Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Projektowanie i mikroiniekcja oligonukleotydów antysensownych morpholino i mRNA do zarodków danio pręgowanego w celu wyjaśnienia specyficznej funkcji genów w rozwoju serca

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63324

⸱

9 sierpnia 2022

 ,  ,  ,  , 
1Biomedical Research Center, Qatar University, Doha, Qatar, 2Department of Biological and Environmental Sciences, College of Arts and Science, Qatar University, Doha, Qatar, 3Department of Cell Biology, Neurobiology and Anatomy, Medical College of Wisconsin, 4Department of Pediatrics, Medical College of Wisconsin

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje projektowanie, przygotowanie i mikrowstrzykiwanie blokującego translację morfolinu przeciwko reprezentatywnemu genowi sercowemu; Pochodne serca i grzebienia nerwowego wyrażone2 (ręka2) w żółtku nowo zapłodnionych zarodków danio pręgowanego w celu obniżenia funkcji genu. Pokazuje również przejściowe uratowanie tych "morfantów" poprzez jednoczesne wstrzyknięcie mRNA kodującego ten produkt genu.

Streszczenie

System knockdown oparty na oligomerach morpholino został wykorzystany do identyfikacji funkcji różnych produktów genowych poprzez utratę lub zmniejszenie ekspresji. Morfolinosy (MO) mają przewagę pod względem stabilności biologicznej nad oligonukleukleetami DNA, ponieważ nie są podatne na degradację enzymatyczną. Aby uzyskać optymalną skuteczność, MO są wstrzykiwane do zarodków w stadium 1-4 komórek. Czasowa skuteczność knockdownu jest zmienna, ale uważa się, że MO ostatecznie tracą swoje działanie z powodu rozcieńczenia. Rozcieńczenie morfolina i ilość wstrzykniętego leku powinny być ściśle kontrolowane, aby zminimalizować występowanie efektów niepożądanych przy jednoczesnym zachowaniu skuteczności w miejscu docelowym. Dodatkowe narzędzia uzupełniające, takie jak CRISPR/Cas9, powinny być wykonywane na docelowym genie będącym przedmiotem zainteresowania, aby wygenerować zmutowane linie i potwierdzić fenotyp morfu za pomocą tych linii. W tym artykule pokażemy, jak zaprojektować, przygotować i mikrowstrzyknąć blokującą translację morfolinę przeciwko ręce2 do żółtka zarodków danio pręgowanego w stadium 1-4 komórek, aby zniszczyć funkcję ręki2 i uratować te "morfanty" poprzez jednoczesne wstrzyknięcie mRNA kodującego odpowiednie cDNA. Następnie ocenia się skuteczność mikroiniekcji morfoliny, najpierw sprawdzając obecność morfoliny w żółtku (wstrzykiwanym jednocześnie z czerwienią fenolową), a następnie przeprowadzając analizę fenotypową. Ponadto omówiona zostanie analiza czynnościowa serca w celu sprawdzenia skuteczności knockdownu. Na koniec wyjaśniona zostanie ocena wpływu indukowanej przez morfolino blokady translacji genów poprzez western blotting.

Wprowadzenie

Wykorzystanie danio pręgowanego jako modelu do badania rozwoju i chorób układu krążenia oferuje wiele korzyści, w tym wysoką ochronę funkcji genów, przejrzystość optyczną, szybki rozwój układu sercowo-naczyniowego i niższe koszty w porównaniu z tradycyjnymi modelami in vivo1. Oligonukleotydy morfolino (MO) są najczęściej stosowanymi narzędziami do knockdown genów antysensownych w modelu danio pręgowanego. MO są często używane do określania fenotypu lub do badania funkcji genów. Dr James Summerton początkowo opracował system dostarczania morfolino do hamowania in vivo translacji mRNA jako próbę opracowania terapii dla wad rozwojowych u ludzi2,3. MO zostały wykorzystane w organizmach modelowych in vitro i in vivo do knockknocku genów i zbadania konsekwencji tego knockdownu dla fenotypu. Odbywa się to poprzez obserwację zmian w rozwoju określonych narządów, na przykład serca. Knockdown genów specyficznych dla serca w zarodkach zebry zebry WT doprowadził do nieprawidłowego bicia serca, co świadczy o nieodzownej funkcji tych genów dla rozwoju serca4,5. Te fenotypy zostały uratowane przez jednoczesne wstrzyknięcie mRNA dla określonych genów. Badanie z udziałem troponiny sercowej T (Tnnt2) wykazało, że ekspresja mRNA tnnt2 o pełnej długości może uratować fenotypy sarkomeryczne spowodowane przez knockdown6. Inne badanie wykazało, że integralność pasm A i dysków Z może zostać przywrócona przez nadekspresję mRNA regulatorowego ortologu łańcucha lekkiego miozyny (cmlc2) w morfantach cmcl2 7.

MOs są powszechnie używane do obniżania ekspresji genów poprzez celowanie w splicing pre-mRNA lub poprzez blokowanie translacji. MO blokujące splicing wiążą i hamują pre-mRNA poprzez hamowanie splicesomu. Blokowanie translacyjne występuje, gdy MO wiąże się z nieulegającym translacji regionem 5' komplementarnego mRNA, aby utrudnić składanie rybosomów. MO są najpowszechniej stosowaną metodą specyficzną dla genu do obniżania ekspresji genów w modelach in vivo; są również najskuteczniejszymi środkami blokującymi mRNA stosowanymi w hodowlach komórkowych. Sam morfolino zazwyczaj składa się z krótkiego łańcucha (około 25) zasad podjednostek morfolino. Każda podjednostka MO zawiera zasadę kwasu nukleinowego, pierścień morfolinowy i niejonowy fosforodiamidan. Różne mechanizmy działania tych dwóch typów MO wymagają różnych testów w celu sprawdzenia skuteczności knockdownu. W przypadku MO blokujących translację, analiza western blot jest najbardziej wiarygodnym testem skuteczności, ponieważ białko będące przedmiotem zainteresowania nie powinno być wytwarzane z powodu zablokowania miejsca rozpoczęcia translacji ATG. MO nie degradują bezpośrednio swojego docelowego mRNA; Zamiast tego wiążą się z określonymi regionami i hamują ekspresję, dopóki nie ulegną naturalnej degradacji. Jednak MO blokujące splice modyfikują pre-mRNA poprzez indukowanie modyfikacji splicingu, którą można oznaczyć za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR) i elektroforezy żelowej.

Trzy kluczowe elementy procesu przesiewowego MOs muszą być ustandaryzowane: (i) Krzywa dawki MO musi być dostosowana do rozpoznawania fenotypów. Krzywa dawki pokazuje również dawkę śmiertelną 50 (LD50: dawka, przy której umiera 50% wstrzykniętych zarodków) dla każdego badanego MO w celu poprawy zdolności do optymalizacji "sygnału" fenotypowego w porównaniu z "szumem" poza celem3. (ii) nomenklatura fenotypowania, która została dostosowana, powinna być dobrze udokumentowana; Precyzyjny i łatwy do zrozumienia opis fenotypowy ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia obszernych wyjaśnień opartych na istniejącej literaturze i doświadczeniu badaczy, aby ułatwić wymianę informacji między osobami, które nie badały bezpośrednio zarodków. (iii) Posiadanie dobrze zdefiniowanego języka ułatwia centralne zbieranie danych z bazy danych Morpholino8.

W badaniach nad nokautem MO dla genów sercowych, aktywność serca zwierząt i dynamika przepływu krwi muszą być monitorowane w celu określenia wpływu eksperymentów z nokautem MO na funkcjonowanie układu sercowo-naczyniowego. Takie analizy wymagają wizualizacji układu sercowo-naczyniowego w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości. Skóra danio pręgowanego jest przezroczysta przez pierwszy tydzień rozwoju, co umożliwia wizualizację krążenia serca i krwi za pomocą mikroskopii. Do oceny czynności serca najczęściej obliczanymi parametrami fizjologicznymi są tętno i pojemność minutowa serca, a także skrócenie frakcyjne, ułamkowa zmiana obszaru i frakcja wyrzutowa. Prędkości przepływu krwi można mierzyć, śledząc poruszające się erytrocyty, a pomiary te służą do określania poziomów naprężeń ścinających, kluczowego czynnika mechanobiologicznego na komórkach śródbłonka. Taka ocena wymaga nagrywania filmów poklatkowych dla bijącego serca i przepływającej krwi za pomocą mikroskopu odwróconego lub stereoskopowego wyposażonego w szybką kamerę.

Ten artykuł pokazuje, jak zaprojektować, przygotować i wprowadzić do żółtka świeżo zapłodnionych zarodków danio pręgowanego blokującego translację morfolina przeciwko interesującemu genowi, aby osłabić funkcję genu. Pokaże również ratowanie tych "morfantów" poprzez jednoczesne wstrzyknięcie mRNA kodującego ten gen. Następnie przeanalizujemy skuteczność mikroiniekcji morfolino poprzez charakterystykę fenotypową, a także analizy strukturalne i funkcjonalne serca. Podejście to zostanie zademonstrowane na szeroko badanym genie sercowym, ręce2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z przyjętymi standardami humanitarnego traktowania zwierząt pod nadzorem IACUC na QU; zwierzęta przetrzymywano w zapleczu dla danio-prążkowanych w ramach Centrum Badań Biomedycznych Uniwersytetu w Katarze (QU-BRC). Wszystkie zwierzęta wykorzystane w tych badaniach eksperymentalnych miały mniej niż 3 dni od zapłodnienia (dpf).

UWAGA: Dla każdej grupy doświadczalnej zaleca się użycie co najmniej 30 embrionów w celu zapewnienia rygoru statystycznego. Grupy doświadczalne są następujące:

Grupa kontrolna: Grupa ta obejmuje embriony hodowane w wodzie z jaj wraz z brakiem wstrzyknięć. Otrzymane tutaj wyniki będą stanowić linię bazową kontrolną.

Grupa kontrolna negatywna: Grupa ta obejmuje embriony hodowane w wodzie z jaj, którym wstrzyknięto zmodyfikowane losowo (scrambled) MO.

Grupa wstrzyknięta: Grupa ta obejmuje embriony, którym wstrzyknięto sam MO hand2 oraz MO hand2 wraz z mRNA hand2 w celu odwrócenia fenotypu. Uzyskane wyniki potwierdzą, że zaobserwowane fenotypy pojawiły się w wyniku wstrzyknięcia MO. Porównanie grup eksperymentalnych umożliwi precyzyjną ocenę wpływu inhibicji i ratowania hand2 na funkcję serca.

1. Projekty morfolino dla hand2.

UWAGA: sekwencje MO można dostosować na podstawie literatury9,10,11. Alternatywnie oligonukleotydy te mogą zostać zaprojektowane online przez Gene-tools. Gene-tools oferuje bezpłatną i szybką usługę projektowania online, dostępną za pośrednictwem ich strony internetowej12. Niestandardowe MO można łatwo zaprojektować, podając informacje o interesujących genach, takie jak informacje o sekwencji lub numery dostępowe. Poniższe konkretne kroki podsumowują sposób projektowania MO przeciwko hand2 u danio pręgowanego:

  1. W pierwszej kolejności należy wyszukać szczegółowe informacje dotyczące badanego genu w bazie danych NCBI. Dla hand2, u danio pręgowanego13.
  2. Pobieranie identyfikatora transkryptu mRNA z bazy GenBank w serwisie NCBI14.
  3. Pobierz sekwencję mRNA z bazy NCBI15.
    UWAGA: Antysensowne oligonukleotydy modyfikowane morfolinowo (MO) dla ryb zebrafish hand2 geny są dostępne i zostały opublikowane wcześniej. hand2 sekwencja MO9,10,11: 5'-CCTCCAACTAAACTCATGGCGACAG-3', MO sekwencje użyte w badaniu wymieniono w Tabela materiałów.
  4. Należy pozyskać kontrolę negatywną w postaci niedopasowanego (mismatched) lub przemieszanego (scrambled) MO (sekwencje podobne z losowymi zmianami par zasad) z firmy Gene Tools.16 do wstrzyknięcia. Pomogłoby to potwierdzić specyficzność fenotypu (lub fenotypów) obserwowanych po wstrzyknięciach konkretnych MO i zminimalizować ryzyko, że zaobserwowane efekty są artefaktem procedury wstrzykiwania.

2. Przygotowanie do iniekcji morfolino

  1. Przygotowanie roztworów zapasowych
    1. Rozpuścić zapasy MO w ddH2O; pirokarbonian diethylu (DEPC) może uszkodzić MO i być toksyczny dla embrionów. Należy zatem używać ddH2O wolnego od DEPC. Po zamówieniu MO są dostarczane w fiolce o stężeniu 300 nM.
      UWAGA: Chociaż firma Gene Tools zaleca roztwory zapasowe o stężeniu 1 mM (~8 ng/nL), może być ono zbyt niskie, zwłaszcza jeśli morpholino wymaga wysokiej dawki lub jest mieszane z innymi MO. Dlatego idealne jest przygotowanie roztworów zapasowych MO o różnych stężeniach (2 lub 3 mM).
    2. Przygotować 0,2 mM roztwór roboczy poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego (np. dla zapasu 2 mM rozcieńczenie 1:10). Przygotować 10 µL roztworu roboczego, dodając roztwór Danieauxa (7 µL), morpholino z zapasu (1 µL) oraz czerwieni fenolowej (2 µL z roztworu 10x). Czerwień fenolowa nadaje roztworowi ciemnoczerwony kolor, co ułatwia śledzenie wstrzykniętego materiału w embrionie.
    3. Przechowywać MO w temperaturze pokojowej (RT) w szczelnych pojemnikach, aby zapobiec odparowaniu. Nie przechowywać MO na lodzie na blacie, ponieważ roztwór może ulec wytrąceniu. Najodpowiedniejsze jest obchodzenie się z nimi w temperaturze RT.
      UWAGA: Gene Tools zaleca jedną z dwóch metod przechowywania MO: roztwór roboczy można przechowywać w -20 °C (przez wiele miesięcy lub lat) lub w temperaturze RT w szczelnej probówce do długoterminowego przechowywania. W przypadku przechowywania w -20 °C, przed użyciem należy ogrzać roztwór oligonukleotydów w 65 °C przez 10 min i wymieszać w wortexie, aby całkowicie rozpuścić morpholino (nie ma potrzeby ogrzewania, jeśli przechowywano w temperaturze RT).
  2. Transkrypcja mRNA in vitro
    UWAGA: Transkrypcja in vitro została wykorzystana do wygenerowania mRNA Hand2 z plazmidu HAND2 (NM_021973) Human Tagged ORF Clone w celu mikroiniekcji do embrionów zebrafish w celu odwrócenia fenotypu wynikającego z wyciszenia genu zebrafish hand2 za pomocą morpholino; szczegóły plazmidu użytego w badaniu znajdują się w Tabeli Materiałów.
    1. Zlinearyzować DNA plazmidowe za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego i oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania DNA (Tabela Materiałów). Oczyszczone zlinearyzowane DNA należy wykorzystać jako matrycę do transkrypcji in vitro w celu wygenerowania mRNA do iniekcji zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela Materiałów).
    2. Na koniec wstrzyknąć 250 pg ludzkiego mRNA dla genu zainteresowania, aby przeprowadzić rescue fenotypu i sprawdzić, czy brak fenotypu rzeczywiście wynika z utraty genu zebrafish przez MO.
  3. Przygotowanie do iniekcji
    1. Wytworzyć igłę za pomocą wyciągacza mikrokapilar (Tabela Materiałów), postępując zgodnie z krokami 2.3.2-2.3.6.
    2. Użyć kapilar o średnicy 1 mm z włóknami oraz wyciągacza mikrokapilar. Włączyć urządzenie i otworzyć pokrywę.
    3. Przekręcić pokrętło wyboru trybu na grzałkę NO.2. Używając grzałki NO.2, dostosować pokrętło tak, aby osiągnąć temperaturę 65 °C.
    4. Przekręcić pokrętło wyboru trybu z powrotem do pozycji Krok 1. Użyć czterech obciążników (2 typu Light / 2 typu Heavy).
    5. Umieścić kapilarę w uchwycie i zamknąć pokrywę. Nacisnąć przycisk Start , aby otrzymać wyciągniętą igłę.
      UWAGA: Pozwoli to na uzyskanie igieł kapilarnych z długim zwężeniem.
    6. Krótko odciąć końcówki igieł za pomocą pęsety. Zaostrzyć końcówkę wyciągniętej igły, aby ułatwić penetrację embrionów zebrafish, używając ściinacza kapilar przez około 30 s, co pozwoli uzyskać końcówki o średnicy około 15-25 µm.
    7. Zkalibrować igłę, aby oszacować ilość iniekcji, postępując zgodnie z krokami 2.3.8-2.3.13.
    8. Krótko wymieszać roztwór mRNA/morpholino przed wprowadzeniem go do igły, aby rozpuścić cząsteczki, które mogłyby całkowicie zapchać igłę.
    9. Dodać ~3-4 µL roztworu MO do tylnej części igły iniekcyjnej za pomocą końcówki pipety o mikrośrednicy. Igły iniekcyjne są wyposażone w mały rowek ułatwiający tylne napełnianie kapilary.
    10. Upewnić się, że w igle iniekcyjnej nie ma pęcherzyków powietrza. Zamontować igłę w mikroinjektorze.
    11. Sprawdzić, czy końcówka igły nie jest zapchana i czy roztwór MO może wypływać z igły po naciśnięciu pedału iniekcyjnego.
    12. Zkalibrować objętość iniekcji, mierząc wielkość kropli. Umieścić końcówkę igły w oleju mineralnym na szkiełku mikrometrycznym. Nacisnąć pedał iniekcyjny i dostosować ciśnienie wtrysku (Eject) (psi) i/lub czas iniekcji (ms), aż średnica wtryśniętej kropli wyniesie 0,1 mm, co odpowiada 0,5 nL.
    13. Upewnić się, że objętość iniekcji wynosi około 0,5-1 nL. Dostosować objętość, zmieniając ciśnienie wtrysku (Eject) (psi) lub czas (ms).
    14. W przypadku protokołu konfiguracji injektora pikolitrowego, postępować zgodnie z krokami 2.3.15-2.3.16.
    15. Użyć injektora pikolitrowego do iniekcji zebrafish. Włączyć pompę zasilającą injektora.
    16. Przygotować injektor zgodnie z poniższymi wymaganiami:
      1. P-balance: Upewnić się, że P-balance wynosi około 0. Należy zadbać, aby wartość była lekko ujemna, aby zapobiec cofaniu się żółtka do igły, co rozcieńczałoby roztwór MO w igle. I odwrotnie, jeśli ciśnienie wsteczne jest zbyt wysokie, MO będzie stale wypływać z igły nawet bez nacisku na pedał, co spowoduje zmienność i niespójność wstrzykiwanej dawki i obserwowanych fenotypów.
      2. P-inject: Idealne jest 20-25 psi; zmienić tę wartość, aby dostosować objętość iniekcji. Może ona wynosić od 10-30 psi, ale należy zacząć od ~20 psi, aby sprawdzić, czy dostarcza pożądaną objętość.
      3. Czas iniekcji: Należy skrócić czas iniekcji do 300 ms. Przed regulacją objętości iniekcji należy dokonać korekt czasu iniekcji.
    17. W przypadku iniekcji morpholino, postępować zgodnie z krokami 2.3.18-2.3.19.
    18. Przygotować komorę iniekcyjną w następujący sposób: Przygotować 2% agarozę z 0,6 g agarozy i 30 mL medium E3. Wlać agarozę do szalki Petriego i umieścić na agarozie formę iniekcyjną TU-1. Po schłodzeniu w zamrażarce utworzą się rowki do umieszczania i stabilizacji embrionów (Rycina 1A).
      UWAGA: Przepis na 60x roztwór zapasowy E3M składa się z 5,0 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,16 mM MgSO4·7H2O, 0,4 mM CaCl2·2H2O w 1 L ddH2O przy końcowym pH 7,6.
    19. Przenieść zebrane embriony do rowków za pomocą pipety transferowej, usuwając nadmiar medium E3 wokół embrionów, aby zapobiec ich pływaniu (Rycina 1B).

3. Wstrzykiwanie roztworu MO i mRNA do żółtka

  1. Wprowadzić igłę przez chorion, wstrzyknąć roztwór w pobliżu granicy komórki i żółtka po stronie embrionu, a następnie nacisnąć pedał wtryskiwacza (Rycina 1C).
    UWAGA: Wstrzyknięty roztwór MO/czerwień fenolowa nie rozprzestrzeni się natychmiast w żółtku. W żółtku pojawi się czerwona plamka, która będzie stopniowo zanikać. Objętość wstrzykniętego materiału nie powinna przekraczać 10% wielkości embrionu. MO można mikroiniekować do żółtka świeżo złożonych jaj zebrafish do etapu 8 komórek włącznie, ponieważ MO mogą być łatwo pobierane przez rozwijające się komórki wraz z prądem cytoplazmatycznym pęcherzyka żółtkowego17,18. W przypadku wstrzykiwania plazmidów lub mRNA z czapeczką, iniekcję należy przeprowadzić do pojedynczej blastomery embrionu w stadium jednej komórki.
  2. Przenieść embriony do szalki Petriego z medium E3 i inkubować w temperaturze 28 °C do 3 dpf, codziennie uzupełniając medium E3. Na tym etapie przeprowadzić ocenę fenotypową za pomocą mikroskopu.
    UWAGA: Roztwory MO muszą być starannie rozcieńczane dla każdego badania w celu ustalenia najniższego stężenia niezbędnego do wywołania konkretnego fenotypu. Należy również określić śmiertelność embrionalną dla każdego MO. Przy wyższych stężeniach (powyżej 4-10 ng, w zależności od MO), MO mają tendencję do wywoływania efektów niespecyficznych, takich jak śmierć komórek mózgu lub ogólna śmierć komórkowa.
  3. W ten sam sposób współwstrzyknąć MO wraz z 250 pg mRNA ludzkiego hand2, aby potwierdzić ratunek fenotypu wywołanego przez utratę genu hand2 zebrafish za pomocą MO.

4. Western blot w celu weryfikacji skuteczności wyciszenia za pomocą morfolino

  1. Zbierz zarodki w określonych punktach czasowych (48 hpf, 72 hpf) i w razie potrzeby przeprowadź dechorionację przy użyciu enzymu Pronaza.
  2. Usuń żółtko z zarodków w celu eliminacji witellogeniny, stosując wcześniej opisaną metodologię19.
    UWAGA: Witellogenina to fosfolipoglikoproteina, która służy jako źródło składników odżywczych dla rozwijającego się zarodka. Usunięcie żółtka i witellogeniny z zarodków umożliwia przeprowadzenie wysokorozdzielczej elektroforezy 2D w żelu oraz znacznie poprawia jakość analizy western blotting.
  3. Przeprowadź analizę western blotting zgodnie z wcześniejszym opisem20.

5. Ocena struktury i funkcji serca:

  1. Obrazowanie żywych organizmów z gatunku zebrafish: Obrazowanie komory serca
    UWAGA: Kilka parametrów funkcji serca i hemodynamicznych można obliczyć poprzez wizualizację bijącego serca zarodka zebrafish21,22. Parametry te obejmują rzut serca (CO), frakcję wyrzutową (EF), objętość wyrzutową (SV), ułamkowe skrócenie (FS) oraz frakcyjną zmianę powierzchni (FAC) (prosimy o zapoznanie się z wcześniejszymi pracami zawierającymi szczegółowe protokoły oceny funkcji serca u zarodków zebrafish22,23). Poniższe kroki krótko wyjaśniają, jak obliczyć te parametry dla zarodków zebrafish w wieku ok. 3 dpf, w stadium, w którym skóra tych organizmów jest przezroczysta, co umożliwia wizualizację za pomocą mikroskopii w polu jasnym.
    1. Nanieść kroplę 3% roztworu metylocelulozy (RT) na szkiełko do obrazowania z wgłębieniem.
    2. Umieścić zarodek zebrafish we wgłębieniu, używając odpowiedniego plastikowego zakraplacza (Rysunek 2A, B).
      UWAGA: Przepełnienie wgłębienia może spowodować wypadnięcie ryby z niego.
    3. Delikatnie zmieszać kroplę 3% metylocelulozy z medium E3, aby ustabilizować wyklutego zarodka.
      UWAGA: Aby przygotować 3% roztwór metylocelulozy, rozpuścić 3 g proszku metylocelulozy w 100 mL PBS lub innym medium montażowym w kolbie. Umieścić magnesy do mieszania w kolbie z mieszaniną i postawić kolbę na magnetycznej mieszalce. Ustawić prędkość na „niską” i przechowywać w temperaturze 4 °C przez ok. 1 dzień, aby rozpuścić wszystkie grudki. Po całkowitym rozpuszczeniu metylocelulozy rozdzielić roztwór do małych probówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    4. Ułożyć rybę na lewym boku, tak aby prawa strona była skierowana do góry, a przednia część w lewo, co ułatwi jednoznaczne obrazowanie komory (Rysunek 2C).
    5. Pod mikroskopem powiększyć obraz serca zarodka 100-krotnie i rozpocząć nagrywanie przez ok. 5 s. Upewnić się, że granice komory znajdują się w oknie obrazowania (Rysunek 2D).
    6. Nagrywać filmy time-lapse za pomocą kamery wysokiej rozdzielczości i stereomikroskopu z prędkością około 100 klatek na sekundę (fps) dla całego zarodka (Rysunek 2C), bijącej komory (Rysunek 2D) oraz poruszających się erytrocytów (RBC) w głównych naczyniach, takich jak aorta grzbietowa lub tylna żyła główna (Rysunek 2E), w celu analizy funkcji serca.
    7. Zapisać film w formacie AVI lub jako sekwencję obrazów TIFF (lub JPEG).
  2. Obliczenie częstości pracy serca
    1. Obliczyć czas potrzebny na zarejestrowanie dwóch kolejnych klatek. Dla 100 fps odstęp czasu wynosi 0,01 s.
    2. Wybrać znany punkt z dowolnego zarejestrowanego cyklu serca (np. koniec rozkurczu lub koniec skurczu). Obliczyć liczbę klatek potrzebnych do powtórzenia cyklu.
    3. Pomnożyć odstęp czasu z kroku 5.2.1 przez liczbę klatek z kroku 5.2.2. Wynikiem jest czas trwania (w sekundach) jednego uderzenia serca.
    4. Aby obliczyć liczbę uderzeń na minutę, podzielić 60 przez liczbę uzyskaną w poprzednim kroku. Dla normalnych zarodków w 3 dpf powinno to być około 150 bpm (2,5 Hz).
      UWAGA: Wiele aplikacji programowych może automatycznie obliczać częstość pracy serca z nagrań bijącego serca, takich jak ViewPoint24 i DanioVision25.
    5. Przeanalizować strukturę serca, używając nagrania time-lapse przy ok. 100 fps, aby sprawdzić całe serce pod kątem obecności obrzęku serca lub innych wad strukturalnych.
      UWAGA: Rysunek 3A przedstawia normalne serce zarodka w 3 dpf, a Rysunek 3B przedstawia serce w 3 dpf z obrzękiem serca i wadą pętlenia serca (wydłużona komora).
  3. Obliczenie frakcyjnej zmiany powierzchni (FAC):
    UWAGA: Frakcyjna zmiana powierzchni (FAC) jest parametrem służącym do porównania powierzchni komory w końcu rozkurczu i końcu skurczu w celu oceny kurczliwości komory.
    1. Użyć nagrania time-lapse przy ok. 100 fps, aby wyznaczyć klatki reprezentujące jeden cykl serca. Wyekstrahować klatki obrazujące koniec skurczu oraz koniec rozkurczu.
    2. Obliczyć powierzchnię końca rozkurczu (EDA) oraz powierzchnię końca skurczu (ESA) za pomocą programu ImageJ lub podobnego oprogramowania do analizy obrazu.
    3. Użyć następnego wzoru do obliczenia FAC22,26,27:
      FAC Równanie obliczania procentowej wydajności przy użyciu zmiennych EDA i ESA w analizie wydajności.
  4. Obliczenie ułamkowego skrócenia (FS):
    UWAGA: Ułamkowe skrócenie (FS) jest kolejnym parametrem służącym do oceny kurczliwości komory; aby wyznaczyć FS, należy zmierzyć średnice rozkurczowe i skurczowe komór21.
    1. Powtórzyć krok 5.3.1
    2. Użyć programu ImageJ lub innego równoważnego programu do analizy obrazu, aby zmierzyć średnice ścian komory w punktach końca rozkurczu Dd oraz końca skurczu Ds. W większości przypadków do wyznaczenia ułamkowej gładkości (FS) stosuje się średnice w osi krótkiej (Rysunek 4).
    3. Użyć następnego wzoru do obliczenia FS22,27:
      FS Wzór na obliczenie porowatości, pokazujący (Dd-Ds)/Dd, istotny w badaniach gęstości materiałów.
  5. Obliczanie objętości wyrzutowej (SV):
    UWAGA: Dla każdego uderzenia serca SV jest ilością krwi pompowanej z komory, którą można łatwo obliczyć z objętości komór w końcu rozkurczu i końcu skurczu28.
    1. Powtórzyć kroki 5.3.1 i 5.3.2
    2. Zmierzyć średnice w końcu rozkurczu (DL) i w końcu skurczu (DS), jak pokazano na Rysunku 4.
      UWAGA: Zakładając, że komory serca zebrafish mają kształt sferoidy wydłużonej21,22, objętość komory oblicza się za pomocą następnego wzoru.
      Volume Równanie obliczania objętości, wzór: V = (1/6)πDLDS², istotne dla badań z zakresu geometrii lub fizyki.
      SV można obliczyć według poniższego wzoru27. Normalny zakres SV dla zarodków w wieku 2-6 dpf wynosi 0,15-0,3 nL29. Tutaj EDV to objętość końca rozkurczu, a ESV to objętość końca skurczu.
      SV = (EDV - ESV)
  6. Obliczenie frakcji wyrzutowej (EF):
    ​UWAGA: EF definiuje się jako ułamek krwi wyrzucanej z komory przy każdym uderzeniu serca28.
    1. Z powyższych wzorów wyznaczyć EDV i ESV dla ryby.
    2. Obliczyć EF w następujący sposób22,27:
      EF (%) Wzór na funkcję serca, równanie objętości wyrzutowej/objętości końca rozkurczu, analiza hemodynamiczna.
  7. Obliczenie rzutu serca (CO):
    UWAGA: CO to objętość krwi pompowanej przez serce28. CO ma wartość 10-55 nL/min dla zarodków w wieku 2-6 dpf29.
    1. Obliczyć SV i HR, jak wspomniano w poprzednich podrozdziałach 5.5 i 5.2.
    2. Użyć następnego wzoru do obliczenia CO22,27:
      CO (nL/min) = SV (nL/beat) x HR (beats/min).
  8. Pomiar prędkości erytrocytów (RBC):
    UWAGA: Wyznaczenie prędkości komórek jest kluczowe dla oceny szybkości przepływu, średnicy naczyń i obliczenia naprężeń ścinających działających na komórki śródbłone naczynia (tzn. naprężenie ścinające jest siłą tarcia działającą na komórki śródbłone wywołaną przez płynącą krew). Dla zarodków w wieku 2-5 dpf średnia prędkość erytrocytów (RBC) wynosi około 300-750 µm/s29. Aby zmierzyć prędkości RBC:
    1. Pod mikroskopem powiększyć obraz ogona zwierzęcia 100-krotnie. Ruch RBC powinien być widoczny przy tym powiększeniu (Rysunek 5A, B).
    2. Rozpocząć nagrywanie przez około 8 s. Upewnić się, że aorta grzbietowa (DA) i tylna żyła główna (PCV), dwie najważniejsze tętnice osiowe, znajdują się w oknie obrazowania przy 100-120 fps. Śledzić poszczególne komórki w kolejnych klatkach (Rysunek 5A, B).
    3. Wyekstrahować kilka klatek za pomocą programu ImageJ lub innego podobnego oprogramowania do analizy obrazu.
    4. Obliczyć różnicę w odległości, jaką przebył pojedynczy erytrocyt (Δx).
    5. Wyznaczyć różnicę czasu między kolejnymi klatkami (Δt).
    6. Użyć następnego wzoru na prędkość RBC22,27:
      RBC velocity (µm/s) Wzór na tempo zmiany, równanie Δx/Δt, obliczanie prędkości w kontekście badań naukowych.
      UWAGA: Prędkość maksymalną i średnią można wyznaczyć z powtórzeń kolejnych klatek dla pojedynczych komórek21. Prędkość RBC reprezentuje również prędkość przepływu krwi. Alternatywnie, do automatycznego pomiaru prędkości RBC można użyć różnych dostępnych komercyjnie aplikacji programowych. Programy ViewPoint24 oraz DanioVision25 posiadają takie funkcje (Rysunek 5C). Ponadto do programu ImageJ dostępne są wtyczki, takie jak TrackMate30 i MTrackJ31, kompatybilne z filmami nagranymi z prędkością powyżej 100 fps.
  9. Obliczanie naprężeń ścinających z pomierzonych prędkości komórek
    Pomierzone prędkości RBC w naczyniach krwionośnych reprezentują również prędkości przepływu krwi (Rysunek 5C). Na podstawie tych pomiarów obliczyć naprężenie ścinające τ w interesującym nas naczyniu w następujący sposób, przyjmując założenie przepływu Poiseuille'a22,27:
    Równanie dynamiki przepływu τ=4μVmean/D, mechanika płynów, schemat, lepkość, prędkość, średnica.
    Gdzie V to średnia prędkość krwi (µm/s), µ to lepkość krwi (dynes/cm2), a D to średnica naczynia (µm). Dla zarodków w 3 dpf naprężenie ścinające w DA22,26,27 wynosi około 4 dynes/cm2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykres na Rysunku 6 przedstawia średni procent zarodków przeżywających w 24, 48 i 72 hpf zarówno w przypadku zarodków wstrzykniętych specyficznym dla HAND2 MO, jak i w grupie kontrolnej z wstrzykniętym MO typu scrambled. W zarodkach wstrzykniętych MO w stężeniu 1 mM (8 ng/µL) i 0,8 mM (6,4 ng/µL) odnotowano znaczący spadek odsetka przeżywalności w porównaniu z zarodkami kontrolnymi z MO typu scrambled. Zjawisko to zaobserwowano w każdym z mierzonych punktów czasowych, w których stwierdzono l...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Technologia Morpholino (MO) jest szeroko stosowana u danio pręgowanego, ksenopusa, jeżowców, a ostatnio w systemach modelowania hodowli komórkowych. W przypadku większości metod, wraz z korzyściami, istnieją również pułapki, których eksperymentator powinien być świadomy. Jedną z głównych pułapek związanych z technologią MO jest obawa, że efekty fenotypowe obserwowane przez podejście knockdown genów za pośrednictwem MO nie są spowodowane utratą funkcji związanej z produktem genu pierwotnego, ale że niektóre inne geny wraz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają interesów finansowych ani nie występują w innych konfliktach interesów.

Podziękowania

Publikacja tego artykułu została wsparta hojnym wsparciem ze strony BARZAN HOLDINGS. RR jest częściowo wspierany przez R61HL154254 i fundusze z Oddziału Pediatrii i Szpitala Dziecięcego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Akrylamid 40%SigmaSigma, nr kat. C977M88
AgarozaSigma-AldrichSigma-Aldrich nr kat. A9539-250G
All Prep DNA/RNA Mini KitQiagenQiagen nr kat. 80204.
alfa tubulinaAbcamAbcam- ab4074Królik poliklonalny do alfa Tubulina partia GR3 180877-1 (50 kDa)
Nadsiarczan amonu klasy molekularnejSigmaSigma, nr kat. C991U65
Ukosowarka kapilarna BV10Produkt Sutter InstrumentsKatalog produktów # BV10
Gen obrazowania chemiluminescencji GnomSYNGENESYNGENE
Tasak Naukowy CVS10D_OmniPAGEMini do BlottinguCVS10D_OmniPAGEMini
CoomassieThermo FisherThermo Fisher nr kat. C861C44
Zestaw do elektrochemiluminescencji (ECL)Abcam Biochemicals AbcamBiochemicals nr kat. ab65623
GlycineSigmaSigma, nr kat. C988U91
Koza anty KrólikAbcamAbcam-  ab6721Kozia IgG Przeciw Królikom H& L (HRP) Przeciwciała 2nd partia GR3179871-1
HAND2Narzędzia genoweWykonane na zamówienie dla HAND2 (NM_021973)5'-CCTCCAACTAAACTCATGGCGAC
AG-3'Hand2
AbcamAbcam- ab10131Królicze poliklonalne przeciwciało anty-HAND2 partia GR143200-9 (24-26 kDa)
HAND2 (NM_021973) Człowiek Tagged Klon ORFOriGene Technologies, IncRC224436L3Wektor: pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro (PS100092)
IBI DNA/RNA/Zestaw do ekstrakcji białekIBI Scientific IBI Scientificnr kat. -r IB47702
System obrazowaniaiBrightiBright CL1000 System
IsopropanolSigma-AldrichSigma-Aldrich nr kat. 278475-2L
Bufor do ładowania próbek Laemmli (4x)Sigma-AldrichSigma-Aldrich nr kat. 70607
MerkaptoetanolSigmaSigma, nr kat. M6250-1L
Spektrofotometr mikropłytkowy z interfejsem oprogramowania do analizy danych Gen5Mikroskop
Ziess SteREO Lumar V12 Mikroskop fluorescencyjny Ziess SteREO Lumar V12Mikroskop
mineralnyFisherScientific Fisher Scientific nr kat. 0121-1
mMESSAGE mMACHINE T7/T3/SP6 Zestaw do transkrypcjiThermo FisherThermo Fisher nr kat. AM1340do wytwarzania mRNA
Woda wolna od nukleazNew England BiolabsNew England Biolabs nr kat. B1500L
PC-100 Ściągacz do mikropipetNARISHIGE GROUP ProduktNARISHIGE GROUP Katalog produktów # PC-100
Czerwień fenolowaSigma Sigma, nr kat. P-0290
Wtryskiwacz pikolinowyAparatura Harvarda Katalogaparatury Harvard # PLI-90A
Test kwasu bicynchoninowego Pierce'a (BCA) Zestaw do oznaczania białekThermoFisher Thermo Fisher nr kat. 23227
PMSF, Inhibitor proteazy jako inhibitor proteazyThermoFisher Thermo Fisher nr kat. 36978
Ponceau SSigma-AldrichSigma-Aldrich nr kat. 10165921001
Koktajl inhibitorów proteazyThermo FisherThermo Fisher nr kat. 88668
Drabinka białkowaSMOBiOSMOBiO nr kat. PM2500
Test radioimmunoprecypitacyjny (RIPA)Thermo FisherThermo Fisher nr kat. 89900
Ringer' s roztwórThermofisherNr katalogowy S25513
SDSSigmaSigma, nr kat. 436143
Standardowenarzędzia Genowedo kontroli SKU: PCO-StandardControl-1005'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTAT
A-3'- który jest ukierunkowany na ludzką mutację intronu beta-globiny
Bufor strippingowySigma-AldrichSigma-Aldrich kat. 21059
TemedIBI naukowyIBI nr kat. C000A52
Tris BaseThermo FisherThermo Fisher nr kat. BP-152-500
Tweensigma nauki przyrodniczesigma nauki przyrodnicze nr kat. P2287
Komora systemu Zebra Box Revolution-Danio Track z oprogramowaniem EthoVision XT 11.5Noldus Information Technology, NLNoldus Information Technology, NL
Zeiss Axiocam ERc 5sZeissStemi 508 Zeiss
Zeiss Stemi 2000-CZeissStemi 2000-C
obrazowania epokowy fluorescencyjny Olej

Bibliografia

  1. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
  2. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  3. Stainier, D. Y., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), 1007000(2017).
  4. Zhou, B., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
  5. Eve, A. M., Place, E. S., Smith, J. C. Comparison of Zebrafish tmem88a mutant and morpholino knockdown phenotypes. PLoS One. 12 (2), 0172227(2017).
  6. Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Developmental Biology. 331 (2), 237-249 (2009).
  7. Chen, Z., et al. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovascular Research. 79 (1), 97-108 (2008).
  8. Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).
  9. Reichenbach, B., et al. Endoderm-derived Sonic hedgehog and mesoderm Hand2 expression are required for enteric nervous system development in zebrafish. Developmental Biology. 318 (1), 52-64 (2008).
  10. Maves, L., Tyler, A., Moens, C. B., Tapscott, S. J. J. Pbx acts with Hand2 in early myocardial differentiation. Developmental Biology. 333 (2), 409-418 (2009).
  11. Hinits, Y., et al. Zebrafish Mef2ca and Mef2cb are essential for both first and second heart field cardiomyocyte differentiation. Developmental Biology. 369 (2), 199-210 (2012).
  12. Gene Tools, custom-sequence Morpholinos. , Available from: https://oligodesign.gene-tools.com/ (2011).
  13. hand2 heart and neural crest derivatives expressed 2 [ Danio rerio (zebrafish). , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/58150 (2021).
  14. Danio rerio heart and neural crest derivatives expressed 2 (hand2), mRNA. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_131626.3 (2021).
  15. NCBI reference sequence -Danio rerio heart and neural crest derivatives expressed 2 (hand2), mRNA FASTA. , hand2), mRNA FASTA at (2021). Prepared control oligos at (2021).
  16. Prepared control oligos. , Available from: https://store.gene-tools.com/prepared-control-oligos (2021).
  17. Schubert, S., Keddig, N., Hanel, R., Kammann, U. Microinjection into zebrafish embryos (Danio rerio)-a useful tool in aquatic toxicity testing. Environmental Sciences Europe. 26 (1), 32(2014).
  18. Moulton, J. D. Guide for morpholino users: toward therapeutics. Journal of Drug Discovery, Development, and Delivery. 3 (2), 1023(2016).
  19. Link, V., Shevchenko, A., Heisenberg, C. -P. Proteomics of early zebrafish embryos. BMC Developmental Biology. 6 (1), 1(2006).
  20. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).
  21. Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiological Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
  22. Yalcin, H. C., Amindari, A., Butcher, J. T., Althani, A., Yacoub, M. Heart function and hemodynamic analysis for zebrafish embryos. Developmental Dynamics: An Officical Publication of the American Association of Anatomists. 246 (11), 868-880 (2017).
  23. Zakaria, Z. Z., et al. Using zebrafish for investigating the molecular mechanisms of drug-induced cardiotoxicity. Biomed Research International. 2018, 1642684(2018).
  24. Parker, T., et al. A multi-endpoint in vivo larval zebrafish (Danio rerio) model for the assessment of integrated cardiovascular function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (1), 30-38 (2014).
  25. Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), 0151148(2016).
  26. Salman, H. E., Yalcin, H. C. Advanced blood flow assessment in Zebrafish via experimental digital particle image velocimetry and computational fluid dynamics modeling. Micron. 130, 102801(2020).
  27. Benslimane, F. M., et al. Cardiac function and blood flow hemodynamics assessment of zebrafish (Danio rerio) using high-speed video microscopy. Micron. 136, 102876(2020).
  28. DeGroff, C. G. Doppler echocardiography. Pediatric Cardiology. 23 (3), 307-333 (2002).
  29. Bagatto, B., Burggren, W. A three-dimensional functional assessment of heart and vessel development in the larva of the zebrafish (Danio rerio). Physiological and Biochemical Zoology. 79 (1), 194-201 (2005).
  30. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods (San Diego, Calif.). 115, 80-90 (2017).
  31. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  32. Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. 32 (1), 97-108 (2015).
  33. Sumanas, S. Inducible inhibition of gene function with photomorpholinos. Methods in Molecular Biology. 1565, Clifton, N.J. 51-57 (2017).
  34. Kyritsi, K., et al. Knockdown of hepatic gonadotropin-releasing hormone by vivo-morpholino decreases liver fibrosis in multidrug resistance gene 2 knockout mice by down-regulation of miR-200b. The American Journal of Pathology. 187 (7), 1551-1565 (2017).
  35. Flynt, A. S., Rao, M., Patton, J. G. Blocking zebrafish microRNAs with morpholinos. Methods in Molecular Biology. 1565, Clifton, N.J. 59-78 (2017).
  36. Schoenebeck, J. J., Keegan, B. R., Yelon, D. Vessel and blood specification override cardiac potential in anterior mesoderm. Developmental Cell. 13 (2), 254-267 (2007).
  37. Lu, F., Langenbacher, A., Chen, J. -N. Transcriptional regulation of heart development in zebrafish. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (2), 14(2016).
  38. Laurent, F., et al. HAND2 target gene regulatory networks control atrioventricular canal and cardiac valve development. Cell Reports. 19 (8), 1602-1613 (2017).
  39. Miura, G. I., Yelon, D. A guide to analysis of cardiac phenotypes in the zebrafish embryo. Methods in Cell Biology. 101, 161-180 (2011).
  40. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oligonukleotydy Morpholinowyciszanie gen wtechnika mikroiniekcjiiniekcja mRNAblokowanie translacjianaliza fenotypowaanaliza funkcji sercaWestern blot

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.