Specyficzna dla reszty wymiana proliny przez analogi proliny w białkach fluorescencyjnych: jak "chirurgia molekularna" kręgosłupa wpływa na fałdowanie i stabilność

Klasyczna mutageneza ukierunkowana na miejsce pozwala na permutację dowolnej istniejącej sekwencji białka kodowanej przez gen poprzez manipulację kodonami na poziomie DNA. Aby zbadać fałdowanie i stabilność białek, często pożądane jest zastąpienie podobnych aminokwasów podobnymi odpowiednikami. Jednak tradycyjna mutageneza białek jest zdecydowanie ograniczona do strukturalnie podobnych zamienników wśród kanonicznych aminokwasów, takich jak Ser/Ala/Cys, Thr/Val, Glu/Gln, Asp/Asn, Tyr/Phe, które są obecne w standardowym repertuarze kodów genetycznych. Z drugiej strony, nie ma takich możliwości dla innych kanonicznych aminokwasów, takich jak Trp, Met, His lub Pro, które często odgrywają istotną rolę strukturalną i funkcjonalną w białkach¹. Idealnym podejściem do badania tych oddziaływań w kontekście wysoce specyficznej wewnętrznej architektury białek i ich procesu fałdowania jest generowanie niezakłócających modyfikacji izosterycznych. Rzeczywiście, gdy izosteryczne analogi aminokwasów tych kanonicznych aminokwasów, znanych również jako aminokwasy niekanoniczne (ncAA), są wprowadzane do białek, pozwalają na subtelne zmiany nawet na poziomie pojedynczych atomów lub grup atomów, takich jak H/F, CH₂/S/Se/Te znanych jako "mutacje atomowe"2. Taka "chirurgia molekularna" wytwarza zmienione białka, których właściwości wynikają wyłącznie z wymiany pojedynczych atomów lub grup atomów, które w sprzyjających przypadkach mogą być analizowane, a wykryte zmiany mogą być racjonalizowane. W ten sposób zakres syntezy białek w celu badania fałdowania i struktury białek wykracza daleko poza klasyczną mutagenezę DNA. Należy zauważyć, że białka generowane przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce są zwykle określane jako "mutanty", podczas gdy białka z podstawionymi aminokwasami kanonicznymi są określane jako "warianty" ³, "alloproteins"⁴, lub "kongenery białkowe"⁵.

Białko zielonej fluorescencji (GFP), po raz pierwszy zidentyfikowane w organizmie morskim Aequorea victoria, wykazuje jasnozieloną fluorescencję po wystawieniu na działanie światła ultrafioletowego do niebieskiego6^,7. Obecnie GFP jest powszechnie stosowany jako bardzo czułe narzędzie do znakowania do rutynowej wizualizacji ekspresji genów i lokalizacji białek w komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. GFP okazał się również przydatny w różnych badaniach biofizycznych^8,9,10 i biomedical^11,12, a także w inżynierii białek^13,14,15. Wnikliwa analiza struktury GFP pozwoliła na stworzenie licznych wariantów charakteryzujących się zróżnicowaną stabilnością i maksimami fluorescencji^16,17. Większość wariantów GFP stosowanych w biologii komórkowej i molekularnej to białka monomeryczne zarówno w roztworze, jak i w klasie crystal18. Ich główna organizacja strukturalna jest typowa dla wszystkich członków rodziny GFP, niezależnie od ich pochodzenia filogenetycznego, i składa się z 11 β-nici tworzących tzw. β-beczkę, podczas gdy załamana α-helisa biegnie przez środek lufy i nosi chromofor (Rysunek 1A). Autokatalityczne dojrzewanie chromoforu (Rysunek 1B) wymaga precyzyjnego umiejscowienia otaczających go łańcuchów bocznych w centralnym miejscu białka; wiele z tych łańcuchów bocznych jest wysoce konserwatywnych w innych wariantach GFP¹⁹. W większości białek fluorescencyjnych z meduz, takich jak Aequorea victoria, chromofor emitujący zieleń składa się z dwóch pierścieni aromatycznych, w tym pierścienia fenolowego Tyr66 i pięcioczłonowej heterocyklicznej struktury imidazolinonu (Figura 1B). Chromofor, odpowiednio osadzony w matrycy białkowej, odpowiada za charakterystyczną fluorescencję całego białka. Znajduje się w centrum konstrukcji, podczas gdy struktura beczki izoluje ją od medium wodnego²⁰. Wystawienie chromoforu na działanie wody spowodowałoby wygaszenie fluorescencji, tj. utratę fluorescencji²¹.

Prawidłowe zagięcie struktury przypominającej beczkę jest niezbędne do ochrony chromoforu przed wygaszaniem fluorescencji²². Pozostałości proliny (Pro) odgrywają szczególną rolę w organizacji strukturalnej GFP²³. Nie będąc w stanie utrzymać nici β, stanowią pętle łączące odpowiedzialne za utrzymanie struktury białka jako całości. Nic dziwnego, że 10-15 reszt proliny znajduje się zarówno w GFP pochodzących z Aequorea, jak i Anthoathecata; Niektóre z nich są wysoce konserwatywne w innych typach fluorescencyjnych białek β-beczkowych. Oczekuje się, że proliny będą miały decydujący wpływ na właściwości składania ze względu na ich szczególne cechy geometryczne. Na przykład w GFP pochodzących z Aequorea, z dziesięciu reszt proliny (Rysunek 2A), dziewięć tworzy trans-, a tylko jedna tworzy wiązanie cis-peptydowe (Pro89). Pro58 jest niezbędny, tzn. nie można go stosować zamiennie z pozostałymi 19 aminokwasami kanonicznymi. Pozostałość ta może być odpowiedzialna za prawidłowe pozycjonowanie reszty Trp57, która została uznana za kluczową dla dojrzewania chromoforu i ogólnego składania GFP²⁴. Fragment PVPWP z trzema resztami proliny (Pro54, Pro56, Pro58) i Trp57 jest zasadniczą częścią "dolnej powieki" w strukturze GFP z Rysunek 1A. Motyw strukturalny PVPWP znajduje się w kilku białkach, takich jak cytochromy i eukariotyczne kanały potasowe aktywowane napięciem²⁵. Substytucja proliny do alaniny w pozycjach 75 i 89 jest również szkodliwa dla ekspresji i fałdowania białek oraz znosi dojrzewanie chromoforów. Pro75 i Pro89 są częścią "górnej pokrywy" zakopującej chromofor (Rysunek 1A) i są zachowane w 11-niciowych β-beczkowych białkach fluorescencyjnych²³. Te dwie "pokrywki" utrzymują chromofor z dala od wodnego rozpuszczalnika, nawet jeśli stabilna struktura trzeciorzędowa została częściowo złamana²⁶. Taka specyficzna architektura molekularna chroni fluorofor przed kolizyjnym (dynamicznym) wygaszaniem fluorescencji, np. przez wodę, tlen lub inne dyfuzyjne ligandy.

Aby przeprowadzić inżynierię molekularną struktury GFP, należy wprowadzić podstawienia aminokwasów w podstawowej strukturze białka. Na GFP przeprowadzono liczne mutacje, które zapewniły wariantom podwyższoną stabilność, szybkie i niezawodne fałdowanie oraz zmienne właściwości fluorescencji¹⁷. Niemniej jednak w większości przypadków mutacja reszt proliny jest uważana za ryzykowne podejście ze względu na fakt, że żaden z pozostałych 19 kanonicznych aminokwasów nie jest w stanie prawidłowo przywrócić profilu konformacyjnego reszty proliny²⁷. W związku z tym opracowano alternatywne podejście, w którym reszty proliny są zastępowane innymi strukturami opartymi na prolinie, nazwanymi analogami proliny²⁸. Ze względu na swoją unikalną cykliczną strukturę chemiczną, prolina wykazuje dwie charakterystyczne przemiany konformacyjne (Rysunek 1C): 1) marszczenie się pierścienia proline, szybki proces pociągający za sobą organizację kręgosłupa, który wpływa przede wszystkim na kąt skrętu φ, oraz 2) izomeryzację wiązania peptydowego cis/trans, powolny proces wpływający na fałdowanie kręgosłupa pod kątem skrętu ω. Ze względu na swój powolny charakter, to ostatnie przejście jest powszechnie odpowiedzialne za etapy ograniczające szybkość w procesie fałdowania całego białka. Wykazano wcześniej, że izomeryzacja wiązania peptydowego cis / trans wokół niektórych reszt proliny charakteryzuje się powolnymi etapami fałdowania wariantów GFP. Na przykład, tworzenie wiązania cis-peptydowego w Pro89 charakteryzuje się powolnym krokiem w procesie składania, ponieważ opiera się na przejściu wiązania z trans do cis²⁹. Szybsze ponowne fałdowanie można osiągnąć po zastąpieniu Pro89 pętlą peptydową all-trans, tj. poprzez zniesienie zdarzenia izomeryzacji cis-to-trans<sup class="xref">30. Oprócz izomeryzacji cis/trans, przejścia fałdowania mogą również generować głębokie zmiany w fałdowaniu białek ze względu na organizację szkieletu i upakowanie we wnętrzu białka^27,31.

Modyfikacje chemiczne powodują zmianę wewnętrznych przemian konformacyjnych reszt proliny, wpływając tym samym na zdolność białka do fałdowania. Niektóre analogi proliny są szczególnie atrakcyjnymi kandydatami do substytucji proliny w białkach, ponieważ umożliwiają manipulację i badanie właściwości fałdowania. Na przykład (4R)-fluoroprolina (R-Flp), (4S)-fluoroprolina (S-Flp), 4,4-difluoroprolina (Dfp) i 3,4-dehydroprolina (Dhp) to cztery analogi (Rysunek 1D), które różnią się minimalnie od proliny zarówno pod względem objętości cząsteczkowej, jak i polarności³². W tym samym czasie każdy analog wykazuje wyraźne marszczenie pierścienia: S-Flp stabilizuje marszczenie C^4-endo, R-Flp stabilizuje marszczenie C 4-exo, Dfp nie wykazuje widocznej preferencji marszczenia, podczas gdy Dhp znosi marszczenie (Rysunek 1D)³³. Stosując te analogi w strukturze białka, można manipulować przejściem konformacyjnym reszt proliny, a tym samym wpływać na właściwości powstałych wariantów GFP.

W tej pracy postanowiliśmy włączyć wyznaczony zestaw analogów proliny (Rysunek 1D) do struktury wariantów GFP za pomocą metody selektywnego włączania ciśnienia (SPI, Rysunek 3)³⁴. Zastąpienie reszt aminokwasowych ich najbliższymi analogami izostrukturalnymi jest koncepcją biotechnologiczną stosowaną w projektowaniu białek^35,36. Tak więc wpływ analogów proliny w białku modelowym ilustruje ich potencjał do wykorzystania jako narzędzia w inżynierii białek³⁷. Produkcję białek zawierających pożądane analogi prowadzono w zmodyfikowanych szczepach E. coli, które nie są w stanie wytwarzać proliny (auksotrofia proliny). W ten sposób mogą zostać zmuszeni do zaakceptowania wymiany substratów w procesie biosyntezy białek³⁸. Ta globalna substytucja proliny jest możliwa dzięki naturalnej elastyczności substratów endogennych syntetaz aminoacylo-tRNA³⁹, kluczowych enzymów katalizujących estryfikację tRNA odpowiednimi aminokwasami⁴⁰. Ogólnie rzecz biorąc, jak opisano w Rysunek 3, wzrost komórek odbywa się w określonym podłożu, aż do osiągnięcia środkowej fazy wzrostu logarytmicznego. W kolejnym kroku aminokwas, który ma zostać zastąpiony, jest wewnątrzkomórkowo wytracany z systemu ekspresji podczas fermentacji, a następnie wymieniany przez pożądany analog lub ncAA. Ekspresja białka docelowego jest następnie indukowana w celu włączenia aminokwasów niekanonicznych specyficznych dla reszt. Substytucja pokrewnego aminokwasu jego analogiem zachodzi w sposób obejmujący cały proteom. Chociaż ten efekt uboczny może mieć negatywny wpływ na wzrost szczepu gospodarza, jakość produkcji białka docelowego w większości nie jest zagrożona, ponieważ w ekspresji rekombinowanej zasoby komórkowe są głównie kierowane do produkcji białka docelowego^41,42. Dlatego ściśle regulowany, indukowalny system ekspresji i silne promotory są kluczowe dla wysokiej efektywności inkorporacji⁴³. Nasze podejście opiera się na wielokrotnym wprowadzaniu ncAA specyficznych dla reszt w odpowiedzi na kodony zmysłowe (reprzydział kodonów zmysłowych), przy czym w obrębie genu docelowego liczbą pozycji do insercji analogu Pro można manipulować za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce⁴⁴. Podobne podejście zostało zastosowane w naszym poprzednim raporcie na temat otrzymywania rekombinowanych peptydów o właściwościach przeciwdrobnoustrojowych⁴⁵. W niniejszej pracy zastosowaliśmy metodę SPI, która pozwala na zastąpienie wszystkich reszt proliny przez pokrewne analogi, w celu wytworzenia białek, od których oczekuje się, że będą miały odrębne właściwości fizykochemiczne, nieobecne w białkach syntetyzowanych z kanonicznym repertuarem aminokwasów. Charakteryzując profil fałdowania i fluorescencji otrzymanych wariantów, staramy się pokazać efekty podstawień atomowych w wariantach GFP.

1. Wprowadzenie plazmidów ekspresyjnych do kompetentnych proauksotroficznych komórek E. coli

1. Wymieszać 1 ng każdego plazmidu próbki, pQE-80L H 6-EGFP, pQE-80L H_6-NowGFP i pQE-80L H_{6-KillerOrange}, z 50 μl chemicznie kompetentnych lub elektrokompetentnych komórek proauksotroficznego szczepu pochodzącego z E. coli K12 JM83 (Addgene #50348 lub ATCC #35607) w celu transformacji metodą szoku cieplnego lub elektroporacji zgodnie z dostępnymi protokołami^{46, 47}.
   UWAGA: Wektor ekspresyjny pQE-80L EGFP-H₆ koduje odpowiednio C-końcowe 6xHis-tagowane ulepszone białko zielonej fluorescencji (EGFP), wektory ekspresyjne pQE-80L H 6-NowGFP i pQE-80L H_{6-KillerOrange} kodują N-końcowy 6xHis-tagowany NowGFP⁴⁸ lub N-terminalnie 6xHis-tagged KillerOrange⁴⁹, każdy w szkielecie plazmidowym pQE-80L. Wszystkie geny docelowe są pod kontrolą bakteryjnego promotora T5 regulowanego przez operatora lac. Oporność na ampicylinę wykorzystano jako marker selekcyjny, a colE1 jako początek replikacji. Więcej informacji na temat plazmidu pQE-80L można znaleźć w Tabeli Materiałów. Alternatywne proauksotroficzne E. coli pochodzące ze szczepów K-12 i B mogą być również stosowane do ekspresji i powinny przynieść podobne wyniki. Obliczona masa cząsteczkowa pojedynczo protonowanych ([M+H]⁺) białek typu dzikiego znakowanych_{H 6} (po dojrzewaniu chromoforu) wynosi 27 745,33 Da (EGFP-H₆), 27 931,50 Da (H 6-NowGFP) i 27 606,09 Da (H_{6-KillerOrange}). Pierwszorzędowe struktury docelowych białek podano w tabeli 1 (podkreślenie His-tag). Glutamina (Q) w sekwencji znacznika Hisa NowGFP została zidentyfikowana przez sekwencjonowanie DNA po subklonowaniu cDNA NowGFP otrzymanego od Pletneva i wsp.⁵¹ do plazmidu pQE-80L. Nie utrudnia oczyszczania białek ani właściwości białka fluorescencyjnego.
2. Odzyskać komórki w 950 μl pożywki SOC w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
3. Rozprowadzić 50 μl odzyskanych komórek na płytkach z agarem Luria (LA) (patrz materiał dodatkowy) zawierających glukozę (10 g/l) i ampicylinę (100 μg/ml).
4. Inkubować płytki pożywki LA w temperaturze 37 °C przez noc lub w temperaturze 30 °C przez 24 godziny.

2. Produkcja rekombinowanych białek fluorescencyjnych typu dzikiego (zawierających kanoniczną prolinę) i procedura selektywnego włączania ciśnienia (SPI) do produkcji białek fluorescencyjnych z analogami proliny (S-Flp, R-Flp, Dfp, Dhp)

1. Nocna hodowla pro-auksotroficznego szczepu E. coli pochodzącego z K12 JM83 zawierającego pQE-80L EGFP-H₆, pQE-80L H 6-NowGFP i pQE-80L H _{6-KillerOrange}
   1. Użyj sterylnej końcówki pipety lub pętli do zaszczepiania, aby wybrać pojedynczą kolonię z płytki z pożywką LA i ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki bulionu lizogenicznego (LB) (patrz Materiał uzupełniający; zawierający 10 g/l glukozy, 100 μg/ml ampicyliny) w sterylnej probówce do hodowli polistyrenu o pojemności 14 ml.
      UWAGA: Do inokulacji zaleca się świeżo przekształcone kolonie. Komórki na płytkach LA (z kroku 2.2) przechowywane w temperaturze 4 °C należy zużyć w ciągu kilku dni.
   2. Hodować kulturę komórkową przez noc w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 200-250 obr./min.
2. Produkcja rekombinowanych EGFP-H₆, H 6-NowGFP i H_{6-KillerOrange} z natywną proliną i odpowiednimi wariantami białka z analogami proliny
   1. Zaszczepić 200 ml świeżej pożywki NMM (7,5 mM (NH₄)₂SO₄, 50 mM K₂HPO₄ i 22 mM KH₂PO₄, 8,5 mM NaCl, 1 mM_MgSO4, 20 mM D-glukozy, 1 μg/ml FeCl₂, 1 μg/ml CaCl₂, 10 μg/ml tiaminy, 10 μg/ml biotyny, 0,01 μg/ml pierwiastki śladowe (CuSO₄, ZnCl₂, MnCl₂, (NH₄)₂MoO₄), pH ~7,2) ze wszystkimi kanonicznymi l-aminokwasami (50 mg/L); patrz materiał dodatkowy) uzupełniony 100 μg/ml ampicyliny z 2 ml nocnej hodowli w 2-litrowej kolbie Erlenmeyera.
      UWAGA: W zależności od rodzaju białka, alternatywne podłoża uprawowe, takie jak MOPS medium⁵², sole glukozowo-mineralne medium⁵³, Davis minimal medium⁵⁴, M9 minimal medium⁵⁵ lub GMML⁵⁶ mogą być testowane w celu optymalizacji wydajności białka.
   2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 220 obr./min przez ~3 h 30 min.
   3. Mierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD₆₀₀) w spektrofotometrze co 30 minut, aż do osiągnięcia wartości OD₆₀₀ ~ 0,7.
      UWAGA: Do oznaczania OD₆₀₀ w spektrofotometrze kuweta powinna mieć długość ścieżki 1 cm. Do pomiaru referencyjnego ("zero") używa się odpowiedniego podłoża uprawowego. Czas inkubacji do osiągnięcia wartości OD₆₀₀ wynoszącej ~ 0,7 może zależeć od objętości hodowli. 3 h 30 min to wartość przybliżona. W wariancie podetapów protokołu 2.2.1-2.2.3., hodowla z podkroku 2.1.2. stosuje się do inokulacji świeżej pożywki NMMΔPro (patrz materiał uzupełniający) uzupełnionej ograniczonym stężeniem proliny (np. 5 mg/L zamiast 50 mg/l), a komórki hoduje się przez noc w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 220 obr./min. Następnego dnia oznaczenie OD₆₀₀ wykonuje się co 30 minut, aż różnice między pomiarami będą mniejsze niż 0,05. Maksymalna wartość OD₆₀₀ powinna wynosić około 1 (± 0,3). Początkowe, ograniczone stężenie proliny można dostosować w zależności od odmiany ekspresji i podłoża uprawowego (patrz Dyskusja).
   4. Wirować zawiesinę komórek przez 10 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C.
   5. Delikatnie zdekantować supernatant do odpadów.
   6. Etap mycia: Zawiesić komórki w 50 ml lodowatego podłoża NMMΔAA (bez aminokwasów, patrz materiał uzupełniający) lub NMMΔPro (bez proliny, patrz materiał uzupełniający), ostrożnie pipetując.
      UWAGA: Na tym etapie płukania można użyć jednego z dwóch podanych, ponieważ ważne jest tylko pozbycie się resztki proliny z pożywki inkubacyjnej.
   7. Oddzielić komórki od pożywki przez sedymentację w temperaturze 4 °C w wirówce o sile 3 000 x g przez 10 minut.
   8. Delikatnie zdekantować supernatant do odpadów.
   9. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić osad komórek w 200 ml pożywki NMMΔPro uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny do 2-litrowej kolby Erlenmeyera.
      UWAGA: Otrzymaną zawiesinę komórkową można rozdzielić na kilka próbek o równej objętości w celu uzyskania identycznych kultur wyjściowych do porównania ekspresji białek w obecności analogów Pro lub proliny (np. rozdzielenie na 4 x 50 ml w 100 ml kolbach Erlenmeyera).
   10. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 220 obr./min w celu całkowitego wyczerpania Pro.
       UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla całkowitego wyczerpania Pro z komórek.
   11. Dodać odpowiednią objętość L-proliny lub R-Flp, S-Flp, Dfp i Dhp z 50 mM roztworu podstawowego, aby dostosować 1 mM końcowe stężenie w zawiesinie komórki.
       UWAGA: Zgodnie z ogólną zasadą, przed użyciem należy zawsze przygotować świeże 50 mM roztwory podstawowe pochodnych Pro lub proliny. Tylko wtedy, gdy hydroliza określonego kanonicznego lub niekanonicznego aminokwasu w roztworze wodnym nie stanowi problemu, można również użyć zamrożonych wywarów.
   12. Dodać 0,5 mM IPTG z 1 M roztworu podstawowego, aby indukować ekspresję białka docelowego.
   13. Przeprowadzić ekspresję białka docelowego przez noc (12 godzin) w temperaturze 37 °C w wytrząsarce orbitalnej przy 220 obr./min.
   14. Zmierz OD₆₀₀ następnego dnia.
       UWAGA: Oznaczanie OD₆₀₀ wykonuje się w celu ilościowego określenia ilości komórek po ekspresji białka. Niższa wartość OD₆₀₀ w porównaniu z wartością zmierzoną przed etapem płukania 2.2.3 wskazuje na cytotoksyczność dostarczonego aminokwasu. W takim przypadku zabieg należy powtórzyć przy zminimalizowanym stężeniu podawanego aminokwasu (do 0,1 mM).
   15. Odwirować i zebrać komórki bakteryjne w temperaturze 5 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut, a następnie zdekantować supernatant do odpadów.
   16. Etap mycia: Zawiesić komórki przez ostrożne pipetowanie w 50 ml buforu wiążącego (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM DTT) zawierającego 10% glicerolu i przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki polistyrenowej o pojemności 50 ml.
   17. Odwirować i zebrać komórki bakteryjne w temperaturze 5 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut, a następnie zdekantować supernatant do odpadów.
   18. Przechowywać granulki komórkowe w stożkowej probówce polistyrenowej o pojemności 50 ml w temperaturze -20 °C lub -80 °C do czasu dalszego użycia (oczyszczanie białka, patrz poniżej).

3. Procedura oczyszczania próbek białek metodą chromatografii powinowactwa jonów metali (IMAC)

1. Liza komórek bakteryjnych
   UWAGA: Wykonaj wszystkie etapy lizy komórek na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aby zapobiec degradacji białka docelowego.
   1. Rozmrażać osad komórek bakteryjnych na lodzie lub w temperaturze 4 °C w stożkowej probówce z polistyrenu o pojemności 50 ml przez 10-20 minut.
   2. Dodać 10 ml lodowatego buforu wiążącego (patrz materiał dodatkowy) i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić osad komórkowy.
   3. Dodać 100 μl lizozymu 50 mg/mL, 100 μL 1 mg/ml DNazy I, 100 μl 1 mg/ml RNazy A, 30 μl 1 M MgCl₂. Ostrożnie odwrócić zawiesinę komórek pięć razy i trzymać zamkniętą probówkę na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez 60 min.
      UWAGA: Lizozym indukuje chemiczną lizę komórek poprzez zakłócenie ściany komórkowej bakterii.
   4. Sonifikować próbkę w celu rozerwania komórek za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego (np. 3 razy przez 3 minuty w probówce polistyrenowej o pojemności 50 ml na mieszaninie lodu i wody, impuls 2 s/przerwa 4 s, amplituda 45%).
      UWAGA: Alternatywnie można zastosować inne metody rozbijania komórek, np. homogenizację wysokociśnieniową w 20 cyklach przy 14 000 psi. W razie potrzeby rozcieńczyć za pomocą buforu wiążącego (patrz Materiał uzupełniający), aby osiągnąć minimalną objętość instrumentu. Co więcej, odczynniki do ekstrakcji białek mogą być stosowane do rozbijania komórek. Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z przykładami.
   5. Wirować przez 60 minut w temperaturze 18 000 x g, 4 °C.
   6. Zanotować objętość cieczy dla podetapu 3.1.9 i wlać supernatant do świeżej probówki z polistyrenu o pojemności 50 ml.
   7. Usunąć supernatant za pomocą filtra membranowego o średnicy porów 0,45 μm.
   8. Pobrać próbkę "lizatu" dla SDS-PAGE (patrz sekcja 4 poniżej); odpowiada to "rozpuszczalnej frakcji białkowej", supernatantowi z podkroku 3.1.6.
   9. Dodać równą objętość_ddH2O, jak określono w podkroku 3.1.6, w celu ponownego zawieszenia resztek komórek w celu utrzymania tego samego rozcieńczenia próbek do późniejszej analizy SDS-PAGE.
   10. Pobrać próbkę "osadu" do SDS-PAGE (patrz sekcja 4 poniżej); odpowiada to "nierozpuszczalnej frakcji białkowej", zawiesinie szczątków komórek z podkroku 3.1.9.
2. Oczyszczanie metodą immobilizowanej chromatografii powinowactwa do metali (IMAC)
   UWAGA: Oczyszczanie docelowego białka fluorescencyjnego można przeprowadzić w temperaturze 4 °C lub w temperaturze pokojowej (RT). W przypadku tej drugiej opcji poczekaj, aż lizat, kolumna i wszystkie zrównoważą się w temperaturze pokojowej, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza w wyniku parowania powietrza uwięzionego w zimnym roztworze po umieszczeniu w ciepłej kolumnie.
   1. Oczyścić próbkę za pomocą 1 ml kolumny IMAC FPLC (szybkiej chromatografii cieczowej białek [lub wydajności]) o pojemności 1 ml zgodnie z instrukcjami producenta; ustawić maksymalne ciśnienie w kolumnie na 0,3 MPa, a natężenie przepływu na 1 ml/min; użyć buforu wiążącego (patrz Materiał dodatkowy) do równoważenia kolumny, bufor do przemywania (patrz Materiał uzupełniający) dla etapu mycia, i bufor elucyjny (patrz materiał dodatkowy) do elucji białka docelowego.
      UWAGA: Alternatywnie można zastosować zautomatyzowany system FPLC do elucji białka docelowego za pomocą buforu elucyjnego działającego w liniowym gradinie stężenia imidazolu (20-200 mM).
   2. Zbierz i połącz frakcje eluacyjne z białkami fluorescencyjnymi (wybierz widoczny kolor zielony lub pomarańczowy).
   3. Przenieść zebrane frakcje do membrany dializacyjnej (odcięcie masy cząsteczkowej (MWCO) 5 000-10 000) zgodnie z instrukcjami producenta i dializować co najmniej trzy razy z buforem dializacyjnym lub buforem MS (patrz Materiał uzupełniający). Na przykład należy przeprowadzić dializę próbki o pojemności 1 ml trzy razy w stosunku do 100 ml buforu przez co najmniej 2 godziny w każdej rundzie. Szczegółowy protokół można znaleźć w Budisa et al.³⁴.
   4. Przygotować 1:100-krotne rozcieńczenie dializowanej frakcji elucyjnej w buforze PBS (patrz materiał uzupełniający).
   5. Zapisać widmo absorbancji rozcieńczonych próbek w spektrofotometrze UV-Vis.
   6. Obliczyć stężenie białka w oparciu o prawo Lamberta-Beera w następujący sposób, używając wartości literaturowych współczynników ekstynkcji molowej ε przy określonej długości fali (dla EGFP przy 488 nm_{ε 488} = 55 000 ^cm-1·^M-1, NowGFP przy 493 nm ε₄₉₃ = 53 600 ^cm-1·^M-1, KillerOrange przy 514 nm ε₅₁₄ = 22 600 ^cm-1·^M-1):
      (prawo Lamberta-Beera)
      c_białko = stężenie białka [mg/ml]
      A = absorbancja przy określonej długości fali
      ε = molowy współczynnik ekstynkcji przy określonej długości fali [^M-1·^cm-1]
      d = długość ścieżki kuwety, tutaj 1 cm
      MW = masa cząsteczkowa białka [g/mol]
      Użyć buforu do dializy (patrz materiał dodatkowy) do pomiaru referencyjnego ("zerowego").
   7. Pobrać próbkę "eluatu" dla SDS-PAGE (patrz sekcja 4 poniżej), załadować 1-10 μg białka (obliczone zgodnie z poprzednim krokiem) na próbkę dołka dla żeli barwionych na niebiesko Coomassie Brilliant.
      UWAGA: Dostosuj ilości próbki SDS w zależności od zastosowanej metody barwienia i wrażliwości barwnika, jeśli do barwienia pasm białkowych stosuje się związki inne niż Coomassie Brilliant Blue.
   8. Zawiesić i przechowywać próbkę białka w buforze do dializy (patrz materiał dodatkowy) w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: W tych warunkach przechowywania próbki białka powinny być stabilne przez co najmniej 6 miesięcy. Alternatywne laboratoryjne spektrofotometry UV-Vis i fluorescencyjne mogą być wykorzystywane do rejestrowania widm absorpcyjnych i emisji fluorescencji docelowych białek. Do pomiarów emisji fluorescencji można zastosować następujące długości fal wzbudzenia: 488 nm (EGFP), 493 nm (NowGFP) i 510 nm (KillerOrange).

4. Przygotowanie próbki SDS-PAGE

1. Oznaczyć absorbancję A przy 280 nm (A_{280 nm}) dla próbek "eluat", "lizat" i "osad" z sekcji 3. Dostosuj objętość sondy, aby osiągnąć A_280nm = 2, dodając odpowiednią ilość buforu elucyjnego (końcowa objętość sondy powinna wynosić co najmniej 80 μL).
2. Wymieszać próbkę w stosunku 4:1 (v/v) z 5-krotnym buforem barwnikowym SDS (patrz Materiał uzupełniający) przez pipetowanie, np. 80 μl próbki z 20 μl buforu ładującego 5x SDS.
3. Gotować próbki SDS w temperaturze 95 °C przez 5 minut w łaźni wodnej lub bloku grzewczym w celu denaturacji białek.
4. Pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej i odwirowywać sondy przy 13 000 x g przez 1 minutę w mikrowirówce przed załadowaniem do żelu.
5. Użyj 5-10 μl dla Coomassie Brilliant Blue-stained SDS-PAGE. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat procedury SDS-PAGE, skonsult⁵⁷.
   UWAGA: Dostosuj ilości próbki SDS w zależności od zastosowanej metody barwienia i wrażliwości barwnika. Wynik SDS-PAGE powinien być dokładnie sprawdzony, aby upewnić się, że próbki zawierają więcej niż 95% całkowitego białka w paśmie odpowiadającym oczekiwanej masie cząsteczkowej pożądanego białka. W tym celu należy wykonać zdjęcie żelu barwionego metodą Coomassie i porównać intensywność pasma białka o pożądanej masie cząsteczkowej z intensywnością wszystkich innych prążków na pasie (jeśli występują) za pomocą densytometrii. Do densytometrycznej oceny natężeń pasma można użyć oprogramowania ImageJ⁵⁸. Aby eksperymentalnie udowodnić włączenie pożądanych ncAA do białka będącego przedmiotem zainteresowania, należy przeprowadzić analizę masy nienaruszonych białek za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) sprzężonej ze spektrometrią mas czasu przelotu z jonizacją elektrorozpylania (LC-ESI-TOF-MS) zgodnie z opisem⁵⁹ (patrz sekcja 5 protokołu i tabela materiałów w nim dla przykładowego sprzętu).

5. Emisja fluorescencji wariantów białek

1. Przed zabiegiem sprawdź wynik eksperymentu SDS-PAGE, aby upewnić się, że czystość próbki wynosi >95% (patrz UWAGA po kroku 4.5).
2. Dostosować próbki każdego oczyszczonego wariantu białka do stężenia 0,3 μM, przyjmując obliczoną wartość absorbancji przy odpowiedniej długości fali jako odniesienie (podetap 3.2.5). Upewnij się, że przybliżona końcowa objętość próbki wynosi 200 μl.
3. Pozostawić rozcieńczone próbki do równowagi przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
4. Przenieść próbki do 1-centymetrowej kuwety kwarcowej i zmierzyć widmo emisji fluorescencji próbek za pomocą spektrometru fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów), stosując następujące długości fal wzbudzenia: 488 nm (dla EGFP), 493 nm (dla NowGFP), 510 nm (dla KillerOrange).

6. Denaturacja i ponowne składanie wariantów EGFP

1. Przed zabiegiem sprawdź wynik eksperymentu SDS-PAGE, aby upewnić się, że czystość próbki wynosi >95% (patrz UWAGA po kroku 4.5).
2. Przygotować dla każdego oczyszczonego wariantu białka dwie próbki o końcowej objętości 2 μl o stężeniu 300 μM (patrz oznaczanie stężenia białka w podkrokach 3.2.4-3.2.6).
3. Dodać 18 μl buforu 1,11x PBS (patrz materiał uzupełniający) zawierającego 8,89 M mocznika i 5,56 mM DTT do 2 μl każdego oczyszczonego wariantu białka (aby uzyskać 1x PBS zawierający 8 M mocznika i 5 mM DTT) w celu wywołania denaturacji.
   UWAGA: W przypadku kroków 6.4-6.6 należy przetwarzać każdą próbkę osobno.
4. Inkubować próbki przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
5. Rozcieńczyć 20 μl próbek 100-krotnie, dodając 1980 μl 1x PBS (patrz materiał uzupełniający) zawierający 5 mM DTT w celu wywołania renaturacji, uzyskując końcowe stężenie białka 0,3 μM i natychmiast przenieść 200 μl próbek do 1-centymetrowej kuwety kwarcowej.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby pracować szybko, ponieważ renaturyzacja rozpoczyna się natychmiast.
6. Włożyć kuwetę kwarcową do odpowiedniego spektrometru fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów) i monitorować ponowne fałdowanie białek w próbkach, uzyskując widmo fluorescencji co 3 s przez 30 minut. Dla każdego wariantu białka należy zastosować wzbudzenie fluorescencyjne 295 nm dla pierwszej próbki i wzbudzenie fluorescencji 488 nm dla drugiej.
7. Ponownie złożone próbki przenieść do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, zamknąć pokrywę i przechowywać próbki w temperaturze pokojowej w ciemności przez 24 godziny, aby umożliwić całkowite ponowne złożenie wariantów EGFP.
8. Zmierzyć emisję fluorescencji ponownie sfałdowanych próbek białek zgodnie z krokiem 6.6 przy użyciu tej samej długości fali wzbudzenia, co poprzednio, aby uchwycić czasowy punkt końcowy odzyskiwania fluorescencji.

Na początku badania wybraliśmy trzy różne warianty białek fluorescencyjnych, które mają wspólną architekturę macierzystego GFP. Pierwszym wybranym białkiem był EGFP, który jest zmodyfikowanym wariantem pochodzącym z oryginalnego GFP meduzy Aequorea victoria zawierającego mutacje Phe64Leu/Ser65Thr. Drugim wybranym białkiem był NowGFP51,60. Jest to również wariant A. victoria GFP uzyskany w drodze mutagenezy w kilku etapach za pośrednictwem poprzedzających białek fluorescencyjnych. NowGFP zawiera 18 mutacji w porównaniu do swojego bezpośredniego poprzednika, białka fluorescencyjnego "Cerulean"61. Z kolei białko "Cerulean" jest pochodną wzmocnionego cyjanowego białka fluorescencyjnego (ECFP)62,63, białka wcześniej wyselekcjonowanego przez kierowaną ewolucję laboratoryjną i zawierającego chromofor na bazie tryptofanu. Zarówno EGFP, jak i NowGFP są szeroko stosowane w biologii komórki i badaniach biofizycznych i zawierają w swoich strukturach dziesięć konserwatywnych reszt proliny. Ponadto NowGFP ma jedenastą resztę proliny w pozycji 230, która pojawiła się z powodu obszernej historii mutacji tego wariantu białka. Trzecim wybranym białkiem było białko fluorescencyjne KillerOrange64,65. Jest pochodną chromoproteiny anm2CP z rodzaju hydrozoan Anthoathecata. Sekwencja białkowa zawiera 15 reszt proliny, a chromofor jest oparty na tryptofanie, a nie na reszcie tyrozyny. Struktury rentgenowskie o wysokiej rozdzielczości zostały zgłoszone dla wszystkich trzech wybranych białek (Rysunek 2)51,65,66.

W pierwszym kroku, analogi proliny (Rysunek 1D) zostały włączone do wszystkich pozycji proliny trzech modelowych białek (EGFP, NowGFP i KillerOrange) poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI, schemat procedury jest podany w Rysunek 3). Instrumentalnie do ekspresji białek w obecności proliny i analogów użyto prolinowo-auksotroficznego szczepu E. coli K12 JM8367 (Figura 1D), dając odpowiednio białka typu dzikiego i zmodyfikowanego. Osady z komórek wyrażających natywne białko i warianty zawierające S-Flp i Dhp miały typowy jasny kolor ze względu na nienaruszony chromofor, podczas gdy warianty zawierające R-Flp i Dfp pozostały bezbarwne, co wskazuje na nieprawidłowe fałdowanie i odkładanie się niesfałdowanego białka w ciałach inkluzyjnych (Figura 4A). Analiza SDS-PAGE ekspresji próbek potwierdziła obecność nierozpuszczalnych białek zawierających R-Flp (Rysunek 4B-D), co uniemożliwiło dalsze badania. Chociaż wykracza to poza zakres niniejszego badania, należy zauważyć, że problemy z rozpuszczalnością białek i nieprawidłowym fałdowaniem mogą być do pewnego stopnia złagodzone przez procedury ponownego fałdowania in vitro68. W przeciwieństwie do tego, białka natywne, a także warianty zawierające S-Flp i Dhp znaleziono głównie we frakcjach rozpuszczalnych (Rysunek 4B-D). Warianty typu dzikiego, a także zawierające S-Flp i Dhp, można było dalej izolować i charakteryzować w badaniach fluorescencyjnych. Rozpuszczalne białka oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa immobilizowanych jonów metali (IMAC), uzyskując 20-30 mg/l objętości kultury dla EGFP, 60-80 mg dla NowGFP i KillerOrange, których wydajność dla białek typu dzikiego i modyfikowanych była bardzo podobna. Analiza sprzężona z chromatografią cieczową i spektrometrią mas (LC-MS) potwierdziła oczekiwaną tożsamość i czystość izolatów otrzymanych w ten sposób (Rysunek 5). W widmach masowych każda zamiana proliny z S-Flp powodowała przesunięcie +18 Da na każdą resztę proliny w sekwencji, podczas gdy w przypadku zamiany proliny na Dhp przesunięcie wynosiło -2 Da na resztę.

W następnym kroku zarejestrowano widma absorpcji i emisji światła, aby przeanalizować potencjalny wpływ inkorporacji niekanonicznych analogów proliny na właściwości spektroskopowe macierzystych białek fluorescencyjnych (Rysunek 6). Widma absorpcyjne UV-Vis wykazały typowe pasmo około 280 nm charakterystyczne dla reszt aromatycznych, tyrozyny i tryptofanu, podczas gdy absorbancję chromoforu stwierdzono przy 488 nm dla EGFP i 493 nm dla NowGFP (Rysunek 6A,B). W KillerOrange obszar absorbancji chromoforu składał się z dwóch pasm (Rysunek 6C), które odpowiadają dwóm możliwym stanom konfiguracyjnym i ładunkowym chromoforu złożonego. Pasmo około 510 nm jest znane jako stan, w którym zachodzi fluorescencja z wysoką wydajnością kwantową49,65. W wariantach zastępujących prolinę zaobserwowano, co następuje: Włączenie Dhp nie zmieniło widm absorbancji EGFP i NowGFP, podczas gdy S-Flp powodowało zwiększoną absorpcję UV. To ostatnie można wytłumaczyć indukowanymi różnicami w mikrośrodowiskach reszt tryptofanu, w szczególności Trp57 umieszczonego pomiędzy trzema S-Flp w motywie PVPWP (Rysunek 6A,B)69. Bardziej trywialne wyjaśnienie wyższej absorpcji promieniowania UV może jednak wynikać ze zwiększonej frakcji nieprawidłowo pofałdowanego białka. Ponieważ stężenie białka oceniano za pomocą kwantyfikacji cech absorbancji, obecność białka z nieprawidłowo dojrzałym chromoforem może zwiększyć absorbancję, podczas gdy ta frakcja nie jest wliczana do całkowitego stężenia (Rysunek 6A,B). Wspierając tę hipotezę, zaobserwowaliśmy, że EGFP zawierający S-Flp wykazywał znacznie zmniejszony stosunek chromoforu do połączonej absorbancji tryptofanu i tyrozyny (ε(CRO)/ε(Tyr+Trp) = 0,96) w porównaniu z wyższą wartością (1,57) w białku macierzystym (Tabela 2)70. Obecność frakcji niefluorescencyjnej w EGFP zawierającym S-Flp będzie ważnym czynnikiem przyczyniającym się do dalszej analizy właściwości białka. W wariancie KillerOrange zawierającym S-Flp zaobserwowano zwiększoną absorbancję wraz z przesunięciem ku czerwieni w paśmie chromoforu. Fakt ten wskazywał, że formacja chromoforu faworyzowała konfigurację o dużej wydajności kwantowej fluorescencji (Rysunek 6C).

Następnie przeanalizowaliśmy widma fluorescencji białek zarejestrowanych podczas wzbudzenia przy odpowiednich maksymalnych długościach fal absorbancji. Uzyskane wyniki wskazują, że widma pozostały zasadniczo identyczne dla badanych wariantów białek fluorescencyjnych zawierających prolinę i zamienniki S-Flp i Dhp. Wynik ten sugeruje, że analogi w żadnym wypadku nie zmieniły środowiska chemicznego chromoforu (Rysunek 6G-I). Mimo to zaobserwowano wyraźne różnice w widmach fluorescencji KillerOrange zarejestrowanych po wzbudzeniu przy 295 nm, a więc po wzbudzeniu tryptofanu. Eksperyment ten śledzi transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) lub bezpośrednie sprzężenie ekscytoniczne, które zachodzi między łańcuchami bocznymi tryptofanu a dojrzałym chromoforem, ponieważ oba znajdują się w niewielkiej odległości nie większej niż 25 A. W przypadku wariantów EGFP i NowGFP, gdy widma emisyjne mierzono za pomocą wzbudzenia 295 nm, zaobserwowano silną emisję chromoforu wraz z prawie żadną emisją tryptofanu (Rysunek 6D,E). Jednak warianty zawierające S-Flp wykazywały nieco większą emisję specyficzną dla tryptofanu. Obserwację tę można powiązać z niezliczonym wkładem rozwiniętej apoproteiny, która zawiera tryptofany, ale nie dojrzały chromofor. Znacznie zwiększoną emisję specyficzną dla tryptofanu zaobserwowano w KillerOrange, co wskazuje na brak wygaszania fluorescencji poprzez oczekiwany mechanizm transferu energii wzbudzenia lub sprzężenia ekscytonowego. Warianty białek zawierające prolinę i S-Flp wykazywały porównywalną emisję tryptofanu wraz z preferowaną cechą fluorescencji przesuniętej ku czerwieni o wysokiej wydajności kwantowej. W przeciwieństwie do tego, wariant zawierający Dhp wykazał drastyczny spadek intensywności fluorescencji chromoforu, prawdopodobnie z powodu niewielkich efektów strukturalnych (Rysunek 6F).

Następnie porównaliśmy właściwości fałdowania białek, przeprowadzając eksperyment z rozwijaniem/renaturacją. Widma emisyjne fluorescencji rejestrowano w stanie złożonym (sekcja 5 protokołu), po denaturacji chemicznej, a następnie w procesie ponownego fałdowania monitorowane przez okres 24 godzin (sekcja 6 protokołu). Widma zarejestrowano po wzbudzeniu na obu odpowiednich długościach fal, 295 nm, oraz na maksimach widm absorbancji chromoforów, podczas gdy uzyskana fluorescencja jest przedstawiona jako znormalizowana do maksymalnej wartości dla każdego białka (Rysunek 7). Pod koniec protokołu zaobserwowaliśmy, że warianty EGFP mogą się ponownie zwinąć, podczas gdy warianty NowGFP i KillerOrange - po denaturacji - pozostały rozwinięte (dane nie pokazane). W związku z tym zdolności do ponownego fałdowania pierwotnych białek fluorescencyjnych różniły się znacznie. Warto zauważyć, że KillerOrange został opracowany jako fotosensybilizator, począwszy od wariantu chromoproteiny hydrozoan KillerRed65,71, a jego ponowne składanie zazwyczaj pozostaje w tyle pomimo solidnej konstrukcji β-lufowej. W naszych eksperymentach stwierdziliśmy, że fluorescencja chromoforu EGFP typu dzikiego odzyskała się tylko częściowo, chociaż fluorescencja specyficzna dla tryptofanu była większa po renaturacji (Figura 7A,D). Zasadniczo podobne zachowanie zaobserwowano w wariancie zawierającym Dhp (Rysunek 7C,F). W EGFP zawierającym S-Flp podobny wynik zaobserwowano, gdy wzbudzenie przeprowadzono na specyficznej dla tryptofanu długości fali 295 nm (Rysunek 7B). Uderzające jest to, że fluorescencja powróciła do znacznie większego zakresu, gdy chromofor został wzbudzony przy 488 nm (Rysunek 7E). Wydaje się, że S-Flp indukuje znacznie lepszą wydajność ponownego składania w porównaniu z pozostałymi dwoma wariantami. Jednak tego korzystnego efektu nie zaobserwowano przy użyciu wzbudzenia 295 nm z powodu nieznanych interakcji molekularnych.

Następnie, prędkość ponownego fałdowania była monitorowana poprzez rejestrację fluorescencji zarówno tryptofanu, jak i chromoforu, oddzielnie, podczas gdy punkt końcowy procesu był określany po 24 godzinach od rozpoczęcia renaturyzacji. Tylko warianty EGFP wykazywały stosunkowo szybką kinetykę ponownego fałdowania, którą można było wiarygodnie ocenić, podczas gdy żaden ze zdenaturowanych wariantów NowGFP i KillerOrange nie mógł powrócić do wartości umożliwiającej dalsze pomiary ilościowe. W EGFP odzysk emisji tryptofanu był dwa razy szybszy (zakończony w 750 s) w porównaniu z odzyskiem emisji chromoforu (zakończonym w 1500 s), co wskazuje na złożoność procesów leżących u podstaw (Rysunek 8). Przy obu długościach fal wzbudzenia szybkość ponownego fałdowania była podwyższona przez obecność S-Flp, zgodnie z danymi literaturowymi25. W tym samym czasie wariant zawierający DHP wykazywał profil ponownego składania podobny do typu dzikiego.

Rysunek 1: Rusztowanie strukturalne zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), budowa chromoforu, przejścia konformacyjne proliny i syntetyczne analogi użyte w tym badaniu. (A) Struktura GFP składa się z β-pasm tworzących prawie idealną lufę (tj. "puszkę" o wymiarach 4,2 nm x 2,4 nm), która jest zamknięta na obu końcach α-spiralnymi pokrywkami. Białko GFP o masie 27 kDa wykazuje strukturę trzeciorzędową składającą się z jedenastu nici β, dwóch krótkich α-helis i chromoforu pośrodku. Stany konformacyjne sąsiednich prolin są związane z tworzeniem chromoforów. (B) Autokatalityczne dojrzewanie (kondensacja) chromoforu zachodzi przy resztach Ser65, Tyr66 i Gly67 i przebiega w kilku etapach: Po pierwsze, korekty skrętne w szkielecie polipeptydowym w celu zbliżenia węgla karboksylowego Thr65 do azotu amidowego Gly67. Następnie tworzenie heterocyklicznego układu pierścieniowego imidazoliny-5-onu następuje po nukleofilowym ataku na ten atom węgla przez azot amidowy glicyny, a następnie odwodnieniu. Wreszcie, układ uzyskuje widoczną fluorescencję, gdy utlenianie wiązania węglowego alfa-beta tyrozyny przez tlen cząsteczkowy prowadzi do rozszerzenia sprzężonego układu pierścieniowego imidazoliny, na końcu obejmującego pierścień fenylowy tyrozyny i jego podstawnik paratlenowy. Powstały chromofor para-hydroksybenzylidenimidazolinonu w środku β-cylindra jest całkowicie oddzielony od rozpuszczalnika luzem. (C) Wzory i geometrie struktury szkieletu 1) pierścienia prolinowego (fałdowania) i 2) poprzedzającego wiązania amidowego reprezentują główne przejścia konformacyjne reszty proliny. (D) Analogi proliny użyte w tej pracy z wyznaczonymi fałdami pierścienia proliny. Figura została wygenerowana przy użyciu ChemDraw i Discovery Studio Visualizer. Struktura GFP pochodzi z wpisu struktury PDB 2Q6P. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Białka fluorescencyjne użyte w tym badaniu. Panele pokazują wstęgową reprezentację typowych β-beczkowych struktur trzech różnych wariantów białek fluorescencyjnych: EGFP, NowGFP i KillerOrange, przy czym kolor wstęgi reprezentuje kolor emisji fluorescencji każdego wariantu. Pozostałości proliny (jednoliterowy kod) są wyróżnione jako patyczki, a odpowiednie pozycje są oznaczone. Chromofory są pokazane z początkowym składem aminokwasowym pogrubioną czcionką. Wszystkie reprezentacje struktury zostały utworzone za pomocą PyMol w oparciu o następujące wpisy struktury PDB: 2Q6P dla EGFP, 4RYS dla NowGFP, 4ZFS dla KillerOrange. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schemat blokowy przedstawiający metodę SPI do specyficznego dla pozostałości włączania niekanonicznych analogów proliny. Prolinowo-auksotroficzny szczep gospodarza Escherichia coli (E. coli) przenoszący gen zainteresowania na plazmidzie ekspresyjnym jest hodowany w określonym minimalnym pożywce ze wszystkimi 20 kanonicznymi aminokwasami, aż do osiągnięcia OD600 ~ 0,7, przy którym hodowla komórkowa znajduje się w środkowej logarytmicznej fazie wzrostu. Komórki są zbierane i przenoszone na świeżą minimalną pożywkę zawierającą 19 kanonicznych aminokwasów i analog proliny. Po dodaniu induktora ekspresja białka odbywa się przez noc. Na koniec białko docelowe jest izolowane przez lizę komórek i oczyszczane przed dalszą analizą. W odmianie protokołu komórki są hodowane w określonym minimalnym pożywce z 19 kanonicznymi aminokwasami, a prolina jest dodawana w ograniczonej ilości (np. Jedna piąta stężenia innych aminokwasów). W ten sposób komórki wydmuchują prolinę w pożywce, zanim będą mogły wyjść z logarytmicznej fazy wzrostu, a następnie dodaje się analog i indukuje się produkcję białka będącego przedmiotem zainteresowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Analiza wyrażeń wariantów EGFP, NowGFP i KillerOrange. (A) Osady komórkowe z 1 ml kultury ekspresyjnej, znormalizowane do OD600 = 2. ANALIZA STRON SDS WARIANTÓW (B) EGFP, (C) NowGFP i (D) KillerOrange. Rozpuszczalne (S) i nierozpuszczalne frakcje (I) każdego fluorescencyjnego pochodnego białka załadowano 15% żelem akrylamidowym, a także eluowane frakcje (E) z IMAC białek rozpuszczalnych. PageRuler Unstained Protein Ladder został użyty jako znacznik (M) na pasach oznaczonych przez (M). Oczekiwane regiony danego białka są ujęte w ramy. Aminokwasy włączone w pozycjach proliny to Pro, R-Flp, S-Flp i Dhp (w (A) pokazano granulki komórkowe z fluorescencyjnych wariantów białek zawierających Dfp zamiast Dfp). Żele były barwione 1% (w/v) Coomassie Brillant Blue. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Analiza spektrometryczna wariantów białek fluorescencyjnych. (A) Reprezentatywne, zdekonwolucyjne widma ESI-MS EGFP oznaczone H6 (), S-Flp-EGFP (pomarańczowy) i Dhp-EGFP (cyjan) z lokalizacją głównych pików masy podanymi jako liczby (w Da). Obliczone masy cząsteczkowe [M+H]+ białek znakowanych H6 to: Dla EGFP 27 745,33 Da (obserwowane 27 746,15 Da); dla S-Flp-EGFP 27 925,33 Da (obserwowane 27 925,73 Da); dla Dhp-EGFP 27 725,33 Da (obserwowane 27 726,01 Da). (B) Reprezentatywne, zdekonwolucyjne widma ESI-MS dlaH-6-znakowanych NowGFP (), S-Flp-NowGFP (pomarańczowy) i Dhp-NowGFP (cyjan) z lokalizacją głównych pików masy podanymi jako liczby (w Da). Obliczone masy białek znakowanych H6 to: Na razie GFP 27 931,50 Da (obserwowane 27 946,46 Da; różnica ~16 Da jest prawdopodobnie spowodowana utlenianiem metioniny w białku); dla S-Flp-NowGFP 28 129,50 Da (obserwowane 28 130,08 Da); dla Dhp-NowGFP 27 909,50 Da (obserwowane 27 910,22 Da). (C) Reprezentatywne, zdekonwolucyjne widma ESI-MS KillerOrange znakowaneH 6 (), S-Flp-KillerOrange (pomarańczowy) i Dhp-KillerOrange (cyjan) z lokalizacją głównych pików masy podanymi jako liczby (w Da). Obliczone masy białek znakowanych H6 to: Dla KillerOrange 27 606,09 Da (obserwowane 27 605,91 Da); dla S-Flp-KillerOrange 27 876,09 Da (obserwowane 27 876,08 Da); dla Dhp-KillerOrange 27 576,09 Da (obserwowane 27 575,93 Da). Odchylenia między obserwowanymi a obliczonymi masami cząsteczkowymi wynoszące około 1 Da mieszczą się w zakresie błędu urządzenia ESI-MS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Absorpcja światła i widma emisji fluorescencji wariantów białek fluorescencyjnych. Znormalizowane widma absorpcyjne UV-VIS przedstawiono dla wariantów (A) EGFP, (B) NowGFP i (C) KillerOrange. Widma znormalizowano do maksimum absorbancji chromoforu (około 500 nm). Pokazano znormalizowane widma emisji fluorescencji wariantów (D,G) EGFP, (E,H) NowGFP i (F,I) KillerOrange. Widma w (D,E,F) mierzono po wzbudzeniu światłem ultrafioletowym (295 nm), dla widm w (G,H,I) do wzbudzenia wykorzystano odpowiednio 488 nm, 493 nm i 510 nm, a widma znormalizowano do odpowiednich maksimów emisji chromoforów (około 500 nm). W każdym panelu czarne krzywe odpowiadają widmom wariantu białka fluorescencyjnego z natywną proliną, pomarańczowe krzywe wskazują widma białek podstawionych S-Flp, a niebieskie krzywe odpowiadają białkom podstawionym Dhp. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Widma emisji fluorescencji wariantów EGFP w eksperymentach z ponownym składaniem. Znormalizowane widma emisji fluorescencji 0,3 μM roztworów wariantów białek fluorescencyjnych w stanie natywnym oraz po denaturacji i ponownym fałdowaniu: Widma w (A,B,C) mierzono po wzbudzeniu światłem ultrafioletowym (295 nm) (A) dla EGFP, (B) dla S-Flp-EGFP i (C) dla Dhp-EGFP. Widma w (D,E,F) mierzono po wzbudzeniu zielonym światłem (488 nm) (D) dla EFGP, (E) dla S-Flp-EGFP i (F) dla Dhp-EGFP. Widma emisyjne próbek natywnych (czarne krzywe) i ponownie zagiętych (kolor zielony odpowiada odpowiednio EGFP, pomarańczowy S-Flp-EGFP i niebieski Dhp-EGFP) każdego wariantu białka są normalizowane do maksymalnej fluorescencji odpowiedniego stanu natywnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Monitorowanie fałdowania białek i dojrzewania chromoforów wariantów EGFP za pomocą fluorescencji. (A) Emisja fluorescencji w obszarze fluorescencji Trp (emisja została ustawiona na 330 nm) zarejestrowana po wzbudzeniu światłem ultrafioletowym (295 nm). (B) Rozwój amplitudy fluorescencji w obszarze emisji chromoforu po wzbudzeniu światłem zielonym (488 nm). Zależne od czasu ślady fluorescencji znormalizowano do jedności (100%) zgodnie z amplitudą fluorescencji osiągniętą na koniec interwału monitorowania. W każdym panelu czarne krzywe odpowiadają widmom fluorescencyjnego wariantu białka z natywną proliną, pomarańczowe krzywe wskazują widma białek podstawionych S-Flp, a niebieskie krzywe odpowiadają białkom podstawionym Dhp. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Podstawowe struktury docelowych białek. Jego-tagi są podkreślone w każdej sekwencji.

Tabela 2: Współczynniki ekstynkcji (ε) wariantów EGFP na wybranych długościach fal. Wartości współczynnika ekstynkcji ε (w M-1·cm-1) oblicza się na podstawie zarejestrowanych widm absorpcyjnych UV-Vis odpowiednich wariantów EGFP przy użyciu znanych stężeń białek. Wybrana długość fali 280 nm odpowiada maksymalnej absorbancji reszt aromatycznych, tyrozyny i tryptofanu, podczas gdy 488 nm odpowiada maksymalnej długości fali absorbancji chromoforu.

Materiał uzupełniający: Przygotowanie roztworów podstawowych i Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy ujawniają wszelkie konflikty interesów.