Artykuł metodologiczny

Podłużna mikroskopia przyżyciowa z wykorzystaniem okienka do obrazowania sutkowego z wymienną pokrywą

DOI:

10.3791/63326

⸱

20 stycznia 2022

 ,  ,  , 
1Center for Cancer Biology, VIB (BE), 2Department of Oncology, KU Leuven (BE), 3Netherlands Cancer Institute, Department of Molecular Pathology, Oncode Institute (NL)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje nowatorskie okno obrazowania sutka z wymienną pokrywą (R.MIW). Mikroskopia przyżyciowa po wszczepieniu R.MIW pozwala na podłużne i wielodniowe obrazowanie zdrowego i chorego gruczołu sutkowego z rozdzielczością komórkową na różnych etapach rozwoju.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozgałęziona struktura gruczołu sutkowego jest bardzo dynamiczna i przechodzi kilka faz wzrostu i przebudowy po urodzeniu. Mikroskopia przyżyciowa w połączeniu z chirurgią płata skórnego lub implantacją okien obrazowych została wykorzystana do zbadania dynamiki zdrowego gruczołu sutkowego na różnych etapach rozwoju. Większość technologii obrazowania gruczołu sutkowego jest ograniczona do ram czasowych od godzin do dni, podczas gdy większość procesów przebudowy gruczołu sutkowego zachodzi w ramach czasowych od dni do tygodni. Aby zbadać przebudowę gruczołu sutkowego, wymagane są metody, które umożliwiają optyczny dostęp do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania przez dłuższy czas. W tym miejscu opisano ulepszoną wersję tytanowego okienka obrazowania sutka z wymienną pokrywą (R.MIW), która umożliwia obrazowanie gruczołu sutkowego w wysokiej rozdzielczości z rozdzielczością komórkową przez okres do kilku tygodni. Co ważne, R.MIW zapewnia dostęp do tkanek przez cały czas trwania eksperymentu obrazowania przyżyciowego i dlatego może być używany do miejscowej manipulacji tkankami, znakowania, podawania leków lub mikrodysekcji sterowanej obrazem. Podsumowując, R.MIW umożliwia charakteryzację dynamiki komórkowej w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju gruczołu sutkowego, homeostazy i choroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonek sutka jest unikalnym organem wydzielniczym obecnym u ssaków, który produkuje i wydziela mleko, aby odżywiać potomstwo. Przez całe życie gruczoł sutkowy przechodzi wiele rund rozwoju i wzrostu, którym towarzyszą zmiany strukturalne i funkcjonalne w klasie1. W zależności od etapu rozwojowego typy komórek przyczyniających się do przebudowy tkanek są różne, a także lokalizacja w drzewie przewodowym.

Wielofotonowa mikroskopia przyżyciowa (IVM) pozwala na badanie dynamiki komórek sutka in vivo w natywnym i minimalnie zaburzonym otoczeniu2,3,4. Aby uzyskać wizualny dostęp do gruczołu sutkowego, opublikowano kilka tymczasowych technik obrazowania ex vivo lub płatów skóry na różnych etapach rozwoju gruczołu sutkowego, w tym w okresie dojrzewania4,5,6,7, dorosłość2,8, laktacja9,10,11,12, and tumor dynamics13,14,15. Chociaż techniki te skutkują obrazowaniem dynamiki komórek sutka w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej, ramy czasowe są ograniczone do godzin, podczas gdy większość procesów przebudowy gruczołu sutkowego trwa od dni do tygodni. Dlatego wymagane są metody, które umożliwiają optyczny dostęp do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania przez dłuższy czas. Z biegiem lat opracowano kilka stałych okien obrazowania do obrazowania guza sutka15,16,17,18, w tym okno obrazowania sutka tytanowego (MIW)2,3,19. Chociaż jest to bardzo przydatne do badania wzrostu guza sutka, wizualizacja zdrowej struktury gruczołu sutkowego pozostała ograniczona do kilku dni. Niedawno opracowano elastyczne okno obrazowania krzemowego, które umożliwia wizualizację gruczołu sutkowego w okresie dojrzewania przez wiele tygodni20. Jednak gruczoł sutkowy jest osadzony w poduszce tłuszczowej bogatej w adipocyty, co prowadzi do nadmiernego rozpraszania światła, aw rezultacie ograniczonej widoczności struktur przewodowych sutka. Dlatego przez cały czas wymagane są doskonałe warunki obrazowania, aby uwidocznić dynamikę tkanek w dłuższych okresach czasu w gruczole sutkowym. Ani klasyczne MIW, ani elastyczne okienko silikonowe nie pozwalają na manipulację tkankami ani optymalizację fizycznej lokalizacji tkanki przed obrazowaniem, ponieważ okienko tworzy zamknięty system po operacji i implantacji. W rezultacie, optymalny dostęp optyczny do leżącej pod spodem tkanki sutka prawdopodobnie stanie się wykluczony przez dłuższy czas. W przeciwieństwie do tego, technika płata skóry pozwala na optymalizację i repozycję tkanki podczas sesji obrazowania, a płat skóry może być powtarzany wiele razy2. Jednak wielokrotne sesje obrazowania przez płat skóry są możliwe tylko wtedy, gdy między operacjami przeznaczono wystarczająco dużo czasu (co najmniej 7 dni), aby umożliwić regenerację skóry, a zatem nadaje się głównie do badania procesów w dłuższych skalach czasowych. Ponadto zaleca się, aby nie wykonywać tej procedury wiele razy ze względu na jej inwazyjny charakter i duże ryzyko infekcji i blizn po zamknięciu rany.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, tj. zapewnić optymalne warunki obrazowania przez dłuższy okres czasu z wysoką częstotliwością, a jednocześnie umożliwić manipulację tkankami, zaprojektowano ulepszoną tytanową wersję MIW z wymienną pokrywą (R.MIW), aby wizualizować zdrowy i chory gruczoł sutkowy przez wiele dni do tygodni2 (Rysunek 1A, B). R.MIW został specjalnie zaprojektowany, aby zapewnić optymalny dostęp do tkanek, umożliwiając bezpośrednią manipulację tkankami przez cały czas trwania eksperymentu IVM, a tym samym umożliwia wizualizację gruczołu sutkowego we właściwym czasie i miejscu przez dłuższy czas. Po zamknięciu R.MIW tworzy hermetyczny system porównywalny do klasycznego MIW (Rysunek 1C). Po otwarciu w warunkach aseptycznych, R.MIW umożliwia miejscową manipulację tkankami w celu poprawy dostępu optycznego, a także umożliwia miejscowe podawanie substancji, takich jak inhibitory szlaków lub agoniści, wstrzykiwanie różnych typów komórek będących przedmiotem zainteresowania, takich jak populacje komórek rakowych lub odpornościowych, lub dodawanie barwników znakujących tkanki. Pokrywę można otworzyć w dowolnym momencie między sesjami obrazowania bez powodowania uszkodzenia tkanki znajdującej się pod spodem.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Projekt okienka do obrazowania sutka z wymienną pokrywą. (A) Widok z góry i z boku na wymienną pokrywę okienka do obrazowania sutka z 10 mm szkłem nakrywkowym przyklejonym do pierścienia. (B) Widok z góry i z boku okienka obrazowania sutka, które składa się z pierścienia zewnętrznego i pierścienia wewnętrznego z rowkiem pomiędzy nimi w celu zabezpieczenia okienka w skórze myszy za pomocą szwu ze sznurka do torebki. Pierścień zewnętrzny ma mały rowek, który pasuje do czterech występów (ramion) pokrywy. (C) Karykatura i rysunki przedstawiające mechanizmy otwierania i zamykania pokrywy. Skośne występy zapewniają, że pokrywa jest zamocowana w ramie okiennej. Ten rysunek został zmodyfikowany z Messal et al. 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ten protokół opisuje projekt i procedurę implantacji R.MIW, a także strategię podłużnego IVM w celu ponownego zbadania tych samych przewodów sutkowych i ich wizualizacji w rozdzielczości komórkowej. R.MIW umożliwia śledzenie podziałów komórkowych i zmian morfologicznych podczas różnych faz rozwojowych gruczołu sutkowego w różnych fluorescencyjnych modelach myszy reporterowych. Podsumowując, R.MIW ułatwia charakterystykę dynamiki komórkowej w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju gruczołu sutkowego, homeostazy i choroby.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury opisane w tym artykule zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi IACUC i KU Leuven i zostały przeprowadzone w kontekście zatwierdzonego wniosku projektowego P160/2020. Przed wykonaniem tego protokołu należy zapoznać się ze strategią analgezji z lekarzem weterynarii i zastosować analgezję przed- i pooperacyjną zgodnie z wytycznymi instytucji.

1. Przygotowanie R.MIW (szacowany czas: 2 godziny)

UWAGA: Do budowy R.MIW zaleca się znalezienie lokalnego producenta, który specjalizuje się w pracy z twardymi materiałami, takimi jak tytan, ponieważ wymaga to specjalnych narzędzi i specjalistycznej wiedzy. Warsztaty specjalizujące się w projektowaniu i produkcji protez tytanowych zazwyczaj dysponują maszynami i wiedzą specjalistyczną do produkcji części R.MIW.

  1. Umieść pokrywkę R.MIW na sterylnej powierzchni z zewnętrzną częścią pokrywy skierowaną do góry (a ramionami pokrywy pochylonymi w dół; Rysunek 1A).
  2. Nałóż klej klejący z cyjanoakrylanu na całą krawędź wieczka i ostrożnie umieść okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 10 mm na wierzchu pokrywy.
    UWAGA: Zawsze przygotuj zapasową pokrywkę ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym jako kopię zapasową podczas zabiegu chirurgicznego.
  3. Użyj sterylnego drewnianego patyczka, aby ustawić szklane szkiełko nakrywkowe i przyłóż pewną siłę, aby go docisnąć, aby zapewnić hermetyczne uszczelnienie między szklanym szkiełkiem nakrywkowym a ramą pokrywki. Upewnij się, że otwory w ramionach pokrywy nie są zakryte przez szkło.
  4. Zdezynfekować pokrywki i R.MIW, zanurzając w 80% etanolu na co najmniej 30 minut na zamkniętej szalce Petriego.
    UWAGA: Nie pozostawiaj pokrywek dłużej niż 1 godzinę w 80% etanolu, aby uniknąć rozpuszczenia kleju cyjanoakrylowego.
  5. Usuń nadmiar kleju klejącego z cyjanoakrylanu ze szklanego szkiełka nakrywkowego za pomocą bawełnianej końcówki nasączonej acetonem.
  6. Przechowuj pokrywki i R.MIW w sterylnym środowisku do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: Ramkę i pokrywki R.MIW można przechowywać w sterylnej probówce lub torbie maksymalnie przez 1 tydzień. Wznawiając eksperyment, zawsze sprawdzaj, czy szklane szkiełko nakrywkowe jest nadal prawidłowo przymocowane do pokrywki przed przystąpieniem do protokołu.

2. Przygotowanie do zabiegu (szacowany czas: 15 min)

UWAGA: Do procedury implantacji R.MIW można użyć samic myszy (>3,5 tygodnia) dowolnego szczepu.

  1. Utrzymuj sterylność, używając sterylnych rękawiczek i sterylizuj wszystkie przedmioty, które będą miały kontakt z myszą. Umyj narzędzia chirurgiczne wodą z łagodnym mydłem, wysusz na powietrzu, zawiń w folię aluminiową bez odsłoniętych rogów i krawędzi i sterylizuj w autoklawie przez cykl 20 minut w temperaturze 120 °C przed zabiegiem.
  2. Przygotuj sterylną platformę chirurgiczną i wysterylizuj powierzchnie 80% etanolem.
    UWAGA: Aby zapewnić sterylność, zabieg można wykonać w komorze przepływowej.
  3. Włącz poduszkę grzewczą i przykryj matę sterylną serwetą. Ułóż sterylne narzędzia na sterylnej serwecie i umieść R.MIW i co najmniej dwie pokrywki pokryte szkłem w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na szalce Petriego (zamknij pokrywkę, aby uniknąć zanieczyszczenia zewnętrznego).
  4. Znieczulić mysz w komorze indukcyjnej za pomocą 3% mieszaniny izofluranu/O2. Upewnij się, że zwierzę jest na tyle zrelaksowane, aby można było nim łatwo manipulować i bez wysiłku przenieść je do maski na nos.
  5. Przenieść mysz z komory indukcyjnej do anestezjologicznej maski na nos i zmniejszyć poziom izofluranu do 1,5% - 2% mieszaniny izofluranu/O2. Sprawdź pełne znieczulenie, wykonując test wycofania łapy.
  6. Aby wykonać test wycofania łapy, mocno ściśnij łapę zwierzęcia za pomocą paznokci lub kleszczy z końcami. W przypadku braku jakiegokolwiek odruchu mięśniowego należy uznać zwierzę za nieprzytomne i przystąpić do przygotowania chirurgicznego. Wykonaj ten test przed manipulacją na zwierzętach i powtarzaj regularnie podczas zabiegów anestezjologicznych i chirurgicznych, aby potwierdzić znieczulenie.
  7. Zastosuj maść do oczu, aby zapobiec odwodnieniu rogówki.
    8. Ogol obszar wokół 4. gruczołu sutkowego za pomocą żyletki (Rysunek 2A).
  8. Użyj 4. sutka jako punktu orientacyjnego. Usuń luźne włosy za pomocą taśmy klejącej.
    UWAGA: Alternatywnie do usunięcia włosków można użyć kremu do depilacji.
  9. Zdezynfekuj odsłoniętą skórę 80% etanolem lub jodonem powidonu i umieść mysz w sterylnym obszarze chirurgicznym na plecach z pyskiem w znieczulającej masce na nos, używając 1,5% mieszaniny izofluranu/O2.
  10. Zabezpiecz przednie i tylne kończyny myszy za pomocą taśmy papierowej.
    UWAGA: Pozostaw znieczuloną i regenerującą się mysz na poduszce grzewczej tak długo, jak to możliwe, podczas i po operacji.
  11. Użyj wstępnie przyciętej sterylnej serwety chirurgicznej lub gazy, aby przykryć mysz, pozostawiając odsłonięte pole operacyjne.

3. Implantacja R.MIW (szacowany czas: 30 min)

  1. Sprawdź, czy zwierzę jest odpowiednio znieczulone, wykonując test wycofania łapy. Delikatnie unieś skórę za pomocą cienkich kleszczyków Graefe i wykonaj nacięcie po przekątnej 10-15 mm za pomocą małych nożyczek sprężynowych w skórze na wierzchu 4. poduszeczki tłuszczowej sutka, używając 4. sutka jako punktu orientacyjnego (Rysunek 2A). Uważaj, aby nie przeciąć ani nie uszkodzić otrzewnej ani gruczołu sutkowego.
  2. Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) na podstawie makroskopowych cech tkanki sutka, w tym lokalizacji węzła chłonnego lub zmiany nowotworowej, i staraj się, aby ROI był centralny w odniesieniu do nacięcia.
  3. Oddziel skórę od poduszeczki tłuszczowej sutka i leżących pod nią warstw tkanki, wykonując rozwarstwienie do 5-8 mm wokół linii nacięcia, aby utworzyć kieszeń pasującą do ramy R.MIW (Rysunek 2BI).
  4. Podnieś R.MIW za pomocą sterylnych kleszczy i sprawdź, czy nacięcie jest wystarczająco duże, aby włożyć okno. W razie potrzeby nieznacznie powiększ nacięcie, aż R.MIW się zmieści.
  5. Usuń R.MIW i umieść szew ze sznurka torebkowego wokół nacięcia za pomocą jedwabnego szwu 5-0 (plecionego, niewchłanialnego). Założyć szew 1-2 mm od krawędzi nacięcia od zewnątrz do wnętrza skóry, zaczynając od ogonowego końca nacięcia.
  6. Przesuń około 5 mm w górę wzdłuż nacięcia i przełóż nić szwu przez skórę od wewnątrz na zewnątrz. Powtórz tę procedurę wzdłuż krawędzi nacięcia, tworząc w ten sposób okrągły szew składający się z 5-6 pętli (Rysunek 2BII). Końcowe wyjście nici szwu powinno znajdować się w odległości około 2-5 mm od pierwszego wejścia.
    UWAGA: Należy uważać, aby nie umieszczać szwu zbyt blisko krawędzi nacięcia, ponieważ zwiększa to ryzyko rozdarcia skóry. Umieszczenie szwu zbyt daleko od krawędzi nacięcia zwiększa ryzyko infekcji między nadmiarem skóry a rowkiem R.MIW.
  7. Dopasuj R.MIW do nacięcia i użyj kleszczyków Graefe, aby ostrożnie umieścić skórę w rowku R.MIW. Upewnij się, że pętle szwu zostały pozostawione na zewnątrz.
  8. Pociągnij za pętle szwu ze sznurka do torebki i zaciśnij szew w rowku R.MIW, delikatnie pociągając za oba końce szwu (Rysunek 2BIII). Zawiąż węzłami chirurgicznymi i odetnij nadmiar nici.
  9. Nałóż wazelinę na wewnętrzną krawędź R.MIW za pomocą wykałaczki, upewniając się, że unikasz tkanki znajdującej się pod spodem. Delikatnie popchnij ramę okienną w dół za pomocą sterylnych kleszczyków lub dwóch opuszków palców i umieść pokrywę w ramie R.MIW (Rysunek 1B). Pozwoli to uniknąć objętości powietrza między tkanką gruczołu sutkowego a pokrywą R.MIW.
  10. Umieść końcówki cienkich kleszczyków przez otwory w ramionach pokrywy i dokręć pokrywkę, przekręcając pokrywkę zgodnie z ruchem wskazówek zegara (około 5°) (Rysunek 1C i Rysunek 2BIV).
  11. Jeśli po dokręceniu pokrywy R.MIW pozostanie trochę powietrza, użyj sterylnej igły do insuliny, aby usunąć nadmiar powietrza. Wprowadzić igłę przez skórę do jamy między tkanką sutka a pokrywką i powoli wyciągnąć tłok, tworząc w ten sposób podciśnienie między tkanką gruczołu sutkowego a pokrywką R.MIW.
  12. Pooperacyjnie należy podawać leki przeciwbólowe, takie jak buprenorfina (0,1 mg/kg rozcieńczona w sterylnym 0,9% NaCl) we wstrzyknięciu podskórnym. Powtórzyć iniekcję podskórną z buprenorfiną po 8 i 16 godzinach od zabiegu.
  13. Umieść mysz z powrotem w klatce, aby wyzdrowiała i uważnie monitoruj, aż całkowicie się obudzi, lub przejdź do kroku 4, aby natychmiast obrazować.
  14. Na tym etapie pooperacyjnym należy uważnie monitorować myszy pod kątem oznak dyskomfortu lub powikłań w oparciu o parametry życiowe, takie jak oddychanie, reaktywność, zachowanie, postawa i masa ciała. Uważnie monitoruj skórę otaczającą okno pod kątem oznak stanu zapalnego i martwicy. Jeśli nie wystąpią żadne komplikacje, R.MIW pozwoli na powtarzanie sesji IVM przez kilka tygodni po implantacji.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Przegląd procedury chirurgicznej i implantacji okiennej. (A) Ukośne nacięcie jest wykonywane w pobliżuczwartego sutka samicy myszy, a skóra i tkanka pod spodem są oddzielone przez rozwarstwienie. (B) Pachwinowy węzeł chłonny i kształt poduszeczki tłuszczowej można wykorzystać do prawidłowej orientacji tkanki (I). Szew sznurkowy zakłada się w skórę wokół nacięcia (II), a po wpasowaniu w ramę okienną szew zaciska się w rowku zabezpieczającym ościeżnicę okienną i zabezpiecza węzłami chirurgicznymi (III). Ostatnim krokiem jest włożenie i zablokowanie pokrywy w ramie okiennej (IV). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Powtarzana mikroskopia przyżyciowa za pomocą R.MIW

UWAGA: Opisana tutaj strategia powtarzania IVM została zoptymalizowana dla odwróconego wielofotonowego systemu konfokalnego wyposażonego w zmotoryzowany stolik i ciemną komorę klimatyczną o temperaturze 35,8 °C.

  1. Znieczulić mysz w komorze indukcyjnej za pomocą 3% mieszaniny izofluranu/O2. Sprawdź, czy utrata przytomności została wykonana, wykonując test wycofania łapy (opisany w kroku 2.6). Nałóż maść do oczu, aby zapobiec odwodnieniu rogówki podczas sesji obrazowania.
  2. Sprawdź stan ramy i pokrywy R.MIW, w tym stabilność szwów lub ewentualne uszkodzenia pokrywy. W przypadku uszkodzenia pokrywy pokrywę można założyć zgodnie z opisem w kroku 5.
  3. Przenieś mysz do wstępnie podgrzanego (37 °C), specjalnie wykonanego pudełka do obrazowania (Rysunek 3A) i umieść mysz z głową w stożku nosowym. Skrzynka obrazowania składa się z ramy, która mieści się w zautomatyzowanym stoliku mikroskopu. Rama została zaprojektowana tak, aby pomieścić wykonaną na zamówienie wkładkę z otworem o średnicy R.MIW (Rysunek 3A) .
  4. Wlot ze stożkiem nosowym jest podłączony z przodu pudełka i podłączony do stacji parownika izofluranu przy użyciu mieszaniny 2%-3% izofluranu/O2. Wylot jest podłączony do urządzenia do oczyszczania środków znieczulających, aby zapewnić krążenie i zapobiec gromadzeniu się izofluranu w pudełku. Pudełko obrazowania można zamknąć za pomocą przezroczystej pokrywy.
  5. Umieść mysz na wkładce w taki sposób, aby R.MIW wpadł do otworu we wkładce pudełka z obrazowaniem (Rysunek 3A). Nałóż parafilm i taśmę papierową na grzbiet myszy, aby ustabilizować mysz i zmniejszyć ruch tkanek spowodowany oddychaniem.
  6. Zamknij pudełko obrazowe pokrywką i włóż pudełko do obrazowania do stolika mikroskopu.
  7. Dawkę izofrubanu należy stopniowo zmniejszać w trakcie sesji obrazowania, aby utrzymać stabilne, ale powierzchowne znieczulenie (zwykle między 1,5%-0,8% mieszaniny izofluranu/O2).
  8. Zapewnij prawidłowe odżywianie podczas obrazowania, jak opisano poniżej.
    1. W przypadku sesji obrazowania <3 godziny wstrzyknij mysz podskórnie 200-300 μl sterylnego PBS w celu nawodnienia.
    2. W przypadku sesji obrazowania trwających >3 godziny należy postępować zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
      1. W przypadku długotrwałego obrazowania napełnij mysz składnikami odżywczymi. W tym celu użyj dostępnej w handlu sterylnej mieszaniny infuzyjnej zawierającej aminokwasy i glukozę. Umieść elastyczną igłę podskórnie w szyi myszy i zabezpiecz ją taśmą papierową.
      2. Podłącz strzykawkę o pojemności 10 ml z przygotowaną mieszanką składników odżywczych do elastycznej silikonowej rurki i przepchnij mieszankę składników odżywczych, aż dotrze do końca tubki.
      3. Podłącz silikonową rurkę do elastycznej igły. Weź koniec rurki i umieść ją w jednym z otworów w pudełku do obrazowania (od wewnątrz na zewnątrz, pozostawiając stronę z mocowaniem igły w pudełku).
      4. Wstrzykiwać 50 μl roztworu infuzyjnego co 30 minut.
  9. Zabezpiecz pudełko obrazowania w stoliku mikroskopu i zdefiniuj obszar zainteresowania za pomocą trybu epifluorescencji mikroskopu.
  10. Zastosuj żądane ustawienia mikroskopu w zależności od modelu myszy (Rysunek 3B). Struktury naczyń krwionośnych, wzory kolagenu (wizualizowane przez generowanie drugiej harmonicznej) i inne stabilne struktury anatomiczne, w tym pachwinowy węzeł chłonny, mogą być używane jako punkty orientacyjne. Uzyskuj obrazy za pomocą odwróconego wielofotonowego mikroskopu konfokalnego o 12-bitowej głębokości i 25-krotnego obiektywu wodnego przy użyciu kroku Z w zakresie od 1,0 do 4,0 μm (całkowity stos z w zakresie od 150 do 800 μm). Zastosuj następujące ustawienia standardowe: format 1024 x 1024, prędkość skanowania 600 Hz, tryb dwukierunkowy.
  11. Wizualizacja włókien kolagenu I poprzez generowanie drugiej harmonicznej za pomocą długości fali wzbudzenia 860 nm i detekcji przy 425-435 nm. Długości fal wzbudzenia i detekcji dla różnych fluoroforów przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

  1. Użyj funkcji Spirala w trybie nawigatora oprogramowania do obrazowania, aby wygenerować duży skan poglądowy w celu utworzenia mapy referencyjnej tkanki (Rysunek 3B). Zdefiniuj ROI w przeglądzie krzywej przejściowej, zdefiniuj górną i dolną płaszczyznę Z, aby określić stos Z. Naciśnij przycisk Start, aby uzyskać szczegółowe trójwymiarowe (xyz) lub czterowymiarowe stosy Z (xyzt) tkanki.
    UWAGA: Podczas całego eksperymentu obrazowego mysz powinna być ściśle monitorowana. W przypadku długich sesji obrazowania zalecany jest pulsoksymetr i sonda temperatury. Oddech myszy powinien być regularny i w tym samym tempie. Jeśli mysz zacznie wykazywać oznaki sapania, należy zmniejszyć ilość izofluranu.
  2. Pod koniec każdej sesji obrazowania trzymaj mysz na poduszce grzewczej do momentu całkowitego wybudzenia. Jeśli mysz wykazuje oznaki dyskomfortu lub zmniejszonej mobilności, trzymaj klatkę przez dłuższy czas na poduszce grzewczej i podawaj żele odżywcze zamiast zwykłej karmy.
    UWAGA: Pomiędzy sesjami obrazowania mysz powinna być ściśle monitorowana pod kątem oznak dyskomfortu, takich jak zmniejszone spożycie pokarmu i wody, szybki oddech, zmniejszony ruch, drżenie, nieprawidłowa postawa ciała lub nieutrzymana sierść. W przypadku wyraźnych oznak dyskomfortu należy postępować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt i zakończyć eksperyment po osiągnięciu humanitarnego punktu końcowego.
  3. Powtórz kroki 4.1-4.12 dla każdej powtórzonej sesji obrazowania i użyj kafelków przeglądu, aby prześledzić te same pozycje w wielu punktach czasowych (Rysunek 3B). Częstotliwość obrazowania będzie zależeć od pytania badawczego i czasu badanego procesu i zazwyczaj waha się od sesji obrazowania dwa razy dziennie do raz w tygodniu.
  4. Pod koniec pożądanego okresu eksperymentalnego należy poddać zwierzęta eutanazji z wszczepionym R.MIW przy użyciu głębokiego znieczulenia izofluranem, a następnie zwichnąć szyjkę macicy. W razie potrzeby należy przeprowadzić sekcję narządów będących przedmiotem zainteresowania w celu przeprowadzenia dalszych analiz ex vivo.
  5. Alternatywnie, utrzymuj zwierzę przy życiu do przyszłych analiz in vivo. W takim przypadku usuń szew woreczka przytrzymujący R.MIW, przecinając go nożyczkami sprężynowymi i ostrożnie odłącz pierścień okienny od skóry myszy za pomocą kleszczy. Oczyść krawędzie skóry, na których wcześniej znajdowało się okienko, i wykonaj prosty ciągły szew (materiał wchłanialny, taki jak kwas poliglikolowy).
  6. Po zamknięciu skóry zawiąż początkową i końcową nić szwu dwoma kwadratowymi węzłami (4 rzuty). Aby zminimalizować niedokrwienie tkanek, węzły powinny być na tyle luźne, aby umożliwić przepływ krwi na krawędzi skóry. Zdezynfekuj ranę jodonem powidonu, aby zapobiec stanom zapalnym i przyspieszyć gojenie się skóry.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Podłużny przepływ pracy IVM. (A) Schematyczne przedstawienie typowego wielodniowego eksperymentu IVM. (B) Obrazowanie obszaru rakotwórczego w obrębie dorosłego gruczołu sutkowego. Przed każdą sesją obrazowania można wykonać obrazowy skan przeglądowy o niskiej rozdzielczości (górny panel) w celu identyfikacji obszaru (regionów) zainteresowania w kolejnych dniach obrazowania. Wzór kolagenu I (generacja drugiej harmonicznej, magenta), struktura tkanki i wzorce różnie znakowanych komórek z białkami fluorescencyjnymi (przedstawionymi na zielono, żółto i czerwono) można wykorzystać do odtworzenia tego samego obszaru tkanki. Podziałki reprezentują 1 mm (płytki poglądowe) i 100 μm (panele dolne). (C) Schematyczne przedstawienie konstrukcji reportera R26-Confetti. Po indukowanej tamoksyfenem rekombinacji Cre, konstrukt konfetti rekombinuje się stochastycznie, powodując ekspresję jednego z czterech fluoroforów (nGFP, YFP, RFP lub mCFP). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Otwieranie i zamykanie pokrywy R.MIW pomiędzy sesjami obrazowania

  1. Utrzymuj sterylność, używając sterylnych rękawiczek i sterylizuj wszystkie przedmioty, które będą miały kontakt z myszą. Autoklaw narzędzi chirurgicznych przed zabiegiem (szczegóły w kroku 2).
  2. Włącz poduszkę grzewczą i przykryj matę sterylną serwetą i znieczul mysz w komorze indukcyjnej za pomocą 3% mieszaniny izofluranu/O2. Sprawdź odpowiednie znieczulenie, wykonując test odruchu wycofania łapy.
  3. Przenieś mysz z komory indukcyjnej do anestezjologicznej maski na nos i zmniejsz poziom izofluranu do 1,5%-2% mieszaniny izofluranu/O2.
  4. Umieść końcówki cienkich kleszczyków przez otwory w ramionach pokrywki i poluzuj pokrywkę, przekręcając pokrywkę w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. W razie potrzeby nałóż trochę wstępnie podgrzanego sterylnego PBS (37 °C) na okienko, aby ułatwić poluzowanie pokrywy.
  5. Umieść pokrywkę R.MIW w sterylnym naczyniu ze sterylnym PBS do czasu dalszego użycia. Wyczyść szklaną pokrywę pokrywy za pomocą demi-wody, a następnie 80% etanolu. Przechowywać pokrywkę w sterylnym PBS do czasu dalszego użycia.
  6. Zapobiegaj wysychaniu odsłoniętej tkanki, dodając kilka kropli sterylnego PBS do powierzchni tkanki.
  7. Nałożyć lub wstrzyknąć dowolną substancję lub komórki będące przedmiotem zainteresowania na odsłoniętą tkankę, można użyć maksymalnej objętości 50 μl. Odczekaj kilka minut, aż płyn zostanie wchłonięty przez tkankę. Alternatywnie, tkanka może być manipulowana lub zmieniana za pomocą sterylnych, kleszczy, aby zoptymalizować warunki obrazowania dla określonych ROI.
  8. Nałóż wazelinę na wewnętrzną krawędź R.MIW, uważając, aby uniknąć tkanki znajdującej się pod spodem. Umieść pokrywę w ramie R.MIW zgodnie z opisem w kroku 3.9, umieść końcówki cienkich kleszczyków w otworach w ramionach pokrywy i dokręć pokrywę, przekręcając pokrywkę zgodnie z ruchem wskazówek zegara (około 5°).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać dynamikę proliferacyjną komórek nabłonka sutka podczas różnych etapów rozwoju gruczołu sutkowego, przeprowadzono opisany protokół. Konstrukcja R.MIW jest przedstawiona w Rysunek 1, a procedura wszczepienia R.MIW jest podsumowana w Rysunek 2. R.MIW jest chirurgicznie wszczepiany między gruczoł sutkowy a skórę. Szew służy do przytrzymywania pierścienia okiennego i zapobiegania ciągnięciu szwów przez myszy (Rysunek 2). Szwy mocujące R.MIW wykonane są z niewchłanialnego jedwabiu, który ma właściwości hipoalergiczne, miękką konsystencję i jest łatwy w obsłudze. Pierścień R.MIW jest wykonany z tytanu, jednego z najbardziej biokompatybilnych materiałów, które nie sprzyjają stanom zapalnym ani martwicy po implantacji21. Jeśli warunki aseptyczne są przestrzegane, a szwy są dobrze wykonane, implantacja gruczołu sutkowego R.MIW stwarza niskie ryzyko powikłań pooperacyjnych. Co więcej, w przeciwieństwie do implantacji okna obrazowania jamy brzusznej22, implantacja R.MIW nie jest czynnikiem ograniczającym przeżycie myszy, ponieważ gruczoł sutkowy nie jest niezbędnym narządem i umożliwia codzienne obrazowanie do limitu określonego w protokole etycznym. Jedynym czynnikiem ograniczającym czas implantacji okienka jest homeostatyczny obrót skóry, który ostatecznie doprowadzi do wypadnięcia szwów po 4 - 6 tygodniach. Dlatego ważne jest, aby regularnie sprawdzać stabilność szwów. W razie potrzeby szwy można usunąć i zastąpić nowym szwem sznurkowym w warunkach aseptycznych (zgodnie z opisem w krokach 3.5 - 3.8), aby zapewnić stabilność okna.

Głównym wyzwaniem podczas korzystania z metody obrazowania wielodniowego jest śledzenie zwrotu z inwestycji w kolejnych dniach. W tym celu można dołączyć szybki skan przeglądowy przed wybraniem ROI(s) (Rysunek 3B). Wiele punktów orientacyjnych tkanek może być użytych do odtworzenia tego samego regionu tkanki, w tym sygnału sieci kolagenowej (wizualizowanego przez generowanie drugiej harmonicznej), struktury tkanki, a także lokalnych wzorców komórek różnicowo lub stochastycznie znakowanych barwnikami lub białkami fluorescencyjnymi (Figura 3B). W tym reprezentatywnym przykładzie R.MIW został wszczepiony do 4. gruczołu sutkowego MMTV-PyMT; R26-CreERT2het; R26-Confettihet samica myszy na początku wyczuwalnego palpacyjnie tworzenia guza. Następnie rekombinację stochastyczną indukowano przez wstrzyknięcie 1,5 mg tamoksyfenu, co spowodowało rekombinację konstruktu Confetti w niektórych komórkach (Figura 3C). Rekombinowane komórki nowotworowe obserwowano przez okres 20 dni (Rysunek 3B, C). Jeśli obrazowanie tego samego obszaru gruczołu sutkowego przez kolejne dni jest wykluczone, okienko można otworzyć w aseptycznym środowisku (jak opisano w kroku 5.1) w celu dalszego oczyszczenia i zmiany położenia tkanki w celu poprawy widoczności i akwizycji obrazu (Rysunek 3A).

Korzystając z tej metody, rozwijający się gruczoł sutkowy w okresie dojrzewania był śledzony na poziomie pojedynczej komórki. Powtórzenie IVM za pomocą R.MIW przeprowadzono przy użyciu R26-CreERT2het; R26-mTmGhet samice myszy w wieku od 4 do 6 tygodni, w których wszystkie komórki są znakowane błoną tdPomidor (Rysunek 4A) < sup class = "xref">23. Myszom wstrzyknięto małą dawkę tamoksyfenu (0,2 mg / 25 g masy ciała), co spowodowało sporadyczną rekombinację konstruktu mTmG, powodując zmianę z czerwonego na zielony w niektórych komórkach we wszystkich tkankach, w tym w gruczole sutkowym (Figura 4B). Te same ROI były ponownie analizowane przez wiele dni, aby uwidocznić zmiany morfologiczne w gruczole sutkowym, w tym wydłużenie przewodu i rozgałęzienie przewodu (Figura 4C) w rozdzielczości komórkowej. Co ważne, to połączenie stochastycznego znakowania komórek i wielodniowego IVM pozwala również na wizualizację dynamicznych zmian środowiska przewodowego, takich jak dynamika pojedynczych komórek w zrębie otaczającym wydłużające się i rozgałęziające się kanały (Rysunek 4D), a także dynamikę komórkową w pachwinowym węźle chłonnym ( Figura 4E).

figure-results-1
Rysunek 4: Wielodniowy IVM morfogenezy rozgałęzień dojrzewania. (A) Dojrzewanie R26-CreERT2; Myszom R26-mTmG w wieku od 4 do 6 tygodni wstrzyknięto małą dawkę tamoksyfenu, co prowadziło do rekombinacji allelu R26-mTmG za pośrednictwem Cre i obrazowano je w dniach 1, 3 i 5 w celu śledzenia dynamicznych zmian w rozwijającym się gruczole sutkowym. (B) Schematyczne przedstawienie konstruktu myszy R26-mTmG, który w warunkach nierekombinowanych powoduje wszechobecną ekspresję błony tdTomato (mT). Po rekombinacji za pośrednictwem Cre, mT jest przełączany na ekspresję eGFP (mG) w błonie. (C) Renderowanie 3D wydłużającego się i rozgałęziającego się przewodu sutkowego przez wiele dni, obrazowane za pomocą R.MIW w R26-CreERT2; Samica myszy R26-mTmG w wieku 6 tygodni. (D) Pojedyncze obrazy w płaszczyźnie Z rozgałęziającej się końcówki (górne panele) i wydłużającej się gałęzi (dolne panele). mT jest pokazane na czerwono, a mG na niebiesko, paski skali reprezentują 100 μm (A i B). Pojedyncze komórki w zrębie są wyróżnione białymi gwiazdkami. Należy zauważyć, że intensywność sygnału została ręcznie zwiększona, aby uwydatnić pojedyncze komórki w zrębie, co doprowadziło do lekko prześwietlonego wyglądu komórek nabłonka sutka. (E) Reprezentatywne obrazy pachwinowego węzła chłonnego R26-CreERT2; Żeńska mysz R26-mTmG zobrazowana przez R.MIW, pokazująca skan kafelka przeglądu (lewy panel), obrazy powiększenia (prawe panele) pojedynczej płaszczyzny Z (na górze) i renderowanie 3D (na dole). Generacja drugiej harmonicznej (kolagen I) jest pokazana na zielono, mT na czerwono, a mG na niebieskozielonym. Paski skali reprezentują 500 μm (kafelki poglądowe) i 100 μm (obrazy powiększone). Panele rysunkowe C i D zostały zmodyfikowane z Messal et al. 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podobnie, w dorosłym gruczole sutkowym, proponowane podejście R.MIW pozwala na wizualizację tych samych struktur przewodowych przez wiele dni z nieograniczoną widocznością. Nawet użycie mniej jasnych fluorescencyjnych modeli reporterowych 24, takich jak mysi model Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP), pozwala na wizualizację stabilności przewodowej i subtelnych zmian morfologicznych w rozdzielczości komórkowej (Rysunek 5). Zauważ, że widoczność między dniem 3 a 5 znacznie się poprawiła po repozycji tkanek (Ryc. 5).

figure-results-2
Rysunek 5: Wielodniowe obrazowanie dorosłego gruczołu sutkowego. Renderowane w 3D obrazy struktury przewodu sutkowego dorosłej samicy Cdh1-mCFP (cyjan, oznaczający ekspresję komórek luminalnych Ecadherin-dodatnich) przez wiele kolejnych dni. Wzór kolagenu I (generacja drugiej harmonicznej, magenta) został użyty do odtworzenia tego samego ROI, a sygnał Cdh1-mCFP został użyty do oznaczenia komórek przewodowych (luminalnych). Należy zauważyć, że widoczność po 3 dniu poprawiła się dzięki otwarciu pokrywy R.MIW i zmianie położenia tkanki. Podziałka skali reprezentuje 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby ocenić proliferacyjna heterogeniczność komórek nabłonka sutka podczas cyklu hormonalnego na poziomie pojedynczej komórki, użyto fotokonwertowalnego modelu myszy reportera Kikume Green-Red (KikGR)25,26, który ma wszechobecną ekspresję białka KikGR. KikGR jest jasnym fluoroforem, który ulega konwersji z zielonego na czerwony pod wpływem światła fioletowego, a stosunek czerwieni do zieleni może być używany jako wskaźnik zastępczy dla aktywności proliferacyjnej komórki2 (Rysunek 6A,B). Stosując podejście R.MIW, obserwowaliśmy te same komórki w drzewie przewodowym dorosłego gruczołu sutkowego przez kilka dni i znaleźliśmy wcześniej nieoczekiwaną heterogeniczność proliferacyjną w całym drzewie przewodowym (Figura 6C). Komórki o wysokiej i niskiej proliferacji były równomiernie rozmieszczone w różnych przekształconych obszarach (Rysunek 6C, D). Uderzające jest to, że na poziomie lokalnym sąsiednie komórki wykazały duże różnice w stosunku koloru czerwonego do zielonego (Rysunek 6C,D). Kwantyfikacja stosunku koloru czerwonego do zielonego różnych komórek (jako wskaźnik zastępczy dla ich aktywności proliferacyjnej) 10 dni po fotokonwersji ujawniła bardzo zmienne tempo rozcieńczania niektórych komórek w tym samym mikrośrodowisku przewodowym (Figura 6E). Łącznie dane te ujawniają niezwykłą lokalną heterogeniczność proliferacyjną w obrębie dorosłego gruczołu sutkowego, a jednocześnie globalny jednolity wskaźnik rotacji.

figure-results-3
Rysunek 6: Podłużny IVM proliferacyjnej heterogeniczności w dorosłym gruczole sutkowym przy użyciu mysiego modelu KikGR. (A) Myszy KikGR zostały zobrazowane w dniu 0 przed i po ekspozycji na światło fioletowe. Sesje obrazowania powtarzano w 2., 6. i 10. dniu po konwersji. (B) Schematyczne przedstawienie hipotetycznych wyników fotokonwersji komórek nabłonka sutka KikGR po proliferacji (lewy panel) i braku proliferacji (prawy panel) w funkcji czasu. (C) Ten sam obszar gruczołu sutkowego był obrazowany przez R.MIW przez okres 10 dni. Mniejsze obszary zostały poddane fotokonwersji w dniu 0 i wykazują podobny stopień rozcieńczenia czerwonego sygnału Kikume w czasie, co wskazuje na równe tempo rotacji w całym nabłonku. (D) Powiększone obrazy (pojedyncze płaszczyzny Z) wskazanych obszarów w panelu C wykazują heterogeniczność proliferacyjną na poziomie komórkowym 6 i 10 dni po fotokonwersji. Podziałki liniowe reprezentują 100 μm (panel C) i 10 μm (panel D). (E) Kwantyfikacja stosunku koloru czerwonego do zielonego losowo wybranych komórek (n = 48 komórek) w trzech obszarach poddanych konwersji zdjęć. Wysoki stosunek koloru czerwonego/zielonego wskazuje na niski stopień rozcieńczenia i niską aktywność proliferacyjną, podczas gdy niski stosunek koloru czerwonego do zielonego wskazuje na wysoki współczynnik rozcieńczenia i proliferację. Panele rysunkowe C-E zostały zmodyfikowane z Messal et al. 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R.MIW umożliwia obrazowanie podłużne zdrowego i chorego gruczołu sutkowego w jego naturalnym i minimalnie zakłóconym środowisku oraz umożliwia wielokrotną wizualizację gruczołu sutkowego na różnych etapach rozwoju. Konstrukcja R.MIW pozwala na otwarcie okna w dowolnym momencie eksperymentu. Długotrwały dostęp wzrokowy do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania może być utrudniony, na przykład przez gromadzenie się resztek komórkowych na szkiełku nakrywkowym. W takich przypadkach R.MIW można otworzyć przed lub bezpośrednio po sesji obrazowania, aby umożliwić oczyszczenie całego widocznego obszaru tkanki i pokrywy. Zdejmowana pokrywa umożliwia również manipulacje tkanką, a także miejscowe nakładanie substancji, takich jak określone inhibitory i terapie, barwniki znakujące lub określone typy komórek będących przedmiotem zainteresowania.

Metoda ta przezwycięża ograniczenia wcześniej opisanych procedur płata sutka 4,7,8,13, które są ograniczone do jednej sesji obrazowania i mogą wizualizować procesy, takie jak rozgałęziona morfogeneza (ryc. 5), homeostatyczny obrót tkankowy (ryc. 6) lub wzrost guza na poziomie komórkowym (ryc. 3B). Jednocześnie jednak R.MIW umożliwia miejscową manipulację tkanką pomiędzy sesjami obrazowania, co stanowi wielką zaletę R.MIW w porównaniu z wcześniej opublikowanym MIW 3,18 i wszystkimi innymi oknami obrazowania20,22. Podczas otwierania R.MIW ważne jest, aby przez cały czas utrzymywać warunki aseptyki, aby zapobiec jakiemukolwiek źródłu infekcji. Możliwość otwarcia R.MIW w aseptycznym środowisku pozwala na optymalizację warunków obrazowania przed każdą sesją obrazowania, co znacznie poprawia długoterminowy dostęp wzrokowy do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. W szczególności w gruczole sutkowym, który jest osadzony w zrębie bogatym w adipocyty, ma to wielką wartość. Co więcej, wymienna pokrywa może w unikalny sposób umożliwić miejscowe podawanie środków terapeutycznych, różnych typów komórek, barwników znakujących, mikrodysekcji sterowanej obrazem lub jakiejkolwiek innej lokalnej manipulacji tkanką bez konieczności przerywania eksperymentu IVM. Na przykład, aby zbadać inicjację guza, określone populacje komórek rakowych można wstrzyknąć bezpośrednio do drzewa przewodowego lub zrębu w określonym punkcie czasowym IVM i dokładnej lokalizacji gruczołu sutkowego, o ile ten zwrot z inwestycji jest dostępny przez pierścień R.MIW. Aby zbadać progresję guza, określone populacje komórek nowotworowych (w określonym miejscu, w określonym mikrośrodowisku lub o określonym zachowaniu) mogą być oznaczone zdjęciem podczas sesji IVM, a następnie poddane mikrosekcji za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego po otwarciu R.MIW. Wyizolowane komórki mogą być dalej przetwarzane do dalszych analiz, takich jak sekwencjonowanie mRNA (pojedynczych komórek). Stosując to podejście, można połączyć zachowanie komórek in vivo z profilami ekspresji molekularnej. Zaletą miejscowego podawania leków przez R.MIW jest możliwość obrazowania tkanki przed i bezpośrednio po zabiegu. Interwał potrzebny do wyjęcia myszy z pudełka do obrazowania, a następnie do wykonania miejscowego podania leku po otwarciu pokrywy R.MIW można wykonać w ciągu kilku minut, co pozwala na natychmiastowe wychwycenie fazy szybko działających leków.

Pokazujemy, że IVM gruczołu sutkowego za pośrednictwem R.MIW jest kompatybilny z wieloma różnymi fluorescencyjnymi modelami myszy reporterowych. Środowisko bogate w tłuszcz jest trudne do zobrazowania, dlatego zaleca się stosowanie jasnych fluoroforów. Jednak, jak pokazano tutaj, nawet mniej jasne fluorofory, takie jak mCFP, mogą być wizualizowane przez R.MIW w optymalnych warunkach obrazowania. Nieuchronnie poduszeczka tłuszczowa uniemożliwi obrazowanie głębszych struktur przewodowych i ograniczy obrazowanie do bardziej powierzchownych przewodów. Obraz poglądowy o niskiej rozdzielczości na początku każdego eksperymentu IVM pomoże zidentyfikować interesujące struktury przewodowe, które są wystarczająco powierzchowne do obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Miejscowa manipulacja tkanką, usunięcie tkanki łącznej lub repozycja tkanki tłuszczowej po otwarciu R.MIW może zoptymalizować IVM pod kątem określonych zwrotów z inwestycji, które są nakładane przez tkankę tłuszczową. Jest to ważna zaleta w stosunku do wszystkich poprzednich konstrukcji okien, które nie pozwalają na wykonywanie tych manipulacji i wymagałyby całkowitego usunięcia samego okna. W szczególności w celu wizualizacji pachwinowego węzła chłonnego zaleca się delikatne usunięcie leżącej nad nim tkanki tłuszczowej, co zmniejsza rozpraszanie światła i umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości. Podczas manipulowania tkanką należy zawsze zachowywać warunki aseptyczne i zapobiegać krwawieniu lub poważnemu uszkodzeniu tkanki, ponieważ mogą one wpływać na procesy badane podczas eksperymentu IVM.

R.MIW jest wykonany z tytanu, materiału, który jest powszechnie stosowany w praktyce klinicznej do zastępowania tkanek twardych, takich jak stawy lub płytki kostne. Tytan ma kilka zalet w porównaniu z oknami stalowymi, w tym lekkość i obojętność21. Ostatnio wykorzystano kilka innych materiałów do wygenerowania nowatorskich typów okien obrazowania, w tym elastycznego okna krzemowego20. W przeciwieństwie do R.MIW, elastyczne okienko nie wymaga żadnych szwów do implantacji i nadaje się do prawie każdej pozycji anatomicznej, szczególnie w przypadku tkanek miękkich i delikatnych. Okna silikonowe mają minimalny wpływ na ruchliwość zwierząt ze względu na ich lekką i odkształcalną naturę i być może bardziej nadają się do eksperymentów badających szybką ekspansję i wzrost tkanek20. Kolejną zaletą w stosunku do wersji tytanowej jest to, że okienka krzemowe są kompatybilne z innymi metodami obrazowania, w tym z rezonansem magnetycznym20,27. Należy jednak pamiętać, że obiektywy są zoptymalizowane pod kątem szkiełek nakrywkowych o grubości 0,17 mm. Ponadto tkanka sutka jest podatna na ruchy oddechowe, które trudno ograniczyć za pomocą elastycznego okienka, zwłaszcza podczas korzystania z mikroskopu odwróconego. Artefakty oddychania są zminimalizowane dzięki konstrukcji R.MIW i zamocowaniu R.MIW we wkładce pudełka do obrazowania. W rezultacie obrazy uzyskane przy użyciu proponowanej konfiguracji R.MIW nie są zniekształcone z powodu artefaktów oddychania. Mogą jednak wystąpić niewielkie odchylenia w lokalizacji tkanki, które zwykle są stopniowe i można je skorygować za pomocą oprogramowania do korekcji ruchu po akwizycji28. Wraz z rosnącym zestawem narzędzi technologii IVM 2,20, szczegółowe wymagania dla każdego eksperymentu ostatecznie określą najlepszy sposób wizualizacji in vivo tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Różne konstrukcje okien mają różne zalety i wady i w zależności od pytania badawczego, dostępnej konfiguracji mikroskopowej, wymaganej rozdzielczości przestrzennej i czasowej oraz całkowitej długości badanego procesu, należy określić optymalne podejście.

Podsumowując, R.MIW ułatwia charakterystykę dynamiki komórkowej w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju gruczołu sutkowego, homeostazy i choroby w ciągu wielu dni do tygodni.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Fundację Badawczą Flandrii (grant doktorski na badania podstawowe 11L7222N dla M.C.), Fundację Boehringer Ingelheim (stypendium doktoranckie dla C.L.G.J.S.), stypendium podoktorskie EMBO (grant ALTF 1035-2020 dla C.L.G.J.S.) oraz Nagrodę Doktora Josefa Steinera (dla J.v.R.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% NaClBD306573Dostępne inne marki
Okrągła szklana szklana nakrywka 10 mmFisher scientific10696365Inne dostępne marki
5-0 plecione jedwabne niciEthiconW580
80% etanoludomowej robotyNA
Pudełko indukcyjne do anestezjologiiKentscientificVetFlo-MSEKIT
Buprenorfina (Vetergesic®)EcupharNA
Bawełniane końcówki (sterylne)Fisher scientific13113743Dostępne inne marki
Klej cyjanoakrylowyLoctiteNADostępne inne marki
Maść do oczuDuratearsNA
Elastyczna igła motylkowaGreiner Bio-One450120Dostępne inne marki
Kleszcze Graefe ()Fine Science Tools11051-10
Poduszka grzewczaKentscientificRightTemp Jr.Dostępne inne marki
Pudełko doobrazowania Wykonane na zamówienieNA
Mieszanka składników odżywczych do zaparzaniaBraunNutriflex special 70/240
Strzykawki insulinoweBD324911Dostępne inne marki
Odwrócony mikroskop wielofotonowy z automatycznym stolikiemLeica MicrosystemsNA
Waporyzator izofluranowyKentscientificVetFlo-1231K
Uchwyt na igłęFine Science Tools12510-14
ParafilmSigma-AldrichP7793taśma półprzezroczysta
Taśma papierowa tesa tesaNA
Petroleum JellyWazelinaNA
scientific11904325Dostępne inne marki
Rurki silikonoweRozwiązania ElastomeryNADowolne artykuły gospodarstwa domowego
Nożyczki sprężynowe (małe)Fine Science Tools15018-10
PBSThermoFisher Scientific10010023
(10 ml)BD305482Dostępne inne marki
Cienkie kleszczeFine Science Tools11413-11
Tytanowa pokrywa do okienkado obrazowania sutkaWykonane na zamówienieNA
Tytanowe okienko do obrazowania sutkaWykonane na zamówienieNA
Drewniane patyczki WykałaczkiFisher scientificNC1678836Dostępne inne marki
Żyletki Fisher Sterylna strzykawka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment. Development. 147 (22), Cambridge, England. (2020).
  2. Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. An Intravital Microscopy Toolbox to Study Mammary Gland Dynamics from Cellular Level to Organ Scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
  3. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  4. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  5. Scheele, C. L., et al. Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis. Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).
  6. Kotsuma, M., et al. Nondestructive, serial in vivo imaging of a tissue-flap using a tissue adhesion barrier. IntraVital. 1 (1), 69-76 (2012).
  7. Ingman, W. V., Wyckoff, J., Gouon-Evans, V., Condeelis, J., Pollard, J. W. Macrophages promote collagen fibrillogenesis around terminal end buds of the developing mammary gland. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 235 (12), 3222-3229 (2006).
  8. Entenberg, D., et al. large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods (San Diego, Calif). 128, 65-77 (2017).
  9. Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. Intravital Imaging of the Lactating Mammary Gland in Transgenic Mice Expressing Fluorescent Proteins. Advances in Intravital Microscopy. , Springer. Netherlands. 187-204 (2014).
  10. Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).
  11. Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion. Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).
  12. Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (43), 26822-26832 (2020).
  13. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of Mice for Long-Term Intravital Imaging of the Mammary Gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).
  14. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of Vital Signs for Long-Term Survival of Mice under Anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563(2011).
  15. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54042(2016).
  16. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. IntraVital. 5 (1), 1125562(2016).
  18. Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).
  19. Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).
  20. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
  21. Niinomi, M. Recent research and development in titanium alloys for biomedical applications and healthcare goods. Science and Technology of Advanced Materials. 4 (5), 445-454 (2003).
  22. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  23. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, N., Luo, L. A global double-fluorescent cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), New York, N.Y. 593-605 (2007).
  24. Snippert, H. J., et al. Intestinal Crypt Homeostasis Results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
  25. Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Developmental Biology. 9, 49(2009).
  26. Kurotaki, Y., Hatta, K., Nakao, K., Nabeshima, Y. I., Fujimori, T. Blastocyst Axis Is Specified Independently of Early Cell Lineage But Aligns with the ZP Shape. Science. 316 (5825), New York, N.Y. 719-723 (2007).
  27. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818(2016).
  28. Warren, S. C., et al. Removing physiological motion from Intravital and clinical functional imaging data. eLife. 7, 35800(2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie pod u neprzebudowa gruczo u mlekowegomanipulacja tkankobrazowanie o wysokiej rozdzielczo ciprogresja nowotworuobrazowanie pojedynczych kom rekgruczo mlekowy myszy

Powiązane artykuły