej.
    7. Oddzielić komórki od pożywki przez sedymentację w temperaturze 4 °C w wirówce o sile 3 000 x g przez 10 minut.
    8. Delikatnie zdekantować supernatant do odpadów.
    9. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić osad komórek w 200 ml pożywki NMMΔPro uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny do 2-litrowej kolby Erlenmeyera.
      UWAGA: Otrzymaną zawiesinę komórkową można rozdzielić na kilka próbek o równej objętości w celu uzyskania identycznych kultur wyjściowych do porównania ekspresji białek w obecności analogów Pro lub proliny (np. rozdzielenie na 4 x 50 ml w 100 ml kolbach Erlenmeyera).
    10. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 220 obr./min w celu całkowitego wyczerpania Pro.
      UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla całkowitego wyczerpania Pro z komórek.
    11. Dodać odpowiednią objętość L-proliny lub R-Flp, S-Flp, Dfp i Dhp z 50 mM roztworu podstawowego, aby dostosować 1 mM końcowe stężenie w zawiesinie komórki.
      UWAGA: Zgodnie z ogólną zasadą, przed użyciem należy zawsze przygotować świeże 50 mM roztwory podstawowe pochodnych Pro lub proliny. Tylko wtedy, gdy hydroliza określonego kanonicznego lub niekanonicznego aminokwasu w roztworze wodnym nie stanowi problemu, można również użyć zamrożonych wywarów.
    12. Dodać 0,5 mM IPTG z 1 M roztworu podstawowego, aby indukować ekspresję białka docelowego.
    13. Przeprowadzić ekspresję białka docelowego przez noc (12 godzin) w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej przy 220 obr./min.
    14. Zmierz OD600 następnego dnia.
      UWAGA: Oznaczanie OD600 wykonuje się w celu ilościowego określenia ilości komórek po ekspresji białka. Niższa wartość OD600 w porównaniu z wartością zmierzoną przed etapem płukania 2.2.3 wskazuje na cytotoksyczność dostarczonego aminokwasu. W takim przypadku zabieg należy powtórzyć przy zminimalizowanym stężeniu podawanego aminokwasu (do 0,1 mM).
    15. Odwirować i zebrać komórki bakteryjne w temperaturze 5 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut, a następnie zdekantować supernatant do odpadów.
    16. Etap mycia: Zawiesić komórki przez ostrożne pipetowanie w 50 ml buforu wiążącego (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM DTT) zawierającego 10% glicerolu i przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki polistyrenowej o pojemności 50 ml.
    17. Odwirować i zebrać komórki bakteryjne w temperaturze 5 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut, a następnie zdekantować supernatant do odpadów.
    18. Przechowywać granulki komórkowe w stożkowej probówce polistyrenowej o pojemności 50 ml w temperaturze -20 °C lub -80 °C do czasu dalszego użycia (oczyszczanie białka, patrz poniżej).

3. Procedura oczyszczania próbek białek metodą chromatografii powinowactwa jonów metali (IMAC)

  1. Liza komórek bakteryjnych
    UWAGA: Wykonaj wszystkie etapy lizy komórek na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aby zapobiec degradacji białka docelowego.
    1. Rozmrażać osad komórek bakteryjnych na lodzie lub w temperaturze 4 °C w stożkowej probówce z polistyrenu o pojemności 50 ml przez 10-20 minut.
    2. Dodać 10 ml lodowatego buforu wiążącego (patrz materiał dodatkowy) i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić osad komórkowy.
    3. Dodać 100 μl lizozymu 50 mg/mL, 100 μL 1 mg/ml DNazy I, 100 μl 1 mg/ml RNazy A, 30 μl 1 M MgCl2. Ostrożnie odwrócić zawiesinę komórek pięć razy i trzymać zamkniętą probówkę na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez 60 min.
      UWAGA: Lizozym indukuje chemiczną lizę komórek poprzez zakłócenie ściany komórkowej bakterii.
    4. Sonifikować próbkę w celu rozerwania komórek za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego (np. 3 razy przez 3 minuty w probówce polistyrenowej o pojemności 50 ml na mieszaninie lodu i wody, impuls 2 s/przerwa 4 s, amplituda 45%).
      UWAGA: Alternatywnie można zastosować inne metody rozbijania komórek, np. homogenizację wysokociśnieniową w 20 cyklach przy 14 000 psi. W razie potrzeby rozcieńczyć za pomocą buforu wiążącego (patrz Materiał uzupełniający), aby osiągnąć minimalną objętość instrumentu. Co więcej, odczynniki do ekstrakcji białek mogą być stosowane do rozbijania komórek. Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z przykładami.
    5. Wirować przez 60 minut w temperaturze 18 000 x g, 4 °C.
    6. Zanotować objętość cieczy dla podetapu 3.1.9 i wlać supernatant do świeżej probówki z polistyrenu o pojemności 50 ml.
    7. Usunąć supernatant za pomocą filtra membranowego o średnicy porów 0,45 μm.
    8. Pobrać próbkę "lizatu" dla SDS-PAGE (patrz sekcja 4 poniżej); odpowiada to "rozpuszczalnej frakcji białkowej", supernatantowi z podkroku 3.1.6.
    9. Dodać równą objętośćddH2O, jak określono w podkroku 3.1.6, w celu ponownego zawieszenia resztek komórek w celu utrzymania tego samego rozcieńczenia próbek do późniejszej analizy SDS-PAGE.
    10. Pobrać próbkę "osadu" do SDS-PAGE (patrz sekcja 4 poniżej); odpowiada to "nierozpuszczalnej frakcji białkowej", zawiesinie szczątków komórek z podkroku 3.1.9.
  2. Oczyszczanie metodą immobilizowanej chromatografii powinowactwa do metali (IMAC)
    UWAGA: Oczyszczanie docelowego białka fluorescencyjnego można przeprowadzić w temperaturze 4 °C lub w temperaturze pokojowej (RT). W przypadku tej drugiej opcji poczekaj, aż lizat, kolumna i wszystkie zrównoważą się w temperaturze pokojowej, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza w wyniku parowania powietrza uwięzionego w zimnym roztworze po umieszczeniu w ciepłej kolumnie.
    1. Oczyścić próbkę za pomocą 1 ml kolumny IMAC FPLC (szybkiej chromatografii cieczowej białek [lub wydajności]) o pojemności 1 ml zgodnie z instrukcjami producenta; ustawić maksymalne ciśnienie w kolumnie na 0,3 MPa, a natężenie przepływu na 1 ml/min; użyć buforu wiążącego (patrz Materiał dodatkowy) do równoważenia kolumny, bufor do przemywania (patrz Materiał uzupełniający) dla etapu mycia, i bufor elucyjny (patrz materiał dodatkowy) do elucji białka docelowego.
      UWAGA: Alternatywnie można zastosować zautomatyzowany system FPLC do elucji białka docelowego za pomocą buforu elucyjnego działającego w liniowym gradinie stężenia imidazolu (20-200 mM).
    2. Zbierz i połącz frakcje eluacyjne z białkami fluorescencyjnymi (wybierz widoczny kolor zielony lub pomarańczowy).
    3. Przenieść zebrane frakcje do membrany dializacyjnej (odcięcie masy cząsteczkowej (MWCO) 5 000-10 000) zgodnie z instrukcjami producenta i dializować co najmniej trzy razy z buforem dializacyjnym lub buforem MS (patrz Materiał uzupełniający). Na przykład należy przeprowadzić dializę próbki o pojemności 1 ml trzy razy w stosunku do 100 ml buforu przez co najmniej 2 godziny w każdej rundzie. Szczegółowy protokół można znaleźć w Budisa et al.34.
    4. Przygotować 1:100-krotne rozcieńczenie dializowanej frakcji elucyjnej w buforze PBS (patrz materiał uzupełniający).
    5. Zapisać widmo absorbancji rozcieńczonych próbek w spektrofotometrze UV-Vis.
    6. Obliczyć stężenie białka w oparciu o prawo Lamberta-Beera w następujący sposób, używając wartości literaturowych współczynników ekstynkcji molowej ε przy określonej długości fali (dla EGFP przy 488 nmε 488 = 55 000 cm-1·M-1, NowGFP przy 493 nm ε493 = 53 600 cm-1·M-1, KillerOrange przy 514 nm ε514 = 22 600 cm-1·M-1):
      figure-protocol-1 (prawo Lamberta-Beera)
      cbiałko = stężenie białka [mg/ml]
      A = absorbancja przy określonej długości fali
      ε = molowy współczynnik ekstynkcji przy określonej długości fali [M-1·cm-1]
      d = długość ścieżki kuwety, tutaj 1 cm
      MW = masa cząsteczkowa białka [g/mol]
      Użyć buforu do dializy (patrz materiał dodatkowy) do pomiaru referencyjnego ("zerowego").
    7. Pobrać próbkę "eluatu" dla SDS-PAGE (patrz sekcja 4 poniżej), załadować 1-10 μg białka (obliczone zgodnie z poprzednim krokiem) na próbkę dołka dla żeli barwionych na niebiesko Coomassie Brilliant.
      UWAGA: Dostosuj ilości próbki SDS w zależności od zastosowanej metody barwienia i wrażliwości barwnika, jeśli do barwienia pasm białkowych stosuje się związki inne niż Coomassie Brilliant Blue.
    8. Zawiesić i przechowywać próbkę białka w buforze do dializy (patrz materiał dodatkowy) w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: W tych warunkach przechowywania próbki białka powinny być stabilne przez co najmniej 6 miesięcy. Alternatywne laboratoryjne spektrofotometry UV-Vis i fluorescencyjne mogą być wykorzystywane do rejestrowania widm absorpcyjnych i emisji fluorescencji docelowych białek. Do pomiarów emisji fluorescencji można zastosować następujące długości fal wzbudzenia: 488 nm (EGFP), 493 nm (NowGFP) i 510 nm (KillerOrange).

4. Przygotowanie próbki SDS-PAGE

  1. Oznaczyć absorbancję A przy 280 nm (A280 nm) dla próbek "eluat", "lizat" i "osad" z sekcji 3. Dostosuj objętość sondy, aby osiągnąć A280nm = 2, dodając odpowiednią ilość buforu elucyjnego (końcowa objętość sondy powinna wynosić co najmniej 80 μL).
  2. Wymieszać próbkę w stosunku 4:1 (v/v) z 5-krotnym buforem barwnikowym SDS (patrz Materiał uzupełniający) przez pipetowanie, np. 80 μl próbki z 20 μl buforu ładującego 5x SDS.
  3. Gotować próbki SDS w temperaturze 95 °C przez 5 minut w łaźni wodnej lub bloku grzewczym w celu denaturacji białek.
  4. Pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej i odwirowywać sondy przy 13 000 x g przez 1 minutę w mikrowirówce przed załadowaniem do żelu.
  5. Użyj 5-10 μl dla Coomassie Brilliant Blue-stained SDS-PAGE. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat procedury SDS-PAGE, skonsult57.
    UWAGA: Dostosuj ilości próbki SDS w zależności od zastosowanej metody barwienia i wrażliwości barwnika. Wynik SDS-PAGE powinien być dokładnie sprawdzony, aby upewnić się, że próbki zawierają więcej niż 95% całkowitego białka w paśmie odpowiadającym oczekiwanej masie cząsteczkowej pożądanego białka. W tym celu należy wykonać zdjęcie żelu barwionego metodą Coomassie i porównać intensywność pasma białka o pożądanej masie cząsteczkowej z intensywnością wszystkich innych prążków na pasie (jeśli występują) za pomocą densytometrii. Do densytometrycznej oceny natężeń pasma można użyć oprogramowania ImageJ58. Aby eksperymentalnie udowodnić włączenie pożądanych ncAA do białka będącego przedmiotem zainteresowania, należy przeprowadzić analizę masy nienaruszonych białek za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) sprzężonej ze spektrometrią mas czasu przelotu z jonizacją elektrorozpylania (LC-ESI-TOF-MS) zgodnie z opisem59 (patrz sekcja 5 protokołu i tabela materiałów w nim dla przykładowego sprzętu).

5. Emisja fluorescencji wariantów białek

  1. Przed zabiegiem sprawdź wynik eksperymentu SDS-PAGE, aby upewnić się, że czystość próbki wynosi >95% (patrz UWAGA po kroku 4.5).
  2. Dostosować próbki każdego oczyszczonego wariantu białka do stężenia 0,3 μM, przyjmując obliczoną wartość absorbancji przy odpowiedniej długości fali jako odniesienie (podetap 3.2.5). Upewnij się, że przybliżona końcowa objętość próbki wynosi 200 μl.
  3. Pozostawić rozcieńczone próbki do równowagi przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Przenieść próbki do 1-centymetrowej kuwety kwarcowej i zmierzyć widmo emisji fluorescencji próbek za pomocą spektrometru fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów), stosując następujące długości fal wzbudzenia: 488 nm (dla EGFP), 493 nm (dla NowGFP), 510 nm (dla KillerOrange).

6. Denaturacja i ponowne składanie wariantów EGFP

  1. Przed zabiegiem sprawdź wynik eksperymentu SDS-PAGE, aby upewnić się, że czystość próbki wynosi >95% (patrz UWAGA po kroku 4.5).
  2. Przygotować dla każdego oczyszczonego wariantu białka dwie próbki o końcowej objętości 2 μl o stężeniu 300 μM (patrz oznaczanie stężenia białka w podkrokach 3.2.4-3.2.6).
  3. Dodać 18 μl buforu 1,11x PBS (patrz materiał uzupełniający) zawierającego 8,89 M mocznika i 5,56 mM DTT do 2 μl każdego oczyszczonego wariantu białka (aby uzyskać 1x PBS zawierający 8 M mocznika i 5 mM DTT) w celu wywołania denaturacji.
    UWAGA: W przypadku kroków 6.4-6.6 należy przetwarzać każdą próbkę osobno.
  4. Inkubować próbki przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
  5. Rozcieńczyć 20 μl próbek 100-krotnie, dodając 1980 μl 1x PBS (patrz materiał uzupełniający) zawierający 5 mM DTT w celu wywołania renaturacji, uzyskując końcowe stężenie białka 0,3 μM i natychmiast przenieść 200 μl próbek do 1-centymetrowej kuwety kwarcowej.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby pracować szybko, ponieważ renaturyzacja rozpoczyna się natychmiast.
  6. Włożyć kuwetę kwarcową do odpowiedniego spektrometru fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów) i monitorować ponowne fałdowanie białek w próbkach, uzyskując widmo fluorescencji co 3 s przez 30 minut. Dla każdego wariantu białka należy zastosować wzbudzenie fluorescencyjne 295 nm dla pierwszej próbki i wzbudzenie fluorescencji 488 nm dla drugiej.
  7. Ponownie złożone próbki przenieść do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, zamknąć pokrywę i przechowywać próbki w temperaturze pokojowej w ciemności przez 24 godziny, aby umożliwić całkowite ponowne złożenie wariantów EGFP.
  8. Zmierzyć emisję fluorescencji ponownie sfałdowanych próbek białek zgodnie z krokiem 6.6 przy użyciu tej samej długości fali wzbudzenia, co poprzednio, aby uchwycić czasowy punkt końcowy odzyskiwania fluorescencji.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na początku badania wybraliśmy trzy różne warianty białek fluorescencyjnych, które mają wspólną architekturę macierzystego GFP. Pierwszym wybranym białkiem był EGFP, który jest zmodyfikowanym wariantem pochodzącym z oryginalnego GFP meduzy Aequorea victoria zawierającego mutacje Phe64Leu/Ser65Thr. Drugim wybranym białkiem był NowGFP51,60. Jest to również wariant A. victoria GFP uzyskany w drodze mutagenezy w kilku etapach za pośrednictwem poprzedzających białek fluorescencyjnych. NowGFP zawiera 18 mutacji w porównaniu do swojego bezpośredniego poprzednika, białka fluorescencyjnego "Cerulean"61. Z kolei białko "Cerulean" jest pochodną wzmocnionego cyjanowego białka fluorescencyjnego (ECFP)62,63, białka wcześniej wyselekcjonowanego przez kierowaną ewolucję laboratoryjną i zawierającego chromofor na bazie tryptofanu. Zarówno EGFP, jak i NowGFP są szeroko stosowane w biologii komórki i badaniach biofizycznych i zawierają w swoich strukturach dziesięć konserwatywnych reszt proliny. Ponadto NowGFP ma jedenastą resztę proliny w pozycji 230, która pojawiła się z powodu obszernej historii mutacji tego wariantu białka. Trzecim wybranym białkiem było białko fluorescencyjne KillerOrange64,65. Jest pochodną chromoproteiny anm2CP z rodzaju hydrozoan Anthoathecata. Sekwencja białkowa zawiera 15 reszt proliny, a chromofor jest oparty na tryptofanie, a nie na reszcie tyrozyny. Struktury rentgenowskie o wysokiej rozdzielczości zostały zgłoszone dla wszystkich trzech wybranych białek (Rysunek 2)51,65,66.

W pierwszym kroku, analogi proliny (Rysunek 1D) zostały włączone do wszystkich pozycji proliny trzech modelowych białek (EGFP, NowGFP i KillerOrange) poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI, schemat procedury jest podany w Rysunek 3). Instrumentalnie do ekspresji białek w obecności proliny i analogów użyto prolinowo-auksotroficznego szczepu E. coli K12 JM8367 (Figura 1D), dając odpowiednio białka typu dzikiego i zmodyfikowanego. Osady z komórek wyrażających natywne białko i warianty zawierające S-Flp i Dhp miały typowy jasny kolor ze względu na nienaruszony chromofor, podczas gdy warianty zawierające R-Flp i Dfp pozostały bezbarwne, co wskazuje na nieprawidłowe fałdowanie i odkładanie się niesfałdowanego białka w ciałach inkluzyjnych (Figura 4A). Analiza SDS-PAGE ekspresji próbek potwierdziła obecność nierozpuszczalnych białek zawierających R-Flp (Rysunek 4B-D), co uniemożliwiło dalsze badania. Chociaż wykracza to poza zakres niniejszego badania, należy zauważyć, że problemy z rozpuszczalnością białek i nieprawidłowym fałdowaniem mogą być do pewnego stopnia złagodzone przez procedury ponownego fałdowania in vitro68. W przeciwieństwie do tego, białka natywne, a także warianty zawierające S-Flp i Dhp znaleziono głównie we frakcjach rozpuszczalnych (Rysunek 4B-D). Warianty typu dzikiego, a także zawierające S-Flp i Dhp, można było dalej izolować i charakteryzować w badaniach fluorescencyjnych. Rozpuszczalne białka oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa immobilizowanych jonów metali (IMAC), uzyskując 20-30 mg/l objętości kultury dla EGFP, 60-80 mg dla NowGFP i KillerOrange, których wydajność dla białek typu dzikiego i modyfikowanych była bardzo podobna. Analiza sprzężona z chromatografią cieczową i spektrometrią mas (LC-MS) potwierdziła oczekiwaną tożsamość i czystość izolatów otrzymanych w ten sposób (Rysunek 5). W widmach masowych każda zamiana proliny z S-Flp powodowała przesunięcie +18 Da na każdą resztę proliny w sekwencji, podczas gdy w przypadku zamiany proliny na Dhp przesunięcie wynosiło -2 Da na resztę.

W następnym kroku zarejestrowano widma absorpcji i emisji światła, aby przeanalizować potencjalny wpływ inkorporacji niekanonicznych analogów proliny na właściwości spektroskopowe macierzystych białek fluorescencyjnych (Rysunek 6). Widma absorpcyjne UV-Vis wykazały typowe pasmo około 280 nm charakterystyczne dla reszt aromatycznych, tyrozyny i tryptofanu, podczas gdy absorbancję chromoforu stwierdzono przy 488 nm dla EGFP i 493 nm dla NowGFP (Rysunek 6A,B). W KillerOrange obszar absorbancji chromoforu składał się z dwóch pasm (Rysunek 6C), które odpowiadają dwóm możliwym stanom konfiguracyjnym i ładunkowym chromoforu złożonego. Pasmo około 510 nm jest znane jako stan, w którym zachodzi fluorescencja z wysoką wydajnością kwantową49,65. W wariantach zastępujących prolinę zaobserwowano, co następuje: Włączenie Dhp nie zmieniło widm absorbancji EGFP i NowGFP, podczas gdy S-Flp powodowało zwiększoną absorpcję UV. To ostatnie można wytłumaczyć indukowanymi różnicami w mikrośrodowiskach reszt tryptofanu, w szczególności Trp57 umieszczonego pomiędzy trzema S-Flp w motywie PVPWP (Rysunek 6A,B)69. Bardziej trywialne wyjaśnienie wyższej absorpcji promieniowania UV może jednak wynikać ze zwiększonej frakcji nieprawidłowo pofałdowanego białka. Ponieważ stężenie białka oceniano za pomocą kwantyfikacji cech absorbancji, obecność białka z nieprawidłowo dojrzałym chromoforem może zwiększyć absorbancję, podczas gdy ta frakcja nie jest wliczana do całkowitego stężenia (Rysunek 6A,B). Wspierając tę hipotezę, zaobserwowaliśmy, że EGFP zawierający S-Flp wykazywał znacznie zmniejszony stosunek chromoforu do połączonej absorbancji tryptofanu i tyrozyny (ε(CRO)/ε(Tyr+Trp) = 0,96) w porównaniu z wyższą wartością (1,57) w białku macierzystym (Tabela 2)70. Obecność frakcji niefluorescencyjnej w EGFP zawierającym S-Flp będzie ważnym czynnikiem przyczyniającym się do dalszej analizy właściwości białka. W wariancie KillerOrange zawierającym S-Flp zaobserwowano zwiększoną absorbancję wraz z przesunięciem ku czerwieni w paśmie chromoforu. Fakt ten wskazywał, że formacja chromoforu faworyzowała konfigurację o dużej wydajności kwantowej fluorescencji (Rysunek 6C).

Następnie przeanalizowaliśmy widma fluorescencji białek zarejestrowanych podczas wzbudzenia przy odpowiednich maksymalnych długościach fal absorbancji. Uzyskane wyniki wskazują, że widma pozostały zasadniczo identyczne dla badanych wariantów białek fluorescencyjnych zawierających prolinę i zamienniki S-Flp i Dhp. Wynik ten sugeruje, że analogi w żadnym wypadku nie zmieniły środowiska chemicznego chromoforu (Rysunek 6G-I). Mimo to zaobserwowano wyraźne różnice w widmach fluorescencji KillerOrange zarejestrowanych po wzbudzeniu przy 295 nm, a więc po wzbudzeniu tryptofanu. Eksperyment ten śledzi transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) lub bezpośrednie sprzężenie ekscytoniczne, które zachodzi między łańcuchami bocznymi tryptofanu a dojrzałym chromoforem, ponieważ oba znajdują się w niewielkiej odległości nie większej niż 25 A. W przypadku wariantów EGFP i NowGFP, gdy widma emisyjne mierzono za pomocą wzbudzenia 295 nm, zaobserwowano silną emisję chromoforu wraz z prawie żadną emisją tryptofanu (Rysunek 6D,E). Jednak warianty zawierające S-Flp wykazywały nieco większą emisję specyficzną dla tryptofanu. Obserwację tę można powiązać z niezliczonym wkładem rozwiniętej apoproteiny, która zawiera tryptofany, ale nie dojrzały chromofor. Znacznie zwiększoną emisję specyficzną dla tryptofanu zaobserwowano w KillerOrange, co wskazuje na brak wygaszania fluorescencji poprzez oczekiwany mechanizm transferu energii wzbudzenia lub sprzężenia ekscytonowego. Warianty białek zawierające prolinę i S-Flp wykazywały porównywalną emisję tryptofanu wraz z preferowaną cechą fluorescencji przesuniętej ku czerwieni o wysokiej wydajności kwantowej. W przeciwieństwie do tego, wariant zawierający Dhp wykazał drastyczny spadek intensywności fluorescencji chromoforu, prawdopodobnie z powodu niewielkich efektów strukturalnych (Rysunek 6F).

Następnie porównaliśmy właściwości fałdowania białek, przeprowadzając eksperyment z rozwijaniem/renaturacją. Widma emisyjne fluorescencji rejestrowano w stanie złożonym (sekcja 5 protokołu), po denaturacji chemicznej, a następnie w procesie ponownego fałdowania monitorowane przez okres 24 godzin (sekcja 6 protokołu). Widma zarejestrowano po wzbudzeniu na obu odpowiednich długościach fal, 295 nm, oraz na maksimach widm absorbancji chromoforów, podczas gdy uzyskana fluorescencja jest przedstawiona jako znormalizowana do maksymalnej wartości dla każdego białka (Rysunek 7). Pod koniec protokołu zaobserwowaliśmy, że warianty EGFP mogą się ponownie zwinąć, podczas gdy warianty NowGFP i KillerOrange - po denaturacji - pozostały rozwinięte (dane nie pokazane). W związku z tym zdolności do ponownego fałdowania pierwotnych białek fluorescencyjnych różniły się znacznie. Warto zauważyć, że KillerOrange został opracowany jako fotosensybilizator, począwszy od wariantu chromoproteiny hydrozoan KillerRed65,71, a jego ponowne składanie zazwyczaj pozostaje w tyle pomimo solidnej konstrukcji β-lufowej. W naszych eksperymentach stwierdziliśmy, że fluorescencja chromoforu EGFP typu dzikiego odzyskała się tylko częściowo, chociaż fluorescencja specyficzna dla tryptofanu była większa po renaturacji (Figura 7A,D). Zasadniczo podobne zachowanie zaobserwowano w wariancie zawierającym Dhp (Rysunek 7C,F). W EGFP zawierającym S-Flp podobny wynik zaobserwowano, gdy wzbudzenie przeprowadzono na specyficznej dla tryptofanu długości fali 295 nm (Rysunek 7B). Uderzające jest to, że fluorescencja powróciła do znacznie większego zakresu, gdy chromofor został wzbudzony przy 488 nm (Rysunek 7E). Wydaje się, że S-Flp indukuje znacznie lepszą wydajność ponownego składania w porównaniu z pozostałymi dwoma wariantami. Jednak tego korzystnego efektu nie zaobserwowano przy użyciu wzbudzenia 295 nm z powodu nieznanych interakcji molekularnych.

Następnie, prędkość ponownego fałdowania była monitorowana poprzez rejestrację fluorescencji zarówno tryptofanu, jak i chromoforu, oddzielnie, podczas gdy punkt końcowy procesu był określany po 24 godzinach od rozpoczęcia renaturyzacji. Tylko warianty EGFP wykazywały stosunkowo szybką kinetykę ponownego fałdowania, którą można było wiarygodnie ocenić, podczas gdy żaden ze zdenaturowanych wariantów NowGFP i KillerOrange nie mógł powrócić do wartości umożliwiającej dalsze pomiary ilościowe. W EGFP odzysk emisji tryptofanu był dwa razy szybszy (zakończony w 750 s) w porównaniu z odzyskiem emisji chromoforu (zakończonym w 1500 s), co wskazuje na złożoność procesów leżących u podstaw (Rysunek 8). Przy obu długościach fal wzbudzenia szybkość ponownego fałdowania była podwyższona przez obecność S-Flp, zgodnie z danymi literaturowymi25. W tym samym czasie wariant zawierający DHP wykazywał profil ponownego składania podobny do typu dzikiego.

figure-results-1
Rysunek 1: Rusztowanie strukturalne zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), budowa chromoforu, przejścia konformacyjne proliny i syntetyczne analogi użyte w tym badaniu. (A) Struktura GFP składa się z β-pasm tworzących prawie idealną lufę (tj. "puszkę" o wymiarach 4,2 nm x 2,4 nm), która jest zamknięta na obu końcach α-spiralnymi pokrywkami. Białko GFP o masie 27 kDa wykazuje strukturę trzeciorzędową składającą się z jedenastu nici β, dwóch krótkich α-helis i chromoforu pośrodku. Stany konformacyjne sąsiednich prolin są związane z tworzeniem chromoforów. (B) Autokatalityczne dojrzewanie (kondensacja) chromoforu zachodzi przy resztach Ser65, Tyr66 i Gly67 i przebiega w kilku etapach: Po pierwsze, korekty skrętne w szkielecie polipeptydowym w celu zbliżenia węgla karboksylowego Thr65 do azotu amidowego Gly67. Następnie tworzenie heterocyklicznego układu pierścieniowego imidazoliny-5-onu następuje po nukleofilowym ataku na ten atom węgla przez azot amidowy glicyny, a następnie odwodnieniu. Wreszcie, układ uzyskuje widoczną fluorescencję, gdy utlenianie wiązania węglowego alfa-beta tyrozyny przez tlen cząsteczkowy prowadzi do rozszerzenia sprzężonego układu pierścieniowego imidazoliny, na końcu obejmującego pierścień fenylowy tyrozyny i jego podstawnik paratlenowy. Powstały chromofor para-hydroksybenzylidenimidazolinonu w środku β-cylindra jest całkowicie oddzielony od rozpuszczalnika luzem. (C) Wzory i geometrie struktury szkieletu 1) pierścienia prolinowego (fałdowania) i 2) poprzedzającego wiązania amidowego reprezentują główne przejścia konformacyjne reszty proliny. (D) Analogi proliny użyte w tej pracy z wyznaczonymi fałdami pierścienia proliny. Figura została wygenerowana przy użyciu ChemDraw i Discovery Studio Visualizer. Struktura GFP pochodzi z wpisu struktury PDB 2Q6P. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Białka fluorescencyjne użyte w tym badaniu. Panele pokazują wstęgową reprezentację typowych β-beczkowych struktur trzech różnych wariantów białek fluorescencyjnych: EGFP, NowGFP i KillerOrange, przy czym kolor wstęgi reprezentuje kolor emisji fluorescencji każdego wariantu. Pozostałości proliny (jednoliterowy kod) są wyróżnione jako patyczki, a odpowiednie pozycje są oznaczone. Chromofory są pokazane z początkowym składem aminokwasowym pogrubioną czcionką. Wszystkie reprezentacje struktury zostały utworzone za pomocą PyMol w oparciu o następujące wpisy struktury PDB: 2Q6P dla EGFP, 4RYS dla NowGFP, 4ZFS dla KillerOrange. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Schemat blokowy przedstawiający metodę SPI do specyficznego dla pozostałości włączania niekanonicznych analogów proliny. Prolinowo-auksotroficzny szczep gospodarza Escherichia coli (E. coli) przenoszący gen zainteresowania na plazmidzie ekspresyjnym jest hodowany w określonym minimalnym pożywce ze wszystkimi 20 kanonicznymi aminokwasami, aż do osiągnięcia OD600 ~ 0,7, przy którym hodowla komórkowa znajduje się w środkowej logarytmicznej fazie wzrostu. Komórki są zbierane i przenoszone na świeżą minimalną pożywkę zawierającą 19 kanonicznych aminokwasów i analog proliny. Po dodaniu induktora ekspresja białka odbywa się przez noc. Na koniec białko docelowe jest izolowane przez lizę komórek i oczyszczane przed dalszą analizą. W odmianie protokołu komórki są hodowane w określonym minimalnym pożywce z 19 kanonicznymi aminokwasami, a prolina jest dodawana w ograniczonej ilości (np. Jedna piąta stężenia innych aminokwasów). W ten sposób komórki wydmuchują prolinę w pożywce, zanim będą mogły wyjść z logarytmicznej fazy wzrostu, a następnie dodaje się analog i indukuje się produkcję białka będącego przedmiotem zainteresowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza wyrażeń wariantów EGFP, NowGFP i KillerOrange. (A) Osady komórkowe z 1 ml kultury ekspresyjnej, znormalizowane do OD600 = 2. ANALIZA STRON SDS WARIANTÓW (B) EGFP, (C) NowGFP i (D) KillerOrange. Rozpuszczalne (S) i nierozpuszczalne frakcje (I) każdego fluorescencyjnego pochodnego białka załadowano 15% żelem akrylamidowym, a także eluowane frakcje (E) z IMAC białek rozpuszczalnych. PageRuler Unstained Protein Ladder został użyty jako znacznik (M) na pasach oznaczonych przez (M). Oczekiwane regiony danego białka są ujęte w ramy. Aminokwasy włączone w pozycjach proliny to Pro, R-Flp, S-Flp i Dhp (w (A) pokazano granulki komórkowe z fluorescencyjnych wariantów białek zawierających Dfp zamiast Dfp). Żele były barwione 1% (w/v) Coomassie Brillant Blue. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Analiza spektrometryczna wariantów białek fluorescencyjnych. (A) Reprezentatywne, zdekonwolucyjne widma ESI-MS EGFP oznaczone H6 (), S-Flp-EGFP (pomarańczowy) i Dhp-EGFP (cyjan) z lokalizacją głównych pików masy podanymi jako liczby (w Da). Obliczone masy cząsteczkowe [M+H]+ białek znakowanych H6 to: Dla EGFP 27 745,33 Da (obserwowane 27 746,15 Da); dla S-Flp-EGFP 27 925,33 Da (obserwowane 27 925,73 Da); dla Dhp-EGFP 27 725,33 Da (obserwowane 27 726,01 Da). (B) Reprezentatywne, zdekonwolucyjne widma ESI-MS dlaH-6-znakowanych NowGFP (), S-Flp-NowGFP (pomarańczowy) i Dhp-NowGFP (cyjan) z lokalizacją głównych pików masy podanymi jako liczby (w Da). Obliczone masy białek znakowanych H6 to: Na razie GFP 27 931,50 Da (obserwowane 27 946,46 Da; różnica ~16 Da jest prawdopodobnie spowodowana utlenianiem metioniny w białku); dla S-Flp-NowGFP 28 129,50 Da (obserwowane 28 130,08 Da); dla Dhp-NowGFP 27 909,50 Da (obserwowane 27 910,22 Da). (C) Reprezentatywne, zdekonwolucyjne widma ESI-MS KillerOrange znakowaneH 6 (), S-Flp-KillerOrange (pomarańczowy) i Dhp-KillerOrange (cyjan) z lokalizacją głównych pików masy podanymi jako liczby (w Da). Obliczone masy białek znakowanych H6 to: Dla KillerOrange 27 606,09 Da (obserwowane 27 605,91 Da); dla S-Flp-KillerOrange 27 876,09 Da (obserwowane 27 876,08 Da); dla Dhp-KillerOrange 27 576,09 Da (obserwowane 27 575,93 Da). Odchylenia między obserwowanymi a obliczonymi masami cząsteczkowymi wynoszące około 1 Da mieszczą się w zakresie błędu urządzenia ESI-MS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Absorpcja światła i widma emisji fluorescencji wariantów białek fluorescencyjnych. Znormalizowane widma absorpcyjne UV-VIS przedstawiono dla wariantów (A) EGFP, (B) NowGFP i (C) KillerOrange. Widma znormalizowano do maksimum absorbancji chromoforu (około 500 nm). Pokazano znormalizowane widma emisji fluorescencji wariantów (D,G) EGFP, (E,H) NowGFP i (F,I) KillerOrange. Widma w (D,E,F) mierzono po wzbudzeniu światłem ultrafioletowym (295 nm), dla widm w (G,H,I) do wzbudzenia wykorzystano odpowiednio 488 nm, 493 nm i 510 nm, a widma znormalizowano do odpowiednich maksimów emisji chromoforów (około 500 nm). W każdym panelu czarne krzywe odpowiadają widmom wariantu białka fluorescencyjnego z natywną proliną, pomarańczowe krzywe wskazują widma białek podstawionych S-Flp, a niebieskie krzywe odpowiadają białkom podstawionym Dhp. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Widma emisji fluorescencji wariantów EGFP w eksperymentach z ponownym składaniem. Znormalizowane widma emisji fluorescencji 0,3 μM roztworów wariantów białek fluorescencyjnych w stanie natywnym oraz po denaturacji i ponownym fałdowaniu: Widma w (A,B,C) mierzono po wzbudzeniu światłem ultrafioletowym (295 nm) (A) dla EGFP, (B) dla S-Flp-EGFP i (C) dla Dhp-EGFP. Widma w (D,E,F) mierzono po wzbudzeniu zielonym światłem (488 nm) (D) dla EFGP, (E) dla S-Flp-EGFP i (F) dla Dhp-EGFP. Widma emisyjne próbek natywnych (czarne krzywe) i ponownie zagiętych (kolor zielony odpowiada odpowiednio EGFP, pomarańczowy S-Flp-EGFP i niebieski Dhp-EGFP) każdego wariantu białka są normalizowane do maksymalnej fluorescencji odpowiedniego stanu natywnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Monitorowanie fałdowania białek i dojrzewania chromoforów wariantów EGFP za pomocą fluorescencji. (A) Emisja fluorescencji w obszarze fluorescencji Trp (emisja została ustawiona na 330 nm) zarejestrowana po wzbudzeniu światłem ultrafioletowym (295 nm). (B) Rozwój amplitudy fluorescencji w obszarze emisji chromoforu po wzbudzeniu światłem zielonym (488 nm). Zależne od czasu ślady fluorescencji znormalizowano do jedności (100%) zgodnie z amplitudą fluorescencji osiągniętą na koniec interwału monitorowania. W każdym panelu czarne krzywe odpowiadają widmom fluorescencyjnego wariantu białka z natywną proliną, pomarańczowe krzywe wskazują widma białek podstawionych S-Flp, a niebieskie krzywe odpowiadają białkom podstawionym Dhp. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

konstruowaćSekwencje aminokwasów (podkreślone 6xHis tag):
EGFP-H6MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVP
WPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTR
AEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVN
FKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDH
MVLLEFVTAAGITLGMDELYKHHHHHH
H6-NowGFPMRGSHHQHHHGSVSKGEKLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGDATYGK
MSLKFICTTGKLPVPWPTLKTTLTWGMQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGY
VQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGVDFKEDGNILGHKLEYN
AISGNANITADKQKNGIKAYFTIRHDVEDGSVLLADHYQQNTPIGDGPVLLPD
NHYLSTQSKQSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIPLGADELYK
H6-ZabójcaPomarańczowyMRGSHSHHHHHHGSECGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPH
GDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQWGEPFFARYPDGISHFAQECFPEG
LSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELSDTCVVSRITVNCDGFQPDGPIMRDQ
LVDILPSETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHLDSKMTFNGSR
AIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAHAHSVPRITSAIGSDQD

Tabela 1: Podstawowe struktury docelowych białek. Jego-tagi są podkreślone w każdej sekwencji.

λ [nm]ε [M-1·cm-1] (EGFP)ε [M-1·cm-1] (S-Flp-EGFP)ε [M-1·cm-1] (Dhp-EGFP)
488 (≡ CRO)31 657 (± 1 341)22 950 (± 290)27 800 (± 542)
280 (≡ Tyr+Trp)20 116 (± 172)23 800 (± 715)17 300 (± 554)
Wartości współczynnika ekstynkcji ε (w M-1·cm-1) są obliczane na podstawie zarejestrowanych widm absorpcyjnych UV-Vis odpowiednich wariantów EGFP przy użyciu znanych stężeń białek. Wybrana długość fali przy 280 nm odpowiada maksymalnej absorbancji reszt aromatycznych, tyrozyny i tryptofanu, a 488 nm reprezentuje długość fali absorbancji chromoforu.

Tabela 2: Współczynniki ekstynkcji (ε) wariantów EGFP na wybranych długościach fal. Wartości współczynnika ekstynkcji ε (w M-1·cm-1) oblicza się na podstawie zarejestrowanych widm absorpcyjnych UV-Vis odpowiednich wariantów EGFP przy użyciu znanych stężeń białek. Wybrana długość fali 280 nm odpowiada maksymalnej absorbancji reszt aromatycznych, tyrozyny i tryptofanu, podczas gdy 488 nm odpowiada maksymalnej długości fali absorbancji chromoforu.

Materiał uzupełniający: Przygotowanie roztworów podstawowych i Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W naturze manipulacje strukturami i funkcjami białek zwykle zachodzą z powodu mutacji, zjawiska, które prowadzi do wymiany tożsamości aminokwasów w określonych pozycjach w sekwencji białka. Ten naturalny mechanizm jest szeroko stosowany jako metoda biotechnologiczna inżynierii białkowej w postaci mutagenezy i opiera się na repertuarze 20 kanonicznych aminokwasów biorących udział w tym procesie. Wymiana reszt proliny jest jednak problematyczna. Ze względu na specjalną architekturę grupy szkieletowej, jest on prawie niewymienny z pozostałymi 19 pozostałościami do wymiany72. Na przykład prolina jest zwykle znana jako łamacz struktur drugorzędowych w sekwencjach polipeptydowych ze względu na jej słabą kompatybilność z najczęstszymi strukturami drugorzędowymi, tj. α-helisą i nicią β. Ta cecha proliny jest łatwo tracona, gdy reszta jest zmutowana do innego aminokwasu ze wspólnego repertuaru. Zastąpienie proliny jej chemicznymi analogami stanowi alternatywne podejście, które umożliwia zachowanie podstawowych cech szkieletu macierzystej reszty proliny, przy jednoczesnym narzuceniu odchylenia na jej specyficzne przejścia konformacyjne lub wytwarzaniu modulacji objętości cząsteczkowej i polarności. Na przykład możliwe jest dostarczanie kultur bakteryjnych o strukturach analogowych, takich jak hydroksy-, fluoro-, alkilo-, dehydroproliny, struktury o zmiennych rozmiarach pierścieni i inne, ułatwiając w ten sposób produkcję białka zawierającego specyficzne zmiany reszty proliny.

Opisana w tym badaniu metoda selektywnego włączania ciśnienia (SPI) pozwala na globalną, tj. specyficzną dla reszty wymianę wszystkich prolin w białku docelowym na pokrewne analogi chemiczne. O znaczeniu metody świadczy fakt, że SPI pozwala na tworzenie zmian sekwencji niedostępnych dla powszechnych technik mutagenezy. Na przykład pozwala na produkcję docelowego białka zawierającego raczej niewielkie zmiany strukturalne, które zazwyczaj nie mogą przekraczać jednej lub dwóch podmian/delecji/addycji atomów, jak wykazano w tym badaniu. Takie modyfikacje białek nazywane są "mutacjami atomowymi"73,74. W białku fluorescencyjnym, takim jak GFP, wynik tej intruzji molekularnej można zaobserwować w prędkości fałdowania, lokalnych polaryzacjach, upakowaniu białek, stabilności zaangażowanych cech strukturalnych. Zmiany właściwości absorbancji i fluorescencji powstają pośrednio w wyniku wpływu na fałdowanie białek i mikrośrodowiska pozostałości. Precyzja zmian molekularnych zachodzących w SPI jest zazwyczaj znacznie wyższa w porównaniu z mutacjami prolin do innych reszt kanonicznych, przy czym te ostatnie są zazwyczaj szkodliwe dla fałdowania, produkcji i izolacji białek.

Jako metodę produkcji, podejście SPI wykorzystuje tolerancję substratową kieszeni syntetazy aminoacylo-tRNA w stosunku do chemicznych analogów natywnego aminokwasu. Syntetaza jest odpowiedzialna za prawidłową identyfikację struktury aminokwasu, podczas gdy włączenie do białek następuje w dalszej części procesu translacji. Instrumentalnie produkcja, izolacja i oczyszczanie białek w SPI odbywa się w sposób typowy dla wszelkich innych technik ekspresji białek rekombinowanych; jednak z pewnymi dodatkami do protokołu, jak następuje: Prolina, która jest związana z wymianą, jest dostarczana na początku procesu fermentacji, dzięki czemu komórki mogą rosnąć i rozwijać swoją nienaruszoną maszynerię komórkową. Jednak hodowla komórkowa nie może osiągnąć maksymalnej gęstości optycznej, aby utrzymać komórki w fazie logarytmicznej optymalnej dla ekspresji białek. W tym momencie istnieją dwie główne odmiany metody SPI. W pierwszym z nich stężenie proliny jest regulowane w początkowym pożywce wzrostowej (pożywce zdefiniowanej chemicznie) w taki sposób, że wyczerpanie proliny następuje bez ingerencji z zewnątrz. Komórki wydalają prolinę w pożywce, zanim będą mogły wyjść z logarytmicznej fazy wzrostu, a następnie dodaje się analog i indukuje się produkcję białka będącego przedmiotem zainteresowania. W drugiej wersji metody komórki hoduje się w pożywce zawierającej prolinę do połowy ich fazy logarytmicznej. W tym momencie komórki należy wyjąć i fizycznie przenieść do innego podłoża, które nie zawiera już proliny, tylko analog, z późniejszą indukcją interesującego białka. W obu wersjach analog i odczynnik do indukcji białek są dostarczane do wstępnie wyhodowanych komórek. Izolację i oczyszczanie białka typu dzikiego przeprowadza się w taki sam sposób, jak w przypadku wariantów. W zasadzie każdy dostępny szczep proauksotroficzny może być używany jako gospodarz ekspresji. Niemniej jednak wskazane są testy ekspresji w celu zidentyfikowania najbardziej odpowiedniego gospodarza. Testy różnych chemicznie zdefiniowanych pożywek mogą być również wykorzystane do optymalizacji wydajności białka.

Istnieją pewne wymagania dotyczące analogów chemicznych, które należy wziąć pod uwagę dla SPI, takie jak rozpuszczalność i stężenie. Dostępność metaboliczna i wychwyt aminokwasów zależą od liczby rozpuszczonych cząsteczek w pożywce. Aby zwiększyć rozpuszczalność określonego związku, można wybrać warunki lekko kwaśne lub zasadowe. Ponieważ sztuczne cząsteczki mogą powodować działanie hamujące wzrost ze względu na ich toksyczność komórkową, stężenie powinno być obniżone do minimum, aby uniknąć stresu komórkowego75.

Drobną słabością SPI jest spadek efektywności inkorporacji przy większej liczbie pozycji, które trzeba wymienić. Zasadniczo zmniejszenie częstości aminokwasów w docelowej biomolekułach przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce może rozwiązać ten problem. Jednak na właściwości strukturalne i funkcjonalne pożądanego białka może mieć wpływ zmiana struktury pierwszorzędowej.

Jak wspomniano wcześniej, SPI umożliwia specyficzną dla reszty wymianę aminokwasu kanonicznego. Oznacza to, że aminokwasy niekanoniczne są wprowadzane w każdą pozycję aminokwasu kanonicznego w białku docelowym, w tym konserwatywne reszty, które są niezbędne do funkcjonowania białka lub fałdowania. Alternatywne metody włączania specyficznego dla danego miejsca są jedyną możliwością przezwyciężenia tego problemu3. W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano metodę par ortogonalnych, która może wytwarzać białka zawierające zmodyfikowane reszty w określonych miejscach. Najczęstszą modyfikacją tej metody jest tzw. supresja kodonu stop. Metoda ta opiera się na zaprojektowanym ortogonalnym systemie translacji dedykowanym do specyficznego dla miejsca wprowadzania syntetycznych aminokwasów76. Do tej pory przy użyciu tego podejścia do białek włączono ponad 200 aminokwasów o różnych modyfikacjach łańcucha bocznego77. Jednak te systemy translacyjne nadal nie nadają się do insercji analogów proliny do białek docelowych. Co więcej, wydajność metody jest uważana za niską w przypadku niewielkich modyfikacji aminokwasów, ponieważ pewna rozwiązłość tła syntetazy aminoacylo-tRNA zwykle pozostaje w zmodyfikowanych systemach translacji.

Za pomocą SPI wyprodukowaliśmy szereg β-beczkowych wariantów białek fluorescencyjnych i zbadaliśmy wyniki wymiany proliny z jej nienaturalnymi analogami. W przypadku zastąpienia proliny przez R-Flp i Dfp, dysfunkcyjne białko zostało wytworzone przez gospodarza ekspresji. Efekt ten jest prawdopodobnie spowodowany nieprawidłowym fałdowaniem białek. Ten ostatni może pochodzić z konformacji C 4-egzo promowanej przez R-Flp, która nie jest faworyzowana przez macierzyste struktury białkowe27. W przypadku Dfp nieprawidłowe fałdowanie prawdopodobnie jest spowodowane zmniejszoną prędkością izomeryzacji wiązania peptydowego trans-to-cis na reszcie proliny27. Wiadomo, że ten ostatni jest jednym z etapów ograniczających w profilu kinetycznym fałdowania białka, który wpływa na tworzenie β-beczki, a następnie dojrzewanie chromoforu. Rzeczywiście, w przypadku obu aminokwasów, R-Flp i Dfp, produkcja białka doprowadziła do zagregowanego i nierozpuszczalnego białka. W związku z tym nie mogło dojść do powstania chromoforu, a fluorescencja została całkowicie utracona. Jednak w przypadku S-Flp i Dhp zaobserwowano prawidłowe dojrzewanie białek, w wyniku czego uzyskano próbki białek fluorescencyjnych dla każdej kombinacji analog/białko. Pomimo pewnych modulacji cech absorbancji i fluorescencji białka, w dużej mierze pozostały one podobne do tych w białkach typu dzikiego. Efekt substytucji aminokwasów został ujawniony w badaniach kinetyki fałdowania. Ten ostatni wykazał szybsze ponowne fałdowanie w przypadku zastąpienia S-Flp. Badania modelowe wykazały, że ta pozostałość może powodować pewną poprawę prędkości rotacji amidu trans-do cisu i prowadzić do powstania konformacji C4-endo. Oba te czynniki mogą przyczyniać się do korzystnych skutków kinetycznych tej pozostałości w EGFP. W przeciwieństwie do tego, Dhp wytwarzał kinetyczne profile fałdowania maksymalnie podobne do białka macierzystego. Różnorodność wyników uzyskanych przez zwykłe mutacje atomowe w badanych białkach fluorescencyjnych ilustruje potencjał metody produkcji SPI w zmianie właściwości białek docelowych. Zmiany białek wywołane przez zastąpienie proliny analogami mają dalsze implikacje w inżynierii enzymów 78,79,80 i kanałów jonowych 81,82, a także w ogólnej inżynierii stabilności białek.

Podstawowym ograniczeniem metody SPI jest jej tryb "all-or-none" w wymianie proliny na pokrewne analogi. Byłoby bardzo korzystne, gdyby można było precyzyjnie wybrać, które reszty proliny należy zastąpić analogami, a które powinny pozostać niezmodyfikowane. Jednak obecnie nie ma techniki, która pozwoliłaby na przeprowadzenie tak wyrafinowanej produkcji przy użyciu gospodarza produkcji mikrobiologicznej. Chemiczna synteza białek83,84, a także produkcja bezkomórkowa85,86, to dwie alternatywne metody, które mogą powodować modyfikacje proliny specyficzne dla pozycji. Niemniej jednak ich złożoność operacyjna i niska wydajność produkcji sprawiają, że są gorsze w porównaniu z produkcją w żywych komórkach. Jak dotąd, SPI pozostaje najprostszym pod względem operacyjnym i niezawodnym podejściem do produkcji złożonych białek z mutacjami atomowymi. Wprowadzając nienaturalne substytuty aminokwasów, metoda pozwala na modyfikację cech białek w sposób ukierunkowany, czego przykładem są zmiany w fałdowaniu i absorpcji/emisji światła białek fluorescencyjnych generowanych przez substytucje proliny.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy ujawniają wszelkie konflikty interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Niemiecką Fundację Badawczą (Klaster Doskonałości "Unifying Systems in Catalysis") dla T.F. i N.B. oraz przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Nauki (BMBF Program "HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio) dla F.-J.S. i T.M.T.T.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonitrylVWRHiPerSolv CHROMANORM ULTRA do LC-MS, wymagany stopień 83642LC-MS
Wodny roztwór podstawowy akryloamidu i bisakryloamidu w stosunku 37,5:1 (żel ROTIPHORESE 30)Carl Roth3029.1
Agar-agarCarl Roth5210
Molibdenian amonu ((NH4)2MoO4)Sigma-Aldrich277908
Nadtlenosiarczan amonu (APS)Carl Roth9592.2≥ 98 %, rocznie, wymagany stopień ACS
Siarczan amonu ((NH4)2SO4)Sigma-AldrichA4418
Sól sodowa ampicylinyCarl RothK029
BiotynaSigma-AldrichB4501
Błękit bromofenolowySigma-AldrichB0126
Chlorek wapnia (CaCl< sub>2)Sigma-AldrichC5670
Coomassie Brillant Blue R 250Carl Roth3862
Siarczan miedzi (CuSO4)Carl RothCP86.1
D-glukozaCarl Roth6780
1,2-bis-(dimetyloamino)-etan,  N,N,N',N'-Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Carl Roth2367.3≥ 99 % rocznie, do elektroforezy
1,4-ditiotreitol (DTT)Carl Roth6908
Dichlorometan (DCM)Sigma-Aldrich270997
wodorofosforan dipotasu (K2HPO4)Carl RothP749.1
wodorofosforan disodowy (Na2HPO4)Carl RothX987
DNase ISigma-AldrichD5025
Dowex 50WX8-100 (forma wodorowa)Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, Stany Zjednoczone)10731181żywica kationowymienna
EtanolCarl Roth9065.1
Kwas mrówkowyVWRHiPerSolv CHROMANORM dla LC-MS, wymagany 84865LC-MS
Lodowcowy kwas octowyCarl Roth3738.5100 %, p. a.
GlicerolCarl Roth3783
ImidazolCarl RothX998
Chlroide wodoru (HCl)Merck295426
Chlorek żelaza(II) (FeCl2)Sigma-Aldrich380024
IsopropanolCarl RothAE73.1
Izopropyl β-D-1- tiogalaktopiranozyd (IPTG)Sigma-AldrichI6758
LizozymSigma-AldrichL6876
Chlorek magnezu (MgCl2)Carl RothKK36.1
Siarczan magnezu (MgSO4)Carl Roth8283.2
Chlorek manganu (MnCl2)Sigma-Aldrich63535
β-merkaptoetanolCarl Roth4227.3
PageRuler Niebarwiona drabinka białkowaThermo Fisher Scientific26614
Chlorek potasu (KCl)Carl Roth6781.3
Diwodorofosforan potasu (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655
RNaza ACarl Roth7156
Chlorek sodu (NaCl)Carl RothP029
Diwodorofosforan sodu (NaH2PO4)Carl RothT879
Dodecylosiarczan sodu (NaC12H25SO4)Carl Roth0183
TiaminaSigma-AldrichT4625
Kwas trifluorooctowy (TFA)Sigma-AldrichT6508
Chlorowodorek Tris (Tris-HCl)Sigma-Aldrich857645
Tris(hydroksymetylo)-aminometan (Tris)Carl Roth5429
TryptonCarl Roth8952
Ekstrakt drożdżowyCarl Roth2363
Chlorek (ZnCl2)Sigma-Aldrich229997
L-alaninaSigma-AldrichA7627
L-argininaSigma-AldrichA5006
L-asparaginaSigma-AldrichA8381
L-asparaginaSigma-AldrichA0884
L-cysteinaSigma-AldrichC7352
L-glutaminowy kwasSigma-AldrichG2128
L-glutaminaSigma-AldrichG3126
L-glicynaSigma-AldrichG7126
L-histydynaSigma-AldrichH8000
L-izoleucynaSigma-AldrichI2752
L-leucynaSigma-AldrichL8000
L-lizynaSigma-AldrichL5501
L-metioninaSigma-AldrichM9625
L-fenyloalaninaSigma-AldrichP2126
L-prolineSigma-AldrichP0380
L-serynaSigma-AldrichS4500
L-treoninaSigma-AldrichT8625
L-tryptofanSigma-AldrichT0254
L-tyrozynaSigma-AldrichT3754
L-walinaSigma-AldrichV0500
(4S)-fluoroprolinaBachem4033274Upewnij się, że wszystkie analogi proliny nie zawierają proliny, sprawdź zawartość. W przeciwnym razie należy wykonać krok w celu spożycia zanieczyszczeń proliną podczas odciągania.
(4R)-fluoroprolineBachem4033275Upewnij się, że wszystkie analogi proliny są wolne od proliny, sprawdź zawartość. W przeciwnym razie uwzględnij krok do spożycia zanieczyszczeń proliny podczas odciągania
3,4-dehydroprolinyBachem4003545Upewnij się, że wszystkie analogi proliny są wolne od proliny, sprawdź zawartość. W przeciwnym razie uwzględnij krok do spożycia zanieczyszczeń proliną podczas odciągania
4,4-difluoroprolinyEnamineEN400-17448Upewnij się, że wszystkie analogi proliny są wolne od proliny, sprawdź zawartość. W przeciwnym razie uwzględnij krok do spożycia zanieczyszczeń proliną podczas odciągania
Stożkowe probówki polistyrenowe (Falcon), 15 mlFisher Scientific14-959-49B
Stożkowe probówki polistyrenowe (Falcon), 50 mlFisher Scientific14-432-22
Membrana do dializy, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000Spectrum Medical IndustriesSpectra/Por MWCO 5000 membrana dializacyjna, 133198
Kolumna do chromatografii powinowactwa do immobilizowanych jonów metali (IMAC) 1 ml, Ni-NTAGE HealthcareHisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01
Strzykawka Luer-Lock, 5 mlRothEP96.1
Luer-Lock, 20 mlRothT550.1
Luer-Lock, 50 mlCarl RothT552.1
Probówki do mikrowirówek, 1,5 mlEppendorf
szalki Petriego (polistyren, sterylne)Carl RothTA19
pQE-80L wektor plazmidowyQiagennie jest już dostępnyzastąpiony przez N-koniec pQE Zestaw wektorów Nr kat./ID: 32915
Pro-auksotroficzny E. coli szczep JM83Addgene50348https://www.addgene.org/50348/
Proauksotroficzny E. coli szczep JM83ATCC35607
Rurki z polistyrenu okrągłodennego, 14 mlFisher ScientificCorning Falcon, 14-959-1B
Filtr strzykawkowy 0,45 i mikro; m z membraną z polifluorku winylidenu (PVDF)RothCCY1.1
Kolumna do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) do LC-ESI-TOF-MSSigma-AldrichSupelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC, 3 i mikro; m wielkość cząstek, 10 cm x 2,1 mmze stożkowymi wkładkami szklanymi 0,1 ml, nakrętkami i
fiolkami z autosamplerem przegrodowym HPLC 1,5 mlSigma-AldrichSupelco 854165
Spektrometr masowy do LC-ESI-TOF-MSAgilentAgilent 6530 Oprogramowanie
danychAgilentMassHunter do analizy jakościowej v. B.06.00
Wirówka stołowa do probówek Eppendorf 1,5 mlEppendorf5427 R
Wirówka chłodząca do probówek Falcon 50 mlSystem Eppendorf5810 R
do szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC)GE HealthcareÄ KTA pure 25 L
Spektrometr fluorescencyjnyPerkin ElmerLS 55
Wysokociśnieniowy mikrofluidyzator do rozbijania komórek bakteryjnychMikrofluidykaSeria LM z " Z” typ komora
Wytrząsarka orbitalna do hodowli bakteriiInfors HTMinitron
Pompa perystaltyczna do chromatografii cieczowej (LC)GE HealthcareP-1
Homogenizator ultradźwiękowy do rozbijania komórek bakteryjnychOmnilabBandelin SONOPULS HD 3200, 5650182z końcówką sonifikatora MS72
Spektrofotometr UV-VisBiochromULTROSPEC 2100
Spektrofotometr UV-Vis/NIRPerkin ElmerLAMBDA 950 UV/Vis/NIR
Strzykawka Carl Strzykawka Carl 30120086 Carl do analizy danych spektrometrii mas Accurate-Mass QTOF Oprogramowanie do analizy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Agostini, F., Völler, J. -S., Koksch, B., Acevedo-Rocha, C. G., Kubyshkin, V., Budisa, N. Biocatalysis with unnatural amino acids: Enzymology meets xenobiology. Angewandte Chemie (International ed. In English). 56 (33), 9680-9703 (2017).
  2. Minks, C., Alefelder, S., Moroder, L., Huber, R., Budisa, N. Towards new protein engineering: In vivo building and folding of protein shuttles for drug delivery and targeting by the selective pressure incorporation (SPI) method. Tetrahedron. 56 (48), 9431-9442 (2000).
  3. Hoesl, M. G., Budisa, N. Expanding and engineering the genetic code in a single expression experiment. Chembiochem: A, European Journal of Chemical Biology. 12 (4), 552-555 (2011).
  4. Wiltschi, B., Budisa, N. Natural history and experimental evolution of the genetic code. Applied Microbiology and Biotechnology. 74 (4), 739-753 (2007).
  5. Hoesl, M. G., et al. Lipase congeners designed by genetic code engineering. ChemCatChem. 3 (1), 213-221 (2011).
  6. FPbase avGFP. , Available from: https://www.fpbase.org/protein/avgfp/ (2011).
  7. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
  8. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418 (6895), 331-335 (2002).
  9. Misteli, T., Spector, D. L. Applications of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology. Nature Biotechnology. 15 (10), 961-964 (1997).
  10. Hanson, M. R., Köhler, R. H. GFP imaging: methodology and application to investigate cellular compartmentation in plants. Journal of Experimental Botany. 52 (356), 529-539 (2001).
  11. Sakamoto, S., Shoyama, Y., Tanaka, H., Morimoto, S. Application of green fluorescent protein in immunoassays. Advances in Bioscience and Biotechnology. 05 (6), 557-563 (2014).
  12. Akbar, M., Kim, H. Y. Green fluorescent protein tagging: A novel tool in biomedical research. Indian Journal of Biotechnology. 4, 466-470 (2005).
  13. Kobayashi, T., Morone, N., Kashiyama, T., Oyamada, H., Kurebayashi, N., Murayama, T. Engineering a novel multifunctional green fluorescent protein tag for a wide variety of protein research. PloS One. 3 (12), 3822(2008).
  14. Kent, K. P., Oltrogge, L. M., Boxer, S. G. Synthetic control of green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (44), 15988-15989 (2009).
  15. Born, J., Pfeifer, F. Improved GFP variants to study gene expression in Haloarchaea. Frontiers in Microbiology. 10, 1200(2019).
  16. Pakhomov, A. A., Martynov, V. I. GFP family: structural insights into spectral tuning. Chemistry & Biology. 15 (8), 755-764 (2008).
  17. Zimmer, M. Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophysical behavior. Chemical Reviews. 102 (3), 759-781 (2002).
  18. Valbuena, F. M., Fitzgerald, I., Strack, R. L., Andruska, N., Smith, L., Glick, B. S. A photostable monomeric superfolder green fluorescent protein. Traffic. 21 (8), Copenhagen, Denmark. 534-544 (2020).
  19. Craggs, T. D. Green fluorescent protein: structure, folding and chromophore maturation. Chemical Society Reviews. 38 (10), 2865-2875 (2009).
  20. Maddalo, S. L., Zimmer, M. The role of the protein matrix in green fluorescent protein fluorescence. Photochemistry and Photobiology. 82 (2), 367-372 (2006).
  21. Cui, G., Lan, Z., Thiel, W. Intramolecular hydrogen bonding plays a crucial role in the photophysics and photochemistry of the GFP chromophore. Journal of the American Chemical Society. 134 (3), 1662-1672 (2012).
  22. Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
  23. Andrews, B. T., Roy, M., Jennings, P. A. Chromophore packing leads to hysteresis in GFP. Journal of Molecular Biology. 392 (1), 218-227 (2009).
  24. Xie, J. -B., Zhou, J. -M. Trigger factor assisted folding of green fluorescent protein. Biochemistry. 47 (1), 348-357 (2008).
  25. Steiner, T., Hess, P., Bae, J. H., Wiltschi, B., Moroder, L., Budisa, N. Synthetic biology of proteins: tuning GFPs folding and stability with fluoroproline. PloS One. 3 (3), 1680(2008).
  26. Andrews, B. T., Schoenfish, A. R., Roy, M., Waldo, G., Jennings, P. A. The rough energy landscape of superfolder GFP is linked to the chromophore. Journal of Molecular Biology. 373 (2), 476-490 (2007).
  27. Kubyshkin, V., Davis, R., Budisa, N. Biochemistry of fluoroprolines: the prospect of making fluorine a bioelement. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 17, 439-460 (2021).
  28. Renner, C., Alefelder, S., Bae, J. H., Budisa, N., Huber, R., Moroder, L. Fluoroprolines as tools for protein design and engineering. Angewandte Chemie (International ed. In English). 40 (5), 923-925 (2001).
  29. Fukuda, H., Arai, M., Kuwajima, K. Folding of green fluorescent protein and the cycle3 mutant. Biochemistry. 39 (39), 12025-12032 (2000).
  30. Rosenman, D. J., et al. Green-lighting green fluorescent protein: faster and more efficient folding by eliminating a cis-trans peptide isomerization event. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 23 (4), 400-410 (2014).
  31. Vitagliano, L., Berisio, R., Mastrangelo, A., Mazzarella, L., Zagari, A. Preferred proline puckerings in cis and trans peptide groups: implications for collagen stability. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 10 (12), 2627-2632 (2001).
  32. Kubyshkin, V. Experimental lipophilicity scale for coded and noncoded amino acid residues. Organic and Biomolecular Chemistry. 19 (32), 7031-7040 (2021).
  33. Kubyshkin, V., Budisa, N. cis-trans-Amide isomerism of the 3,4-dehydroproline residue, the 'unpuckered' proline. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 12, 589-593 (2016).
  34. Budisa, N. Prolegomena to future experimental efforts on genetic code engineering by expanding its amino acid repertoire. Angewandte Chemie (International ed. In English). 43 (47), 6426-6463 (2004).
  35. Beatty, K. E., Tirrel, D. A. Noncanonical amino acids in protein science and engineering. Protein Engineering. Nucleic Acids and Molecular Biology. 22, Springer. Berlin, Heidelberg. (2009).
  36. Budisa, N. Engineering the Genetic Code: Expanding the Amino Acid Repertoire for the Design of Novel Proteins. , WILEY-VCH. Weinheim. (2006).
  37. Merkel, L., Budisa, N. Organic fluorine as a polypeptide building element: in vivo expression of fluorinated peptides, proteins and proteomes. Organic & Biomolecular Chemistry. 10 (36), 7241-7261 (2012).
  38. van Eldijk, M. B., van Hest, J. C. M. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids for protein engineering. Methods in Molecular Biology. 1728, Clifton, N.J. 137-145 (2018).
  39. Hartman, M. C. T. Non-canonical amino acid substrates of E. coli aminoacyl-tRNA synthetases. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. , (2021).
  40. Gomez, M. A. R., Ibba, M. Aminoacyl-tRNA synthetases. RNA. 26 (8), 910-936 (2020).
  41. Grant, M. M., Brown, A. S., Corwin, L. M., Troxler, R. F., Franzblau, C. Effect of l-azetidine 2-carboxylic acid on growth and proline metabolism in Escherichia coli. Biochimica et Biophysica Acta. 404 (2), 180-187 (1975).
  42. Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 230 (2), 788-796 (1995).
  43. Budisa, N., Pal, P. P. Designing novel spectral classes of proteins with a tryptophan-expanded genetic code. Biological Chemistry. 385 (10), 893-904 (2004).
  44. Hoesl, M. G., Budisa, N. Recent advances in genetic code engineering in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 751-757 (2012).
  45. Nickling, J. H., et al. Antimicrobial peptides produced by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57551(2018).
  46. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  47. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  48. Sarkisyan, K. S., et al. fluorescent protein with anionic tryptophan-based chromophore and long fluorescence lifetime. Biophysical Journal. 109 (2), 380-389 (2015).
  49. Sarkisyan, K. S., et al. KillerOrange, a genetically encoded photosensitizer activated by blue and green light. PloS One. 10 (12), 0145287(2015).
  50. Grigorenko, B. L., Krylov, A. I., Nemukhin, A. V. Molecular modeling clarifies the mechanism of chromophore maturation in the green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 139 (30), 10239-10249 (2017).
  51. Pletnev, V. Z., et al. Structure of the green fluorescent protein NowGFP with an anionic tryptophan-based chromophore. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71, Pt 8 1699-1707 (2015).
  52. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  53. Hörnsten, E. G. On culturing Escherichia coli on a mineral salts medium during anaerobic conditions. Bioprocess Engineering. 12 (3), 157-162 (1995).
  54. Davis, B. D. The Isolation of biochemically deficient mutants of bacteria by means of penicillin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 35 (1), 1-10 (1949).
  55. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, USA. (2001).
  56. Wang, Y. -S., et al. The de novo engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase for genetic incorporation of L-phenylalanine and its derivatives. Molecular bioSystems. 7 (3), 714-717 (2011).
  57. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. ImageJ at (2021).
  58. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).
  59. Baumann, T., et al. Engineering 'Golden' fluorescence by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids and protein analysis by mass spectrometry and fluorescence. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57017(2018).
  60. FPbase NowFFP. , Available from: https://www.fpbase.org/protein/nowgfp/ (2021).
  61. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PloS One. 6 (3), 17896(2011).
  62. Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. Chromophore isomer stabilization is critical to the efficient fluorescence of cyan fluorescent proteins. Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).
  63. Lelimousin, M., et al. Intrinsic dynamics in ECFP and Cerulean control fluorescence quantum yield. Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).
  64. FPbase mKillerOrange. , Available from: https://www.fpbase.org/protein/mkillerorange/ (2021).
  65. Pletneva, N. V., et al. Crystal structure of phototoxic orange fluorescent proteins with a tryptophan-based chromophore. PloS One. 10 (12), 0145740(2015).
  66. Royant, A., Noirclerc-Savoye, M. Stabilizing role of glutamic acid 222 in the structure of Enhanced Green Fluorescent Protein. Journal of Structural Biology. 174 (2), 385-390 (2011).
  67. Larregola, M., Moore, S., Budisa, N. Congeneric bio-adhesive mussel foot proteins designed by modified prolines revealed a chiral bias in unnatural translation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421 (4), 646-650 (2012).
  68. Yamaguchi, H., Miyazaki, M. Refolding techniques for recovering biologically active recombinant proteins from inclusion bodies. Biomolecules. 4 (1), 235-251 (2014).
  69. Ghisaidoobe, A. B. T., Chung, S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: A focus on Förster resonance energy transfer techniques. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22518-22538 (2014).
  70. Pal, P. P., et al. Structural and spectral response of Aequorea victoria green fluorescent proteins to chromophore fluorination. Biochemistry. 44 (10), 3663-3672 (2005).
  71. Pletnev, S., et al. Structural basis for phototoxicity of the genetically encoded photosensitizer KillerRed. The Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 32028-32039 (2009).
  72. Kubyshkin, V., Budisa, N. Anticipating alien cells with alternative genetic codes: away from the alanine world. Current Opinion in Biotechnology. 60, 242-249 (2019).
  73. Minks, C., Huber, R., Moroder, L., Budisa, N. Atomic mutations at the single tryptophan residue of human recombinant annexin V: effects on structure, stability, and activity. Biochemistry. 38 (33), 10649-10659 (1999).
  74. Budisa, N., Huber, R., Golbik, R., Minks, C., Weyher, E., Moroder, L. Atomic mutations in annexin V thermodynamic studies of isomorphous protein variants. European Journal of Biochemistry. 253, 1-9 (1998).
  75. Lin, X., Yu, A. C. S., Chan, T. F. Efforts and challenges in engineering the genetic code. Life. 7, Basel, Switzerland. (2017).
  76. Völler, J. -S., Budisa, N. Coupling genetic code expansion and metabolic engineering for synthetic cells. Current Opinion in Biotechnology. 48, 1-7 (2017).
  77. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annual Review of Biochemistry. 79, 413-444 (2010).
  78. Lukesch, M. S., Pavkov-Keller, T., Gruber, K., Zangger, K., Wiltschi, B. Substituting the catalytic proline of 4-oxalocrotonate tautomerase with non-canonical analogues reveals a finely tuned catalytic system. Scientific Reports. 9 (1), 2697(2019).
  79. Acevedo-Rocha, C. G., et al. Non-canonical amino acids as a useful synthetic biological tool for lipase-catalysed reactions in hostile environments. Catalysis Science & Technology. 3 (5), 1198(2013).
  80. Holzberger, B., Marx, A. Replacing 32 proline residues by a non-canonical amino acid results in a highly active DNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 132 (44), 15708-15713 (2010).
  81. Mosesso, R., Dougherty, D. A., Lummis, S. C. R. Proline residues in the transmembrane/extracellular domain interface loops have different behaviors in 5-HT3 and nACh receptors. ACS Chemical Neuroscience. 10 (7), 3327-3333 (2019).
  82. Mosesso, R., Dougherty, D. A., Lummis, S. C. R. Probing proline residues in the prokaryotic ligand-gated ion channel, ELIC. Biochemistry. 57 (27), 4036-4043 (2018).
  83. Torbeev, V. Deciphering protein folding using chemical protein synthesis. Total Chemical Synthesis of Proteins. 1st ed. , WILEY-VCH. Weinheim. (2021).
  84. Torbeev, V. Y., Hilvert, D. Both the cis-trans equilibrium and isomerization dynamics of a single proline amide modulate β2-microglobulin amyloid assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20051-20056 (2013).
  85. Kawakami, T., Ishizawa, T., Murakami, H. Extensive reprogramming of the genetic code for genetically encoded synthesis of highly N-alkylated polycyclic peptidomimetics. Journal of the American Chemical Society. 135 (33), 12297-12304 (2013).
  86. Cui, Z., Johnston, W. A., Alexandrov, K. Cell-free approach for non-canonical amino acids incorporation into polypeptides. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1031(2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Selektywne wprowadzanie presjizwijanie bia ekstabilno bia ekdojrzewanie chromoforuSDS PAGEspektrometria masrefolding bia ekin ynieria bia ek

Powiązane artykuły