Artykuł metodologiczny

Specyficzna dla reszty wymiana proliny przez analogi proliny w białkach fluorescencyjnych: jak "chirurgia molekularna" kręgosłupa wpływa na fałdowanie i stabilność

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63320

⸱

3 lutego 2022

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 2Department of Chemistry, University of Manitoba, 3Institute of Physics, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

W tym artykule

Podsumowanie

Aby przezwyciężyć ograniczenia klasycznej mutagenezy ukierunkowanej, analogi proliny ze specyficznymi modyfikacjami zostały włączone do kilku białek fluorescencyjnych. Pokazujemy, jak zastąpienie wodoru przez fluor lub pojedynczego przez wiązania podwójne w resztach proliny ("chirurgia molekularna") wpływa na podstawowe właściwości białek, w tym ich fałdowanie i interakcję ze światłem.

Streszczenie

Zastąpienie reszt proliny (Pro) w białkach przez tradycyjną mutagenezę ukierunkowaną przez którykolwiek z pozostałych 19 kanonicznych aminokwasów jest często szkodliwe dla fałdowania białek, a w szczególności dojrzewania chromoforów w białkach zielonej fluorescencji i pokrewnych wariantach. Rozsądną alternatywą jest manipulowanie translacją białka w taki sposób, aby wszystkie reszty Pro zostały zastąpione przez analogi, metoda znana jako selektywne włączenie ciśnienia (SPI). Wbudowane modyfikacje chemiczne mogą być wykorzystywane jako rodzaj "chirurgii molekularnej" do precyzyjnej analizy mierzalnych zmian, a nawet racjonalnego manipulowania różnymi właściwościami białek. W niniejszej pracy wykazano przydatność metody SPI do badania roli prolin w organizacji typowej struktury β-beczkowej wariantów spektralnych białka zielonej fluorescencji (GFP) z 10-15 prolinami w swojej sekwencji: wzmocnione białko zielonej fluorescencji (EGFP), NowGFP i KillerOrange. Pozostałości Pro są obecne w odcinkach łączących między poszczególnymi β-pasmami i stanowią pokrywy zamykające rusztowanie beczki, odpowiadając tym samym za izolację chromoforu od wody, czyli właściwości fluorescencyjne. Eksperymenty z selektywnym włączaniem ciśnienia z (4R)-fluoroproliną (R-Flp), (4S)-fluoroproliną (S-Flp), 4,4-difluoroproliną (Dfp) i 3,4-dehydroproliną (Dhp) przeprowadzono przy użyciu prolino-auksotroficznego szczepu E. coli jako gospodarza ekspresji. Odkryliśmy, że białka fluorescencyjne z S-Flp i Dhp są aktywne (tj. fluorescencyjne), podczas gdy pozostałe dwa analogi (Dfp i R-Flp) wytwarzają dysfunkcyjne, nieprawidłowo sfałdowane białka. Kontrola profili absorpcji i emisji fluorescencji UV-Vis wykazała niewiele charakterystycznych zmian w białkach zawierających analogi Pro. Badanie profili kinetycznych fałdowania w wariantach EGFP wykazało przyspieszony proces ponownego fałdowania w obecności S-Flp, podczas gdy proces ten był podobny do typu dzikiego w białku zawierającym Dhp. Badanie to pokazuje zdolność metody SPI do wytwarzania subtelnych modyfikacji reszt białkowych na poziomie atomowym ("chirurgia molekularna"), które można zastosować do badania innych białek będących przedmiotem zainteresowania. Ilustruje on wyniki substytucji proliny z bliskimi analogami chemicznymi na właściwości fałdowania i spektroskopowe w klasie białek fluorescencyjnych z β beczkami.

Wprowadzenie

Klasyczna mutageneza ukierunkowana na miejsce pozwala na permutację dowolnej istniejącej sekwencji białka kodowanej przez gen poprzez manipulację kodonami na poziomie DNA. Aby zbadać fałdowanie i stabilność białek, często pożądane jest zastąpienie podobnych aminokwasów podobnymi odpowiednikami. Jednak tradycyjna mutageneza białek jest zdecydowanie ograniczona do strukturalnie podobnych zamienników wśród kanonicznych aminokwasów, takich jak Ser/Ala/Cys, Thr/Val, Glu/Gln, Asp/Asn, Tyr/Phe, które są obecne w standardowym repertuarze kodów genetycznych. Z drugiej strony, nie ma takich możliwości dla innych kanonicznych aminokwasów, takich jak Trp, Met, His lub Pro, które często odgrywają istotną rolę strukturalną i funkcjonalną w białkach1. Idealnym podejściem do badania tych oddziaływań w kontekście wysoce specyficznej wewnętrznej architektury białek i ich procesu fałdowania jest generowanie niezakłócających modyfikacji izosterycznych. Rzeczywiście, gdy izosteryczne analogi aminokwasów tych kanonicznych aminokwasów, znanych również jako aminokwasy niekanoniczne (ncAA), są wprowadzane do białek, pozwalają na subtelne zmiany nawet na poziomie pojedynczych atomów lub grup atomów, takich jak H/F, CH2/S/Se/Te znanych jako "mutacje atomowe"2. Taka "chirurgia molekularna" wytwarza zmienione białka, których właściwości wynikają wyłącznie z wymiany pojedynczych atomów lub grup atomów, które w sprzyjających przypadkach mogą być analizowane, a wykryte zmiany mogą być racjonalizowane. W ten sposób zakres syntezy białek w celu badania fałdowania i struktury białek wykracza daleko poza klasyczną mutagenezę DNA. Należy zauważyć, że białka generowane przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce są zwykle określane jako "mutanty", podczas gdy białka z podstawionymi aminokwasami kanonicznymi są określane jako "warianty" 3, "alloproteins"4, lub "kongenery białkowe"5.

Białko zielonej fluorescencji (GFP), po raz pierwszy zidentyfikowane w organizmie morskim Aequorea victoria, wykazuje jasnozieloną fluorescencję po wystawieniu na działanie światła ultrafioletowego do niebieskiego6,7. Obecnie GFP jest powszechnie stosowany jako bardzo czułe narzędzie do znakowania do rutynowej wizualizacji ekspresji genów i lokalizacji białek w komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. GFP okazał się również przydatny w różnych badaniach biofizycznych8,9,10 i biomedical11,12, a także w inżynierii białek13,14,15. Wnikliwa analiza struktury GFP pozwoliła na stworzenie licznych wariantów charakteryzujących się zróżnicowaną stabilnością i maksimami fluorescencji16,17. Większość wariantów GFP stosowanych w biologii komórkowej i molekularnej to białka monomeryczne zarówno w roztworze, jak i w klasie crystal18. Ich główna organizacja strukturalna jest typowa dla wszystkich członków rodziny GFP, niezależnie od ich pochodzenia filogenetycznego, i składa się z 11 β-nici tworzących tzw. β-beczkę, podczas gdy załamana α-helisa biegnie przez środek lufy i nosi chromofor (Rysunek 1A). Autokatalityczne dojrzewanie chromoforu (Rysunek 1B) wymaga precyzyjnego umiejscowienia otaczających go łańcuchów bocznych w centralnym miejscu białka; wiele z tych łańcuchów bocznych jest wysoce konserwatywnych w innych wariantach GFP19. W większości białek fluorescencyjnych z meduz, takich jak Aequorea victoria, chromofor emitujący zieleń składa się z dwóch pierścieni aromatycznych, w tym pierścienia fenolowego Tyr66 i pięcioczłonowej heterocyklicznej struktury imidazolinonu (Figura 1B). Chromofor, odpowiednio osadzony w matrycy białkowej, odpowiada za charakterystyczną fluorescencję całego białka. Znajduje się w centrum konstrukcji, podczas gdy struktura beczki izoluje ją od medium wodnego20. Wystawienie chromoforu na działanie wody spowodowałoby wygaszenie fluorescencji, tj. utratę fluorescencji21.

Prawidłowe zagięcie struktury przypominającej beczkę jest niezbędne do ochrony chromoforu przed wygaszaniem fluorescencji22. Pozostałości proliny (Pro) odgrywają szczególną rolę w organizacji strukturalnej GFP23. Nie będąc w stanie utrzymać nici β, stanowią pętle łączące odpowiedzialne za utrzymanie struktury białka jako całości. Nic dziwnego, że 10-15 reszt proliny znajduje się zarówno w GFP pochodzących z Aequorea, jak i Anthoathecata; Niektóre z nich są wysoce konserwatywne w innych typach fluorescencyjnych białek β-beczkowych. Oczekuje się, że proliny będą miały decydujący wpływ na właściwości składania ze względu na ich szczególne cechy geometryczne. Na przykład w GFP pochodzących z Aequorea, z dziesięciu reszt proliny (Rysunek 2A), dziewięć tworzy trans-, a tylko jedna tworzy wiązanie cis-peptydowe (Pro89). Pro58 jest niezbędny, tzn. nie można go stosować zamiennie z pozostałymi 19 aminokwasami kanonicznymi. Pozostałość ta może być odpowiedzialna za prawidłowe pozycjonowanie reszty Trp57, która została uznana za kluczową dla dojrzewania chromoforu i ogólnego składania GFP24. Fragment PVPWP z trzema resztami proliny (Pro54, Pro56, Pro58) i Trp57 jest zasadniczą częścią "dolnej powieki" w strukturze GFP z Rysunek 1A. Motyw strukturalny PVPWP znajduje się w kilku białkach, takich jak cytochromy i eukariotyczne kanały potasowe aktywowane napięciem25. Substytucja proliny do alaniny w pozycjach 75 i 89 jest również szkodliwa dla ekspresji i fałdowania białek oraz znosi dojrzewanie chromoforów. Pro75 i Pro89 są częścią "górnej pokrywy" zakopującej chromofor (Rysunek 1A) i są zachowane w 11-niciowych β-beczkowych białkach fluorescencyjnych23. Te dwie "pokrywki" utrzymują chromofor z dala od wodnego rozpuszczalnika, nawet jeśli stabilna struktura trzeciorzędowa została częściowo złamana26. Taka specyficzna architektura molekularna chroni fluorofor przed kolizyjnym (dynamicznym) wygaszaniem fluorescencji, np. przez wodę, tlen lub inne dyfuzyjne ligandy.

Aby przeprowadzić inżynierię molekularną struktury GFP, należy wprowadzić podstawienia aminokwasów w podstawowej strukturze białka. Na GFP przeprowadzono liczne mutacje, które zapewniły wariantom podwyższoną stabilność, szybkie i niezawodne fałdowanie oraz zmienne właściwości fluorescencji17. Niemniej jednak w większości przypadków mutacja reszt proliny jest uważana za ryzykowne podejście ze względu na fakt, że żaden z pozostałych 19 kanonicznych aminokwasów nie jest w stanie prawidłowo przywrócić profilu konformacyjnego reszty proliny27. W związku z tym opracowano alternatywne podejście, w którym reszty proliny są zastępowane innymi strukturami opartymi na prolinie, nazwanymi analogami proliny28. Ze względu na swoją unikalną cykliczną strukturę chemiczną, prolina wykazuje dwie charakterystyczne przemiany konformacyjne (Rysunek 1C): 1) marszczenie się pierścienia proline, szybki proces pociągający za sobą organizację kręgosłupa, który wpływa przede wszystkim na kąt skrętu φ, oraz 2) izomeryzację wiązania peptydowego cis/trans, powolny proces wpływający na fałdowanie kręgosłupa pod kątem skrętu ω. Ze względu na swój powolny charakter, to ostatnie przejście jest powszechnie odpowiedzialne za etapy ograniczające szybkość w procesie fałdowania całego białka. Wykazano wcześniej, że izomeryzacja wiązania peptydowego cis / trans wokół niektórych reszt proliny charakteryzuje się powolnymi etapami fałdowania wariantów GFP. Na przykład, tworzenie wiązania cis-peptydowego w Pro89 charakteryzuje się powolnym krokiem w procesie składania, ponieważ opiera się na przejściu wiązania z trans do cis29. Szybsze ponowne fałdowanie można osiągnąć po zastąpieniu Pro89 pętlą peptydową all-trans, tj. poprzez zniesienie zdarzenia izomeryzacji cis-to-trans<sup class="xref">30. Oprócz izomeryzacji cis/trans, przejścia fałdowania mogą również generować głębokie zmiany w fałdowaniu białek ze względu na organizację szkieletu i upakowanie we wnętrzu białka27,31.

Modyfikacje chemiczne powodują zmianę wewnętrznych przemian konformacyjnych reszt proliny, wpływając tym samym na zdolność białka do fałdowania. Niektóre analogi proliny są szczególnie atrakcyjnymi kandydatami do substytucji proliny w białkach, ponieważ umożliwiają manipulację i badanie właściwości fałdowania. Na przykład (4R)-fluoroprolina (R-Flp), (4S)-fluoroprolina (S-Flp), 4,4-difluoroprolina (Dfp) i 3,4-dehydroprolina (Dhp) to cztery analogi (Rysunek 1D), które różnią się minimalnie od proliny zarówno pod względem objętości cząsteczkowej, jak i polarności32. W tym samym czasie każdy analog wykazuje wyraźne marszczenie pierścienia: S-Flp stabilizuje marszczenie C4-endo, R-Flp stabilizuje marszczenie C 4-exo, Dfp nie wykazuje widocznej preferencji marszczenia, podczas gdy Dhp znosi marszczenie (Rysunek 1D)33. Stosując te analogi w strukturze białka, można manipulować przejściem konformacyjnym reszt proliny, a tym samym wpływać na właściwości powstałych wariantów GFP.

W tej pracy postanowiliśmy włączyć wyznaczony zestaw analogów proliny (Rysunek 1D) do struktury wariantów GFP za pomocą metody selektywnego włączania ciśnienia (SPI, Rysunek 3)34. Zastąpienie reszt aminokwasowych ich najbliższymi analogami izostrukturalnymi jest koncepcją biotechnologiczną stosowaną w projektowaniu białek35,36. Tak więc wpływ analogów proliny w białku modelowym ilustruje ich potencjał do wykorzystania jako narzędzia w inżynierii białek37. Produkcję białek zawierających pożądane analogi prowadzono w zmodyfikowanych szczepach E. coli, które nie są w stanie wytwarzać proliny (auksotrofia proliny). W ten sposób mogą zostać zmuszeni do zaakceptowania wymiany substratów w procesie biosyntezy białek38. Ta globalna substytucja proliny jest możliwa dzięki naturalnej elastyczności substratów endogennych syntetaz aminoacylo-tRNA39, kluczowych enzymów katalizujących estryfikację tRNA odpowiednimi aminokwasami40. Ogólnie rzecz biorąc, jak opisano w Rysunek 3, wzrost komórek odbywa się w określonym podłożu, aż do osiągnięcia środkowej fazy wzrostu logarytmicznego. W kolejnym kroku aminokwas, który ma zostać zastąpiony, jest wewnątrzkomórkowo wytracany z systemu ekspresji podczas fermentacji, a następnie wymieniany przez pożądany analog lub ncAA. Ekspresja białka docelowego jest następnie indukowana w celu włączenia aminokwasów niekanonicznych specyficznych dla reszt. Substytucja pokrewnego aminokwasu jego analogiem zachodzi w sposób obejmujący cały proteom. Chociaż ten efekt uboczny może mieć negatywny wpływ na wzrost szczepu gospodarza, jakość produkcji białka docelowego w większości nie jest zagrożona, ponieważ w ekspresji rekombinowanej zasoby komórkowe są głównie kierowane do produkcji białka docelowego41,42. Dlatego ściśle regulowany, indukowalny system ekspresji i silne promotory są kluczowe dla wysokiej efektywności inkorporacji43. Nasze podejście opiera się na wielokrotnym wprowadzaniu ncAA specyficznych dla reszt w odpowiedzi na kodony zmysłowe (reprzydział kodonów zmysłowych), przy czym w obrębie genu docelowego liczbą pozycji do insercji analogu Pro można manipulować za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce44. Podobne podejście zostało zastosowane w naszym poprzednim raporcie na temat otrzymywania rekombinowanych peptydów o właściwościach przeciwdrobnoustrojowych45. W niniejszej pracy zastosowaliśmy metodę SPI, która pozwala na zastąpienie wszystkich reszt proliny przez pokrewne analogi, w celu wytworzenia białek, od których oczekuje się, że będą miały odrębne właściwości fizykochemiczne, nieobecne w białkach syntetyzowanych z kanonicznym repertuarem aminokwasów. Charakteryzując profil fałdowania i fluorescencji otrzymanych wariantów, staramy się pokazać efekty podstawień atomowych w wariantach GFP.

Protokół

1. Wprowadzenie plazmidów ekspresyjnych do kompetentnych komórek E. coli z pro-auksotrofią

  1. Wymieszać 1 ng każdego z plazmidów próbnych, pQE-80L H6-EGFP, pQE-80L H6-NowGFP oraz pQE-80L H6-KillerOrange, z 50 µL chemicznie kompetentnych lub elektrokompetentnych komórek szczepu JM83 (Addgene #50348 lub ATCC #35607) pochodnego od E. coli K12 pro-auksotroficznego, w celu transformacji metodą szoku termicznego lub elektroporacji zgodnie z dostępnymi protokołami46,47.
    UWAGA: Wektor ekspresyjny pQE-80L EGFP-H6 koduje ulepszone zielone białko fluorescencyjne (EGFP) z tagiem 6xHis na końcu C, natomiast wektory ekspresyjne pQE-80L H6-NowGFP i pQE-80L H6-KillerOrange kodują odpowiednio NowGFP48 z tagiem 6xHis na końcu N lub KillerOrange49 z tagiem 6xHis na końcu N, każdy w szkielecie plazmidu pQE-80L. Wszystkie geny docelowe znajdują się pod kontrolą bakteryjnego promotora T5 regulowanego przez operator lac. Jako marker selekcyjny wykorzystano oporność na ampicylinę, a jako miejsce startu replikacji colE1. Dalsze informacje na temat plazmidu pQE-80L znajdują się w Tabeli Materiałów. Do ekspresji można wykorzystać również alternatywne szczepy pro-auksotroficzne E. coli pochodzące od szczepów K-12 i B, co powinno przynieść podobne wyniki. Obliczona masa cząsteczkowa jednokrotnie protonowanych ([M+H]+) białek typu dzikiego z tagiem H6 (po dojrzewaniu chromoforu) wynosi odpowiednio 27 745,33 Da (EGFP-H6), 27 931,50 Da (H6-NowGFP) oraz 27 606,09 Da (H6-KillerOrange). Struktury pierwotne białek docelowych podano w Tabeli 1 (tag His podkreślony). Glutamina (Q) w sekwencji tagu His białka NowGFP została zidentyfikowana w drodze sekwencjonowania DNA po subklonowaniu cDNA NowGFP otrzymanego od Pletneva i wsp.51 do plazmidu pQE-80L. Nie utrudnia ona oczyszczania białka ani nie wpływa na właściwości białka fluorescencyjnego.
  2. Regenerować komórki w 950 µL pożywki SOC w temperaturze 37 °C przez 1 h.
  3. Wykropelkować 50 µL zregenerowanych komórek na płytki z pożywką Luria Agar (LA) (patrz Materiały Uzupełniające) zawierającą glukozę (10 g/L) i ampicylinę (100 µg/mL).
  4. Inkubować płytki z pożywką LA w temperaturze 37 °C przez noc lub 30 °C przez 24 h.

2. Produkcja rekombinowanych białek fluorescencyjnych typu dzikiego (zawierających kanoniczną prolinę) oraz procedura selektywnego włączania pod presją (SPI) w celu wytworzenia białek fluorescencyjnych z analogami proliny (S-Flp, R-Flp, Dfp, Dhp)

  1. Hodowla nocna pro-auksotroficznego szczepu E. coli pochodzącego od K12 JM83 zawierającego pQE-80L EGFP- H6, pQE-80L H6-NowGFP oraz pQE-80L H6-KillerOrange
    1. Za pomocą sterylnej końcówki do pipety lub pętli do szczepienia należy wyizolować pojedynczą kolonię z płytki z podłożem LA i resuspenderć komórki w 5 mL podłoża Lysogeny Broth (LB) (patrz Supplementary Material; zawierającego 10 g/L glukozy, 100 µg/mL ampicyliny) w sterylnej polistyrenowej probówce hodowlanej o pojemności 14 mL.
      UWAGA: Do szczepienia zaleca się świeżo transformowane kolonie. Komórki na płytkach z podłożem LA (z kroku 2.2.) przechowywane w temperaturze 4 °C należy wykorzystać w ciągu kilku dni.
    2. Hodowlę komórkową należy inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym przy 200-250 rpm.
  2. Produkcja rekombinowanych białek EGFP- H6, H6-NowGFP i H6-KillerOrange z natywną proliną oraz odpowiadających im wariantów białek z analogami proliny
    1. Do 200 mL świeżego podłoża NMM (7,5 mM (NH4)2SO4, 50 mM K2HPO4 i 22 mM KH2PO4, 8,5 mM NaCl, 1 mM MgSO4, 20 mM D-glukozy, 1 µg/mL FeCl2, 1 µg/mL CaCl2, 10 µg/mL tiaminy, 10 µg/mL biotyny, 0,01 µg/mL mikroelementów (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4), pH ~7,2) z wszystkimi kanonicznymi l-aminokwasami (50 mg/L; patrz Supplementary Material) uzupełnionego o 100 µg/mL ampicyliny, należy wprowadzić 2 mL hodowli nocnej w kolbie Erlenmeyera o pojemności 2 L.
      UWAGA: W zależności od rodzaju białka, w celu optymalizacji wydajności białka, można przetestować alternatywne podłoża hodowlane, takie jak podłoże MOPS52, podłoże glukozo-mineralne53, minimalne podłoże Davisa54, minimalne podłoże M955 lub GMML56.
    2. Komórki należy inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym przy 220 rpm przez około 3 h 30 min.
    3. Gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) należy mierzyć za pomocą spektrofotometru co 30 min, aż do osiągnięcia wartości OD600 wynoszącej ok. 0,7.
      UWAGA: Do oznaczania OD600 w spektrofotometrze należy używać kuwety o długości drogi optycznej 1 cm. Jako wzorzec (pomiar „zera”) stosuje się odpowiednie podłoże hodowlane. Czas inkubacji do osiągnięcia wartości OD600 ok. 0,7 może zależeć od objętości hodowli. Wartość 3 h 30 min jest wartością przybliżoną. W wariancie podkroków 2.2.1-2.2.3 protokołu, hodowlę z podkroku 2.1.2 wykorzystuje się do zaszczepienia świeżego podłoża NMMΔPro (patrz Supplementary Material) uzupełnionego o ograniczoną koncentrację proliny (np. 5 mg/L zamiast 50 mg/L), a komórki hoduje się przez noc w 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym przy 220 rpm. Następnego dnia oznaczanie OD600 wykonuje się co 30 min, dopóki różnice między pomiarami nie będą mniejsze niż 0,05. Maksymalna wartość OD600 powinna wynosić około 1 (± 0,3). Początkowa, ograniczona koncentracja proliny może być dostosowana w zależności od szczepu ekspresyjnego i podłoża hodowlanego (patrz Dyskusja).
    4. Zawiesinę komórkową należy wirować przez 10 min przy 3 000 x g i 4 °C.
    5. Nadpływ należy ostrożnie odlać do odpadów.
    6. Krok płukania: Komórki należy resuspenderć poprzez ostrożne pipetowanie w 50 mL lodowatego podłoża NMMΔAA (bez żadnego aminokwasu, patrz Supplementary Material) lub NMMΔPro (bez proliny, patrz Supplementary Material).
      UWAGA: Do tego kroku płukania można użyć dowolnego z dwóch wymienionych buforów, ponieważ istotne jest jedynie usunięcie pozostałej proliny z podłoża inkubacyjnego.
    7. Komórki należy oddzielić od podłoża poprzez sedymentację w temperaturze 4 °C w wirówce przy 3 000 x g przez 10 min.
    8. Nadpływ należy ostrożnie odlać do odpadów.
    9. Osad komórkowy należy ostrożnie resuspenderć poprzez pipetowanie w 200 mL podłoża NMMΔPro uzupełnionego o 100 µg/mL ampicyliny w kolbie Erlenmeyera o pojemności 2 L.
      UWAGA: Powstałą zawiesinę komórkową można podzielić na kilka próbek o równej objętości, aby uzyskać identyczne kultury startowe do porównania ekspresji białka w obecności Pro lub analogów proliny (np. podział na 4 x 50 mL w kolbach Erlenmeyera o pojemności 100 mL).
    10. Inkubować przez 30 min w 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym przy 220 rpm w celu całkowitego wyczerpania zasobów Pro.
      UWAGA: Krok ten jest krytyczny dla całkowitego usunięcia Pro z komórek.
    11. Należy dodać odpowiednią objętość L-proliny lub R-Flp, S-Flp, Dfp i Dhp z 50 mM roztworu zapasowego, aby uzyskać końcową stężenie 1 mM w zawiesinie komórkowej.
      UWAGA: Co do zasady, świeże 50 mM roztwory zapasowe Pro lub pochodnych proliny powinny być zawsze przygotowywane przed użyciem. Zamrożone zapasy mogą być stosowane tylko wtedy, gdy hydroliza danego kanonicznego lub niekanonicznego aminokwasu w roztworze wodnym nie stanowi problemu.
    12. W celu indukcji ekspresji docelowego białka należy dodać 0,5 mM IPTG z 1 M roztworu zapasowego.
    13. Ekspresję docelowego białka prowadzić przez noc (12 h) w 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym przy 220 rpm.
    14. Następnego dnia należy zmierzyć OD600.
      UWAGA: Oznaczanie OD600 wykonuje się w celu określenia ilości komórek po ekspresji białka. Niższa wartość OD600 w porównaniu z wartością zmierzoną przed krokiem płukania 2.2.3 wskazuje na cytotoksyczność dostarczonego aminokwasu. W takim przypadku procedurę należy powtórzyć, minimalizując stężenie dostarczanego aminokwasu (do 0,1 mM).
    15. Komórki bakteryjne należy wirować przy 5 000 x g i 4 °C przez 10 min, zebrać i odlać nadpływ do odpadów.
    16. Krok płukania: Komórki należy resuspenderć poprzez ostrożne pipetowanie w 50 mL buforu wiążącego (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM DTT) zawierającego 10% glicerolu i przenieść zawiesinę komórkową do 50 mL stożkowej probówki polistyrenowej.
    17. Komórki bakteryjne należy wirować przy 5 000 x g i 4 °C przez 10 min, zebrać i odlać nadpływ do odpadów.
    18. Osad komórkowy należy przechowywać w 50 mL stożkowej probówce polistyrenowej w temperaturze -20 °C lub -80 °C do czasu dalszego użycia (oczyszczanie białek, patrz poniżej).

3. Procedura oczyszczania próbek białek za pomocą chromatografii powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali (IMAC)

  1. Liza komórek bakteryjnych
    UWAGA: Wszystkie etapy lizy komórek należy przeprowadzać w lodzie lub w temperaturze 4 °C, aby zapobiec degradacji docelowego białka.
    1. Rozmrozić osad komórek bakteryjnych w lodzie lub w temperaturze 4 °C w stożkowej probówce polistyrenowej o pojemności 50 mL przez 10-20 min.
    2. Dodać 10 mL schłodzonego do temperatury lodowej buforu wiążącego (patrz Supplementary Material) i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby resuspendować osad komórkowy.
    3. Dodać 100 µL lizozymu (50 mg/mL), 100 µL DNazy I (1 mg/mL), 100 µL RNazy A (1 mg/mL) oraz 30 µL MgCl2 (1 M). Ostrożnie odwrócić zawiesinę komórkową pięć razy i przechowywać zamkniętą probówkę w lodzie lub w temperaturze 4 °C przez 60 min.
      UWAGA: Lizozym indukuje chemiczną lizę komórek poprzez rozrywanie bakteryjnej ściany komórkowej.
    4. Poddać próbkę sonikacji w celu rozbicia komórek, używając homogenizatora ultradźwiękowego (np. 3 razy po 3 min w probówce polistyrenowej 50 mL w mieszaninie lodu z wodą, impuls 2 s/przerwa 4 s, amplituda 45%).
      UWAGA: Alternatywnie można zastosować inne metody rozbicia komórek, np. homogenizację wysokociśnieniową w 20 cyklach przy 14 000 psi. W razie potrzeby rozcieńczyć buforem wiążącym (patrz Supplementary Material), aby osiągnąć minimalną objętość wymaganą przez urządzenie. Ponadto do rozbicia komórek można użyć odczynników do ekstrakcji białek. Przykłady znajdują się w Table of Materials.
    5. Wirować przez 60 min przy 18 000 x g w temperaturze 4 °C.
    6. Zanotować objętość cieczy do etapu 3.1.9. i przelać nadosad do nowej probówki polistyrenowej 50 mL.
    7. Oczyścić nadosad za pomocą filtra membranowego o średnicy porów 0,45 µm.
    8. Pobrać próbkę „lizatu” do SDS-PAGE (patrz sekcja 4 poniżej); odpowiada ona „rozpuszczalnej frakcji białek”, czyli nadosadowi z etapu 3.1.6.
    9. Dodać taką samą objętość ddH2O, jaką określono w etapie 3.1.6., aby resuspendować szczątki komórkowe w celu zachowania tego samego rozcieńczenia próbek do późniejszej analizy SDS-PAGE.
    10. Pobrać próbkę „osadu” do SDS-PAGE (patrz sekcja 4 poniżej); odpowiada ona „nierozpuszczalnej frakcji białek”, czyli zawiesinie szczątków komórkowych z etapu 3.1.9.
  2. Oczyszczanie metodą chromatografii powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali (IMAC)
    UWAGA: Oczyszczanie docelowego białka fluorescencyjnego można przeprowadzać w temperaturze 4 °C lub w temperaturze pokojowej (RT). W przypadku tej drugiej opcji należy odczekać, aż lizat, kolumna i wszystkie bufory wyrównają temperaturę do RT, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza wskutek odparowania powietrza uwięzionego w zimnym roztworze po wprowadzeniu go do ciepłej kolumny.
    1. Oczyścić próbkę za pomocą kolumny IMAC FPLC (szybka chromatografia cieczowa białek) o pojemności 1 mL, gotowej lub napełnionej samodzielnie, zgodnie z instrukcjami producenta; ustawić maksymalne ciśnienie kolumny na 0,3 MPa, a szybkość przepływu na 1 mL/min; użyć buforu wiążącego (patrz Supplementary Material) do równoważenia kolumny, buforu płuczącego (patrz Supplementary Material) do etapu płukania oraz buforu elucyjnego (patrz Supplementary Material) do elucji docelowego białka.
      UWAGA: Alternatywnie można zastosować zautomatyzowany system FPLC do elucji docelowego białka buforem elucyjnym z zastosowaniem liniowego gradientu stężenia imidazolu (20-200 mM).
    2. Zebrać i połączyć frakcje eluatu zawierające białka fluorescencyjne (wybrać na podstawie widocznego zielonego lub pomarańczowego koloru).
    3. Przenieść połączone frakcje do membrany dializacyjnej (próg odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) 5 000-10 000) zgodnie z instrukcjami producenta i dializować co najmniej trzy razy przeciwko buforowi do dializy lub buforowi MS (patrz Supplementary Material). Na przykład przeprowadzić dializę 1-mililitrowej próbki trzy razy przeciwko 100 mL buforu przez co najmniej 2 h w każdej rundzie. Szczegółowy protokół znajduje się w pracy Budisa et al.34.
    4. Przygotować 100-krotne rozcieńczenie (1:100) zdializowanej frakcji elucyjnej w buforze PBS (patrz Supplementary Material).
    5. Zarejestrować widmo absorbancji rozcieńczonych próbek w spektrofotometrze UV-Vis.
    6. Obliczyć stężenie białka na podstawie prawa Lamberta-Beera w następujący sposób, korzystając z wartości literaturowych molowych współczynników ekstynkcji ε dla konkretnej długości fali (dla EGFP przy 488 nm ε488 = 55 000 cm-1·M-1, NowGFP przy 493 nm ε493 = 53 600 cm-1·M-1, KillerOrange przy 514 nm ε514 = 22 600 cm-1·M-1):
      figure-protocol-1 (prawo Lamberta-Beera)
      cprotein = stężenie białka [mg/mL]
      A = absorbancja przy konkretnej długości fali
      ε = molowy współczynnik ekstynkcji przy konkretnej długości fali [M-1·cm-1]
      d = długość drogi optycznej kuwety, tutaj 1 cm
      MW = masa cząsteczkowa białka [g/mol]
      Do pomiaru referencyjnego („zero”) użyć buforu do dializy (patrz Supplementary Material).
    7. Pobrać próbkę „eluatu” do SDS-PAGE (patrz sekcja 4 poniżej), nanieść 1-10 µg białka (obliczonego w poprzednim kroku) na każdą studzienkę próbkową dla żeli barwionych Coomassie Brilliant Blue.
      UWAGA: Dostosować ilość próbek SDS w zależności od zastosowanej metody barwienia i czułości barwnika, jeśli do barwienia prążków białkowych użyto związków innych niż Coomassie Brilliant Blue.
    8. Zamrozić i przechowywać próbkę białka w buforze do dializy (patrz Supplementary Material) w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: W tych warunkach przechowywania próbki białek powinny być stabilne przez co najmniej 6 miesięcy. Do rejestracji widm absorpcji i emisji fluorescencji docelowych białek można użyć innych laboratoryjnych spektrofotometrów UV-Vis i fluorescencyjnych. Do pomiarów emisji fluorescencji można zastosować następujące długości fal wzbudzenia: 488 nm (EGFP), 493 nm (NowGFP) i 510 nm (KillerOrange).

4. Przygotowanie próbek do SDS-PAGE

  1. Wyznaczyć absorbancję A przy 280 nm (A280nm) dla próbek „eluat”, „lizat” i „osad” z sekcji 3. Dostosować objętość próby tak, aby uzyskać A280nm = 2, dodając odpowiednią ilość buforu elucyjnego (końcowa objętość próby powinna wynosić co najmniej 80 µL).
  2. Wymieszać próbkę w stosunku 4:1 (v/v) z 5x buforem do ładowania SDS (patrz Materiały uzupełniające) za pomocą pipety, np. 80 µL próbki z 20 µL 5x buforu do ładowania SDS.
  3. Gotować próbki SDS w temperaturze 95 °C przez 5 min w łaźni wodnej lub bloku grzejnym w celu denaturacji białek.
  4. Pozostawić próbki do ostygnięcia do RT i odwirować próbki z prędkością 13,000 x g przez 1 min w mikrocentry fudze przed nałożeniem na żel.
  5. Użyć 5-10 µL do SDS-PAGE barwionego Coomassie Brilliant Blue. Szczegóły procedury SDS-PAGE znajdują się w źródle57.
    UWAGA: Dostosować ilość próbek SDS w zależności od zastosowanej metody barwienia i czułości barwnika. Wynik SDS-PAGE należy dokładnie sprawdzić, aby upewnić się, że próbki zawierają ponad 95% całkowitego białka w prążku odpowiadającym oczekiwanej masie cząsteczkowej pożądanego białka. W tym celu należy wykonać zdjęcie żelu barwionego Coomassie i porównać intensywność prążka białkowego o pożądanej masie cząsteczkowej z intensywnością wszystkich pozostałych prążków w ścieżce (jeśli występują) za pomocą densytometrii. Do oceny densytometrycznej intensywności prążków można użyć oprogramowania ImageJ58. Aby eksperymentalnie udowodnić wbudowanie pożądanych ncAAs do badanego białka, należy przeprowadzić analizę masy nienaruszonego białka za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) sprzężonej z tandemową spektrometrią mas z jonizacją elektrospray i analizatorem czasu przelotu (LC-ESI-TOF-MS) zgodnie z opisem59 (patrz sekcja 5 protokołu oraz zawarta w niej Tabela materiałów w celu zapoznania się z przykładowym sprzętem).

5. Emisja fluorescencji wariantów białka

  1. Przed przystąpieniem do procedury należy sprawdzić wynik eksperymentu SDS-PAGE, aby upewnić się, że czystość próbki wynosi >95% (patrz UWAGA po kroku 4.5.).
  2. Dostosować stężenie próbek każdego oczyszczonego wariantu białka do poziomu 0.3 µM, przyjmując jako punkt odniesienia obliczoną wartość absorbancji przy odpowiedniej długości fali (podkrok 3.2.5.). Należy upewnić się, że przybliżona końcowa objętość próbki wynosi 200 µL.
  3. Pozostawić rozcieńczone próbki do wyrównania temperatury przez 1 h w RT.
  4. Przenieść próbki do kwarcowej kuwety o szerokości 1 cm i zmierzyć widmo emisji fluorescencji próbek za pomocą spektrometru fluorescencyjnego (patrz Tabela materiałów), stosując następujące długości fali wzbudzenia: 488 nm (dla EGFP), 493 nm (dla NowGFP), 510 nm (dla KillerOrange).

6. Denaturacja i renaturacja wariantów EGFP

  1. Przed przystąpieniem do procedury należy sprawdzić wynik eksperymentu SDS-PAGE, aby upewnić się, że czystość próbki wynosi >95% (patrz UWAGA po kroku 4.5.).
  2. Dla każdego oczyszczonego wariantu białka przygotować dwie próbki o objętości końcowej 2 µL i stężeniu 300 µM (patrz określanie stężenia białka w podkrokach 3.2.4-3.2.6).
  3. Do 2 µL każdego oczyszczonego wariantu białka dodać 18 µL buforu 1,11x PBS (patrz Supplementary Material) zawierającego 8,89 M mocznika i 5,56 mM DTT (aby otrzymać 1x PBS zawierający 8 M mocznika i 5 mM DTT) w celu indukowania denaturacji.
    UWAGA: W krokach 6.4-6.6 każdą próbkę należy przetwarzać oddzielnie.
  4. Próbki inkubować przez 5 min w temperaturze 95 °C.
  5. Próbki o objętości 20 µL rozcieńczyć 100-krotnie, dodając 1980 µL 1x PBS (patrz Supplementary Material) zawierającego 5 mM DTT w celu indukowania renaturacji, co pozwoli uzyskać końcowe stężenie białka 0,3 µM, a następnie niezwłocznie przenieść 200 µL próbek do 1-cm kwarcowej kuwety.
    UWAGA: Niezwykle ważne jest szybkie działanie na tym etapie, ponieważ renaturacja rozpoczyna się natychmiast.
  6. Kuwetę kwarcową włożyć do odpowiedniego spektrometru fluorescencyjnego (patrz Table of Materials) i monitorować refolding białka w próbkach, rejestrując widmo fluorescencji co 3 s przez 30 min. Dla każdego wariantu białka zastosować wzbudzenie fluorescencji 295 nm dla pierwszej próbki i wzbudzenie 488 nm dla drugiej próbki.
  7. Próbki poddawane refoldingu przenieść do probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, zamknąć nakrętki i przechowywać próbki w temperaturze RT w ciemności przez 24 h, aby umożliwić całkowity refolding wariantów EGFP.
  8. Zmierzyć emisję fluorescencji próbek białka po refoldingu zgodnie z krokiem 6.6, używając tej samej długości fali wzbudzenia co wcześniej, aby uchwycić końcowy punkt czasowy odzyskiwania fluorescencji.

Wyniki

Na początku badania wybrano trzy różne warianty białek fluorescencyjnych o wspólnej architekturze macierzystego GFP. Pierwszym wybranym białkiem było EGFP, które jest zmodyfikowanym wariantem pochodzącym z oryginalnego GFP z meduzy Aequorea victoria, zawierającym mutacje Phe64Leu/Ser65Thr. Drugim wybranym białkiem było NowGFP51,60. Jest to również wariant GFP z A. victoria, otrzymany w procesie wieloetapowej mutagenezy poprzez wcześniejsze białka fluorescencyjne. NowGFP zawiera 18 mutacji w porównaniu do bezpośrednio poprzedzającego go białka fluorescencyjnego „Cerulean”61. Z kolei białko „Cerulean” jest pochodną ulepszonego cyjanowego białka fluorescencyjnego (ECFP)62,63, białka wcześniej wyselekcjonowanego metodą ewolucji kierowanej w laboratorium, zawierającego chromofor oparty na tryptofanie. Zarówno EGFP, jak i NowGFP są szeroko stosowane w badaniach biologii komórki i biofizyki i zawierają w swoich strukturach dziesięć konserwatywnych reszt proliny. Dodatkowo NowGFP posiada jedenastą resztę proliny w pozycji 230, która pojawiła się w wyniku rozległej historii mutacji tego wariantu białka. Trzecim wybranym białkiem było fluorescencyjne białko KillerOrange64,65. Jest ono pochodną chromoproteiny anm2CP z rodzaju hydrozoików Anthoathecata. Sekwencja białka zawiera 15 reszt proliny, a chromofor oparty jest na reszcie tryptofanu, a nie tyrozyny. Dla wszystkich trzech wybranych białek opisano struktury rentgenowskie o wysokiej rozdzielczości (Rysunek 2)51,65,66.

W pierwszym kroku analogi proliny (Ryc. 1D) włączono do wszystkich pozycji proliny w trzech białkach modelowych (EGFP, NowGFP i KillerOrange) poprzez inkorporację pod presją selekcyjną (SPI; schemat procedury przedstawiono na Ryc. 3). W celu ekspresji białek w obecności proliny oraz analogów (Ryc. 1D) wykorzystano szczep E. coli K12 JM83 o aukstrofii względem proliny67, co pozwoliło na uzyskanie odpowiednio białek typu dzikiego oraz białek modyfikowanych. Osady z komórek eksponujących białko natywne oraz warianty zawierające S-Flp i Dhp miały typowy intensywny kolor wynikający z nienaruszonego chromoforu, natomiast warianty zawierające R-Flp i Dfp pozostały bezbarwne, co wskazywało na błędne fałdowanie i odkładanie się niefałdowanego białka w ciałkach inkluzyjnych (Ryc. 4A). Analiza SDS-PAGE wyekspresowanych próbek potwierdziła obecność nierozpuszczalnych białek zawierających R-Flp (Ryc. 4B-D), co wykluczyło dalsze badania. Choć wykracza to poza zakres niniejszej pracy, należy zaznaczyć, że problemy z rozpuszczalnością i błędnym fałdowaniem białek można w pewnym stopniu rozwiązać za pomocą procedur refoldingowych in vitro68. W przeciwieństwie do nich, białka natywne, jak również warianty zawierające S-Flp i Dhp, znajdowały się głównie w frakcjach rozpuszczalnych (Ryc. 4B-D). Białka typu dzikiego, a także warianty zawierające S-Flp i Dhp, można było następnie wyizolować i scharakteryzować w badaniach fluorescencji. Rozpuszczalne białka oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali (IMAC), uzyskując 20-30 mg/L objętości hodowli dla EGFP oraz 60-80 mg dla NowGFP i KillerOrange, przy czym wydajności dla białek typu dzikiego i modyfikowanych były bardzo zbliżone. Analiza z wykorzystaniem sprzężonej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas (LC-MS) potwierdziła oczekiwaną tożsamość i czystość izolatów uzyskanych w ten sposób (Ryc. 5). W widmach mas każda zamiana proliny na S-Flp spowodowała przesunięcie o +18 Da na każdy resztę proliny w sekwencji, natomiast w przypadku zamiany proliny na Dhp przesunięcie wynosiło −2 Da na resztę.

W następnym kroku zarejestrowano widma absorpcji i emisji światła, aby przeanalizować potencjalny wpływ wbudowania niekanonicznych analogów proliny na właściwości spektroskopowe macierzystych białek fluorescencyjnych (Rycina 6). Widma absorpcji UV-Vis wykazały typowy pasmo w okolicy 280 nm, charakterystyczne dla pozostałości aromatycznych, tyrozyny i tryptofanu, natomiast absorbancja chromoforu wystąpiła przy 488 nm dla EGFP oraz 493 nm dla NowGFP (Rycina 6A,B). W przypadku KillerOrange obszar absorbancji chromoforu obejmował dwa pasma (Rycina 6C), które odpowiadają dwóm możliwym stanom konfiguracyjnym i ładunkowym złożonego chromoforu. Pasmo w okolicy 510 nm jest znane jako stan, z którego fluorescencja zachodzi z wysoką wydajnością kwantową49,65. W wariantach z zastąpieniem proliny zaobserwowano, co następuje: wbudowanie Dhp nie zmieniło widm absorbancji EGFP i NowGFP, natomiast S-Flp spowodowało zwiększoną absorpcję w zakresie UV. To ostatnie można wyjaśnić indukowanymi różnicami w mikrootoczeniu pozostałości tryptofanu, w szczególności Trp57 znajdującego się pomiędzy trzema S-Flp w motywie PVPWP (Rycina 6A,B)69. Prostsze wyjaśnienie wyższej absorpcji UV może jednak wynikać ze zwiększonego udziału nieprawidłowo pofałdowanego białka. Ponieważ stężenie białka oceniano poprzez kwantyfikację cech absorbancji, obecność białka z nieprawidłowo dojrzałym chromoforem może zwiększyć absorbancję, podczas gdy ta frakcja nie jest uwzględniana w całkowitym stężeniu (Rycina 6A,B). Wspierając tę hipotezę, zaobserwowaliśmy, że EGFP zawierające S-Flp wykazywało wyraźnie zmniejszony stosunek absorbancji chromoforu do połączonej absorbancji tryptofanu i tyrozyny (ε(CRO)/ε(Tyr+Trp) = 0,96) w porównaniu do wyższej wartości (1,57) w białku macierzystym (Tabela 2)70. Obecność frakcji niefluorescencyjnej w EGFP zawierającym S-Flp będzie istotnym czynnikiem w dalszej analizie właściwości białka. W wariancie KillerOrange zawierającym S-Flp zaobserwowano zwiększoną absorbancję wraz z przesunięciem pasma chromoforu w stronę czerwieni. Fakt ten wskazał, że formowanie chromoforu faworyzowało konfigurację o dużej wydajności kwantowej fluorescencji (Rycina 6C).

Następnie przeanalizowano widma fluorescencji białek zarejestrowane przy wzbudzeniu przy odpowiadających im maksymalnych długościach fal absorbancji. Wyniki pokazują, że widma pozostały w zasadzie identyczne dla badanych wariantów białek fluorescencyjnych zawierających prolinę oraz jej zamienniki, S-Flp i Dhp. Wynik ten sugeruje, że analogi w żadnym przypadku nie zmieniły środowiska chemicznego chromoforu (Rycina 6G-I). Pomimo tego faktu, wyraźne różnice zaobserwowano w widmach fluorescencji KillerOrange zarejestrowanych przy wzbudzeniu przy 295 nm, a zatem przy wzbudzeniu tryptofanu. Eksperyment ten pozwala śledzić transfer energii rezonansowej fluorescencji (FRET) lub bezpośrednie sprzężenie ekscytonowe, które zachodzi między łańcuchami bocznymi tryptofanu a dojrzałym chromoforem, ponieważ oba znajdują się w krótkiej odległości nieprzekraczającej 25 Å. W przypadku wariantów EGFP i NowGFP, podczas pomiaru widm emisji przy wzbudzeniu 295 nm, zaobserwowano silną emisję chromoforu przy niemal całkowitym braku emisji tryptofanu (Rycina 6D,E). Jednak warianty zawierające S-Flp wykazały nieco większą emisję specyficzną dla tryptofanu. Obserwację tę można powiązać z nieuwzględnionym wkładem niefałdowanego apobiałka, które zawiera tryptofany, ale nie posiada dojrzałego chromoforu. Znacznie zwiększoną emisję specyficzną dla tryptofanu zaobserwowano w KillerOrange, co wskazuje na brak gaszenia fluorescencji poprzez oczekiwany mechanizm transferu energii wzbudzenia lub sprzężenia ekscytonowego. Warianty białek zawierające prolinę i S-Flp wykazały porównywalną emisję tryptofanu wraz z preferowaną cechą fluorescencji przesuniętej w stronę czerwieni o wysokiej wydajności kwantowej. W przeciwieństwie do nich, wariant zawierający Dhp wykazał drastyczny spadek intensywności fluorescencji chromoforu, prawdopodobnie z powodu niewielkich efektów strukturalnych (Rycina 6F).

Następnie porównaliśmy właściwości fałdowania białek, przeprowadzając eksperyment rozfałdowania/renaturacji. Widma emisji fluorescencji zarejestrowano w stanie sfałdowanym (sekcja protokołu 5), po denaturacji chemicznej, a następnie w procesie refałdowania monitorowanym przez okres 24 h (sekcja protokołu 6). Widma rejestrowano przy wzbudzeniu zarówno na odpowiedniej długości fali 295 nm, jak i w maksimach widm absorbancji chromoforów, natomiast otrzymaną fluorescencję przedstawiono jako znormalizowaną do wartości maksymalnej dla każdego białka (Rysunek 7). Na koniec protokołu zaobserwowaliśmy, że warianty EGFP mogły ulec refałdowaniu, podczas gdy warianty NowGFP i KillerOrange – po denaturacji – pozostały rozfałdowane (dane nie przedstawiono). Zatem zdolności do refałdowania oryginalnych białek fluorescencyjnych różniły się znacząco. Warto zauważyć, że KillerOrange został opracowany jako fotosensybilizator na bazie wariantu chromoproteiny hydrozoów KillerRed65,71, a jego refałdowanie zazwyczaj przebiega wolniej pomimo stabilnej struktury beczki β. W naszych eksperymentach stwierdziliśmy, że fluorescencja chromoforu EGFP typu dzikiego odzyskała się tylko częściowo, choć fluorescencja specyficzna dla tryptofanu była większa po renaturacji (Rysunek 7A,D). Podobne zachowanie zaobserwowano w wariancie zawierającym Dhp (Rysunek 7C,F). W przypadku EGFP zawierającego S-Flp podobny wynik odnotowano, gdy wzbudzenie przeprowadzono na specyficznej dla tryptofanu długości fali 295 nm (Rysunek 7B). Uderzające jest to, że fluorescencja odzyskała się w znacznie większym stopniu, gdy chromofor był wzbudzany przy 488 nm (Rysunek 7E). Wydaje się, że S-Flp indukuje znacznie wyższą wydajność refałdowania w porównaniu do dwóch pozostałych wariantów. Jednakże tego korzystnego efektu nie zaobserwowano przy wzbudzeniu 295 nm z powodu nieznanych oddziaływań molekularnych.

Następnie monitorowano szybkość refoldingowania poprzez oddzielny pomiar fluorescencji tryptofanu oraz chromoforu, a punkt końcowy procesu określono na 24 h po rozpoczęciu renaturacji. Jedynie warianty EGFP wykazały stosunkowo szybką kinetykę refoldingowania, którą można było wiarygodnie ocenić, podczas gdy żadne z denaturowanych wariantów NowGFP i KillerOrange nie odzyskały wartości umożliwiającej dalsze pomiary ilościowe. W przypadku EGFP powrót emisji tryptofanu był dwukrotnie szybszy (zakończony w 750 s) w porównaniu do powrotu emisji chromoforu (zakończony w 1,500 s), co wskazuje na złożoność zachodzących procesów (Rycina 8). Przy obu długościach fali wzbudzenia szybkość refoldingowania była zwiększona w obecności S-Flp, co jest zgodne z danymi literaturowymi25. Jednocześnie wariant zawierający Dhp wykazał profil refoldingowania podobny do typu dzikiego.

figure-results-1
Rysunek 1Rusztowanie strukturalne białka GFP (GFP), budowa chromoforu, przejścia konformacyjne proliny oraz analogi syntetyczne użyte w niniejszym badaniu. (A) Struktura GFP składa się z βnici tworzące niemal idealną beczkę (tj. "może" o wymiarach 4,2 nm x 2,4 nm), który jest zamknięty z obu końców przez α-pokrywki helikalne. Białko GFP o masie 27 kDa wykazuje strukturę trzeciorzędową składającą się z jedenastu β-nici, dwie krótkie α– helisy oraz chromofor w środku. Stany konformacyjne sąsiednich prolin są powiązane z formowaniem się chromoforu. (B) Autokatalityczne dojrzewanie (kondensacja) chromoforu zachodzi w obrębie reszt Ser65, Tyr66 i Gly67 i przebiega w kilku etapach: po pierwsze, następuje dostosowanie torsyjne szkieletu polipeptydowego, aby zbliżyć węgiel karboksylowy Thr65 do azotu amidowego Gly67. Następnie, w wyniku ataku nukleofilowego azotu amidowego glicyny na ten atom węgla i późniejszej dehydratacji, powstaje heterocykliczny układ pierścieniowy imidazolin-5-on. W końcowym etapie układ zyskuje fluorescencję w zakresie światła widzialnego, gdy utlenianie wiązania węgiel alfa-beta tyrozyny przez tlen cząsteczkowy prowadzi do rozszerzenia układu sprzężonego pierścienia imidazolinowego, obejmując ostatecznie pierścień fenylowy tyrozyny oraz jego podstawnik para-tlenowy. Powstały chromofor para-hydroksybenzylideno-imidazolinon w centrum... β-beczka jest całkowicie oddzielona od głównej objętości rozpuszczalnika. (C) Wzory szkieletowe i geometrie 1) pierścienia proliny (pukery) oraz 2) poprzedzającego go wiązania amidowego reprezentują główne przejścia konformacyjne reszty proliny. (D) Analogi proliny użyte w niniejszej pracy z wyznaczonymi konformacjami pierścienia proliny. Rysunek został wygenerowany przy użyciu programów ChemDraw oraz Discovery Studio Visualizer. Struktura GFP pochodzi z wpisu 2Q6P w bazie PDB. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2: Białka fluorescencyjne użyte w niniejszym badaniu. Panele przedstawiają reprezentację wstążkową typowych struktur beczki β trzech różnych wariantów białek fluorescencyjnych: EGFP, NowGFP oraz KillerOrange, przy czym kolor wstążki odpowiada barwie emisji fluorescencji każdego wariantu. Pozostałości proliny (kod jedno-literowy) są zaznaczone jako kije, a odpowiednie pozycje są opisane. Chromofory są przedstawione z początkowym składem aminokwasowym pogrubionym. Wszystkie reprezentacje struktur zostały wykonane w programie PyMol na podstawie następujących wpisów struktur PDB: 2Q6P dla EGFP, 4RYS dla NowGFP, 4ZFS dla KillerOrange. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Schemat blokowy metody SPI służącej do specyficznego dla reszt wbudowywania niekanonicznych analogów proliny. Szczep gospodarza Escherichia coli (E. coli) auksotroficzny względem proliny, zawierający gen zainteresowania na plazmidzie ekspresyjnym, jest hodowany w zdefiniowanym medium minimalnym z wszystkimi 20 kanonicznymi aminokwasami do momentu osiągnięcia OD600 na poziomie ~0,7, przy którym kultura komórek znajduje się w środkowej fazie wzrostu logarytmicznego. Komórki są zbierane i przenoszone do świeżego medium minimalnego zawierającego 19 kanonicznych aminokwasów oraz analog proliny. Po dodaniu induktora ekspresja białka jest prowadzona przez noc. Na koniec białko docelowe jest izolowane poprzez lizę komórek i oczyszczane przed dalszą analizą. W wariancie tego protokołu komórki są hodowane w zdefiniowanym medium minimalnym z 19 kanonicznymi aminokwasami, a prolinę dodaje się w ograniczonej ilości (np. jedna piąta stężenia pozostałych aminokwasów). Dzięki temu komórki wyczerpują prolinę w medium przed opuszczeniem fazy wzrostu logarytmicznego, a następnie dodawany jest analog i indukowana jest produkcja białka zainteresowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza ekspresji wariantów EGFP, NowGFP i KillerOrange. (A) Osady komórkowe z 1 mL kultury ekspresyjnej, znormalizowane do OD600 = 2. Analiza SDS-PAGE dla wariantów (B) EGFP, (C) NowGFP oraz (D) KillerOrange. Na żel poliakrylamidowy 15% naniesiono frakcje rozpuszczalne (S) i nierozpuszczalne (I) każdego pochodnego białka fluorescencyjnego, a także frakcje elucian (E) z IMAC białek rozpuszczalnych. Jako marker (M) w ścieżkach oznaczonych (M) wykorzystano PageRuler Unstained Protein Ladder. Obramowano oczekiwane regiony dla konkretnych białek. Aminokwasy wprowadzone w pozycjach proliny to Pro, R-Flp, S-Flp oraz Dhp (w (A) pokazano osady komórkowe z wariantów białek fluorescencyjnych zawierających Dfp zamiast Dhp). Żele barwiono 1% (w/v) Coomassie Brillant Blue. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Analiza spektrometrią mas białek fluorescencyjnych i ich wariantów. (A) Reprezentatywne dekonwolucyjne widma ESI-MS dla EGFP z tagiem H6 (czarne), S-Flp-EGFP (pomarańczowe) i Dhp-EGFP (cyjanowe), z położeniem głównych pików mas podanymi jako liczby (w Da). Obliczone masy cząsteczkowe [M+H]+ białek z tagiem H6 wynoszą: dla EGFP 27 745,33 Da (zaobserwowano 27 746,15 Da); dla S-Flp-EGFP 27 925,33 Da (zaobserwowano 27 925,73 Da); dla Dhp-EGFP 27 725,33 Da (zaobserwowano 27 726,01 Da). (B) Reprezentatywne dekonwolucyjne widma ESI-MS dla NowGFP z tagiem H6 (czarne), S-Flp-NowGFP (pomarańczowe) i Dhp-NowGFP (cyjanowe), z położeniem głównych pików mas podanymi jako liczby (w Da). Obliczone masy białek z tagiem H6 wynoszą: dla NowGFP 27 931,50 Da (zaobserwowano 27 946,46 Da; różnica ok. 16 Da wynika prawdopodobnie z utlenienia metioniny w białku); dla S-Flp-NowGFP 28 129,50 Da (zaobserwowano 28 130,08 Da); dla Dhp-NowGFP 27 909,50 Da (zaobserwowano 27 910,22 Da). (C) Reprezentatywne dekonwolucyjne widma ESI-MS dla KillerOrange z tagiem H6 (czarne), S-Flp-KillerOrange (pomarańczowe) i Dhp-KillerOrange (cyjanowe), z położeniem głównych pików mas podanymi jako liczby (w Da). Obliczone masy białek z tagiem H6 wynoszą: dla KillerOrange 27 606,09 Da (zaobserwowano 27 605,91 Da); dla S-Flp-KillerOrange 27 876,09 Da (zaobserwowano 27 876,08 Da); dla Dhp-KillerOrange 27 576,09 Da (zaobserwowano 27 575,93 Da). Odchylenia między zaobserwowanymi a obliczonymi masami cząsteczkowymi wynoszące około 1 Da mieszczą się w zakresie błędu urządzenia ESI-MS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Widma absorpcji światła i emisji fluorescencji wariantów białek fluorescencyjnych. Przedstawiono znormalizowane widma absorpcji UV-Vis dla wariantów (A) EGFP, (B) NowGFP oraz (C) KillerOrange. Widma znormalizowano do maksimum absorbancji chromoforu (około 500 nm). Przedstawiono znormalizowane widma emisji fluorescencji wariantów (D,G) EGFP, (E,H) NowGFP oraz (F,I) KillerOrange. Widma w (D,E,F) zmierzono po wzbudzeniu światłem ultrafioletowym (295 nm), natomiast dla widm w (G,H,I) do wzbudzenia wykorzystano odpowiednio światło o długości 488 nm, 493 nm i 510 nm; widma znormalizowano do odpowiednich maksimów emisji chromoforu (około 500 nm). Na każdym panelu czarne krzywe odpowiadają widmom wariantu białka fluorescencyjnego z natywną proliną, pomarańczowe krzywe wskazują widma białek z podstawieniem S-Flp, a niebieskie krzywe odpowiadają białkom z podstawieniem Dhp. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-7
Rycina 7: Widma emisji fluorescencji wariantów EGFP w eksperymentach z refoldingiem. Znormalizowane widma emisji fluorescencji roztworów o stężeniu 0,3 µM wariantów białek fluorescencyjnych w stanie natywnym oraz po denaturacji i refoldingu: Widma w (A,B,C) zmierzono przy wzbudzeniu światłem ultrafioletowym (295 nm) (A) dla EGFP, (B) dla S-Flp-EGFP oraz (C) dla Dhp-EGFP. Widma w (D,E,F) zmierzono przy wzbudzeniu światłem zielonym (488 nm) (D) dla EFGP, (E) dla S-Flp-EGFP oraz (F) dla Dhp-EGFP. Widma emisji próbek natywnych (krzywe czarne) i refoldowanych (odpowiednio: zielony dla EGFP, pomarańczowy dla S-Flp-EGFP i niebieski dla Dhp-EGFP) każdego wariantu białka zostały znormalizowane do maksymalnej fluorescencji odpowiedniego stanu natywnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-8
Rycina 8: Monitorowanie fałdowania białka i dojrzewania chromoforu wariantów EGFP za pomocą fluorescencji. (A) Emisja fluorescencji w obszarze fluorescencji Trp (emisja ustawiona na 330 nm) zarejestrowana po wzbudzeniu światłem ultrafioletowym (295 nm). (B) Rozwój amplitudy fluorescencji w obszarze emisji chromoforu po wzbudzeniu światłem zielonym (488 nm). Zależne od czasu ślady fluorescencji znormalizowano do jedności (100%) zgodnie z amplitudą fluorescencji osiągniętą na koniec przedziału monitorowania. Na każdym panelu krzywe czarne odpowiadają widmom wariantu białka fluorescencyjnego z natywną proliną, krzywe pomarańczowe wskazują widma białek z substytucją S-Flp, a krzywe niebieskie odpowiadają białkom z substytucją Dhp. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

KonstruktSekwencje aminokwasowe (znacznik 6xHis podkreślony):
EGFP-H6MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVP
WPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTR
AEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVN
FKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDH
MVLLEFVTAAGITLGMDELYKHHHHHH
H6-NowGFPMRGSHHQHHHGSVSKGEKLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGK
MSLKFICTTGKLPVPWPTLKTTLTWGMQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGY
VQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGVDFKEDGNILGHKLEYN
AISGNANITADKQKNGIKAYFTIRHDVEDGSVLLADHYQQNTPIGDGPVLLPD
NHYLSTQSKQSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIPLGADELYK
H6-KillerOrangeMRGSHHHHHHGSECGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPH
GDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQWGEPFFARYPDGISHFAQECFPEG
LSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELSDTCVVSRITVNCDGFQPDGPIMRDQ
LVDILPSETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHLDSKMTFNGSR
AIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAHAHSVPRITSAIGSDQD

Tabela 1: Struktury pierwotne białek docelowych. Znaczniki His są podkreślone w każdej sekwencji.

λ [nm]ε [M-1·cm-1] (EGFP)ε [M-1·cm-1] (S-Flp-EGFP)ε [M-1·cm-1] (Dhp-EGFP)
488 (≡ CRO)31,657 (± 1,341)22,950 (± 290)27,800 (± 542)
280 (≡ Tyr+Trp)20,116 (± 172)23,800 (± 715)17,300 (± 554)
Wartości współczynnika ekstynkcji ε (w M-1·cm-1) są obliczane na podstawie zarejestrowanych widm absorbancji UV-Vis odpowiednich wariantów EGFP przy użyciu znanych stężeń białek. Wybrana długość fali 280 nm odpowiada maksimum absorbancji reszt aromatycznych, tyrozyny i tryptofanu, natomiast 488 nm reprezentuje długość fali absorbancji chromoforu.

Tabela 2: Współczynniki ekstynkcji (ε) wariantów EGFP przy wybranych długościach fal. Wartości współczynnika ekstynkcji ε (w M-1·cm-1) obliczono na podstawie zarejestrowanych widm absorpcyjnych UV-Vis odpowiednich wariantów EGFP przy użyciu znanych stężeń białek. Wybrana długość fali 280 nm odpowiada maksymalnej absorbancji reszt aromatycznych, tyrozyny i tryptofanu, natomiast 488 nm reprezentuje długość fali maksymalnej absorbancji chromoforu.

Materiały uzupełniające: Przygotowanie roztworów stokowych i buforów Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W naturze manipulacje strukturami i funkcjami białek zwykle zachodzą z powodu mutacji, zjawiska, które prowadzi do wymiany tożsamości aminokwasów w określonych pozycjach w sekwencji białka. Ten naturalny mechanizm jest szeroko stosowany jako metoda biotechnologiczna inżynierii białkowej w postaci mutagenezy i opiera się na repertuarze 20 kanonicznych aminokwasów biorących udział w tym procesie. Wymiana reszt proliny jest jednak problematyczna. Ze względu na specjalną architekturę grupy szkieletowej, jest on prawie niewymienny z pozostałymi 19 pozostałościami do wymiany72. Na przykład prolina jest zwykle znana jako łamacz struktur drugorzędowych w sekwencjach polipeptydowych ze względu na jej słabą kompatybilność z najczęstszymi strukturami drugorzędowymi, tj. α-helisą i nicią β. Ta cecha proliny jest łatwo tracona, gdy reszta jest zmutowana do innego aminokwasu ze wspólnego repertuaru. Zastąpienie proliny jej chemicznymi analogami stanowi alternatywne podejście, które umożliwia zachowanie podstawowych cech szkieletu macierzystej reszty proliny, przy jednoczesnym narzuceniu odchylenia na jej specyficzne przejścia konformacyjne lub wytwarzaniu modulacji objętości cząsteczkowej i polarności. Na przykład możliwe jest dostarczanie kultur bakteryjnych o strukturach analogowych, takich jak hydroksy-, fluoro-, alkilo-, dehydroproliny, struktury o zmiennych rozmiarach pierścieni i inne, ułatwiając w ten sposób produkcję białka zawierającego specyficzne zmiany reszty proliny.

Opisana w tym badaniu metoda selektywnego włączania ciśnienia (SPI) pozwala na globalną, tj. specyficzną dla reszty wymianę wszystkich prolin w białku docelowym na pokrewne analogi chemiczne. O znaczeniu metody świadczy fakt, że SPI pozwala na tworzenie zmian sekwencji niedostępnych dla powszechnych technik mutagenezy. Na przykład pozwala na produkcję docelowego białka zawierającego raczej niewielkie zmiany strukturalne, które zazwyczaj nie mogą przekraczać jednej lub dwóch podmian/delecji/addycji atomów, jak wykazano w tym badaniu. Takie modyfikacje białek nazywane są "mutacjami atomowymi"73,74. W białku fluorescencyjnym, takim jak GFP, wynik tej intruzji molekularnej można zaobserwować w prędkości fałdowania, lokalnych polaryzacjach, upakowaniu białek, stabilności zaangażowanych cech strukturalnych. Zmiany właściwości absorbancji i fluorescencji powstają pośrednio w wyniku wpływu na fałdowanie białek i mikrośrodowiska pozostałości. Precyzja zmian molekularnych zachodzących w SPI jest zazwyczaj znacznie wyższa w porównaniu z mutacjami prolin do innych reszt kanonicznych, przy czym te ostatnie są zazwyczaj szkodliwe dla fałdowania, produkcji i izolacji białek.

Jako metodę produkcji, podejście SPI wykorzystuje tolerancję substratową kieszeni syntetazy aminoacylo-tRNA w stosunku do chemicznych analogów natywnego aminokwasu. Syntetaza jest odpowiedzialna za prawidłową identyfikację struktury aminokwasu, podczas gdy włączenie do białek następuje w dalszej części procesu translacji. Instrumentalnie produkcja, izolacja i oczyszczanie białek w SPI odbywa się w sposób typowy dla wszelkich innych technik ekspresji białek rekombinowanych; jednak z pewnymi dodatkami do protokołu, jak następuje: Prolina, która jest związana z wymianą, jest dostarczana na początku procesu fermentacji, dzięki czemu komórki mogą rosnąć i rozwijać swoją nienaruszoną maszynerię komórkową. Jednak hodowla komórkowa nie może osiągnąć maksymalnej gęstości optycznej, aby utrzymać komórki w fazie logarytmicznej optymalnej dla ekspresji białek. W tym momencie istnieją dwie główne odmiany metody SPI. W pierwszym z nich stężenie proliny jest regulowane w początkowym pożywce wzrostowej (pożywce zdefiniowanej chemicznie) w taki sposób, że wyczerpanie proliny następuje bez ingerencji z zewnątrz. Komórki wydalają prolinę w pożywce, zanim będą mogły wyjść z logarytmicznej fazy wzrostu, a następnie dodaje się analog i indukuje się produkcję białka będącego przedmiotem zainteresowania. W drugiej wersji metody komórki hoduje się w pożywce zawierającej prolinę do połowy ich fazy logarytmicznej. W tym momencie komórki należy wyjąć i fizycznie przenieść do innego podłoża, które nie zawiera już proliny, tylko analog, z późniejszą indukcją interesującego białka. W obu wersjach analog i odczynnik do indukcji białek są dostarczane do wstępnie wyhodowanych komórek. Izolację i oczyszczanie białka typu dzikiego przeprowadza się w taki sam sposób, jak w przypadku wariantów. W zasadzie każdy dostępny szczep proauksotroficzny może być używany jako gospodarz ekspresji. Niemniej jednak wskazane są testy ekspresji w celu zidentyfikowania najbardziej odpowiedniego gospodarza. Testy różnych chemicznie zdefiniowanych pożywek mogą być również wykorzystane do optymalizacji wydajności białka.

Istnieją pewne wymagania dotyczące analogów chemicznych, które należy wziąć pod uwagę dla SPI, takie jak rozpuszczalność i stężenie. Dostępność metaboliczna i wychwyt aminokwasów zależą od liczby rozpuszczonych cząsteczek w pożywce. Aby zwiększyć rozpuszczalność określonego związku, można wybrać warunki lekko kwaśne lub zasadowe. Ponieważ sztuczne cząsteczki mogą powodować działanie hamujące wzrost ze względu na ich toksyczność komórkową, stężenie powinno być obniżone do minimum, aby uniknąć stresu komórkowego75.

Drobną słabością SPI jest spadek efektywności inkorporacji przy większej liczbie pozycji, które trzeba wymienić. Zasadniczo zmniejszenie częstości aminokwasów w docelowej biomolekułach przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce może rozwiązać ten problem. Jednak na właściwości strukturalne i funkcjonalne pożądanego białka może mieć wpływ zmiana struktury pierwszorzędowej.

Jak wspomniano wcześniej, SPI umożliwia specyficzną dla reszty wymianę aminokwasu kanonicznego. Oznacza to, że aminokwasy niekanoniczne są wprowadzane w każdą pozycję aminokwasu kanonicznego w białku docelowym, w tym konserwatywne reszty, które są niezbędne do funkcjonowania białka lub fałdowania. Alternatywne metody włączania specyficznego dla danego miejsca są jedyną możliwością przezwyciężenia tego problemu3. W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano metodę par ortogonalnych, która może wytwarzać białka zawierające zmodyfikowane reszty w określonych miejscach. Najczęstszą modyfikacją tej metody jest tzw. supresja kodonu stop. Metoda ta opiera się na zaprojektowanym ortogonalnym systemie translacji dedykowanym do specyficznego dla miejsca wprowadzania syntetycznych aminokwasów76. Do tej pory przy użyciu tego podejścia do białek włączono ponad 200 aminokwasów o różnych modyfikacjach łańcucha bocznego77. Jednak te systemy translacyjne nadal nie nadają się do insercji analogów proliny do białek docelowych. Co więcej, wydajność metody jest uważana za niską w przypadku niewielkich modyfikacji aminokwasów, ponieważ pewna rozwiązłość tła syntetazy aminoacylo-tRNA zwykle pozostaje w zmodyfikowanych systemach translacji.

Za pomocą SPI wyprodukowaliśmy szereg β-beczkowych wariantów białek fluorescencyjnych i zbadaliśmy wyniki wymiany proliny z jej nienaturalnymi analogami. W przypadku zastąpienia proliny przez R-Flp i Dfp, dysfunkcyjne białko zostało wytworzone przez gospodarza ekspresji. Efekt ten jest prawdopodobnie spowodowany nieprawidłowym fałdowaniem białek. Ten ostatni może pochodzić z konformacji C 4-egzo promowanej przez R-Flp, która nie jest faworyzowana przez macierzyste struktury białkowe27. W przypadku Dfp nieprawidłowe fałdowanie prawdopodobnie jest spowodowane zmniejszoną prędkością izomeryzacji wiązania peptydowego trans-to-cis na reszcie proliny27. Wiadomo, że ten ostatni jest jednym z etapów ograniczających w profilu kinetycznym fałdowania białka, który wpływa na tworzenie β-beczki, a następnie dojrzewanie chromoforu. Rzeczywiście, w przypadku obu aminokwasów, R-Flp i Dfp, produkcja białka doprowadziła do zagregowanego i nierozpuszczalnego białka. W związku z tym nie mogło dojść do powstania chromoforu, a fluorescencja została całkowicie utracona. Jednak w przypadku S-Flp i Dhp zaobserwowano prawidłowe dojrzewanie białek, w wyniku czego uzyskano próbki białek fluorescencyjnych dla każdej kombinacji analog/białko. Pomimo pewnych modulacji cech absorbancji i fluorescencji białka, w dużej mierze pozostały one podobne do tych w białkach typu dzikiego. Efekt substytucji aminokwasów został ujawniony w badaniach kinetyki fałdowania. Ten ostatni wykazał szybsze ponowne fałdowanie w przypadku zastąpienia S-Flp. Badania modelowe wykazały, że ta pozostałość może powodować pewną poprawę prędkości rotacji amidu trans-do cisu i prowadzić do powstania konformacji C4-endo. Oba te czynniki mogą przyczyniać się do korzystnych skutków kinetycznych tej pozostałości w EGFP. W przeciwieństwie do tego, Dhp wytwarzał kinetyczne profile fałdowania maksymalnie podobne do białka macierzystego. Różnorodność wyników uzyskanych przez zwykłe mutacje atomowe w badanych białkach fluorescencyjnych ilustruje potencjał metody produkcji SPI w zmianie właściwości białek docelowych. Zmiany białek wywołane przez zastąpienie proliny analogami mają dalsze implikacje w inżynierii enzymów 78,79,80 i kanałów jonowych 81,82, a także w ogólnej inżynierii stabilności białek.

Podstawowym ograniczeniem metody SPI jest jej tryb "all-or-none" w wymianie proliny na pokrewne analogi. Byłoby bardzo korzystne, gdyby można było precyzyjnie wybrać, które reszty proliny należy zastąpić analogami, a które powinny pozostać niezmodyfikowane. Jednak obecnie nie ma techniki, która pozwoliłaby na przeprowadzenie tak wyrafinowanej produkcji przy użyciu gospodarza produkcji mikrobiologicznej. Chemiczna synteza białek83,84, a także produkcja bezkomórkowa85,86, to dwie alternatywne metody, które mogą powodować modyfikacje proliny specyficzne dla pozycji. Niemniej jednak ich złożoność operacyjna i niska wydajność produkcji sprawiają, że są gorsze w porównaniu z produkcją w żywych komórkach. Jak dotąd, SPI pozostaje najprostszym pod względem operacyjnym i niezawodnym podejściem do produkcji złożonych białek z mutacjami atomowymi. Wprowadzając nienaturalne substytuty aminokwasów, metoda pozwala na modyfikację cech białek w sposób ukierunkowany, czego przykładem są zmiany w fałdowaniu i absorpcji/emisji światła białek fluorescencyjnych generowanych przez substytucje proliny.

Oświadczenia

Autorzy ujawniają wszelkie konflikty interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Niemiecką Fundację Badawczą (Klaster Doskonałości "Unifying Systems in Catalysis") dla T.F. i N.B. oraz przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Nauki (BMBF Program "HSP 2020", TU-WIMIplus Project SynTUBio) dla F.-J.S. i T.M.T.T.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonitrylVWRHiPerSolv CHROMANORM ULTRA do LC-MS, wymagany stopień 83642LC-MS
Wodny roztwór podstawowy akryloamidu i bisakryloamidu w stosunku 37,5:1 (żel ROTIPHORESE 30)Carl Roth3029.1
Agar-agarCarl Roth5210
Molibdenian amonu ((NH4)2MoO4)Sigma-Aldrich277908
Nadtlenosiarczan amonu (APS)Carl Roth9592.2≥ 98 %, rocznie, wymagany stopień ACS
Siarczan amonu ((NH4)2SO4)Sigma-AldrichA4418
Sól sodowa ampicylinyCarl RothK029
BiotynaSigma-AldrichB4501
Błękit bromofenolowySigma-AldrichB0126
Chlorek wapnia (CaCl< sub>2)Sigma-AldrichC5670
Coomassie Brillant Blue R 250Carl Roth3862
Siarczan miedzi (CuSO4)Carl RothCP86.1
D-glukozaCarl Roth6780
1,2-bis-(dimetyloamino)-etan,  N,N,N',N'-Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Carl Roth2367.3≥ 99 % rocznie, do elektroforezy
1,4-ditiotreitol (DTT)Carl Roth6908
Dichlorometan (DCM)Sigma-Aldrich270997
wodorofosforan dipotasu (K2HPO4)Carl RothP749.1
wodorofosforan disodowy (Na2HPO4)Carl RothX987
DNase ISigma-AldrichD5025
Dowex 50WX8-100 (forma wodorowa)Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, Stany Zjednoczone)10731181żywica kationowymienna
EtanolCarl Roth9065.1
Kwas mrówkowyVWRHiPerSolv CHROMANORM dla LC-MS, wymagany 84865LC-MS
Lodowcowy kwas octowyCarl Roth3738.5100 %, p. a.
GlicerolCarl Roth3783
ImidazolCarl RothX998
Chlroide wodoru (HCl)Merck295426
Chlorek żelaza(II) (FeCl2)Sigma-Aldrich380024
IsopropanolCarl RothAE73.1
Izopropyl β-D-1- tiogalaktopiranozyd (IPTG)Sigma-AldrichI6758
LizozymSigma-AldrichL6876
Chlorek magnezu (MgCl2)Carl RothKK36.1
Siarczan magnezu (MgSO4)Carl Roth8283.2
Chlorek manganu (MnCl2)Sigma-Aldrich63535
β-merkaptoetanolCarl Roth4227.3
PageRuler Niebarwiona drabinka białkowaThermo Fisher Scientific26614
Chlorek potasu (KCl)Carl Roth6781.3
Diwodorofosforan potasu (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655
RNaza ACarl Roth7156
Chlorek sodu (NaCl)Carl RothP029
Diwodorofosforan sodu (NaH2PO4)Carl RothT879
Dodecylosiarczan sodu (NaC12H25SO4)Carl Roth0183
TiaminaSigma-AldrichT4625
Kwas trifluorooctowy (TFA)Sigma-AldrichT6508
Chlorowodorek Tris (Tris-HCl)Sigma-Aldrich857645
Tris(hydroksymetylo)-aminometan (Tris)Carl Roth5429
TryptonCarl Roth8952
Ekstrakt drożdżowyCarl Roth2363
Chlorek (ZnCl2)Sigma-Aldrich229997
L-alaninaSigma-AldrichA7627
L-argininaSigma-AldrichA5006
L-asparaginaSigma-AldrichA8381
L-asparaginaSigma-AldrichA0884
L-cysteinaSigma-AldrichC7352
L-glutaminowy kwasSigma-AldrichG2128
L-glutaminaSigma-AldrichG3126
L-glicynaSigma-AldrichG7126
L-histydynaSigma-AldrichH8000
L-izoleucynaSigma-AldrichI2752
L-leucynaSigma-AldrichL8000
L-lizynaSigma-AldrichL5501
L-metioninaSigma-AldrichM9625
L-fenyloalaninaSigma-AldrichP2126
L-prolineSigma-AldrichP0380
L-serynaSigma-AldrichS4500
L-treoninaSigma-AldrichT8625
L-tryptofanSigma-AldrichT0254
L-tyrozynaSigma-AldrichT3754
L-walinaSigma-AldrichV0500
(4S)-fluoroprolinaBachem4033274Upewnij się, że wszystkie analogi proliny nie zawierają proliny, sprawdź zawartość. W przeciwnym razie należy wykonać krok w celu spożycia zanieczyszczeń proliną podczas odciągania.
(4R)-fluoroprolineBachem4033275Upewnij się, że wszystkie analogi proliny są wolne od proliny, sprawdź zawartość. W przeciwnym razie uwzględnij krok do spożycia zanieczyszczeń proliny podczas odciągania
3,4-dehydroprolinyBachem4003545Upewnij się, że wszystkie analogi proliny są wolne od proliny, sprawdź zawartość. W przeciwnym razie uwzględnij krok do spożycia zanieczyszczeń proliną podczas odciągania
4,4-difluoroprolinyEnamineEN400-17448Upewnij się, że wszystkie analogi proliny są wolne od proliny, sprawdź zawartość. W przeciwnym razie uwzględnij krok do spożycia zanieczyszczeń proliną podczas odciągania
Stożkowe probówki polistyrenowe (Falcon), 15 mlFisher Scientific14-959-49B
Stożkowe probówki polistyrenowe (Falcon), 50 mlFisher Scientific14-432-22
Membrana do dializy, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000Spectrum Medical IndustriesSpectra/Por MWCO 5000 membrana dializacyjna, 133198
Kolumna do chromatografii powinowactwa do immobilizowanych jonów metali (IMAC) 1 ml, Ni-NTAGE HealthcareHisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01
Strzykawka Luer-Lock, 5 mlRothEP96.1
Luer-Lock, 20 mlRothT550.1
Luer-Lock, 50 mlCarl RothT552.1
Probówki do mikrowirówek, 1,5 mlEppendorf
szalki Petriego (polistyren, sterylne)Carl RothTA19
pQE-80L wektor plazmidowyQiagennie jest już dostępnyzastąpiony przez N-koniec pQE Zestaw wektorów Nr kat./ID: 32915
Pro-auksotroficzny E. coli szczep JM83Addgene50348https://www.addgene.org/50348/
Proauksotroficzny E. coli szczep JM83ATCC35607
Rurki z polistyrenu okrągłodennego, 14 mlFisher ScientificCorning Falcon, 14-959-1B
Filtr strzykawkowy 0,45 i mikro; m z membraną z polifluorku winylidenu (PVDF)RothCCY1.1
Kolumna do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) do LC-ESI-TOF-MSSigma-AldrichSupelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC, 3 i mikro; m wielkość cząstek, 10 cm x 2,1 mmze stożkowymi wkładkami szklanymi 0,1 ml, nakrętkami i
fiolkami z autosamplerem przegrodowym HPLC 1,5 mlSigma-AldrichSupelco 854165
Spektrometr masowy do LC-ESI-TOF-MSAgilentAgilent 6530 Oprogramowanie
danychAgilentMassHunter do analizy jakościowej v. B.06.00
Wirówka stołowa do probówek Eppendorf 1,5 mlEppendorf5427 R
Wirówka chłodząca do probówek Falcon 50 mlSystem Eppendorf5810 R
do szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC)GE HealthcareÄ KTA pure 25 L
Spektrometr fluorescencyjnyPerkin ElmerLS 55
Wysokociśnieniowy mikrofluidyzator do rozbijania komórek bakteryjnychMikrofluidykaSeria LM z " Z” typ komora
Wytrząsarka orbitalna do hodowli bakteriiInfors HTMinitron
Pompa perystaltyczna do chromatografii cieczowej (LC)GE HealthcareP-1
Homogenizator ultradźwiękowy do rozbijania komórek bakteryjnychOmnilabBandelin SONOPULS HD 3200, 5650182z końcówką sonifikatora MS72
Spektrofotometr UV-VisBiochromULTROSPEC 2100
Spektrofotometr UV-Vis/NIRPerkin ElmerLAMBDA 950 UV/Vis/NIR
Strzykawka Carl Strzykawka Carl 30120086 Carl do analizy danych spektrometrii mas Accurate-Mass QTOF Oprogramowanie do analizy

Bibliografia

  1. Agostini, F., Völler, J. -S., Koksch, B., Acevedo-Rocha, C. G., Kubyshkin, V., Budisa, N. Biocatalysis with unnatural amino acids: Enzymology meets xenobiology. Angewandte Chemie (International ed. In English). 56 (33), 9680-9703 (2017).
  2. Minks, C., Alefelder, S., Moroder, L., Huber, R., Budisa, N. Towards new protein engineering: In vivo building and folding of protein shuttles for drug delivery and targeting by the selective pressure incorporation (SPI) method. Tetrahedron. 56 (48), 9431-9442 (2000).
  3. Hoesl, M. G., Budisa, N. Expanding and engineering the genetic code in a single expression experiment. Chembiochem: A, European Journal of Chemical Biology. 12 (4), 552-555 (2011).
  4. Wiltschi, B., Budisa, N. Natural history and experimental evolution of the genetic code. Applied Microbiology and Biotechnology. 74 (4), 739-753 (2007).
  5. Hoesl, M. G., et al. Lipase congeners designed by genetic code engineering. ChemCatChem. 3 (1), 213-221 (2011).
  6. FPbase avGFP. , Available from: https://www.fpbase.org/protein/avgfp/ (2011).
  7. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).
  8. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418 (6895), 331-335 (2002).
  9. Misteli, T., Spector, D. L. Applications of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology. Nature Biotechnology. 15 (10), 961-964 (1997).
  10. Hanson, M. R., Köhler, R. H. GFP imaging: methodology and application to investigate cellular compartmentation in plants. Journal of Experimental Botany. 52 (356), 529-539 (2001).
  11. Sakamoto, S., Shoyama, Y., Tanaka, H., Morimoto, S. Application of green fluorescent protein in immunoassays. Advances in Bioscience and Biotechnology. 05 (6), 557-563 (2014).
  12. Akbar, M., Kim, H. Y. Green fluorescent protein tagging: A novel tool in biomedical research. Indian Journal of Biotechnology. 4, 466-470 (2005).
  13. Kobayashi, T., Morone, N., Kashiyama, T., Oyamada, H., Kurebayashi, N., Murayama, T. Engineering a novel multifunctional green fluorescent protein tag for a wide variety of protein research. PloS One. 3 (12), 3822(2008).
  14. Kent, K. P., Oltrogge, L. M., Boxer, S. G. Synthetic control of green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (44), 15988-15989 (2009).
  15. Born, J., Pfeifer, F. Improved GFP variants to study gene expression in Haloarchaea. Frontiers in Microbiology. 10, 1200(2019).
  16. Pakhomov, A. A., Martynov, V. I. GFP family: structural insights into spectral tuning. Chemistry & Biology. 15 (8), 755-764 (2008).
  17. Zimmer, M. Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophysical behavior. Chemical Reviews. 102 (3), 759-781 (2002).
  18. Valbuena, F. M., Fitzgerald, I., Strack, R. L., Andruska, N., Smith, L., Glick, B. S. A photostable monomeric superfolder green fluorescent protein. Traffic. 21 (8), Copenhagen, Denmark. 534-544 (2020).
  19. Craggs, T. D. Green fluorescent protein: structure, folding and chromophore maturation. Chemical Society Reviews. 38 (10), 2865-2875 (2009).
  20. Maddalo, S. L., Zimmer, M. The role of the protein matrix in green fluorescent protein fluorescence. Photochemistry and Photobiology. 82 (2), 367-372 (2006).
  21. Cui, G., Lan, Z., Thiel, W. Intramolecular hydrogen bonding plays a crucial role in the photophysics and photochemistry of the GFP chromophore. Journal of the American Chemical Society. 134 (3), 1662-1672 (2012).
  22. Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
  23. Andrews, B. T., Roy, M., Jennings, P. A. Chromophore packing leads to hysteresis in GFP. Journal of Molecular Biology. 392 (1), 218-227 (2009).
  24. Xie, J. -B., Zhou, J. -M. Trigger factor assisted folding of green fluorescent protein. Biochemistry. 47 (1), 348-357 (2008).
  25. Steiner, T., Hess, P., Bae, J. H., Wiltschi, B., Moroder, L., Budisa, N. Synthetic biology of proteins: tuning GFPs folding and stability with fluoroproline. PloS One. 3 (3), 1680(2008).
  26. Andrews, B. T., Schoenfish, A. R., Roy, M., Waldo, G., Jennings, P. A. The rough energy landscape of superfolder GFP is linked to the chromophore. Journal of Molecular Biology. 373 (2), 476-490 (2007).
  27. Kubyshkin, V., Davis, R., Budisa, N. Biochemistry of fluoroprolines: the prospect of making fluorine a bioelement. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 17, 439-460 (2021).
  28. Renner, C., Alefelder, S., Bae, J. H., Budisa, N., Huber, R., Moroder, L. Fluoroprolines as tools for protein design and engineering. Angewandte Chemie (International ed. In English). 40 (5), 923-925 (2001).
  29. Fukuda, H., Arai, M., Kuwajima, K. Folding of green fluorescent protein and the cycle3 mutant. Biochemistry. 39 (39), 12025-12032 (2000).
  30. Rosenman, D. J., et al. Green-lighting green fluorescent protein: faster and more efficient folding by eliminating a cis-trans peptide isomerization event. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 23 (4), 400-410 (2014).
  31. Vitagliano, L., Berisio, R., Mastrangelo, A., Mazzarella, L., Zagari, A. Preferred proline puckerings in cis and trans peptide groups: implications for collagen stability. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 10 (12), 2627-2632 (2001).
  32. Kubyshkin, V. Experimental lipophilicity scale for coded and noncoded amino acid residues. Organic and Biomolecular Chemistry. 19 (32), 7031-7040 (2021).
  33. Kubyshkin, V., Budisa, N. cis-trans-Amide isomerism of the 3,4-dehydroproline residue, the 'unpuckered' proline. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 12, 589-593 (2016).
  34. Budisa, N. Prolegomena to future experimental efforts on genetic code engineering by expanding its amino acid repertoire. Angewandte Chemie (International ed. In English). 43 (47), 6426-6463 (2004).
  35. Beatty, K. E., Tirrel, D. A. Noncanonical amino acids in protein science and engineering. Protein Engineering. Nucleic Acids and Molecular Biology. 22, Springer. Berlin, Heidelberg. (2009).
  36. Budisa, N. Engineering the Genetic Code: Expanding the Amino Acid Repertoire for the Design of Novel Proteins. , WILEY-VCH. Weinheim. (2006).
  37. Merkel, L., Budisa, N. Organic fluorine as a polypeptide building element: in vivo expression of fluorinated peptides, proteins and proteomes. Organic & Biomolecular Chemistry. 10 (36), 7241-7261 (2012).
  38. van Eldijk, M. B., van Hest, J. C. M. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids for protein engineering. Methods in Molecular Biology. 1728, Clifton, N.J. 137-145 (2018).
  39. Hartman, M. C. T. Non-canonical amino acid substrates of E. coli aminoacyl-tRNA synthetases. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. , (2021).
  40. Gomez, M. A. R., Ibba, M. Aminoacyl-tRNA synthetases. RNA. 26 (8), 910-936 (2020).
  41. Grant, M. M., Brown, A. S., Corwin, L. M., Troxler, R. F., Franzblau, C. Effect of l-azetidine 2-carboxylic acid on growth and proline metabolism in Escherichia coli. Biochimica et Biophysica Acta. 404 (2), 180-187 (1975).
  42. Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 230 (2), 788-796 (1995).
  43. Budisa, N., Pal, P. P. Designing novel spectral classes of proteins with a tryptophan-expanded genetic code. Biological Chemistry. 385 (10), 893-904 (2004).
  44. Hoesl, M. G., Budisa, N. Recent advances in genetic code engineering in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 751-757 (2012).
  45. Nickling, J. H., et al. Antimicrobial peptides produced by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57551(2018).
  46. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  47. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  48. Sarkisyan, K. S., et al. fluorescent protein with anionic tryptophan-based chromophore and long fluorescence lifetime. Biophysical Journal. 109 (2), 380-389 (2015).
  49. Sarkisyan, K. S., et al. KillerOrange, a genetically encoded photosensitizer activated by blue and green light. PloS One. 10 (12), 0145287(2015).
  50. Grigorenko, B. L., Krylov, A. I., Nemukhin, A. V. Molecular modeling clarifies the mechanism of chromophore maturation in the green fluorescent protein. Journal of the American Chemical Society. 139 (30), 10239-10249 (2017).
  51. Pletnev, V. Z., et al. Structure of the green fluorescent protein NowGFP with an anionic tryptophan-based chromophore. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71, Pt 8 1699-1707 (2015).
  52. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  53. Hörnsten, E. G. On culturing Escherichia coli on a mineral salts medium during anaerobic conditions. Bioprocess Engineering. 12 (3), 157-162 (1995).
  54. Davis, B. D. The Isolation of biochemically deficient mutants of bacteria by means of penicillin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 35 (1), 1-10 (1949).
  55. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, USA. (2001).
  56. Wang, Y. -S., et al. The de novo engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase for genetic incorporation of L-phenylalanine and its derivatives. Molecular bioSystems. 7 (3), 714-717 (2011).
  57. JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. ImageJ at (2021).
  58. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).
  59. Baumann, T., et al. Engineering 'Golden' fluorescence by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids and protein analysis by mass spectrometry and fluorescence. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57017(2018).
  60. FPbase NowFFP. , Available from: https://www.fpbase.org/protein/nowgfp/ (2021).
  61. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PloS One. 6 (3), 17896(2011).
  62. Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. Chromophore isomer stabilization is critical to the efficient fluorescence of cyan fluorescent proteins. Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).
  63. Lelimousin, M., et al. Intrinsic dynamics in ECFP and Cerulean control fluorescence quantum yield. Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).
  64. FPbase mKillerOrange. , Available from: https://www.fpbase.org/protein/mkillerorange/ (2021).
  65. Pletneva, N. V., et al. Crystal structure of phototoxic orange fluorescent proteins with a tryptophan-based chromophore. PloS One. 10 (12), 0145740(2015).
  66. Royant, A., Noirclerc-Savoye, M. Stabilizing role of glutamic acid 222 in the structure of Enhanced Green Fluorescent Protein. Journal of Structural Biology. 174 (2), 385-390 (2011).
  67. Larregola, M., Moore, S., Budisa, N. Congeneric bio-adhesive mussel foot proteins designed by modified prolines revealed a chiral bias in unnatural translation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421 (4), 646-650 (2012).
  68. Yamaguchi, H., Miyazaki, M. Refolding techniques for recovering biologically active recombinant proteins from inclusion bodies. Biomolecules. 4 (1), 235-251 (2014).
  69. Ghisaidoobe, A. B. T., Chung, S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: A focus on Förster resonance energy transfer techniques. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22518-22538 (2014).
  70. Pal, P. P., et al. Structural and spectral response of Aequorea victoria green fluorescent proteins to chromophore fluorination. Biochemistry. 44 (10), 3663-3672 (2005).
  71. Pletnev, S., et al. Structural basis for phototoxicity of the genetically encoded photosensitizer KillerRed. The Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 32028-32039 (2009).
  72. Kubyshkin, V., Budisa, N. Anticipating alien cells with alternative genetic codes: away from the alanine world. Current Opinion in Biotechnology. 60, 242-249 (2019).
  73. Minks, C., Huber, R., Moroder, L., Budisa, N. Atomic mutations at the single tryptophan residue of human recombinant annexin V: effects on structure, stability, and activity. Biochemistry. 38 (33), 10649-10659 (1999).
  74. Budisa, N., Huber, R., Golbik, R., Minks, C., Weyher, E., Moroder, L. Atomic mutations in annexin V thermodynamic studies of isomorphous protein variants. European Journal of Biochemistry. 253, 1-9 (1998).
  75. Lin, X., Yu, A. C. S., Chan, T. F. Efforts and challenges in engineering the genetic code. Life. 7, Basel, Switzerland. (2017).
  76. Völler, J. -S., Budisa, N. Coupling genetic code expansion and metabolic engineering for synthetic cells. Current Opinion in Biotechnology. 48, 1-7 (2017).
  77. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annual Review of Biochemistry. 79, 413-444 (2010).
  78. Lukesch, M. S., Pavkov-Keller, T., Gruber, K., Zangger, K., Wiltschi, B. Substituting the catalytic proline of 4-oxalocrotonate tautomerase with non-canonical analogues reveals a finely tuned catalytic system. Scientific Reports. 9 (1), 2697(2019).
  79. Acevedo-Rocha, C. G., et al. Non-canonical amino acids as a useful synthetic biological tool for lipase-catalysed reactions in hostile environments. Catalysis Science & Technology. 3 (5), 1198(2013).
  80. Holzberger, B., Marx, A. Replacing 32 proline residues by a non-canonical amino acid results in a highly active DNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 132 (44), 15708-15713 (2010).
  81. Mosesso, R., Dougherty, D. A., Lummis, S. C. R. Proline residues in the transmembrane/extracellular domain interface loops have different behaviors in 5-HT3 and nACh receptors. ACS Chemical Neuroscience. 10 (7), 3327-3333 (2019).
  82. Mosesso, R., Dougherty, D. A., Lummis, S. C. R. Probing proline residues in the prokaryotic ligand-gated ion channel, ELIC. Biochemistry. 57 (27), 4036-4043 (2018).
  83. Torbeev, V. Deciphering protein folding using chemical protein synthesis. Total Chemical Synthesis of Proteins. 1st ed. , WILEY-VCH. Weinheim. (2021).
  84. Torbeev, V. Y., Hilvert, D. Both the cis-trans equilibrium and isomerization dynamics of a single proline amide modulate β2-microglobulin amyloid assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20051-20056 (2013).
  85. Kawakami, T., Ishizawa, T., Murakami, H. Extensive reprogramming of the genetic code for genetically encoded synthesis of highly N-alkylated polycyclic peptidomimetics. Journal of the American Chemical Society. 135 (33), 12297-12304 (2013).
  86. Cui, Z., Johnston, W. A., Alexandrov, K. Cell-free approach for non-canonical amino acids incorporation into polypeptides. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1031(2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Selektywne wprowadzanie presjizwijanie bia ekstabilno bia ekdojrzewanie chromoforuSDS PAGEspektrometria masrefolding bia ekin ynieria bia ek
Specyficzna dla reszty wymiana proliny przez analogi proliny w białkach fluorescencyjnych: jak "chirurgia molekularna" kręgosłupa wpływa na fałdowanie i stabilność
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.