Projektowanie i mikroiniekcja oligonukleotydów antysensownych morpholino i mRNA do zarodków danio pręgowanego w celu wyjaśnienia specyficznej funkcji genów w rozwoju serca

Zain  Zaki Zakaria; Shahram Eisa-Beygi; Fatiha M. Benslimane; Ramani Ramchandran; Huseyin C. Yalcin

doi:10.3791/63324

Artykuł metodologiczny

Projektowanie i mikroiniekcja oligonukleotydów antysensownych morpholino i mRNA do zarodków danio pręgowanego w celu wyjaśnienia specyficznej funkcji genów w rozwoju serca

DOI:

10.3791/63324

⸱

9 sierpnia 2022

Zain Zaki Zakaria¹^,² , Shahram Eisa-Beygi³ , Fatiha M. Benslimane¹ , Ramani Ramchandran⁴ , Huseyin C. Yalcin¹

¹Biomedical Research Center, Qatar University, Doha, Qatar, ²Department of Biological and Environmental Sciences, College of Arts and Science, Qatar University, Doha, Qatar, ³Department of Cell Biology, Neurobiology and Anatomy, Medical College of Wisconsin, ⁴Department of Pediatrics, Medical College of Wisconsin

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje projektowanie, przygotowanie i mikrowstrzykiwanie blokującego translację morfolinu przeciwko reprezentatywnemu genowi sercowemu; Pochodne serca i grzebienia nerwowego wyrażone2 (ręka2) w żółtku nowo zapłodnionych zarodków danio pręgowanego w celu obniżenia funkcji genu. Pokazuje również przejściowe uratowanie tych "morfantów" poprzez jednoczesne wstrzyknięcie mRNA kodującego ten produkt genu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System knockdown oparty na oligomerach morpholino został wykorzystany do identyfikacji funkcji różnych produktów genowych poprzez utratę lub zmniejszenie ekspresji. Morfolinosy (MO) mają przewagę pod względem stabilności biologicznej nad oligonukleukleetami DNA, ponieważ nie są podatne na degradację enzymatyczną. Aby uzyskać optymalną skuteczność, MO są wstrzykiwane do zarodków w stadium 1-4 komórek. Czasowa skuteczność knockdownu jest zmienna, ale uważa się, że MO ostatecznie tracą swoje działanie z powodu rozcieńczenia. Rozcieńczenie morfolina i ilość wstrzykniętego leku powinny być ściśle kontrolowane, aby zminimalizować występowanie efektów niepożądanych przy jednoczesnym zachowaniu skuteczności w miejscu docelowym. Dodatkowe narzędzia uzupełniające, takie jak CRISPR/Cas9, powinny być wykonywane na docelowym genie będącym przedmiotem zainteresowania, aby wygenerować zmutowane linie i potwierdzić fenotyp morfu za pomocą tych linii. W tym artykule pokażemy, jak zaprojektować, przygotować i mikrowstrzyknąć blokującą translację morfolinę przeciwko ręce2 do żółtka zarodków danio pręgowanego w stadium 1-4 komórek, aby zniszczyć funkcję ręki2 i uratować te "morfanty" poprzez jednoczesne wstrzyknięcie mRNA kodującego odpowiednie cDNA. Następnie ocenia się skuteczność mikroiniekcji morfoliny, najpierw sprawdzając obecność morfoliny w żółtku (wstrzykiwanym jednocześnie z czerwienią fenolową), a następnie przeprowadzając analizę fenotypową. Ponadto omówiona zostanie analiza czynnościowa serca w celu sprawdzenia skuteczności knockdownu. Na koniec wyjaśniona zostanie ocena wpływu indukowanej przez morfolino blokady translacji genów poprzez western blotting.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie danio pręgowanego jako modelu do badania rozwoju i chorób układu krążenia oferuje wiele korzyści, w tym wysoką ochronę funkcji genów, przejrzystość optyczną, szybki rozwój układu sercowo-naczyniowego i niższe koszty w porównaniu z tradycyjnymi modelami in vivo1. Oligonukleotydy morfolino (MO) są najczęściej stosowanymi narzędziami do knockdown genów antysensownych w modelu danio pręgowanego. MO są często używane do określania fenotypu lub do badania funkcji genów. Dr James Summerton początkowo opracował system dostarczania morfolino do hamowania in vivo translacji mRNA jako próbę opracowania terapii dla wad rozwojowych u ludzi²^,³. MO zostały wykorzystane w organizmach modelowych in vitro i in vivo do knockknocku genów i zbadania konsekwencji tego knockdownu dla fenotypu. Odbywa się to poprzez obserwację zmian w rozwoju określonych narządów, na przykład serca. Knockdown genów specyficznych dla serca w zarodkach zebry zebry WT doprowadził do nieprawidłowego bicia serca, co świadczy o nieodzownej funkcji tych genów dla rozwoju serca⁴^,⁵. Te fenotypy zostały uratowane przez jednoczesne wstrzyknięcie mRNA dla określonych genów. Badanie z udziałem troponiny sercowej T (Tnnt2) wykazało, że ekspresja mRNA tnnt2 o pełnej długości może uratować fenotypy sarkomeryczne spowodowane przez knockdown⁶. Inne badanie wykazało, że integralność pasm A i dysków Z może zostać przywrócona przez nadekspresję mRNA regulatorowego ortologu łańcucha lekkiego miozyny (cmlc2) w morfantach cmcl2 ⁷.

MOs są powszechnie używane do obniżania ekspresji genów poprzez celowanie w splicing pre-mRNA lub poprzez blokowanie translacji. MO blokujące splicing wiążą i hamują pre-mRNA poprzez hamowanie splicesomu. Blokowanie translacyjne występuje, gdy MO wiąże się z nieulegającym translacji regionem 5' komplementarnego mRNA, aby utrudnić składanie rybosomów. MO są najpowszechniej stosowaną metodą specyficzną dla genu do obniżania ekspresji genów w modelach in vivo; są również najskuteczniejszymi środkami blokującymi mRNA stosowanymi w hodowlach komórkowych. Sam morfolino zazwyczaj składa się z krótkiego łańcucha (około 25) zasad podjednostek morfolino. Każda podjednostka MO zawiera zasadę kwasu nukleinowego, pierścień morfolinowy i niejonowy fosforodiamidan. Różne mechanizmy działania tych dwóch typów MO wymagają różnych testów w celu sprawdzenia skuteczności knockdownu. W przypadku MO blokujących translację, analiza western blot jest najbardziej wiarygodnym testem skuteczności, ponieważ białko będące przedmiotem zainteresowania nie powinno być wytwarzane z powodu zablokowania miejsca rozpoczęcia translacji ATG. MO nie degradują bezpośrednio swojego docelowego mRNA; Zamiast tego wiążą się z określonymi regionami i hamują ekspresję, dopóki nie ulegną naturalnej degradacji. Jednak MO blokujące splice modyfikują pre-mRNA poprzez indukowanie modyfikacji splicingu, którą można oznaczyć za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR) i elektroforezy żelowej.

Trzy kluczowe elementy procesu przesiewowego MOs muszą być ustandaryzowane: (i) Krzywa dawki MO musi być dostosowana do rozpoznawania fenotypów. Krzywa dawki pokazuje również dawkę śmiertelną 50 (LD50: dawka, przy której umiera 50% wstrzykniętych zarodków) dla każdego badanego MO w celu poprawy zdolności do optymalizacji "sygnału" fenotypowego w porównaniu z "szumem" poza celem³. (ii) nomenklatura fenotypowania, która została dostosowana, powinna być dobrze udokumentowana; Precyzyjny i łatwy do zrozumienia opis fenotypowy ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia obszernych wyjaśnień opartych na istniejącej literaturze i doświadczeniu badaczy, aby ułatwić wymianę informacji między osobami, które nie badały bezpośrednio zarodków. (iii) Posiadanie dobrze zdefiniowanego języka ułatwia centralne zbieranie danych z bazy danych Morpholino⁸.

W badaniach nad nokautem MO dla genów sercowych, aktywność serca zwierząt i dynamika przepływu krwi muszą być monitorowane w celu określenia wpływu eksperymentów z nokautem MO na funkcjonowanie układu sercowo-naczyniowego. Takie analizy wymagają wizualizacji układu sercowo-naczyniowego w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości. Skóra danio pręgowanego jest przezroczysta przez pierwszy tydzień rozwoju, co umożliwia wizualizację krążenia serca i krwi za pomocą mikroskopii. Do oceny czynności serca najczęściej obliczanymi parametrami fizjologicznymi są tętno i pojemność minutowa serca, a także skrócenie frakcyjne, ułamkowa zmiana obszaru i frakcja wyrzutowa. Prędkości przepływu krwi można mierzyć, śledząc poruszające się erytrocyty, a pomiary te służą do określania poziomów naprężeń ścinających, kluczowego czynnika mechanobiologicznego na komórkach śródbłonka. Taka ocena wymaga nagrywania filmów poklatkowych dla bijącego serca i przepływającej krwi za pomocą mikroskopu odwróconego lub stereoskopowego wyposażonego w szybką kamerę.

Ten artykuł pokazuje, jak zaprojektować, przygotować i wprowadzić do żółtka świeżo zapłodnionych zarodków danio pręgowanego blokującego translację morfolina przeciwko interesującemu genowi, aby osłabić funkcję genu. Pokaże również ratowanie tych "morfantów" poprzez jednoczesne wstrzyknięcie mRNA kodującego ten gen. Następnie przeanalizujemy skuteczność mikroiniekcji morfolino poprzez charakterystykę fenotypową, a także analizy strukturalne i funkcjonalne serca. Podejście to zostanie zademonstrowane na szeroko badanym genie sercowym, ręce2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z przyjętymi standardami humanitarnej opieki nad zwierzętami zgodnie z regulacjami IACUC na QU; zwierzęta były przetrzymywane w obiekcie dla zebry w ramach Qatar University Biomedical Research Center (QU-BRC). Wszystkie zwierzęta wykorzystane w tych badaniach eksperymentalnych były poniżej 3 dni po zapłodnieniu (dpf).

UWAGA: Dla każdej grupy eksperymentalnej zaleca się użycie co najmniej 30 embrionów dla rygoru statystycznego. Grupy eksperymentalne są następujące:

Grupa kontrolna: Ta grupa obejmuje zarodki hodowane w wodzie jajecznej bez żadnych zastrzyków. Wyniki w tym miejscu utworzą linię bazową kontroli.

Grupa kontroli negatywnej: Ta grupa obejmuje zarodki hodowane w wodzie jajecznej, którym wstrzyknięto jajecznicę MO.

Grupa wstrzyknięta: Ta grupa obejmuje zarodki, którym wstrzyknięto tylko manual2 MO i hand2 MO z mRNA hand2 w celu uratowania fenotypu. Uzyskane wyniki potwierdzą, że obserwowane fenotypy powstały w wyniku wstrzykniętych MO. Porównanie grup eksperymentalnych pozwoli na precyzyjną ocenę wpływu hamowania i ratowania ręki2 na czynność serca.

1. Projekty Morpholino dla ręki2.

UWAGA: Sekwencje MO mogą być zaadaptowane z literatury⁹^,¹⁰^,¹¹. Alternatywnie, te oligonukleotydy mogą być projektowane online przez Gene-tools. Gene-tools oferuje bezpłatną i szybką usługę projektowania online, do której można uzyskać dostęp za pośrednictwem ich strony internetowej¹². Niestandardowy MO można łatwo zaprojektować, dostarczając informacji o interesujących genach, takich jak informacje o sekwencji lub numery dostępu. Poniższe konkretne kroki podsumowują, jak zaprojektować MO przeciwko ręce2 u danio pręgowanego:

Najpierw poszukaj szczegółów interesującego genu w bazie danych NCBI. Dla dłoni2, w klasie danio pręgowany¹³.
Pobierz identyfikator transkryptu mRNA GenBank z NCBI¹⁴.
Uzyskaj sekwencję mRNA z NCBI¹⁵.
UWAGA: Modyfikowane morfolinolitami (MO) oligonukleotydy antysensowne dla genu ręki danio pręgowanego2 są dostępne i zostały wcześniej opublikowane. ręka2 powiedział: MO sequence⁹^,¹⁰^,¹¹: 5'-CCTCCAACTAAACTCATGGCGACAG-3', sekwencje MO użyte w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
Uzyskaj negatywną kontrolę z niedopasowanego lub zakodowanego MO (podobne sekwencje z losowymi zmianami par zasad) z gene tools¹⁶ do wstrzyknięcia. Pomogłoby to potwierdzić specyficzność fenotypu (fenotypów) obserwowanego w określonych iniekcjach MO i zminimalizować ryzyko, że obserwowane efekty pochodzą z artefaktu procedury iniekcji.

2. Przygotowanie iniekcji morfolina

Przygotowanie zapasów
1. Rozpuścić zapasy MO za pomocą ddH₂O; Pirowęglan dietylu (DEPC) może uszkadzać MO i być toksyczny dla zarodków. Dlatego należy używać ddH₂O bez DEPC. Po złożeniu zamówienia MO są dostarczane w fiolce o stężeniu 300 nM.
  UWAGA: Chociaż Gene Tools zaleca roztwory podstawowe 1 mM (~ 8 ng / nL), może to być zbyt niskie, zwłaszcza jeśli morfolino wymaga dużej dawki lub jest zmieszane z innymi MO. Dlatego idealnie nadaje się do wytwarzania roztworów podstawowych MO o różnych stężeniach (2 lub 3 mM).
2. Przygotować roztwór roboczy o stężeniu 0,2 mM przez podrozcieńczenie roztworu roboczego (tj. dla 2 mM roztworu podstawowego, rozcieńczenie 1:10). Przygotować 10 μl roztworu roboczego, dodając roztwór Danieaux (7 μl), morfolino (1 μl) i czerwieni fenolowej (2 μl z 10x bulionu). Czerwień fenolowa nadaje roztworowi ciemnoczerwony kolor, aby pomóc w śledzeniu wstrzykniętego materiału w zarodku.
3. Przechowuj MO w temperaturze pokojowej (RT) w hermetycznych pojemnikach, aby zapobiec parowaniu. Nie trzymaj MO na lodzie na blacie stołu, ponieważ roztwór może się wytrącić. Obsługa RT jest najbardziej odpowiednia.
  UWAGA: Gene Tools zaleca jedną z dwóch metod przechowywania MO: Roztwór roboczy można przechowywać w temperaturze -20 °C (przez wiele miesięcy do lat) lub RT w szczelnie zamkniętej tubie do długotrwałego przechowywania. Jeśli roztwór oligonukleotydu jest przechowywany w temperaturze -20 °C, należy go podgrzewać w temperaturze 65 °C przez 10 minut i wirować, aby całkowicie rozpuścić morfolino przed użyciem (nie ma potrzeby podgrzewania go, jeśli jest przechowywany w temperaturze pokojowej).
Transkrypcja in vitro mRNA
UWAGA: Transkrypcję in vitro wykorzystano do wygenerowania mRNA Hand2 z plazmidowego klonu ORF oznaczonego ludzką etykietą HAND2 (NM_021973), który ma być mikrowstrzykiwany do zarodków danio pręgowanego w celu uratowania fenotypu w wyniku powalenia ręki danio pręgowanego2 za pomocą morfolinosów, szczegóły plazmidu użyte w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Linearyzować plazmidowe DNA za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego i oczyszczać za pomocą zestawu do oczyszczania DNA (tabela materiałów). Użyj oczyszczonego zlinearyzowanego DNA jako matrycy do transkrypcji in vitro w celu wygenerowania mRNA do wstrzykiwań zgodnie z instrukcjami producenta (tabela materiałów).
2. Na koniec wstrzyknij 250 pg ludzkiego mRNA dla genu, który jest przedmiotem zainteresowania, aby uratować fenotyp, aby sprawdzić, czy brak fenotypu jest rzeczywiście spowodowany utratą genu danio pręgowanego przez MO.
Przygotowanie do wstrzyknięcia
1. Wyciągnąć igłę za pomocą ściągacza do mikropipet (tabela materiałów), wykonując czynności 2.3.2-2.3.6.
2. Użyj probówek kapilarnych o średnicy 1 mm z filamentami i ściągaczem do mikropipet. Włącz maszynę i otwórz pokrywę
3. Przekręć pokrętło wyboru trybu na nr 2 Grzałka. Za pomocą grzałki NO.2 wyreguluj pokrętło, aby doprowadzić ciepło do 68 °C
4. Przekręć pokrętło wyboru trybu z powrotem do pozycji kroku 1. Użyj czterech obciążników (2 typu lekkiego / 2 typu ciężkiego)
5. Umieść kapilarę na uchwycie i zamknij pokrywę. Naciśnij przycisk Start, aby wyciągnąć igłę.
  UWAGA: Spowoduje to wygenerowanie igieł kapilarnych z długim stożkiem
6. Krótko odetnij końcówkę igieł za pomocą kleszczy. Naostrz końcówkę ciągniętej igły, aby ułatwić penetrację zarodków danio pręgowanego za pomocą skosownika kapilarnego przez około 30 s, uzyskując końcówki o średnicy około 15-25 μm.
7. Skalibrować igłę, aby oszacować ilość wstrzyknięcia, wykonując czynności 2.3.8-2.3.13.
8. Krótko wymieszaj roztwór mRNA/morpholino przed załadowaniem go do igły, aby rozpuścić cząsteczki, które mogłyby całkowicie zatkać igłę.
9. Dodać ~3-4 μl roztworu MO do tylnej części igły iniekcyjnej za pomocą końcówki pipety z mikronową końcówką. Igły iniekcyjne wyposażone są w mały wykop ułatwiający zasypywanie kapilarne.
10. Upewnij się, że w igle do wstrzykiwań nie ma pęcherzyków powietrza. Zamontuj igłę do mikrowtryskiwacza.
11. Sprawdzić, czy końcówka igły nie jest zatkana i czy roztwór MO może wypłynąć z igły, naciskając pedał wstrzykiwania.
12. Skalibrować objętość wstrzyknięcia, mierząc wielkość kropli. Umieść końcówkę igły w oleju mineralnym na szkiełku mikrometrycznym. Nacisnąć pedał wtrysku i wyregulować ciśnienie wtrysku (psi) i/lub czas wtrysku (ms) do momentu, gdy średnica wyrzucanej kropli osiągnie 0,1 mm, co odpowiada 0,5 nL.
13. Upewnij się, że objętość wstrzyknięcia wynosi około 0,5-1 nL. Dostosuj objętość, zmieniając ciśnienie wtrysku (wyrzut) (psi) lub czas (ms).
14. Aby zapoznać się z protokołem konfiguracji wtryskiwacza pikoliter, wykonaj kroki 2.3.15-2.3.16
15. Użyj wtryskiwacza pikoliter do wstrzykiwań danio pręgowanego. Włącz pompę zasilającą wtryskiwacza.
16. Przygotuj wtryskiwacz zgodnie z wymaganiami przedstawionymi poniżej:
  1. P-balance: Upewnij się, że P-balance wynosi około 0. Upewnij się, że jest lekko ujemny, aby zapobiec cofaniu się żółtka do igły, rozcieńczając roztwór MO w igle. I odwrotnie, jeśli ciśnienie wsteczne jest zbyt wysokie, MO będzie stale wypływać z igły, nawet bez wywierania nacisku na pedał, co powoduje zmienność i niespójności w wstrzykiwanej dawce i obserwowanych fenotypach.
  2. Wstrzyknięcie P: 20-25 psi jest idealne; zmień to, aby dostosować objętość wtrysku. Może to wynosić od 10 do 30 psi, ale zacznij od ~ 20 psi, aby sprawdzić, czy zapewnia pożądaną głośność.
  3. Czas wstrzykiwania: Należy upewnić się, że czas wstrzyknięcia został skrócony do 300 ms. Przed dostosowaniem objętości wstrzyknięcia należy dokonać regulacji czasu wstrzyknięcia.
17. W przypadku wstrzykiwania morfolino należy postępować zgodnie z krokami 2.3.18-2.3.19.
18. Przygotować komorę iniekcyjną w następujący sposób: Przygotować 2% agarozy z 0,6 g agarozy i 30 ml pożywki E3. Wlej agarozę na szalkę Petriego i umieść formę wtryskową na agarozie za pomocą formy wtryskowej TU-1. Po schłodzeniu w zamrażarce utworzą się bruzdy do umieszczania i stabilizacji zarodków (Rysunek 1A).
  UWAGA: Receptura roztworu podstawowego 60x E3M składa się z 5,0 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,16 mM MgSO,₄·_7H2O, 0,4 mM CaCl₂·2H₂O w 1 L ddH₂O o końcowym pH 7,6.
19. Przenieś pobrane zarodki do bruzd za pomocą pipety transferowej, usuń cały nadmiar pożywki E3 wokół zarodków, aby zapobiec unoszeniu się zarodków (Rysunek 1B).

3. Wstrzyknięcie roztworu MO i mRNA do żółtka

Wprowadzić igłę przez kosmówkę, wstrzyknąć w pobliżu granicy komórki/żółtka w stronę zarodka i nacisnąć pedał iniekcji (Rysunek 1C).
UWAGA: Wstrzyknięty roztwór MO/czerwień fenolowa nie ulegnie natychmiastowej dyfuzji w żółtku. W żółtku zaobserwuje się czerwoną plamę, która stopniowo się rozprasza. Wstrzykiwany materiał nie powinien przekraczać więcej niż 10% wielkości zarodka. MO mogą być mikrowstrzykiwane do żółtka nowo złożonych jaj danio pręgowanego w stadium do 8 komórek, ponieważ MO mogą być łatwo pobierane w strumieniu cytoplazmatycznym woreczka żółtkowego przez rozwijające się komórki¹⁷^,¹⁸. W przypadku iniekcji plazmidowych lub mRNA z czapeczką wstrzyknięcie powinno być wykonane do pojedynczego blastomeru zarodka w stadium jednokomórkowym.
Przenieść zarodki na szalkę Petriego z pożywką E3 i inkubować je w temperaturze 28 °C do 3 dpf, z codziennym uzupełnianiem pożywki E3. Na tym etapie należy przeprowadzić ocenę fenotypową za pomocą mikroskopu.
UWAGA: Roztwory MO muszą być starannie rozcieńczane dla każdego badania w celu ustalenia najniższego stężenia potrzebnego do wywołania określonego fenotypu. Należy również określić śmiertelność zarodków dla każdego MO. Przy wyższych stężeniach (powyżej 4-10 ng, w zależności od MO), MO mają tendencję do wywoływania niespecyficznych efektów, takich jak śmierć mózgu lub ogólna śmierć komórki.
Wstrzyknij MO z 250 pg mRNA ludzkiej ręki2 w ten sam sposób, aby potwierdzić uratowanie fenotypu wywołanego utratą genu ręki danio pręgowanego przez MO.

4. Western blot w celu sprawdzenia sukcesu powalenia morpholino

Zbierz zarodki w określonych punktach czasowych (48 hpf, 72 hpf) i w razie potrzeby dokonaj dechorionatu za pomocą enzymu Pronase.
Żółtko zarodków należy usunąć z filtra witellogeniny przy użyciu wcześniej znanej metodologii¹⁹.
UWAGA: Witellogenina jest fosfolipo-glikoproteiną, która służy jako źródło składników odżywczych dla rosnącego zarodka. Elektroforeza żelowa 2D o wysokiej rozdzielczości i znacznie ulepszone western blot są możliwe dzięki odżółkowywaniu zarodków i usunięciu witellogeniny.
Wykonaj western blotting zgodnie z wcześniejszym opisem²⁰.

5. Ocena struktury i funkcji serca:

Obrazowanie na żywo danio pręgowanego: Obrazowanie komory
UWAGA: Kilka parametrów funkcji serca/hemodynamiki można obliczyć, wizualizując bijące serce danio pręgowanego embryo²¹^,²². Parametry te obejmują rzut serca (CO), frakcję wyrzutową (EF), objętość wyrzutową (SV), skrócenie frakcyjne (FS) i frakcyjną zmianę obszaru (FAC) (zobacz poprzednie prace zawierające szczegółowe protokoły oceny funkcji serca dla zarodków danio pręgowanego²²^,²³). Poniższe kroki pokrótce wyjaśniają, jak obliczyć te parametry dla zarodków danio pręgowanego przy ~3 dpf, etapie, w którym skóra tych organizmów jest przezroczysta, co umożliwia wizualizację za pomocą mikroskopii jasnego pola.
1. Umieść kroplę 3% roztworu metylocelulozy (RT) na szkiełku do obrazowania we wlepce.
2. Umieść zarodek danio pręgowanego w studzience za pomocą odpowiedniego plastikowego zakraplacza (Rysunek 2A, B)
  UWAGA: Przepełnienie studni może spowodować przemieszczenie ryb ze studni.
3. Delikatnie wymieszaj 3% kroplę metylocelulozy z pożywką E3, aby ustabilizować wykluty zarodek.
  UWAGA: Aby przygotować 3% roztwór metylocelulozy, rozpuść 3 g proszku metylocelulozy w 100 ml PBS lub innym podłożu montażowym w kolbie. Umieścić magnes mieszający w kolbie mieszaniny i umieścić kolbę na magnetycznej płytce mieszającej. Ustaw prędkość na "niską" i utrzymuj ją na poziomie 4 °C przez ~1 dzień, aby rozpuścić wszystkie grudki. Po całkowitym rozpuszczeniu metylocelulozy rozformować porcję do małych probówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Ustaw rybę po lewej stronie, prawą stroną skierowaną do góry i skierowaną przednią skierowaną w lewo, aby ułatwić jednoznaczne obrazowanie komory (Rysunek 2C).
5. Pod mikroskopem powiększ serce zarodka w 100-krotnym powiększeniu i rozpocznij nagrywanie przez ~5 s. Upewnij się, że granice komór znajdują się wewnątrz okna obrazowania (Rysunek 2D).
6. Nagrywaj filmy poklatkowe za pomocą szybkiej kamery i mikroskopu stereoskopowego z prędkością około 100 klatek na sekundę (kl./s) całego zarodka (Ryc. 2C), bijąc komorę (Rycina 2D) i poruszające się czerwone krwinki (RBC) w głównych naczyniach, takich jak aorta grzbietowa lub tylna żyła kardynalna (Rycina 2E), w celu analizy funkcji serca.
7. Zapisz film w formacie AVI lub w formacie sekwencji obrazów TIFF (lub JPEG).
Obliczanie tętna
1. Oblicz czas potrzebny na nagranie dwóch kolejnych klatek. Dla 100 kl./s odstęp czasu jest równy 0,01 s.
2. Wybierz znany punkt z dowolnego zarejestrowanego cyklu pracy serca (tj. koniec rozkurczu lub skurcz końcowy). Oblicz liczbę klatek potrzebnych do powtórzenia cyklu.
3. Pomnóż przedział czasu z kroku 5.2.1 przez liczbę klatek z kroku 5.2.2. Wynikiem jest czas trwania (w sekundach) dla jednego uderzenia serca.
4. Aby obliczyć uderzenia na minutę, podziel 60 przez liczbę uzyskaną w poprzednim kroku. W przypadku normalnych zarodków o ciśnieniu 3 dpf powinno to być około 150 uderzeń na minutę (2,5 Hz).
  UWAGA: Wiele aplikacji może automatycznie obliczać tętno na podstawie nagrań bicia serca, takich jak ViewPoint²⁴ i DanioVision²⁵.
5. Przeanalizuj strukturę serca za pomocą nagranego filmu poklatkowego z prędkością około 100 kl./s, aby sprawdzić całe serce w celu wykrycia obrzęku serca lub innej wady strukturalnej.
  UWAGA: Rysunek 3A pokazuje normalne serce zarodka o wartości 3 dpf, a Rysunek 3B pokazuje serce o napięciu 3 dpf z obrzękiem serca i wadą pętli serca (wydłużona komora).
Oblicz ułamkową zmianę obszaru (FAC):
UWAGA: Frakcyjna zmiana obszaru (FAC) jest parametrem używanym do porównywania obszarów końca rozkurczu komory i końca skurczu w celu oceny kurczliwości komory.
1. Użyj nagrania filmu poklatkowego z szybkością około 100 kl./s, aby określić klatki reprezentujące jeden cykl pracy serca. Wyodrębnij klatki, które pokazują koniec skurczu końcowego i rozkurczu końcowego.
2. Oblicz zarówno obszar końca rozkurczu (EDA), jak i obszar końca skurczu (ESA) za pomocą ImageJ lub podobnego oprogramowania do analizy obrazu.
3. Użyj następującego wzoru, aby obliczyć FAC²²^,²⁶^,²⁷:
  FAC
Obliczać skrócenie ułamkowe (FS):
UWAGA: Skrócenie frakcyjne (FS) to kolejny parametr używany do oceny kurczliwości komory; Aby określić FS, należy zmierzyć średnicę końcoworozkurczową i końcowoskurczową komór²¹.
1. Powtórz krok 5.3.1
2. Użyj ImageJ lub innego równoważnego programu do analizy obrazu, aby zmierzyć średnice ścian komór w punktach końca skurczu D_d i końca skurczu D_. W większości przypadków do wyznaczenia gładkości ułamkowej (FS) stosuje się średnice krótkich osi (Rysunek 4).
3. Użyj następującego wzoru, aby obliczyć klasę FS²²^,²⁷:
  FS
Obliczanie objętości wyrzutowej (SV):
UWAGA: Dla każdego uderzenia serca SV to ilość krwi pompowanej z komory, którą można łatwo obliczyć na podstawie objętości końcowo-rozkurczowej i końcowej skurczowej komór²⁸.
1. Powtórz kroki 5.3.1 i 5.3.2
2. Zmierz średnicę rozkurczu końcowego (_DL) i skurczu końcowego (DS), jak pokazano na rysunku Rysunek 4.
  UWAGA: Zakładając, że komory serc danio pręgowanego mają kształt prolate sferoidalny²¹^,²², objętość komór oblicza się według następującego wzoru.
  Tom
  SV można obliczyć zgodnie z poniższą formułą²⁷. Normalny zakres SV wynosi 0,15-0,3 nL dla 2-6 dpf embryos²⁹. W tym przypadku EDV to wolumin końcowo-rozkurczowy, a ESV to wolumin końcowo-skurczowy.
  SV = (EDV - ESV)
Obliczyć frakcję wyrzutową (EF):
UWAGA: EF definiuje się jako frakcję krwi wyrzucaną z komory przy każdym uderzeniu serca²⁸.
1. Z powyższych wzorów wyekstrahuj EDV i ESV dla ryb.
2. Oblicz EF w następujący sposób²²^,²⁷:
  EF (%)
Obliczać rzut serca (CO):
UWAGA: CO to objętość krwi pompowanej przez serce²⁸. CO ma wartość 10-55 nL/min dla zarodków 2-6 dpf ²⁹.
1. Obliczyć SV i HR, jak wspomniano w poprzednich podsekcjach 5.5 i 5.2.
2. Użyj poniższego wzoru, aby obliczyć CO²²^,²⁷:
  CO (nL/min) = SV (nL/uderzenie) x HR (uderzenia/min).
Zmierz prędkości RBC:
UWAGA: Określenie prędkości komórek ma kluczowe znaczenie dla oceny natężenia przepływu, średnicy naczynia i obliczenia naprężenia ścinającego wywieranego na komórki śródbłonka naczynia (tj. Z drugiej strony naprężenie ścinające to siła tarcia wywierana na komórki śródbłonka przez poruszającą się krew). W przypadku zarodków o zawartości 2-5 dpf średnia prędkość czerwonych krwinek (RBC) wynosi około 300-750 μm/s²⁹. Aby zmierzyć prędkości erytrocytów:
1. Pod mikroskopem powiększ ogon zwierzęcia w powiększeniu 100x. Ruch RBC powinien być widoczny w tym powiększeniu (Rysunek 5A, B).
2. Rozpocznij nagrywanie przez około 8 sekund. Upewnij się, że aorta grzbietowa (DA) i tylna żyła kardynalna (PCV), dwie najważniejsze tętnice osiowe, znajdują się 100-120 kl./s wewnątrz okna obrazowania. Śledź poszczególne komórki z sekwencyjnych klatek (Rysunek 5A, B).
3. Wyodrębnij kilka klatek za pomocą ImageJ lub innego podobnego oprogramowania do analizy obrazu.
4. Oblicz różnicę w odległości, na jaką porusza się pojedynczy RBC (Δx).
5. Określ różnicę w czasie między kolejnymi klatkami (Δt).
6. Użyj następującego wzoru dla prędkości RBC²²^,²⁷:
  Prędkość RBC (μm/s)
  UWAGA: Maksymalną i średnią prędkość można wyodrębnić z powtórzeń kolejnych klatek dla poszczególnych komórek²¹. Prędkość krwinek czerwonych reprezentuje również prędkość przepływu krwi. Alternatywnie, różne dostępne na rynku aplikacje mogą być używane do automatycznego pomiaru prędkości RBC. ViewPoint²⁴, jak również DanioVision²⁵, mają takie aplikacje (Rysunek 5C). Ponadto dostępnych jest kilka wtyczek z ImageJ, takich jak TrackMate³⁰ i MTrackJ³¹, kompatybilne z filmami nagrywanymi powyżej 100 kl./s.
Obliczanie naprężenia ścinającego na podstawie zmierzonych prędkości ogniw
Zmierzone prędkości RBC w naczyniach krwionośnych również reprezentują prędkości przepływu krwi (Rysunek 5C). Na podstawie tych pomiarów oblicz naprężenie ścinające τ w interesującym naczyniu w następujący sposób, przyjmując założenie przepływu Poiseuille'a²²^,²⁷:

Gdzie V to średnia prędkość krwi (μm/s), μ to lepkość krwi (dyny/cm²), a D to średnica naczynia (μm). Dla zarodków 3 dpf naprężenie ścinające w klasie DA²²^,< sup class = "xref" > 26 ^< klasa sup = "xref">27 wynosi około 4 dyn / cm².

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykres w Rysunek 6 ilustruje średni procent zarodków przeżywających przy 24, 48 i 72 hpf zarówno dla MO specyficznych dla HAND2, jak i dla kontrolnych zarodków wstrzykniętych MO. Zarodki, którym wstrzyknięto 1 mM (8 ng/μL) i 0,8 mM (6,4 ng/μL), którym wstrzyknięto MO, wykazały znaczne zmniejszenie procentu przeżycia w porównaniu z zarodkami kontrolnymi, którym wstrzyknięto MO. Zaobserwowano to w każdym zmierzonym punkcie czasowym, w którym zaobserwowano śmiertelność lub wadę rozwojową. Wyniki wskazał...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia Morpholino (MO) jest szeroko stosowana u danio pręgowanego, ksenopusa, jeżowców, a ostatnio w systemach modelowania hodowli komórkowych. W przypadku większości metod, wraz z korzyściami, istnieją również pułapki, których eksperymentator powinien być świadomy. Jedną z głównych pułapek związanych z technologią MO jest obawa, że efekty fenotypowe obserwowane przez podejście knockdown genów za pośrednictwem MO nie są spowodowane utratą funkcji związanej z produktem genu pierwotnego, ale że niektóre inne geny wraz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają interesów finansowych ani nie występują w innych konfliktach interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Publikacja tego artykułu została wsparta hojnym wsparciem ze strony BARZAN HOLDINGS. RR jest częściowo wspierany przez R61HL154254 i fundusze z Oddziału Pediatrii i Szpitala Dziecięcego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Akrylamid 40%	Sigma	Sigma, nr kat. C977M88
Agaroza	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich nr kat. A9539-250G
All Prep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	Qiagen nr kat. 80204.
alfa tubulina	Abcam	Abcam- ab4074	Królik poliklonalny do alfa Tubulina partia GR3 180877-1 (50 kDa)
Nadsiarczan amonu klasy molekularnej	Sigma	Sigma, nr kat. C991U65
Ukosowarka kapilarna BV10	Produkt Sutter Instruments	Katalog produktów # BV10
Gen obrazowania chemiluminescencji Gnom	SYNGENE	SYNGENE
Tasak Naukowy CVS10D_OmniPAGEMini do Blottingu		CVS10D_OmniPAGEMini
Coomassie	Thermo Fisher	Thermo Fisher nr kat. C861C44
Zestaw do elektrochemiluminescencji (ECL)	Abcam Biochemicals Abcam	Biochemicals nr kat. ab65623
Glycine	Sigma	Sigma, nr kat. C988U91
Koza anty Królik	Abcam	Abcam- ab6721	Kozia IgG Przeciw Królikom H& L (HRP) Przeciwciała 2^nd partia GR3179871-1
HAND2	Narzędzia genowe	Wykonane na zamówienie dla HAND2 (NM_021973)	5'-CCTCCAACTAAACTCATGGCGAC AG-3'Hand2
	Abcam	Abcam- ab10131	Królicze poliklonalne przeciwciało anty-HAND2 partia GR143200-9 (24-26 kDa)
HAND2 (NM_021973) Człowiek Tagged Klon ORF	OriGene Technologies, Inc	RC224436L3	Wektor: pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro (PS100092)
IBI DNA/RNA/Zestaw do ekstrakcji białek	IBI Scientific IBI Scientific	nr kat. -r IB47702
System obrazowania	iBright	iBright CL1000 System
Isopropanol	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich nr kat. 278475-2L
Bufor do ładowania próbek Laemmli (4x)	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich nr kat. 70607
Merkaptoetanol	Sigma	Sigma, nr kat. M6250-1L
Spektrofotometr mikropłytkowy z interfejsem oprogramowania do analizy danych Gen5	Mikroskop
	Ziess SteREO Lumar V12 Mikroskop fluorescencyjny Ziess SteREO Lumar V12	Mikroskop
mineralny	Fisher	Scientific Fisher Scientific nr kat. 0121-1
mMESSAGE mMACHINE T7/T3/SP6 Zestaw do transkrypcji	Thermo Fisher	Thermo Fisher nr kat. AM1340	do wytwarzania mRNA
Woda wolna od nukleaz	New England Biolabs	New England Biolabs nr kat. B1500L
PC-100 Ściągacz do mikropipet	NARISHIGE GROUP Produkt	NARISHIGE GROUP Katalog produktów # PC-100
Czerwień fenolowa	Sigma Sigma	, nr kat. P-0290
Wtryskiwacz pikolinowy	Aparatura Harvarda Katalog	aparatury Harvard # PLI-90A
Test kwasu bicynchoninowego Pierce'a (BCA) Zestaw do oznaczania białek	Thermo	Fisher Thermo Fisher nr kat. 23227
PMSF, Inhibitor proteazy jako inhibitor proteazy	Thermo	Fisher Thermo Fisher nr kat. 36978
Ponceau S	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich nr kat. 10165921001
Koktajl inhibitorów proteazy	Thermo Fisher	Thermo Fisher nr kat. 88668
Drabinka białkowa	SMOBiO	SMOBiO nr kat. PM2500
Test radioimmunoprecypitacyjny (RIPA)	Thermo Fisher	Thermo Fisher nr kat. 89900
Ringer' s roztwór	Thermofisher	Nr katalogowy S25513
SDS	Sigma	Sigma, nr kat. 436143
Standardowe	narzędzia Genowe	do kontroli SKU: PCO-StandardControl-100	5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTAT A-3'- który jest ukierunkowany na ludzką mutację intronu beta-globiny
Bufor strippingowy	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich kat. 21059
Temed	IBI naukowy	IBI nr kat. C000A52
Tris Base	Thermo Fisher	Thermo Fisher nr kat. BP-152-500
Tween	sigma nauki przyrodnicze	sigma nauki przyrodnicze nr kat. P2287
Komora systemu Zebra Box Revolution-Danio Track z oprogramowaniem EthoVision XT 11.5	Noldus Information Technology, NL	Noldus Information Technology, NL
Zeiss Axiocam ERc 5s	Zeiss	Stemi 508 Zeiss
Zeiss Stemi 2000-C	Zeiss	Stemi 2000-C

obrazowania epokowy fluorescencyjny Olej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
Stainier, D. Y., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), 1007000(2017).
Zhou, B., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
Eve, A. M., Place, E. S., Smith, J. C. Comparison of Zebrafish tmem88a mutant and morpholino knockdown phenotypes. PLoS One. 12 (2), 0172227(2017).
Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Developmental Biology. 331 (2), 237-249 (2009).
Chen, Z., et al. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovascular Research. 79 (1), 97-108 (2008).
Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).
Reichenbach, B., et al. Endoderm-derived Sonic hedgehog and mesoderm Hand2 expression are required for enteric nervous system development in zebrafish. Developmental Biology. 318 (1), 52-64 (2008).
Maves, L., Tyler, A., Moens, C. B., Tapscott, S. J. J. Pbx acts with Hand2 in early myocardial differentiation. Developmental Biology. 333 (2), 409-418 (2009).
Hinits, Y., et al. Zebrafish Mef2ca and Mef2cb are essential for both first and second heart field cardiomyocyte differentiation. Developmental Biology. 369 (2), 199-210 (2012).
Gene Tools, custom-sequence Morpholinos. , Available from: https://oligodesign.gene-tools.com/ (2011).
hand2 heart and neural crest derivatives expressed 2 [ Danio rerio (zebrafish). , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/58150 (2021).
Danio rerio heart and neural crest derivatives expressed 2 (hand2), mRNA. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_131626.3 (2021).
NCBI reference sequence -Danio rerio heart and neural crest derivatives expressed 2 (hand2), mRNA FASTA. , hand2), mRNA FASTA at (2021). Prepared control oligos at (2021).
Prepared control oligos. , Available from: https://store.gene-tools.com/prepared-control-oligos (2021).
Schubert, S., Keddig, N., Hanel, R., Kammann, U. Microinjection into zebrafish embryos (Danio rerio)-a useful tool in aquatic toxicity testing. Environmental Sciences Europe. 26 (1), 32(2014).
Moulton, J. D. Guide for morpholino users: toward therapeutics. Journal of Drug Discovery, Development, and Delivery. 3 (2), 1023(2016).
Link, V., Shevchenko, A., Heisenberg, C. -P. Proteomics of early zebrafish embryos. BMC Developmental Biology. 6 (1), 1(2006).
Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).
Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiological Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
Yalcin, H. C., Amindari, A., Butcher, J. T., Althani, A., Yacoub, M. Heart function and hemodynamic analysis for zebrafish embryos. Developmental Dynamics: An Officical Publication of the American Association of Anatomists. 246 (11), 868-880 (2017).
Zakaria, Z. Z., et al. Using zebrafish for investigating the molecular mechanisms of drug-induced cardiotoxicity. Biomed Research International. 2018, 1642684(2018).
Parker, T., et al. A multi-endpoint in vivo larval zebrafish (Danio rerio) model for the assessment of integrated cardiovascular function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (1), 30-38 (2014).
Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), 0151148(2016).
Salman, H. E., Yalcin, H. C. Advanced blood flow assessment in Zebrafish via experimental digital particle image velocimetry and computational fluid dynamics modeling. Micron. 130, 102801(2020).
Benslimane, F. M., et al. Cardiac function and blood flow hemodynamics assessment of zebrafish (Danio rerio) using high-speed video microscopy. Micron. 136, 102876(2020).
DeGroff, C. G. Doppler echocardiography. Pediatric Cardiology. 23 (3), 307-333 (2002).
Bagatto, B., Burggren, W. A three-dimensional functional assessment of heart and vessel development in the larva of the zebrafish (Danio rerio). Physiological and Biochemical Zoology. 79 (1), 194-201 (2005).
Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods (San Diego, Calif.). 115, 80-90 (2017).
Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. 32 (1), 97-108 (2015).
Sumanas, S. Inducible inhibition of gene function with photomorpholinos. Methods in Molecular Biology. 1565, Clifton, N.J. 51-57 (2017).
Kyritsi, K., et al. Knockdown of hepatic gonadotropin-releasing hormone by vivo-morpholino decreases liver fibrosis in multidrug resistance gene 2 knockout mice by down-regulation of miR-200b. The American Journal of Pathology. 187 (7), 1551-1565 (2017).
Flynt, A. S., Rao, M., Patton, J. G. Blocking zebrafish microRNAs with morpholinos. Methods in Molecular Biology. 1565, Clifton, N.J. 59-78 (2017).
Schoenebeck, J. J., Keegan, B. R., Yelon, D. Vessel and blood specification override cardiac potential in anterior mesoderm. Developmental Cell. 13 (2), 254-267 (2007).
Lu, F., Langenbacher, A., Chen, J. -N. Transcriptional regulation of heart development in zebrafish. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (2), 14(2016).
Laurent, F., et al. HAND2 target gene regulatory networks control atrioventricular canal and cardiac valve development. Cell Reports. 19 (8), 1602-1613 (2017).
Miura, G. I., Yelon, D. A guide to analysis of cardiac phenotypes in the zebrafish embryo. Methods in Cell Biology. 101, 161-180 (2011).
De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oligonukleotydy Morpholino wyciszanie gen w technika mikroiniekcji iniekcja mRNA blokowanie translacji analiza fenotypowa analiza funkcji serca Western blot

Projektowanie i mikroiniekcja oligonukleotydów antysensownych morpholino i mRNA do zarodków danio pręgowanego w celu wyjaśnienia specyficznej funkcji genów w rozwoju serca

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły