Myszoskoczki mongolskie jako zwierzęcy model gojenia się ran

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje nowy model zwierzęcy opracowany do badania anatomii i histologii rogówki oraz procesów jej gojenia. Ten nowy model zwierzęcy wykorzystuje myszoskoczka mongolskiego, który ma rogówkę z wieloma podobieństwami do rogówki ludzkiej.

Streszczenie

Badania nad gojeniem się ran rogówki są prowadzone od dłuższego czasu i pomogły zmniejszyć cierpienie oraz opracować metody leczenia, które przyczyniają się do poprawy zdrowia oczu pacjentów. Historycznie rzecz biorąc, gojenie rogówki było badane u gryzoni, takich jak myszy i szczury, ale modele te mogą nie naśladować całkowicie ludzkich zaburzeń. Jednak informacje na temat innych gryzoni, takich jak myszoskoczki mongolskie (Meriones unguiculatus), są skąpe w badaniach rogówki.

Tutaj opisujemy technikę opracowania nowego modelu zwierzęcego do badania gojenia rogówki po fotorefrakcyjnej keratektomii. Ze względu na ograniczoną dostępną literaturę na temat rogówki M. unguiculatus, opisujemy również analizę histologiczną prawidłowej rogówki. Te techniki badawcze mogą być również stosowane w badaniach nad chorobami oczu ze względu na podobieństwo rogówek myszoskoczków mongolskich i ludzi pod względem genetycznym, anatomii i fizjologii.

Wprowadzenie

Niektóre z najważniejszych aspektów gojenia się ran rogówki, które są kluczowe dla chirurgii przedniego odcinka, to integralność architektury nabłonka, utrzymanie przezroczystości zrębu rogówki, i wreszcie wynik pod względem właściwości refrakcji rogówki¹.

Rogówka jest najbardziej zewnętrzną przezroczystą tkanką z przodu gałki ocznej, dlatego jest podatna na urazy, infekcje i oparzenia; Utrudnione gojenie się tych ran może zagrozić zdrowiu wzroku².

Obecnie dostępnych jest kilka modeli zwierzęcych do badania gojenia rogówki, a niektóre z nich są lepsze od innych, w zależności od gatunku i rodzaju badanego mechanizmu¹. Istnieje kilka zapisów wcześniejszych badań siatkówki myszoskoczków². Jednak do tej pory nie ma opublikowanej literatury na temat procesów bliznowacenia w rogówce tych gryzoni

.

Tutaj prezentujemy Meriones unguiculatus (myszoskoczek mongolski) jako zwierzęcy model gojenia się ran w rogówce. Opisano procedury mające na celu wywołanie gojenia rogówki po fotorefrakcyjnej keratektomii, które pozwalają nam zbadać różne rodzaje procesów bliznowacenia rogówki, zrozumieć gojenie się ran w kategoriach dynamicznych faz żywej tkanki i wreszcie zaplanować odpowiednie przyszłe zabiegi³. Keratektomia fototerapeutyczna jest wysoce powtarzalną techniką z możliwością precyzyjnej kontroli parametrów takich jak głębokość i średnica uszkodzenia rogówki⁴. Co więcej, technika ta nie wymaga zabiegów z użyciem narzędzi chirurgicznych lub roztworów chemicznych (np. roztworu soli fizjologicznej, formaliny, alkoholu itp.), które mogą dodawać zmienne specyficzne dla narzędzi lub operatora wykonującego zabieg⁵.

Trzy 6-miesięczne samce myszoskoczków o podobnych rozmiarach i wadze (około 90 g) zostały użyte do eksperymentu przedstawionego w tym artykule. Zabiegi wykonywano tylko w odpowiednich oczach. Jeden myszoskoczek (określany jako myszoskoczek 1 lub kontrolny) nie przeszedł fototerapeutycznej keratektomii i został wyłuszczony w celu oceny wszystkich normalnych struktur oka. Keratektomia fototerapeutyczna polega na kontrolowanym dostarczaniu do rogówki światła ultrafioletowego generowanego przez laser excimerowy i została opracowana w celu przeprowadzenia chirurgii refrakcyjnej⁶. Był używany u innych gryzoni, takich jak myszy⁷. Pozostałe dwa myszoskoczki poddano fototerapeutycznej keratektomii. Jeden z nich został wyłuszczony po 24 godzinach (określany jako myszoskoczek 2), a drugi po 96 godzinach po operacji (określany jako myszoskoczek 3).

Aby przeprowadzić ten eksperyment, losowo wybrany myszoskoczek został sfilmowany dla każdego badanego stanu, ale ten eksperyment był wcześniej przeprowadzany z 16 myszoskoczkami w sumie dla każdego warunku. Ze względów edycyjnych zdecydowano się użyć losowo wybranego myszoskoczka dla każdego warunku (w sumie trzy myszoskoczki) jako przykładu.

Głównym celem tych badań jest zbadanie najlepszego dostępnego modelu zwierzęcego. Należy jednak pamiętać, że nie wszystkie gatunki mają cechy oczu podobne do ludzkich oczu⁸. W artykule opisano metodologię zastosowaną do badania rogówki Meriones unguiculatus oraz procedurę wykonywaną w celu wywołania uszkodzenia rogówki, które pozwalają nam badać proces gojenia.

Protokół

Wszystkie procedury badawcze zostały zatwierdzone przez "Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych" Universidad Católica de Córdoba i były zgodne z Przewodnikiem Narodowej Rady ds. Badań Naukowych dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Procedury te zostały również zatwierdzone przez władze "Facultad de Ciencias de la Salud" Universidad Católica de Córdoba i "Instituto de la Visión Cerro".

1. Postępowanie z myszoskoczkiem i znieczulenie

UWAGA: Wszystkie zwierzęta były samcami myszoskoczków mongolskich wolnych od specyficznych patogenów (SFP) i były trzymane w obiektach Centrum Badań i Rozwoju w Immunologii i Chorobach Zakaźnych (CIDIE) (Kordoba, Argentyna). Uzyskano je na Universidad de La Plata (Buenos Aires, Argentyna).

1. Myszoskoczki trzymają się społecznie w klatkach polisulfonowych wyściełanych ściółką z kolb kukurydzy. Dostarczaj jedzenie i przefiltrowaną wodę z kranu w butelkach z wodą ad libitum. Upewnij się, że zakres temperatury w pomieszczeniu wynosi od 18 °C do 24 °C i stosuje się cykl 12:12 h jasno-ciemny
.
2. Zważ każdego myszoskoczka osobno i zidentyfikuj każdy z nich, aby uniknąć nieporozumień. Zrób znak niezmywalnym markerem atramentowym u podstawy ogona myszoskoczka. Użyj pęsety, aby przytrzymać ucho myszoskoczka i zrób znak za pomocą nieusuwalnego markera na uchu gryzonia. Jeśli dostępne jest laboratorium i duże biotermium, należy przypisać każdemu gryzoniowi niepowtarzalną klatkę z odpowiednią identyfikacją.
3. Zdezynfekuj okap z przepływem laminarnym 70% roztworem etanolu. Umieść wszystkie narzędzia chirurgiczne i jednorazowe, w tym igły, strzykawki i stojaki, w obszarze roboczym wewnątrz okapu. Umieść również jednorazową piankę chirurgiczną w kapturze.
4. Użyj małego otwartego plastikowego pojemnika, aby utrzymać gryzonia na wadze precyzyjnej, aby ułatwić pomiar.
5. Do tego eksperymentu użyj trzech 6-miesięcznych samców myszoskoczków mongolskich o podobnych rozmiarach i wadze (~80 g). Pojedynczo umieszczaj każdą klatkę z gryzoniem w okapie z przepływem laminarnym. Otwórz klatki, zidentyfikuj każdy z myszoskoczków i zważ je na wadze.
   UWAGA: Myszoskoczki to nieszkodliwe, ale delikatne zwierzęta. Podczas obchodzenia się z myszoskoczkami należy nosić jednorazowe rękawiczki.
6. Chwyć myszoskoczka ręką niedominującą, aby mocno trzymać go za ogon. Użyj dominującej ręki, z kciukiem i palcem wskazującym za uszami, aby trzymać zwierzę z brzuszną częścią skierowaną do góry. Użyj małego palca, aby przytrzymać ogon.
7. Napełnij strzykawkę igłą 30 G z 1 ml ketaminy i ksylazyny. Podać znieczulenie dootrzewnowo gryzoni (50-100 mg/kg ketaminy i 2 mg/kg ksylazyny)⁹ przy użyciu ręki dominującej. Czas trwania efektu wyniesie około 20-50 minut (mogą wystąpić różnice).
8. Aby upewnić się, że myszoskoczek jest w pełni znieczulony, przed wykonaniem nacięć w rogówce sprawdź za pomocą szczypania palca, szczypania ogona i odbicia rogówki itp.
   UWAGA: Wszystkie zabiegi wykonuj tylko na prawym oku.

2. Optyczna koherentna tomografia (OCT) rogówki

1. Umieść sterylne obłożenia chirurgiczne, aby chronić sprzęt przed wydzielinami lub sierścią zwierząt.
2. Upewnij się, że jeden z operatorów trzyma zwierzę, podczas gdy drugi operator robi zdjęcia. Operator powinien oprzeć ręce na sprzęcie, trzymając myszoskoczka, tak aby oko myszoskoczka było jak najbardziej stabilne i nieruchome, aby można je było badać. Oprzyj rękę trzymającą myszoskoczka na podbródku.
3. Uruchom oprogramowanie sterujące OCT i naciśnij Zrób obraz, a następnie Zapisz żądany obraz. Wykonaj wiele strzałkowych i czołowych plasterków rogówki. Wyobraź sobie oko pod OCT i wykonaj wiele plasterków, aby zobaczyć przedni odcinek rogówki gryzonia.
   UWAGA: Jeśli uzyskany obraz nie jest ostry, a oko nieznacznie się poruszyło, powtórz procedurę kilka razy, aby uzyskać wystarczającą liczbę obrazów.
4. Za pomocą oprogramowania OCT wykonaj pomiary pachymetryczne obszarów centralnych i peryferyjnych. Na głównym ekranie oprogramowania naciśnij przycisk Zrób zdjęcie, a następnie naciśnij przycisk Zapisz żądany obraz.
5. Wykonaj pomiary na zdrowym lub kontrolnym oku i bezpośrednio po fototerapeutycznej keratektomii na innych oczach gryzoni
.

3. Fototerapeutyczna keratektomia laserem excimerowym (PTK)

1. Umieść sterylne obłożenia chirurgiczne na urządzeniu lasera excimerowego, aby chronić sprzęt przed wydzielinami lub sierścią zwierząt.
2. Wkraplać kroplę miejscowego chlorowodorku proparakainy (0,5%) do oka, które ma być leczone, 5 minut przed zabiegiem chirurgicznym.
3. Użyj niedominującej ręki, aby mocno przytrzymać myszoskoczka. Dominującą ręką otwórz powieki zwierzęcia, aby można było prawidłowo uchwycić obrazy. Aby móc ustawić ostrość i uzyskać ostry obraz, upewnij się, że ręce osoby trzymającej myszoskoczka spoczywają na głowie sprzętu. Umieść ręce trzymające zwierzę w miejscu, w którym pacjent umieściłby szyję.
4. Wykonaj ablację PTK na prawym oku. Należy użyć następujących parametrów: ablacja o grubości od 60 μm do 62 μm, strefa optyczna 3 mm, czas trwania 4 s i łącznie 1 867 impulsów.
   UWAGA: PTK wykonuje się tylko na myszoskoczku 2 i myszoskoczku 3. Na tym etapie drugi operator przygotowuje i aktywuje laser w celu ablacji tkanki rogówki.
5. Bezpośrednio po zabiegu należy wykonać zdjęcia i przeprowadzić analizę OCT w celu zarejestrowania i udokumentowania zmian powierzchni w leczonych oczach.
6. Po zakończeniu zabiegu umieść gryzonia z powrotem w klatce, monitoruj parametry życiowe (tętno: 360 uderzeń na minutę; temperatura w odbycie: 37-38,5 °C; częstość oddechów: 90 oddechów na minutę) i pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu.

4. Przebudzenie myszoskoczków po wszczepieniu rogówki PTK

1. Podawać buprenorfinę (0,1 mg/kg do 0,05 mg/kg) i atipamezol (0,1-1 mg/kg) we wstrzyknięciach dootrzewnowych.
2. Umieść każdego myszoskoczka w odpowiedniej klatce domowej i monitoruj parametry życiowe w celu normalnego przebudzenia (normalna temperatura ciała wynosi 37-39 °C).
3. Zastosuj maść z erytromycyną, aby utrzymać powierzchnię w czystości i zapobiec infekcji. Wykonuj tę procedurę dwa razy dziennie.
4. Buprenorfinę (co 6-12 godzin) podawać podskórnie (0,01-0,05 ml) w celu znieczulenia i maści do oczu przez dwa kolejne dni po PTK.

5. Metoda eutanazji

1. Przeprowadzaj eutanazję w klatce domowej, gdy tylko jest to możliwe.
2. Wprowadź sprężony dwutlenek węgla (CO₂ ) do klatki domowej. Szybkość napełniania 30%-70% objętości komory na minutę CO₂ dodanym do istniejącego powietrza w klatce domowej jest wystarczająca do uzyskania mieszanki spełniającej cel (w przypadku komory o objętości 10 l należy zastosować natężenie przepływu 3-7 l/min). Użyj zwichnięcia szyjki macicy (jako wtórnej metody eutanazji), aby zapewnić śmierć gryzonia.
3. Po 24 godzinach i 96 godzinach od operacji odpowiednio myszoskoczka 2 i myszoskoczka 3 należy wyjąć zwierzę z klatki domowej w celu wykonania enukleacji gałki ocznej (zarówno gałki ocznej, jak i tej poddawanej operacji), aby obserwować gojenie rogówki.
4. Umieść zwierzę na stole operacyjnym i sprawdzaj, czy nie ma bicia serca przez około 1 minutę.

6. Chirurgia oka

1. Zdejmij górną i dolną powiekę, aby uzyskać dostęp do gałki ocznej. Użyj kleszczy chirurgicznych i nożyczek, aby usunąć powieki. Wielkość obszaru roboczego jest na tyle mała i delikatna, że usunięcie powiek pozwala na wyłuszczenie gałki ocznej bez jej uszkodzenia.
2. Aby wyłuszczyć gałkę oczną, wykonaj nacięcie w zewnętrznej kancie i poprowadź nożyczki w kierunku tylnym. Powtórz tę procedurę od wewnętrznego kantu, oddzielając gałkę oczną od oczodołu.
3. Przekrój nerw wzrokowy z tyłu gałki ocznej. Należy wyjaśnić, że tylny splot oczodołowy zwykle generuje lekkie krwawienie podczas wykonywania tej techniki, co utrudnia pracę.
4. Wprowadzić gałkę oczną do probówki mikrowirówkowej ze sterylnym roztworem soli fizjologicznej na 30 s do 1 minuty, aby wypłukać resztki krwi.
5. Umieść gałkę oczną w probówce mikrowirówkowej zawierającej 10% formaldehydu w celu późniejszej analizy anatomiczno-patologicznej, jak opisano poniżej. Zrób wiele obrazów i zdjęć.

7. Analiza anatomiczno-patologiczna

1. Zanurz całe oko w 10% buforowanej formalinie na 6-24 godziny.
2. Przetnij tkankę za pomocą mikrotomu. Upewnij się, że przecięta tkanka ma grubość 3 mm.
3. Namocz tkankę w 96% alkoholu przez 30-90 minut i powtórz tę procedurę dwukrotnie.
4. Umieść tkankę w alkoholu izopropylowym na 30-90 minut i powtórz tę procedurę dwukrotnie.
5. Umieść tkankę w ksylenie lub substytucie ksylenu na 1-3 godziny.
6. Zanurz tkankę w ciekłej nafcie na minimum 1 godzinę.
7. Za pomocą klocka umieść tkankę i zanurz ją w płynnej parafinie. Pozwól mu zastygnąć (umieść go w chłodnym miejscu) i pokrój.
8. Przygotuj mikrotom do cięcia zgodnie z instrukcjami producenta.
9. Następnie użyj barwników, takich jak hematoksylina i eozyna.
10. Uzyskuj zdjęcia za pomocą aparatu dołączonego do mikroskopu.

Wyniki

W niniejszym badaniu cała struktura rogówki została dokładnie przeanalizowana przy użyciu technik histologicznych oraz uzupełniających badań odcinka przedniego, takich jak optyczna koherentna tomografia. Analiza obrazów struktur odcinka przedniego wykonana za pomocą optycznej koherentnej tomografii wykazuje prawidłowy nabłonek i zrąb (Rysunek 1), przy czym centralna i obwodowa grubość rogówki wynosi odpowiednio 160 µm i 106 µm ± 2 µm. W innych publikacjach również wykazano, że rogówka innych...

Dyskusja

Fizjologia gojenia się ran rogówki to równowaga między regeneracją tkanek a utrzymaniem homeostazy. Nadmierne gojenie się ran może prowadzić do zwłóknienia i bliznowacenia, co ostatecznie może skutkować utratą funkcji narządów. Biorąc pod uwagę szybki rozwój zabiegów chirurgicznych rogówki, nie można przecenić znaczenia zrozumienia procesu gojenia się ran rogówki oraz związanych z tym zdarzeń fizjologicznych i patologicznych¹¹.

Wiele prac badawczych twierdzi, że myszos...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Anestezjologia	Tododrogas
Rurki Eppendorfa	Tododrogas
Excimer Laser	Technolas	2022445
Fluoresceina	Poen
Kleszcze	Ofcor	3339
Formaldehyd	Tododrogas
Ketamina	Sigma-Aldrich
Optyczna tomografia koherentna	Optovue	659007
Proparacaine	Nożyczki Poen
	Ofcor	3336
Sterylne serwety	Soporte hospitalario
Sterylne gazy	Soporte hospitalario
Strzykawki i igły	Tododrogas
Ksylazyna	Sigma-Aldrich

Rękawiczki Tododrogas