Artykuł metodologiczny

Podłużna mikroskopia przyżyciowa z wykorzystaniem okienka do obrazowania sutkowego z wymienną pokrywą

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63326

⸱

20 stycznia 2022

 ,  ,  , 
1Center for Cancer Biology, VIB (BE), 2Department of Oncology, KU Leuven (BE), 3Netherlands Cancer Institute, Department of Molecular Pathology, Oncode Institute (NL)

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje nowatorskie okno obrazowania sutka z wymienną pokrywą (R.MIW). Mikroskopia przyżyciowa po wszczepieniu R.MIW pozwala na podłużne i wielodniowe obrazowanie zdrowego i chorego gruczołu sutkowego z rozdzielczością komórkową na różnych etapach rozwoju.

Streszczenie

Rozgałęziona struktura gruczołu sutkowego jest bardzo dynamiczna i przechodzi kilka faz wzrostu i przebudowy po urodzeniu. Mikroskopia przyżyciowa w połączeniu z chirurgią płata skórnego lub implantacją okien obrazowych została wykorzystana do zbadania dynamiki zdrowego gruczołu sutkowego na różnych etapach rozwoju. Większość technologii obrazowania gruczołu sutkowego jest ograniczona do ram czasowych od godzin do dni, podczas gdy większość procesów przebudowy gruczołu sutkowego zachodzi w ramach czasowych od dni do tygodni. Aby zbadać przebudowę gruczołu sutkowego, wymagane są metody, które umożliwiają optyczny dostęp do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania przez dłuższy czas. W tym miejscu opisano ulepszoną wersję tytanowego okienka obrazowania sutka z wymienną pokrywą (R.MIW), która umożliwia obrazowanie gruczołu sutkowego w wysokiej rozdzielczości z rozdzielczością komórkową przez okres do kilku tygodni. Co ważne, R.MIW zapewnia dostęp do tkanek przez cały czas trwania eksperymentu obrazowania przyżyciowego i dlatego może być używany do miejscowej manipulacji tkankami, znakowania, podawania leków lub mikrodysekcji sterowanej obrazem. Podsumowując, R.MIW umożliwia charakteryzację dynamiki komórkowej w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju gruczołu sutkowego, homeostazy i choroby.

Wprowadzenie

Nabłonek gruczołu mlekowego jest unikalnym organem wydzielniczym występującym u ssaków, który produkuje i wydziela mleko w celu odżywienia potomstwa. W ciągu życia gruczoł mlekowy przechodzi wielokrotne cykle rozwoju i wzrostu, którym towarzyszą zmiany strukturalne i funkcjonalne tkanki1. W zależności od stadium rozwoju różne są typy komórek biorących udział w przebudowie tkanki, a także ich lokalizacja w obrębie drzewa przewodowego.

Wielofotonowa mikroskopia intravitalna (IVM) umożliwia badanie dynamiki komórek gruczołu mlekowego in vivo w naturalnym i minimalnie zaburzonym środowisku2,3,4. Aby uzyskać dostęp wizualny do gruczołu mlekowego, opublikowano kilka tymczasowych technik obrazowania ex vivo lub z wykorzystaniem płata skóry dla różnych etapów rozwoju gruczołu mlekowego, w tym okresu dojrzewania4,5,6,7, dorosłości2,8, laktacji9,10,11,12 oraz dynamiki nowotworów13,14,15. Choć techniki te pozwalają na uzyskanie obrazów dynamiki komórek gruczołu mlekowego o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej, ramy czasowe są ograniczone do godzin, podczas gdy większość procesów przebudowy gruczołu mlekowego trwa od kilku dni do kilku tygodni. W związku z tym wymagane są metody umożliwiające dostęp optyczny do badanej tkanki przez dłuższe okresy czasu. Na przestrzeni lat opracowano kilka trwałych okien obrazujących do badania nowotworów gruczołu mlekowego15,16,17,18, w tym tytanowe okno obrazujące gruczoł mlekowy (MIW)2,3,19. Mimo że jest ono bardzo użyteczne w badaniu wzrostu nowotworu gruczołu mlekowego, wizualizacja struktury zdrowego gruczołu mlekowego pozostawała ograniczona do kilku dni. Niedawno opracowano elastyczne silikonowe okno obrazujące, które pozwala na wizualizację gruczołu mlekowego w okresie dojrzewania przez wiele tygodni20. Jednak gruczoł mlekowy jest zanurzony w bogatej w adipocyty poduszce tłuszczowej, co prowadzi do rozproszonego światła i w konsekwencji do ograniczonej widoczności struktur przewodowych gruczołu. Dlatego w każdej chwili wymagane są lepsze warunki obrazowania, aby wizualizować dynamikę tkanki w gruczole mlekowym przez dłuższe okresy czasu. Ani klasyczne okno MIW, ani elastyczne okno silikonowe nie pozwalają na manipulację tkanką ani optymalizację fizycznego położenia tkanki przed obrazowaniem, ponieważ okno stanowi system zamknięty po operacji i implantacji. W rezultacie optymalny dostęp optyczny do leżącej poniżej tkanki gruczołowej prawdopodobnie zostanie uniemożliwiony w dłuższych przedziałach czasowych. W przeciwieństwieństwie do nich, technika płata skóry pozwala na optymalizację i repozycjonowanie tkanki podczas sesji obrazowania, a zabieg z użyciem płata skóry można powtarzać wielokrotnie2. Jednak wielokrotne sesje obrazowania poprzez płat skóry są możliwe tylko wtedy, gdy pomiędzy operacjami przewidziano wystarczający czas (co najmniej 7 dni) na regenerację skóry, dlatego metoda ta nadaje się głównie do badania procesów w dłuższych skalach czasowych. Ponadto, ze względu na inwazyjny charakter tej procedury oraz duże ryzyko infekcji i bliznowacenia przy zamykaniu rany, nie zaleca się wykonywania jej zbyt wiele razy.

Aby przełamać te ograniczenia, t.j. zapewnić optymalne warunki obrazowania przez dłuższy czas z wysoką częstotliwością, a jednocześnie umożliwić manipulację tkanką, zaprojektowano ulepszoną tytanową wersję MIW z wymienną pokrywą (R.MIW), pozwalającą na wizualizację zdrowego i chorobowego gruczołu mlekowego przez okres od kilku dni do kilku tygodni2 (Rysunek 1A,B). R.MIW został zaprojektowany specjalnie w celu zapewnienia optymalnego dostępu do tkanki, umożliwiając bezpośrednią manipulację nią przez cały czas trwania eksperymentu IVM, co pozwala na wizualizację gruczołu mlekowego we właściwym czasie i miejscu w dłuższych przedziałach czasowych. Po zamknięciu R.MIW tworzy szczelny system porównywalny z klasycznym MIW (Rysunek 1C). Po otwarciu w warunkach aseptycznych R.MIW pozwala na lokalną manipulację tkanką w celu poprawy dostępu optycznego, a także umożliwia lokalne podawanie substancji, takich jak inhibitory lub agoniści szlaków sygnałowych, wstrzykiwanie różnych interesujących typów komórek, np. populacji komórek nowotworowych lub komórek odpornościowych, lub dodawanie barwników do znakowania tkanek. Pokrywę można otworzyć w dowolnym momencie między sesjami obrazowania, nie powodując uszkodzenia tkanki podścielącej.

Kompaktowa konstrukcja zestawu komórkowego; schemat i szczegóły zdjęć; zastosowania spektroskopowe.
Rysunek 1: Konstrukcja okna obrazowego gruczołu mlekowego z wymienną pokrywą. (A) Widok z góry i z boku wymiennej pokrywy okna obrazowego gruczołu mlekowego z przyklejonym do pierścienia szkiełkiem kryjącym o grubości 10 mm. (B) Widok z góry i z boku okna obrazowego gruczołu mlekowego, które składa się z pierścienia zewnętrznego i wewnętrznego z rowkiem pomiędzy nimi, służącym do zamocowania okna w skórze myszy za pomocą szwu typu „marszczenie”. Pierścień zewnętrzny posiada mały rowek dopasowany do czterech wypustek (ramion) pokrywy. (C) Schemat i zdjęcia demonstrujące mechanizmy otwierania i zamykania pokrywy. Skośne wypustki zapewniają stabilne zamocowanie pokrywy w ramie okna. Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Messal et al. 2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Niniejszy protokół opisuje procedurę projektowania i implantacji R.MIW, a także podłużną strategię IVM w celu ponownego badania tych samych przewodów mlecznych oraz ich wizualizacji w rozdzielczości komórkowej. R.MIW umożliwia śledzenie podziałów komórkowych i zmian morfologicznych podczas różnych faz rozwoju gruczołu mlekowego w różnorodnych fluorescencyjnych modelach mysich reporterowych. Wraz ze sobą, R.MIW ułatwia wysokorozdzielczą charakterystykę dynamiki komórkowej podczas rozwoju, homeostazy i chorób gruczołu mlekowego.

Protokół

Wszystkie procedury opisane w niniejszej pracy zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi IACUC oraz KU Leuven i zrealizowano je w ramach zatwierdzonego wniosku projektowego P160/2020. Przed przystąpieniem do realizacji niniejszego protokołu należy omówić strategię przeciwbólowczą z lekarzem weterynarii instytucji oraz podać środki przeciwbólowe przed i po operacji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

1. Przygotowanie R.MIW (przewidywany czas: 2 h)

UWAGA: Przy konstrukcji R.MIW zaleca się znalezienie lokalnego producenta specjalizującego się w obróbce materiałów twardych, takich jak tytan, ponieważ wymaga to specjalistycznych narzędzi i wiedzy. Warsztaty specjalizujące się w projektowaniu i produkcji protez tytanowych zazwyczaj dysponują odpowiednim zapleczem maszynowym i doświadczeniem niezbędnym do wykonania części R.MIW.

  1. Położyć pokrywkę R.MIW na sterylnej powierzchni zewnętrzną stroną do góry (tak, aby ramiona pokrywki były skierowane w dół; Rysunek 1A).
  2. Nanieść klej cyjanoakrylowy na cały brzeg pokrywki i ostrożnie położyć na niej okrągłe szkiełko podstawowe o średnicy 10 mm.
    UWAGA: Podczas procedury chirurgicznej należy zawsze przygotować zapasową pokrywkę ze szkiełkiem podstawkowym.
  3. Użyć sterylnego drewnianego patyczka do ustawienia szkiełka podstawkowego i przyłożyć siłę, aby docisnąć je do ramki pokrywki, zapewniając szczelność powietrzną. Należy upewnić się, że otwory w ramionach pokrywki nie są zasłonięte przez szkło.
  4. Zdezynfekować pokrywki oraz R.MIW, zanurzając je w 80% etanolu na co najmniej 30 min w zamkniętej płytce Petriego.
    UWAGA: Nie należy pozostawiać pokrywek w 80% etanolu dłużej niż przez 1 h, aby uniknąć rozpuszczenia kleju cyjanoakrylowego.
  5. Usunąć nadmiar kleju cyjanoakrylowego ze szkiełka podstawkowego za pomocą patyczka bawełnianego nasączonego acetonem.
  6. Przechowywać pokrywki i R.MIW w sterylnym środowisku do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: Ramkę R.MIW i pokrywki można przechowywać w sterylnej probówce lub woreczku maksymalnie przez 1 tydzień. Przed wznowieniem eksperymentu i przejściem do protokołu należy zawsze sprawdzić, czy szkiełko podstawkowe jest nadal prawidłowo przymocowane do pokrywki.

2. Przygotowanie do operacji (szacowany czas: 15 min)

UWAGA: W procedurze implantacji R.MIW można zastosować myszy żeńskie (>3,5 tygodnia) dowolnej szczepu.

  1. Zachowaj sterylność, używając sterylnych rękawiczek, oraz wysterylizuj wszystkie przedmioty, które będą miały kontakt z myszą. Umyj narzędzia chirurgiczne wodą i łagodnym mydłem, wysusz na powietrzu, owiń folią aluminiową tak, aby nie wystawały żadne rogi ani krawędzie, a następnie wysterylizuj w autoklawie przez 20 min w temperaturze 120 °C przed operacją.
  2. Przygotuj sterylną platformę chirurgiczną i odkaź powierzchnie 80% etanolem.
    UWAGA: Aby zapewnić sterylność, operację można przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
  3. Włącz podkładkę grzewczą i przykryj matę sterylną chustą. Rozłóż sterylne instrumenty na sterylnej chuście, a R.MIW oraz co najmniej dwie przykrywki szklane umieść w sterylnym soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) w czynce Petriego (zamknij pokrywkę, aby uniknąć zewnętrznego zanieczyszczenia).
  4. Zpodaj myszy znieczulenie w komorze indukcyjnej, używając 3% mieszaniny izofluranu/O2. Upewnij się, że zwierzę jest wystarczająco zrelaksowane, aby można je było łatwo manipulować i przenieść do maski nosowej bez żadnego oporu.
  5. Przenieś mysz z komory indukcyjnej do maski nosowej do znieczulenia i zmniejsz stężenie izofluranu do 1,5% - 2% mieszaniny izofluranu/O2. Potwierdź pełne znieczulenie, wykonując test wycofania łapy.
  6. Aby wykonać test wycofania łapy, mocno uciśnij łapę zwierzęcia paznokciami lub pęsetą o tępym zakończeniu. W przypadku braku jakiegokolwiek odruchu mięśniowego uznaj zwierzę za nieprzytomne i przystąp do przygotowań chirurgicznych. Wykonaj ten test przed manipulacją zwierzęciem i powtarzaj regularnie podczas procedur znieczulających i chirurgicznych, aby potwierdzić znieczulenie.
  7. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec odwodnieniu rogówki.
  8. Ogol obszar wokół 4tej gruczołu mlekowego za pomocą żyletki (Rycina 2A). Jako punkt orientacyjny wykorzystaj 4ty sutek. Usuń luźne włosy za pomocą taśmy klejącej.
    UWAGA: Alternatywnie do usunięcia włosów można użyć kremu do depilacji.
  9. Zdezynfekuj odsłoniętą skórę 80% etanolem lub powidonem jodowym i umieść mysz w sterylnym obszarze chirurgicznym na grzbiecie, z pyszczkiem w masce nosowej do znieczulenia przy użyciu 1,5% mieszaniny izofluranu/O2.
  10. Zabezpiecz przednie i tylne kończyny myszy za pomocą papierowej taśmy.
    UWAGA: Pozostaw znieczuloną i regenerującą się mysz na podkładce grzewczej tak długo, jak to możliwe, w trakcie i po operacji.
  11. Użyj dociętej sterylnej chusty chirurgicznej lub gazy, aby przykryć mysz, pozostawiając odsłonięty obszar operacyjny.

3. Implantacja R.MIW (szacowany czas: 30 min)

  1. Sprawdź, czy zwierzę jest odpowiednio znieczulone, wykonując test wycofania łapy. Delikatnie unieś skórę za pomocą cienkiej pęsety Graefe i wykonaj cięcie ukośne o długości 10-15 mm za pomocą małych nożyczek sprężynowych w skórze nad 4tą podkładką tłuszczową gruczołu piersiowego, używając 4tego sutka jako punktu orientacyjnego (Rysunek 2A). Upewnij się, że nie przecięto ani nie uszkodzono otrzewnej ani gruczołu piersiowego.
  2. Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) na podstawie makroskopowych cech tkanki gruczołu piersiowego, w tym lokalizacji węzła chłonnego lub zmiany nowotworowej, i staraj się utrzymać ROI centralnie względem cięcia.
  3. Oddziel skórę od podkładki tłuszczowej gruczołu piersiowego i leżących poniżej warstw tkanki za pomocą tępej dyssekcji na odległość do 5-8 mm wokół linii cięcia, aby stworzyć kieszeń dopasowaną do ramki R.MIW (Rysunek 2BI).
  4. Chwyć R.MIW za pomocą sterylnej pęsety i sprawdź, czy cięcie jest wystarczająco duże, aby wstawić okno. W razie potrzeby lekko powiększ cięcie, aż R.MIW będzie pasować.
  5. Wyjmij R.MIW i wykonaj szew pierścieniowy wokół całego cięcia, używając nici jedwabnej 5-0 (plecionka, nieresorbowalna). Umieść szew 1-2 mm od krawędzi cięcia, prowadząc go z zewnątrz do wnętrza skóry, zaczynając od końca guzicznego cięcia.
  6. Przesuń się o około 5 mm w górę wzdłuż cięcia i przeprowadź nić szwu przez skórę z wnętrza na zewnątrz. Powtarzaj tę procedurę wzdłuż krawędzi cięcia, tworząc w ten sposób okrężny szew składający się z 5-6 pętli (Rysunek 2BII). Ostateczne wyjście nici szwu powinno znajdować się około 2-5 mm od pierwszego punktu wejścia.
    UWAGA: Należy uważać, aby nie umieścić szwu zbyt blisko krawędzi cięcia, ponieważ zwiększa to ryzyko rozerwania skóry. Umieszczenie szwu zbyt daleko od krawędzi cięcia zwiększa ryzyko infekcji między nadmiarową skórą a rowkiem R.MIW.
  7. Włóż R.MIW do cięcia i za pomocą pęsety Graefe ostrożnie ułóż skórę w rowku R.MIW. Upewnij się, że pętle szwu pozostają na zewnątrz.
  8. Pociągnij za pętle szwu pierścieniowego i dociśnij szew w rowku R.MIW, delikatnie pociągając za oba końce nici (Rysunek 2BIII). Zwiąż węzłami chirurgicznymi i odetnij nadmiar nici.
  9. Nałóż wazelinę na wewnętrzną krawędź R.MIW za pomocą wykałaczką, uważając, aby nie dotknąć leżącej poniżej tkanki. Delikatnie dociśnij ramkę okna w dół sterylną pęsetą lub dwoma opuszkami palców i umieść pokrywkę w ramce R.MIW (Rysunek 1B). Pozwoli to uniknąć obecności powietrza między tkanką gruczołu piersiowego a pokrywką R.MIW.
  10. Wprowadź końcówki cienkiej pęsety przez otwory w ramionach pokrywki i dokręć pokrywkę, obracając ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara (około 5°) (Rysunek 1C i Rysunek 2BIV).
  11. Jeśli po dokręceniu pokrywy R.MIW nadal pozostanie trochę powietrza, użyj sterylnej igły insulinowej, aby usunąć nadmiar powietrza. Wprowadź igłę przez skórę do szczeliny między tkanką gruczołu piersiowego a pokrywką i powoli wyciągnij tłok, tworząc w ten sposób próżnię między tkanką gruczołu piersiowego a pokrywką R.MIW.
  12. Po operacji podaj leki przeciwbólowe, takie jak buprenorfina (0,1 mg/kg rozcieńczona w sterylnym 0,9% NaCl), poprzez wstrzyknięcie podskórne. Powtórz wstrzyknięcie podskórne buprenorfiny 8 h i 16 h po operacji.
  13. Umieść mysz z powrotem w klatce w celu rekonwalescencji i monitoruj ją uważnie, aż całkowicie się obudzi, lub przejdź do kroku 4 w celu natychmiastowego obrazowania.
  14. Na tym etapie pooperacyjnym uważnie monitoruj myszy pod kątem oznak dyskomfortu lub powikłań na podstawie parametrów życiowych, takich jak oddychanie, reaktywność, zachowanie, postawa i masa ciała. Uważnie monitoruj skórę wokół okna pod kątem oznak stanu zapalnego i martwicy. Jeśli nie wystąpią powikłania, R.MIW umożliwi wielokrotne sesje IVM przez kilka tygodni po implantacji.

Schemat chirurgiczny myszy z nacięciem do implantacji okna, przedstawiający procedurę i szczegóły szwów.
Rycina 2: Przegląd procedury chirurgicznej i implantacji okna. (A) W pobliżu 4tego sutczaka samicy myszy wykonuje się nacięcie ukośne, a skórę i tkankę podścielną rozdziela się poprzez rozczepianie tępym narzędziem. (B) Węzeł chłonny pachwinowy oraz kształt poduszki tłuszczowej mogą służyć do prawidłowej orientacji tkanki (I). W skórze wokół nacięcia zakłada się szew typu „workowy” (II), a po dopasowaniu ramy okna szew jest zaciśnięty w rowku w celu unieruchomienia ramy i zabezpieczony węzłami chirurgicznymi (III). Ostatnim krokiem jest włożenie i zablokowanie pokrywy w ramie okna (IV). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Powtarzalna mikroskopia przyżyciowa przez R.MIW

UWAGA: Opisana tutaj strategia powtarzanej metody IVM została zoptymalizowana dla odwróconego wielofotonowego systemu konfokalnego wyposażonego w zmotoryzowany stół oraz ciemną komorę klimatyczną w temperaturze 35.8 °C.

  1. Zanurzyć mysz w anestezji w komorze indukcyjnej, stosując mieszankę 3% izofluranu/O2. Potwierdzić utratę przytomności, przeprowadzając test wycofania łapy (opisany w kroku 2.6). Nałożyć maść do oczu, aby zapobiec odwodnieniu rogówki podczas sesji obrazowania.
  2. sprawdzić stan ramy i pokrywy R.MIW, w tym stabilność szwów lub ewentualne uszkodzenia pokrywy. W przypadku uszkodzenia pokrywy można ją wymienić zgodnie z opisem w kroku 5.
  3. Przenieść mysz do podgrzewanej (37 °C), specjalnie wykonanej skrzynki do obrazowania (Rysunek 3A) i umieścić głowę myszy w stożku nosowym. Skrzynka do obrazowania składa się z ramy, która pasuje do zautomatyzowanego stolika mikroskopu. Rama jest zaprojektowana tak, aby pomieścić specjalną wkładkę z otworem o średnicy R.MIW (Rysunek 3A).
  4. Wlot ze stożkiem nosowym jest podłączony do przodu skrzynki i przyłączony do stacji z parownikiem izofluranu przy użyciu mieszanki 2%-3% izofluranu/O2. Wylot jest podłączony do jednostki odprowadzającej środki anestetyczne, aby zapewnić cyrkulację i zapobiec gromadzeniu się izofluranu w skrzynce. Skrzynkę do obrazowania można zamknąć za pomocą przezroczystej pokrywy.
  5. Ułożyć mysz na wkładce w taki sposób, aby R.MIW znajdowało się w otworze wkładki skrzynki do obrazowania (Rysunek 3A). Nałożyć parafilm i taśmę papierową na grzbiet myszy, aby ją ustabilizować i zmniejszyć ruchy tkanek wynikające z oddychania.
  6. Zamknąć skrzynkę do obrazowania pokrywą i włożyć ją do stolika mikroskopu.
  7. Stopniowo zmniejszać dawkę izofluranu w trakcie sesji obrazowania, aby utrzymać stabilną, ale płytką anestezję (zazwyczaj w zakresie od 1,5% do 0,8% mieszanki izofluranu/O2).
  8. Zapewnić odpowiednie odżywianie podczas obrazowania zgodnie z poniższym opisem.
    1. W przypadku sesji obrazowania <3 h, wstrzyknąć myszy podskórnie 200-300 µL sterylnego PBS w celu nawodnienia.
    2. W przypadku sesji obrazowania >3 h, postępować zgodnie z poniższymi krokami.
      1. W przypadku obrazowania długoterminowego podawać myszy składniki odżywcze. W tym celu należy użyć dostępnej w handlu sterylnej mieszanki infuzyjnej zawierającej aminokwasy i glukozę. Umieścić elastyczną igłę podskórnie w karku myszy i zabezpieczyć ją taśmą papierową.
      2. Przymocować strzykawkę 10 mL z przygotowaną mieszanką odżywczą do elastycznej rurki silikonowej i przepchnąć mieszankę, aż dotrze ona do końca rurki.
      3. Połączyć rurkę silikonową z elastyczną igłą. Przeciągnąć koniec rurki przez jeden z otworów skrzynki do obrazowania (od wewnątrz na zewnątrz, pozostawiając stronę z mocowaniem igły wewnątrz skrzynki).
      4. Wstrzykiwać 50 µL roztworu infuzyjnego co 30 min.
  9. Zabezpieczyć skrzynkę do obrazowania w stoliku mikroskopu i zdefiniować obszar zainteresowania, korzystając z trybu epifluorescencyjnego mikroskopu.
  10. Zastosować odpowiednie ustawienia mikroskopu w zależności od modelu myszy (Rysunek 3B). Struktury naczyń, wzory kolagenu (wizualizowane za pomocą generowania drugiej harmonicznej) oraz inne stabilne struktury anatomiczne, w tym węzeł chłonny pachwinowy, mogą służyć jako punkty orientacyjne. Pozyskać obrazy za pomocą odwróconego konfokalnego mikroskopu wielofotonowego przy głębokości 12 bitów i obiektywie wodnym 25x, stosując rozmiar kroku Z w zakresie od 1,0 do 4,0 µm (całkowity stos z w zakresie od 150 do 800 µm). Zastosować następujące standardowe ustawienia: format 1024 x 1024, prędkość skanowania 600 Hz, tryb dwukierunkowy.
  11. Wizualizować włókna kolagenu typu I, przeprowadzając generowanie drugiej harmonicznej przy użyciu długości fali wzbudzenia 860 nm i detekcji przy 425-435 nm. Długości fal wzbudzenia i detekcji dla różnych fluoroforów podano w Tabeli 1.

Tabela 1. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

  1. Użyj funkcji Spiral w trybie nawigacji oprogramowania do obrazowania, aby wygenerować szeroki skan mozaikowy (tilescan), który posłuży jako mapa referencyjna tkanki (Rycina 3B). Zdefiniuj obszary ROI w obrębie spiralnego podglądu oraz określ górną i dolną płaszczyznę Z w celu ustalenia stosu Z. Naciśnij Start, aby uzyskać szczegółowe trójwymiarowe (xyz) lub czterowymiarowe stosy Z (xyzt) tkanki.
    UWAGA: Przez cały czas trwania eksperymentu obrazowania należy ściśle monitorować mysz. W przypadku długich sesji obrazowania zaleca się stosowanie pulsoksymetru i sondy temperatury. Oddech myszy powinien być regularny i utrzymywać stałe tempo. Jeśli u myszy pojawią się oznaki duszności, należy zmniejszyć ilość izofluranu.
  2. Po zakończeniu każdej sesji obrazowania trzymaj mysz na macie grzewczej aż do pełnego wybudzenia. Jeśli mysz wykazuje oznaki dyskomfortu lub ograniczoną ruchomość, pozostaw klatkę na macie grzewczej na dłuższy czas i podaj żele odżywcze zamiast zwykłej karmy.
    UWAGA: Pomiędzy sesjami obrazowania należy ściśle monitorować mysz pod kątem oznak dyskomfortu, takich jak zmniejszone spożycie pokarmu i wody, szybki oddech, zmniejszona ruchomość, drżenie, nieprawidłowa postawa ciała lub zaniedbane futro. W przypadku wyraźnych oznak dyskomfortu należy postępować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt i przerwać eksperyment po osiągnięciu humanitarnego punktu końcowego.
  3. Powtarzaj kroki 4.1-4.12 podczas każdej kolejnej sesji obrazowania, korzystając ze skanu mozaikowego podglądu, aby odnaleźć tę samą pozycję (pozycje) w wielu punktach czasowych (Rycina 3B). Częstotliwość obrazowania zależy od pytania badawczego oraz czasu trwania badanego procesu i zazwyczaj wynosi od dwóch sesji dziennie do jednej sesji w tygodniu.
  4. Po zakończeniu pożądanego okresu eksperymentalnego uśmierć zwierzęta z implantowanym R.MIW poprzez głęboką narkozę izofluranem, a następnie dyslokację szyjną. W razie potrzeby wypreparuj interesujące organy do dalszych analiz ex vivo.
  5. Alternatywnie można pozostawić zwierzę przy życiu do przyszłych analiz in vivo. W takim przypadku usuń szew kieszonki utrzymujący R.MIW, przecinając go nożyczkami sprężynowymi, a następnie ostrożnie odseparuj pierścień okna od skóry myszy za pomocą pęsety tępą końcem. Oczyść brzegi skóry, które wcześniej trzymały okno, i wykonaj prosty szew ciągły (materiał wchłanialny, np. kwas poliglikolowy).
  6. Po zamknięciu skóry zwiąż początkowy i końcowy fragment nici szwu dwoma węzłami kwadratowymi (4 pętle). Aby zminimalizować niedokrwienie tkanek, węzły powinny być na tyle luźne, aby umożliwić przepływ krwi na brzegu skóry. Zdezynfekuj ranę powidonem jodowym, aby zapobiec zapaleniu i przyspieszyć gojenie się skóry.

Układ mikroskopii fluorescencyjnej myszy; schemat widoczności komórek, manipulacji tkanką, leczenia miejscowego.
Rycina 3: Przepływ pracy dla podłużnego IVM. (A) Schematyczne przedstawienie typowego wielodniowego eksperymentu IVM. (B) Obrazowanie regionu tumorigenicznego w dorosłym gruczole mlecznym. Przed każdą sesją obrazowania niskorozdzielczy skan mozaikowy (górny panel) może ułatwić identyfikację obszaru(ów) zainteresowania w kolejne dni obrazowania. Wzór kolagenu I (generacja drugiej harmonicznej, kolor magenta), struktura tkanki oraz rozmieszczenie komórek różnicowo znakowanych białkami fluorescencyjnymi (przedstawione w kolorze zielonym, żółtym i czerwonym) mogą posłużyć do odnalezienia tego samego obszaru tkanki. Paski skali reprezentują 1 mm (skan mozaikowy) i 100 µm (dolne panele). (C) Schematyczna reprezentacja konstruktu reporterowego R26-Confetti. Po indukowanej tamoksyfenem rekombinacji Cre, konstrukt Confetti rekombinuje stochastycznie, co prowadzi do ekspresji jednego z czterech fluoroforów (nGFP, YFP, RFP lub mCFP). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

5. Otwieranie i zamykanie pokrywy R.MIW pomiędzy sesjami obrazowania

  1. Zachowaj sterylność, używając sterylnych rękawiczek, i wysterylizuj wszystkie przedmioty, które będą miały kontakt z myszą. Przed operacją wysterylizuj narzędzia chirurgiczne w autoklawie (szczegóły w kroku 2).
  2. Włącz podgrzewacz i przykryj matę sterylną chustą, a następnie znieczul mysz w komorze indukcyjnej, stosując 3% mieszaninę isofluranu/O2. Zweryfikuj prawidłowy przebieg znieczulenia, wykonując test odruchu cofnięcia łapy.
  3. Przenieś mysz z komory indukcyjnej do maski anestezjologicznej i zmniejsz stężenie isofluranu do 1,5%-2% mieszaniny isofluranu/O2.
  4. Włóż końcówki cienkich pęsety przez otwory w ramionach pokrywy i poluzuj pokrywę, obracając ją przeciwnie do ruchu wskazówek zegara. W razie potrzeby nanieś na okno nieco podgrzanego sterylnego PBS (37 °C), aby ułatwić poluzowanie pokrywy.
  5. Umieść pokrywę R.MIW w sterylnym naczyniu z sterylnym PBS do czasu dalszego użycia. Oczyść szkiełko pokrywy wodą destylowaną, a następnie 80% etanolem. Przechowuj pokrywę w sterylnym PBS do czasu dalszego użycia.
  6. Zapobiegaj wysychaniu odsłoniętej tkanki, dodając kilka kropli sterylnego PBS na powierzchnię tkanki.
  7. Nanieś lub wstrzyknij interesującą substancję lub komórki na odsłoniętą tkankę; można zastosować objętość maksymalnie 50 µL. Odczekaj kilka minut, aż ciecz zostanie wchłonięta przez tkankę. Alternatywnie można manipulować tkanką lub zmieniać jej położenie za pomocą sterylnej pęsety tępej, aby zoptymalizować warunki obrazowania dla konkretnych ROI.
  8. Nanieś wazelinę na wewnętrzną krawędź R.MIW, uważając, aby nie dotknąć tkanki znajdującej się poniżej. Umieść pokrywę w ramie R.MIW zgodnie z opisem w kroku 3.9, włóż końcówki cienkiej pęsety przez otwory w ramionach pokrywy i dokręć pokrywę, obracając ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara (około 5°).

Wyniki

W celu zbadania dynamiki proliferacji komórek nabłonka gruczołu mlekowego w różnych etapach rozwoju gruczołu zastosowano opisany protokół. Budowa R.MIW przedstawiona jest na Ryc. 1, a procedura implantacji R.MIW została podsumowana na Ryc. 2. R.MIW jest chirurgicznie implantowany pomiędzy gruczołem mlekowym a skórą. Do utrzymania pierścienia okna i zapobiegania wyciąganiu szwów przez myszy stosuje się szew (Ryc. 2). Szwy utrzymujące R.MIW wykonano z niewchłanialnego jedwabiu, który wykazuje właściwości hipoalergiczne, posiada miękką teksturę i jest łatwy w obsłudze. Pierścień R.MIW wykonany jest z tytanu, jednego z najbardziej biokompatybilnych materiałów, który nie indukuje stanu zapalnego ani martwicy po implantacji21. Przy zachowaniu warunków aseptycznych i prawidłowym wykonaniu szwów, implantacja R.MIW w gruczole mlekowym wiąże się z niskim ryzykiem powikłań pooperacyjnych. Co więcej, w przeciwieństwie do implantacji okna obrazującego w jamie brzusznej22, implantacja R.MIW nie jest czynnikiem ograniczającym przeżywalność myszy, ponieważ gruczoł mlekowy nie jest organem życiowo ważnym, co umożliwia codzienne obrazowanie do limitu określonego w protokole etycznym. Jedynym czynnikiem ograniczającym czas trwania implantacji okna jest homeostatyczna wymiana skóry, co w konsekwencji doprowadzi do wypadnięcia szwów po 4 - 6 tygodniach. Dlatego ważne jest regularne kontrolowanie stabilności szwów. W razie potrzeby szwy można usunąć i zastąpić nowym szwem typu woreczek w warunkach aseptycznych (zgodnie z opisem w krokach 3.5 - 3.8), aby zapewnić stabilność okna.

Głównym wyzwaniem przy zastosowaniu podejścia obrazowania wielodniowego jest ponowne odnalezienie ROI w kolejnych dniach. W tym celu przed wyborem ROI można przeprowadzić szybki skan przeglądowy (Rycina 3B). Do ponownego zlokalizowania tego samego obszaru tkanki można wykorzystać wiele punktów orientacyjnych, w tym sygnał sieci kolagenowej (wizualizowany za pomocą generacji drugiej harmonicznej), strukturę tkanki, a także lokalne wzorce komórek różnicowo lub stochastycznie znakowanych barwnikami lub białkami fluorescencyjnymi (Rycina 3B). W tym reprezentatywnym przykładzie R.MIW wszczepiono do 4. gruczołu mlekowego samicy myszy MMTV-PyMT;R26-CreERT2het;R26-Confettihet w momencie rozpoczęcia tworzenia się wyczuwalnego guza. Następnie indukowano stochastyczną rekombinację poprzez wstrzyknięcie 1,5 mg tamoksyfenu, co doprowadziło do rekombinacji konstrukcji Confetti w niektórych komórkach (Rycina 3C). Rekombinowane komórki nowotworowe śledzono przez okres 20 dni (Rycina 3B,C). Jeśli obrazowanie tego samego obszaru gruczołu mlekowego w kolejnych dniach jest niemożliwe, okno można otworzyć w środowisku aseptycznym (zgodnie z opisem w kroku 5.1), aby dodatkowo go oczyścić i repozycjonować tkankę w celu poprawy widoczności i akwizycji obrazu (Rycina 3A).

Zastosowanie tej metody pozwoliło na obserwację rozwijającego się gruczołu mlekowego w okresie dojrzewania na poziomie pojedynczych komórek. Powtarzalne IVM za pomocą R.MIW przeprowadzono u samic myszy R26-CreERT2het;R26-mTmGhet w wieku od 4 do 6 tygodni, w których wszystkie komórki są oznakowane błonowym białkiem tdTomato (Rysunek 4A)23. Myszy wstrzyknięto niską dawką tamoksyfenu (0,2 mg/25 g masy ciała), co doprowadziło do sporadycznej rekombinacji konstruktu mTmG, powodując zmianę koloru z czerwonego na zielony w niektórych komórkach we wszystkich tkankach, w tym w gruczole mlekowym (Rysunek 4B). Te same obszary zainteresowania (ROI) analizowano przez wiele dni, aby zwizualizować zmiany morfologiczne w gruczole mlekowym, w tym wydłużanie i rozgałęzianie przewodów (Rysunek 4C) z rozdzielczością komórkową. Co istotne, ta kombinacja stochastycznego znakowania komórek i wielodniowego IVM pozwala również na wizualizację dynamicznych zmian w środowisku przewodowym, takich jak dynamika pojedynczych komórek w zrębie otaczającym wydłużające się i rozgałęziające przewody (Rysunek 4D), a także dynamika komórkowa w węźle chłonnym pachwinowym (Rysunek 4E).

Rekombinacja indukowana tamoksyfenem, konstrukt mT/mG, obrazowanie 3D, ekspresja Cre, mikroskopia w płaszczyźnie Z.
Rysunek 4: Wielodniowy IVM morfogenezy rozgałęziania w okresie dojrzewania płciowego. (A) Myszy w okresie dojrzewania płciowego R26-CreERT2; R26-mTmG w wieku od 4 do 6 tygodni otrzymały wstrzykniętą niską dawkę tamoksyfenu, co doprowadziło do rekombinacji allelu R26-mTmG zapośredniczonej przez białko Cre; obrazy wykonano w dniach 1, 3 i 5, aby śledzić dynamiczne zmiany w rozwijającym się gruczole mlekowym. (B) Schematyczny rysunek konstruktu mysiego R26-mTmG , który w warunkach braku rekombinacji skutkuje powszechną ekspresją błonowego tdTomato (mT). Po rekombinacji zapośredniczonej przez białko Cre, ekspresja mT zostaje zastąpiona ekspresją błonowego eGFP (mG). (C) Rendering 3D wydłużającego się i rozgałęziającego przewodu mlecznego w ciągu wielu dni, obrazowanego przez R.MIW u samicy myszy R26-CreERT2; R26-mTmG w wieku 6 tygodni. (D) Pojedyncze obrazy w płaszczyźnie Z końcówki rozgałęzienia (panele górne) i wydłużającego się odgałęzienia (panele dolne). mT przedstawiono w kolorze czerwonym, a mG w cyjanowym; paski skali oznaczają 100 µm (A i B). Pojedyncze komórki w zrębie zaznaczono białymi gwiazdkami. Należy zauważyć, że intensywność sygnału została zwiększona ręcznie, aby uwydatnić pojedyncze komórki w zrębie, co doprowadziło do lekkiego prześwietlenia komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego. (E) Reprezentatywne obrazy węzła chłonnego pachwinowego samicy myszy R26-CreERT2; R26-mTmG obrazowanego przez R.MIW, przedstawiające ogólny skan mozaikowy (panel lewy), obrazy powiększone (panele prawe) pojedynczej płaszczyzny Z (góra) oraz rendering 3D (dół). Generacja drugiej harmonicznej (kolagen I) pokazana jest w kolorze zielonym, mT w czerwonym, a mG w cyjanowym. Paski skali oznaczają 500 µm (ogólny skan mozaikowy) i 100 µm (obrazy powiększone). Panele rysunku C i D zostały zmodyfikowane z pracy Messal i wsp. 2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Podobnie w dorosłym gruczole piersiowym zaproponowane podejście R.MIW umożliwia wizualizację tych samych struktur przewodowych przez wiele dni przy zachowaniu niezakłóconej widoczności. Nawet zastosowanie mniej jasnych modeli reporterowych z fluorescencją24, takich jak model mysi Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP), pozwala na wizualizację stabilności przewodów oraz subtelnych zmian morfologicznych w rozdzielczości komórkowej (Rysunek 5). Należy zauważyć, że widoczność między 3. a 5. dniem uległa znacznej poprawie po repozycjonowaniu tkanki (Rysunek 5).

Schemat obrazowania in vivo; ustawienie myszy; Cdh1-mCFP; wizualizacja kolagenu I w czasie; wynik eksperymentu.
Rysunek 5: Wielodniowe obrazowanie dorosłego gruczołu mlekowego. Renderowane obrazy 3D struktury przewodowej gruczołu mlekowego dorosłej samicy myszy Cdh1-mCFP (cyjan, znakowanie ekspresji komórek luminalnych wykazujących obecność ekadheryny) w ciągu wielu kolejnych dni. Wzorzec kolagenu I (generowanie drugiej harmonicznej, magenta) posłużył do ponownego zlokalizowania tego samego ROI, a sygnał Cdh1-mCFP został użyty do oznaczenia komórek przewodowych (luminalnych). Należy zauważyć, że widoczność po 3. dniu poprawiła się dzięki otwarciu pokrywy R.MIW i repozycjonowaniu tkanki. Paski skali reprezentują 100 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Aby ocenić heterogenność proliferacyjną komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego podczas cyklu hormonalnego na poziomie pojedynczych komórek, wykorzystano fotokonwertowalny model mysi z reporterem Kikume Green-Red (KikGR)25,26, charakteryzujący się powszechną ekspresją białka KikGR. KikGR jest jasnym fluorophorem, który ulega konwersji z koloru zielonego na czerwony po ekspozycji na światło fioletowe, a stosunek czerwieni do zieleni może służyć jako wskaźnik aktywności proliferacyjnej komórki2 (Rysunek 6A,B). Stosując podejście R.MIW, śledziliśmy te same komórki w obrębie drzewa przewodowego dorosłego gruczołu mlekowego przez kilka dni i stwierdziliśmy wcześniej nieprzewidzianą heterogenność proliferacyjną w całym drzewie przewodowym (Rysunek 6C). Komórki o wysokiej i niskiej aktywności proliferacyjnej były równomiernie rozmieszczone w różnych konwertowanych obszarach (Rysunek 6C,D). Uderzające jest to, że na poziomie lokalnym sąsiednie komórki wykazywały duże różnice w stosunku czerwieni do zieleni (Rysunek 6C,D). Ilościowe oznaczenie stosunku czerwieni do zieleni w różnych komórkach (jako wskaźnika ich aktywności proliferacyjnej) 10 dni po fotokonwersji wykazało bardzo zmienne tempo rozcieńczania niektórych komórek w tym samym mikrośrodowisku przewodowym (Rysunek 6E). Łącznie dane te ujawniają niezwykłą lokalną heterogenność proliferacyjną w dorosłym gruczole mlekowym i jednocześnie globalnie jednolity wskaźnik wymiany komórkowej.

Schemat podziału komórek i degradacji białek z mikroskopią fotokonwersyjną; analiza stosunku czerwonego do zielonego sygnału.
Rysunek 6: Podłużna IVM heterogeniczności proliferacyjnej w dorosłym gruczole mlekowym z wykorzystaniem modelu mysiego KikGR. (A) Myszy KikGR obrazowano w dniu 0 przed i po ekspozycji na światło fioletowe. Sesje obrazowania powtarzano w dniach 2, 6 i 10 po konwersji. (B) Schematyczne przedstawienie hipotetycznych wyników po fotokonwersji komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego KikGR w zależności od czasu, w przypadku wystąpienia proliferacji (panel lewy) oraz braku proliferacji (panel prawy). (C) Ten sam obszar gruczołu mlekowego obrazowano przez R.MIW w okresie 10 dni. Mniejsze regiony poddano fotokonwersji w dniu 0, a analiza wykazuje podobną szybkość rozcieńczenia czerwonego sygnału Kikume w czasie, co wskazuje na jednakową częstotliwość wymiany komórek w całym nabłonku. (D) Powiększone obrazy (pojedyncze płaszczyzny Z) wskazanych regionów w panelu C pokazują heterogeniczność proliferacyjną na poziomie komórkowym 6 i 10 dni po fotokonwersji. Paski skali reprezentują 100 µm (panel C) oraz 10 µm (panel D). (E) Ilościowe oznaczenie stosunku czerwonego do zielonego sygnału w losowo wybranych komórkach (n = 48 komórek) w trzech obszarach poddanych fotokonwersji. Wysoki stosunek czerwonego do zielonego sygnału świadczy o niskiej szybkości rozcieńczenia i niskiej aktywności proliferacyjnej, natomiast niski stosunek czerwonego do zielonego sygnału świadczy o wysokiej szybkości rozcieńczenia i proliferacji. Panele C-E zostały zmodyfikowane z pracy Messal i wsp. 2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

R.MIW umożliwia obrazowanie podłużne zdrowego i chorego gruczołu sutkowego w jego naturalnym i minimalnie zakłóconym środowisku oraz umożliwia wielokrotną wizualizację gruczołu sutkowego na różnych etapach rozwoju. Konstrukcja R.MIW pozwala na otwarcie okna w dowolnym momencie eksperymentu. Długotrwały dostęp wzrokowy do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania może być utrudniony, na przykład przez gromadzenie się resztek komórkowych na szkiełku nakrywkowym. W takich przypadkach R.MIW można otworzyć przed lub bezpośrednio po sesji obrazowania, aby umożliwić oczyszczenie całego widocznego obszaru tkanki i pokrywy. Zdejmowana pokrywa umożliwia również manipulacje tkanką, a także miejscowe nakładanie substancji, takich jak określone inhibitory i terapie, barwniki znakujące lub określone typy komórek będących przedmiotem zainteresowania.

Metoda ta przezwycięża ograniczenia wcześniej opisanych procedur płata sutka 4,7,8,13, które są ograniczone do jednej sesji obrazowania i mogą wizualizować procesy, takie jak rozgałęziona morfogeneza (ryc. 5), homeostatyczny obrót tkankowy (ryc. 6) lub wzrost guza na poziomie komórkowym (ryc. 3B). Jednocześnie jednak R.MIW umożliwia miejscową manipulację tkanką pomiędzy sesjami obrazowania, co stanowi wielką zaletę R.MIW w porównaniu z wcześniej opublikowanym MIW 3,18 i wszystkimi innymi oknami obrazowania20,22. Podczas otwierania R.MIW ważne jest, aby przez cały czas utrzymywać warunki aseptyki, aby zapobiec jakiemukolwiek źródłu infekcji. Możliwość otwarcia R.MIW w aseptycznym środowisku pozwala na optymalizację warunków obrazowania przed każdą sesją obrazowania, co znacznie poprawia długoterminowy dostęp wzrokowy do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. W szczególności w gruczole sutkowym, który jest osadzony w zrębie bogatym w adipocyty, ma to wielką wartość. Co więcej, wymienna pokrywa może w unikalny sposób umożliwić miejscowe podawanie środków terapeutycznych, różnych typów komórek, barwników znakujących, mikrodysekcji sterowanej obrazem lub jakiejkolwiek innej lokalnej manipulacji tkanką bez konieczności przerywania eksperymentu IVM. Na przykład, aby zbadać inicjację guza, określone populacje komórek rakowych można wstrzyknąć bezpośrednio do drzewa przewodowego lub zrębu w określonym punkcie czasowym IVM i dokładnej lokalizacji gruczołu sutkowego, o ile ten zwrot z inwestycji jest dostępny przez pierścień R.MIW. Aby zbadać progresję guza, określone populacje komórek nowotworowych (w określonym miejscu, w określonym mikrośrodowisku lub o określonym zachowaniu) mogą być oznaczone zdjęciem podczas sesji IVM, a następnie poddane mikrosekcji za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego po otwarciu R.MIW. Wyizolowane komórki mogą być dalej przetwarzane do dalszych analiz, takich jak sekwencjonowanie mRNA (pojedynczych komórek). Stosując to podejście, można połączyć zachowanie komórek in vivo z profilami ekspresji molekularnej. Zaletą miejscowego podawania leków przez R.MIW jest możliwość obrazowania tkanki przed i bezpośrednio po zabiegu. Interwał potrzebny do wyjęcia myszy z pudełka do obrazowania, a następnie do wykonania miejscowego podania leku po otwarciu pokrywy R.MIW można wykonać w ciągu kilku minut, co pozwala na natychmiastowe wychwycenie fazy szybko działających leków.

Pokazujemy, że IVM gruczołu sutkowego za pośrednictwem R.MIW jest kompatybilny z wieloma różnymi fluorescencyjnymi modelami myszy reporterowych. Środowisko bogate w tłuszcz jest trudne do zobrazowania, dlatego zaleca się stosowanie jasnych fluoroforów. Jednak, jak pokazano tutaj, nawet mniej jasne fluorofory, takie jak mCFP, mogą być wizualizowane przez R.MIW w optymalnych warunkach obrazowania. Nieuchronnie poduszeczka tłuszczowa uniemożliwi obrazowanie głębszych struktur przewodowych i ograniczy obrazowanie do bardziej powierzchownych przewodów. Obraz poglądowy o niskiej rozdzielczości na początku każdego eksperymentu IVM pomoże zidentyfikować interesujące struktury przewodowe, które są wystarczająco powierzchowne do obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Miejscowa manipulacja tkanką, usunięcie tkanki łącznej lub repozycja tkanki tłuszczowej po otwarciu R.MIW może zoptymalizować IVM pod kątem określonych zwrotów z inwestycji, które są nakładane przez tkankę tłuszczową. Jest to ważna zaleta w stosunku do wszystkich poprzednich konstrukcji okien, które nie pozwalają na wykonywanie tych manipulacji i wymagałyby całkowitego usunięcia samego okna. W szczególności w celu wizualizacji pachwinowego węzła chłonnego zaleca się delikatne usunięcie leżącej nad nim tkanki tłuszczowej, co zmniejsza rozpraszanie światła i umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości. Podczas manipulowania tkanką należy zawsze zachowywać warunki aseptyczne i zapobiegać krwawieniu lub poważnemu uszkodzeniu tkanki, ponieważ mogą one wpływać na procesy badane podczas eksperymentu IVM.

R.MIW jest wykonany z tytanu, materiału, który jest powszechnie stosowany w praktyce klinicznej do zastępowania tkanek twardych, takich jak stawy lub płytki kostne. Tytan ma kilka zalet w porównaniu z oknami stalowymi, w tym lekkość i obojętność21. Ostatnio wykorzystano kilka innych materiałów do wygenerowania nowatorskich typów okien obrazowania, w tym elastycznego okna krzemowego20. W przeciwieństwie do R.MIW, elastyczne okienko nie wymaga żadnych szwów do implantacji i nadaje się do prawie każdej pozycji anatomicznej, szczególnie w przypadku tkanek miękkich i delikatnych. Okna silikonowe mają minimalny wpływ na ruchliwość zwierząt ze względu na ich lekką i odkształcalną naturę i być może bardziej nadają się do eksperymentów badających szybką ekspansję i wzrost tkanek20. Kolejną zaletą w stosunku do wersji tytanowej jest to, że okienka krzemowe są kompatybilne z innymi metodami obrazowania, w tym z rezonansem magnetycznym20,27. Należy jednak pamiętać, że obiektywy są zoptymalizowane pod kątem szkiełek nakrywkowych o grubości 0,17 mm. Ponadto tkanka sutka jest podatna na ruchy oddechowe, które trudno ograniczyć za pomocą elastycznego okienka, zwłaszcza podczas korzystania z mikroskopu odwróconego. Artefakty oddychania są zminimalizowane dzięki konstrukcji R.MIW i zamocowaniu R.MIW we wkładce pudełka do obrazowania. W rezultacie obrazy uzyskane przy użyciu proponowanej konfiguracji R.MIW nie są zniekształcone z powodu artefaktów oddychania. Mogą jednak wystąpić niewielkie odchylenia w lokalizacji tkanki, które zwykle są stopniowe i można je skorygować za pomocą oprogramowania do korekcji ruchu po akwizycji28. Wraz z rosnącym zestawem narzędzi technologii IVM 2,20, szczegółowe wymagania dla każdego eksperymentu ostatecznie określą najlepszy sposób wizualizacji in vivo tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Różne konstrukcje okien mają różne zalety i wady i w zależności od pytania badawczego, dostępnej konfiguracji mikroskopowej, wymaganej rozdzielczości przestrzennej i czasowej oraz całkowitej długości badanego procesu, należy określić optymalne podejście.

Podsumowując, R.MIW ułatwia charakterystykę dynamiki komórkowej w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju gruczołu sutkowego, homeostazy i choroby w ciągu wielu dni do tygodni.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fundację Badawczą Flandrii (grant doktorski na badania podstawowe 11L7222N dla M.C.), Fundację Boehringer Ingelheim (stypendium doktoranckie dla C.L.G.J.S.), stypendium podoktorskie EMBO (grant ALTF 1035-2020 dla C.L.G.J.S.) oraz Nagrodę Doktora Josefa Steinera (dla J.v.R.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% NaClBD306573Dostępne inne marki
Okrągła szklana szklana nakrywka 10 mmFisher scientific10696365Inne dostępne marki
5-0 plecione jedwabne niciEthiconW580
80% etanoludomowej robotyNA
Pudełko indukcyjne do anestezjologiiKentscientificVetFlo-MSEKIT
Buprenorfina (Vetergesic®)EcupharNA
Bawełniane końcówki (sterylne)Fisher scientific13113743Dostępne inne marki
Klej cyjanoakrylowyLoctiteNADostępne inne marki
Maść do oczuDuratearsNA
Elastyczna igła motylkowaGreiner Bio-One450120Dostępne inne marki
Kleszcze Graefe ()Fine Science Tools11051-10
Poduszka grzewczaKentscientificRightTemp Jr.Dostępne inne marki
Pudełko doobrazowania Wykonane na zamówienieNA
Mieszanka składników odżywczych do zaparzaniaBraunNutriflex special 70/240
Strzykawki insulinoweBD324911Dostępne inne marki
Odwrócony mikroskop wielofotonowy z automatycznym stolikiemLeica MicrosystemsNA
Waporyzator izofluranowyKentscientificVetFlo-1231K
Uchwyt na igłęFine Science Tools12510-14
ParafilmSigma-AldrichP7793taśma półprzezroczysta
Taśma papierowa tesa tesaNA
Petroleum JellyWazelinaNA
scientific11904325Dostępne inne marki
Rurki silikonoweRozwiązania ElastomeryNADowolne artykuły gospodarstwa domowego
Nożyczki sprężynowe (małe)Fine Science Tools15018-10
PBSThermoFisher Scientific10010023
(10 ml)BD305482Dostępne inne marki
Cienkie kleszczeFine Science Tools11413-11
Tytanowa pokrywa do okienkado obrazowania sutkaWykonane na zamówienieNA
Tytanowe okienko do obrazowania sutkaWykonane na zamówienieNA
Drewniane patyczki WykałaczkiFisher scientificNC1678836Dostępne inne marki
Żyletki Fisher Sterylna strzykawka

Bibliografia

  1. Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment. Development. 147 (22), Cambridge, England. (2020).
  2. Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. An Intravital Microscopy Toolbox to Study Mammary Gland Dynamics from Cellular Level to Organ Scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
  3. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  4. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  5. Scheele, C. L., et al. Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis. Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).
  6. Kotsuma, M., et al. Nondestructive, serial in vivo imaging of a tissue-flap using a tissue adhesion barrier. IntraVital. 1 (1), 69-76 (2012).
  7. Ingman, W. V., Wyckoff, J., Gouon-Evans, V., Condeelis, J., Pollard, J. W. Macrophages promote collagen fibrillogenesis around terminal end buds of the developing mammary gland. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 235 (12), 3222-3229 (2006).
  8. Entenberg, D., et al. large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods (San Diego, Calif). 128, 65-77 (2017).
  9. Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. Intravital Imaging of the Lactating Mammary Gland in Transgenic Mice Expressing Fluorescent Proteins. Advances in Intravital Microscopy. , Springer. Netherlands. 187-204 (2014).
  10. Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).
  11. Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion. Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).
  12. Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (43), 26822-26832 (2020).
  13. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of Mice for Long-Term Intravital Imaging of the Mammary Gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).
  14. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of Vital Signs for Long-Term Survival of Mice under Anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563(2011).
  15. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042(2016).
  16. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. IntraVital. 5 (1), 1125562(2016).
  18. Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).
  19. Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).
  20. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
  21. Niinomi, M. Recent research and development in titanium alloys for biomedical applications and healthcare goods. Science and Technology of Advanced Materials. 4 (5), 445-454 (2003).
  22. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  23. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, N., Luo, L. A global double-fluorescent cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), New York, N.Y. 593-605 (2007).
  24. Snippert, H. J., et al. Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  25. Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Developmental Biology. 9, 49(2009).
  26. Kurotaki, Y., Hatta, K., Nakao, K., Nabeshima, Y. I., Fujimori, T. Blastocyst Axis Is Specified Independently of Early Cell Lineage But Aligns with the ZP Shape. Science. 316 (5825), New York, N.Y. 719-723 (2007).
  27. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818(2016).
  28. Warren, S. C., et al. Removing physiological motion from Intravital and clinical functional imaging data. eLife. 7, 35800(2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie pod u neprzebudowa gruczo u mlekowegomanipulacja tkankobrazowanie o wysokiej rozdzielczo ciprogresja nowotworuobrazowanie pojedynczych kom rekgruczo mlekowy myszy
Podłużna mikroskopia przyżyciowa z wykorzystaniem okienka do obrazowania sutkowego z wymienną pokrywą
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.