Artykuł metodologiczny

Pomiar właściwości okresowego szkieletu błonowego początkowego segmentu aksonu przy użyciu mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (3D-SIM)

DOI:

10.3791/63327

⸱

11 lutego 2022

 ,  , 
1Minerva Foundation Institute for Medical Research, 2Department of Computer Science, Aalto University School of Science, 3HiLIFE - Neuroscience Center, University of Helsinki, 4HiLIFE - Institute of Biotechnology, University of Helsinki

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje metodę wizualizacji i pomiaru pierścieni aktynowych i innych składników okresowego szkieletu błony początkowego segmentu aksonu przy użyciu hodowanych neuronów hipokampa szczura i mikroskopii iluminacyjnej o strukturze 3D (3D-SIM).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Początkowy segment aksonu (AIS) to miejsce, w którym inicjowane są potencjały czynnościowe i stanowi filtr transportowy oraz barierę dyfuzyjną, które przyczyniają się do utrzymania polaryzacji neuronów poprzez sortowanie ładunków somato-dendrytycznych. Błonowy szkielet okresowy (MPS) składający się z okresowych pierścieni aktynowych stanowi rusztowanie do zakotwiczenia różnych białek AIS, w tym białek strukturalnych i różnych kanałów jonowych. Chociaż najnowsze podejścia proteomiczne zidentyfikowały znaczną liczbę nowych komponentów AIS, brakuje szczegółów na temat struktury MPS i ról jego poszczególnych komponentów. Odległość między poszczególnymi pierścieniami aktynowymi w MPS (~190 nm) wymaga zastosowania technik mikroskopii superrozdzielczej w celu rozdzielenia szczegółów strukturalnych MPS. Protokół ten opisuje metodę wykorzystania hodowanych neuronów hipokampa szczura do zbadania dokładnej lokalizacji białka AIS w MPS w stosunku do subbłoniastych pierścieni aktynowych przy użyciu mikroskopii oświetlenia o strukturze 3D (3D-SIM). Ponadto opisano również podejście analityczne do ilościowej oceny okresowości poszczególnych składników i ich położenia względem pierścieni aktynowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Początkowy segment aksonu (AIS) to krótki, unikalnie wyspecjalizowany obszar proksymalnego aksonu neuronów kręgowców1. AIS składa się z filtra transportowego i bariery dyfuzyjnej niezbędnej do utrzymania polaryzacji neuronów poprzez sortowanie ładunku somatyczno-dendrytycznego2,3,4,5,6,7. Ponadto, unikalna struktura AIS pozwala na umieszczanie klastrów kanałów jonowych bramkowanych napięciem, które ułatwiają jego funkcję jako miejsca inicjacji potencjału czynnościowego8. Wysoce stabilny kompleks strukturalny leży u podstaw unikalnych funkcji AIS. Badania przeprowadzone w ciągu ostatniej dekady ujawniły obecność błonowego szkieletu okresowego (MPS) zawierającego pierścienie aktynowe połączone spektryną i stanowiące rusztowanie do zakotwiczenia różnych białek AIS9,10.

Odległość między pierścieniami aktynowymi w MPS (~190 nm)9,10 jest poniżej limitu rozdzielczości konwencjonalnej mikroskopii świetlnej. Wczesne próby wykorzystania mikroskopii elektronowej do wizualizacji MPS nie powiodły się, ponieważ zastosowane surowe procedury przygotowawcze nie pozwoliły zachować struktury MPS. W związku z tym techniki mikroskopii superrozdzielczej okazały się nieocenione w wyjaśnianiu niektórych szczegółów strukturalnych klasy MPS11. Jednak zrozumienie kompleksu strukturalnego AIS, tożsamości i funkcji jego komponentów oraz jego regulacji czasoprzestrzennej jest nadal niepełne. Ostatnie badania proteomiczne doprowadziły do stworzenia pokaźnej listy białek, które lokalizują się w AIS w pobliżu składników strukturalnych klasy AIS12,13. Wciąż jednak brakuje szczegółów na temat ich funkcji i dokładnego miejsca w kompleksie AIS. W związku z tym techniki mikroskopii superrozdzielczej służą jako niezbędne narzędzie do badania dokładnych pozycji tych białek w stosunku do innych składników MPS i badania ich funkcji. Kilka technik mikroskopii świetlnej może osiągnąć rozdzielczość wyższą niż granica dyfrakcji światła, a niektóre są nawet zdolne do lokalizacji pojedynczych cząsteczek. Jednak wiele z tych technik zazwyczaj wymaga specjalistycznych fluoroforów lub obrazowania, a pozyskiwanie obrazów jest często czasochłonne14.

3D strukturalna mikroskopia oświetleniowa (3D-SIM), dzięki łatwości użycia i prostym wymaganiom dotyczącym przygotowania próbki, nie wymaga specjalnych odczynników do obrazowania lub przygotowania próbki, dobrze współpracuje z szeroką gamą fluoroforów i próbek, może być łatwo zaimplementowana w wielu kolorach i jest zdolna do obrazowania żywych komórek15. Podczas gdy najlepsza możliwa rozdzielczość oferowana przez SIM (~120 nm) jest niska w porównaniu z wieloma innymi technikami superrozdzielczości, jest wystarczająca dla wielu zastosowań (na przykład do rozwiązywania składowych MPS w neuronach). Dlatego ważne jest, aby wziąć pod uwagę wymagania dotyczące konkretnych aplikacji, aby określić, czy karta SIM jest odpowiednim wyborem, czy też konieczna jest jeszcze wyższa rozdzielczość. W tym miejscu opisano protokół wykorzystania hodowanych neuronów hipokampa i mikroskopii iluminacyjnej o strukturze 3D (3D-SIM) do zbadania pozycji i organizacji przypuszczalnych białek AIS względem pierścieni aktynowych w MPS, zgodnie z implementacją w Abouelezz et al.16

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne neurony hipokampa użyte w tych eksperymentach zostały pobrane16 od 17 dnia embrionalnego Zarodki szczurów Wistar obu płci zgodnie z wytycznymi etycznymi Uniwersytetu Helsińskiego i fińskim prawem.

1. Przygotowanie próbki

  1. Na szkiełkach nakrywkowych o wysokiej wierności pozwól neuronom hipokampa szczura rosnąć w rzadkich warunkach hodowli (~ 5 000-10 000 komórek / cm2) przez 14 dni (14 dni in vitro).
    UWAGA: Stosowanie rzadkich kultur zmniejsza ryzyko nakładania się neurytów, co pomaga w ilościowym określeniu MPS.
  2. Napraw neurony za pomocą 4% paraformaldehydu przez 12 minut w temperaturze pokojowej. Szkiełko nakrywkowe umyć raz w 0,2% BSA w PBS (BSA-PBS), a następnie inkubować przez 10 minut w 1% roztworze Triton-X w PBS w temperaturze pokojowej. Umyć raz w BSA-PBS.
  3. Rozcieńczyć przeciwciała anty-ankyryny G (1:200) w BSA-PBS. Dodać roztwór przeciwciała do szkiełka nakrywkowego i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Opcjonalnie dodać przeciwciała anty-MAP2 kurczaka (patrz tabela materiałów) do roztworu przeciwciała w celu wyznaczenia domeny somatodendrytycznej.
  4. Umyj komórki raz w BSA-PBS, następnie 0,1% Triton-X w PBS, a następnie wykonaj końcowe płukanie w BSA-PBS.
  5. Rozcieńczone fluoroforem przeciwciała drugorzędowe przeciwko mysim przeciwciałom (1:200) (patrz tabela materiałów) w BSA-PBS, dodać do szkiełka nakrywkowego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj ogniwa raz w BSA-PBS, raz w 0,1% Triton-X w PBS, a następnie raz w PBS.
  6. Przygotować 1 μM roztwór znakowanej falloidyny w PBS (patrz Tabela Materiałów) i dodać go do komórek. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Umyj komórki raz w PBS, raz w 0,1% Triton-X w PBS, a następnie raz w PBS.
    UWAGA: Użyto tutaj falloidyny oznaczonej tagiem AlexaFluor488, ale inne znaczniki również będą działać.
  7. Aby zamontować szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym, nałóż kroplę środka montażowego na szkiełko podstawowe, zanurz szkiełko nakrywkowe w wodzie dejonizowanej i przetrzyj miękkim ręcznikiem papierowym (aby usunąć nadmiar wody).
    1. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 24 godziny
      UWAGA: Nie zaobserwowano niekorzystnego wpływu na próbkę przy użyciu twardych mediów montażowych (współczynnik załamania światła 1,47 po utwardzeniu).

2. Obrazowanie

  1. Jeśli to możliwe, przed obrazowaniem skonsultuj się z personelem zakładu mikroskopowego. Użyj kalkulatora olejków immersyjnych (patrz tabela materiałów), aby wybrać olejek immersyjny odpowiedni dla próbki.
  2. Gdy próbki są gotowe, upewnij się, że szkiełka nakrywkowe są czyste i wolne od wszelkich pozostałości lub nadmiaru mediów montażowych. W razie potrzeby użyj bawełnianej końcówki zamoczonej w wodzie lub etanolu do czyszczenia. Umieść próbkę w mikroskopie 3D obsługującym kartę SIM (patrz tabela materiałów) i znajdź komórkę do zobrazowania.
  3. Dostosuj moc odpowiednich linii laserowych i czasy naświetlania, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu bez znacznego wybielania próbki.
    UWAGA: Dobry stosunek sygnału do szumu pokaże wyraźny wygląd przypominający siatkę skupioną na próbce i doprowadzi do dokładnych rekonstrukcji w wysokiej rozdzielczości. Linie laserowe o długości fali 488 nm i 640 nm wykorzystano do wizualizacji odpowiednio F-aktyny i ankyryny G.
  4. Ustaw górną i dolną granicę próbki w wymiarze z i przystąp do pobierania stosu.
    UWAGA: zastosowano tutaj rozmiar kroku z 125 nm.
  5. Aby pomyślnie zrekonstruować kartę SIM, upewnij się, że oprogramowanie mikroskopowe (patrz Tabela materiałów) ma plik do transferu optycznego (OTF) odpowiedni dla użytych barwników.
    UWAGA: Są one zazwyczaj tworzone i utrzymywane przez wyspecjalizowany personel. W przypadku braku funkcjonalnego OTF, dostępne są również narzędzia open-source do wykonywania rekonstrukcji na podstawie szacunków17. W tej pracy wykorzystano aktualne pliki OTF kontrolowane przez wyspecjalizowany personel.
  6. Uruchom algorytm rekonstrukcji na stosie, aby uzyskać rekonstrukcję w pełnej rozdzielczości. Sprawdź rekonstrukcje pod kątem znanych artefaktów i, jeśli to konieczne, dostosuj parametry, aby je poprawić.
    UWAGA: Domyślne parametry algorytmu zazwyczaj dają dokładne wyniki. Wiele z tych artefaktów wiąże się z powtarzającymi się wzorami: pasiastymi liniami wraz z wieloma kierunkami na jednej płaszczyźnie z, "zjawymi" (powtarzające się cechy pojawiające się w różnych płaszczyznach z) lub sześciokątny wzór "plastra miodu" pojawiający się w niektórych obszarach. Artefakty te można często naprawić dzięki lepszemu przygotowaniu próbki, lepszemu stosunkowi sygnału do szumu, dostosowaniu parametrów algorytmu rekonstrukcji lub upewnieniu się, że współczynnik załamania światła wybranego olejku immersyjnego jest odpowiedni dla medium montażowego i próbki. Aby uzyskać bardziej szczegółowe omówienie artefaktów SIM i swobodnie dostępne narzędzie do sprawdzania obecności artefaktów, zobacz Ball i wsp.18
  7. Porównaj rekonstrukcję karty SIM z obrazem szerokokątnym, aby zaobserwować poprawę rozdzielczości.
  8. Podczas wykonywania wielokolorowej karty SIM użyj algorytmu wyrównania, aby prawidłowo wyrównać różne kanały, gdy zadowalająca rekonstrukcja jest gotowa.
    UWAGA: Algorytm osiowania wykorzystuje plik referencyjny osiowania wygenerowany przy użyciu przygotowania ściegu mikrosferycznego zgodnie z instrukcją producenta mikroskopu.

3. Analiza obrazu

  1. Pierścienie aktynowe w MPS mają charakterystyczny okresowy wygląd. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu (patrz tabela materiałów), utwórz obraz projekcji o maksymalnej intensywności, używając wszystkich płaszczyzn ogniskowych, w których widoczne są pierścienie aktynowe.
  2. Na obrazie projekcji o maksymalnej intensywności narysuj prostopadłą linię w poprzek widocznych sąsiednich pierścieni i zapisz intensywność fluorescencji wraz z funkcją "Profil wykresu" oprogramowania.
  3. Aby obliczyć średnią odległość między pikami, należy zanotować lokalne maksima w profilu linii i zmierzyć odległość między poszczególnymi sąsiednimi pikami intensywności fluorescencji.
    UWAGA: Można to łatwo obliczyć, na przykład za pomocą funkcji 'findpeaks' w MATLAB lub platformie GNU Octave (open-source).
  4. Aby ocenić kolokalizację różnych białek z pierścieniami aktynowymi w MPS, uruchom procedurę analizy kolokalizacji19,20,21 na rekonstrukcjach SIM aktyny i białka kandydującego. Ręcznie narysuj wybór, aby zdefiniować AIS jako obszar zainteresowania dla wtyczki EzColocalization w platformie oprogramowania19 i uruchom analizę, aby obliczyć współczynnik korelacji Pearsona (PCC) kolokalizacji19,20,21. Wartość PCC bliska 1 wskazuje na silną kolokalizację.
    UWAGA: Ten protokół jest podsumowany w Rysunek 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z hodowanych neuronów hipokampa szczurów i 3D-SIM, opisano protokół do wizualizacji i pomiaru pierścieni aktynowych i innych składników MPS w AIS. Rekonstrukcje stosów obrazów wykazały wyraźną okresowość pierścieni aktynowych (Rysunek 2A). W naszych rękach średnia odległość między szczytami pierścieni aktynowych w MPS, wizualizowana za pomocą falloidyny znakowanej Alexa 488, wynosiła 190,36 ± 1,7 nm (średnia ± SEM). Jest to zgodne z wcześniej podawaną średnią odległością ~190 nm między pie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół zapewnia metodę wizualizacji i pomiaru białek MPS przy użyciu techniki superrozdzielczości. Ponieważ pierścienie aktynowe i inne składniki MPS wykazują okresowość ~190 nm 9,10, konwencjonalne metody obrazowania o ograniczonej dyfrakcji nie mogą ujawnić szczegółów MPS. Kilka konfiguracji mikroskopowych może rozdzielać struktury o ograniczonej dyfrakcji w superrozdzielczości, a SIM stanowi solidną i nieskomplikowaną opcję. Co ważne, karta SIM...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr Pirta Hotulainen jest doceniana za swoje krytyczne komentarze, nieocenione dla przygotowania tego manuskryptu. Dr Rimante Minkeviciene jest doceniana za pomoc w przygotowaniu kultur neuronalnych używanych do oryginalnych eksperymentów. Wszystkie obrazowania wykonano w Zakładzie Obrazowania Biomedicum. Prace te były wspierane przez Akademię Fińską (D.M., SA 266351) oraz program doktorancki Brain & Mind (AA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 24-dołkoweCorning3524
4% paraformaldehyd
Alexa-488 PhalloidinThermoFisherA12379
Alexa-647 anty-mysieThermoFisherA31571
anty-ankyrynowe GUC Davis/NIH NeuroMab Facility, klon 106/3675-146
Przeciwciało anty-MAP2Merck MilliporeAB5543
B-27Invitrogen17504044
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)BioWestP6154
Deltavision OMX SRGE Healthcare Life SciencesN/A Fidżi
oprogramowaniaImageJ
GNU OctaveGNU
Wysoka wydajność szkiełka nakrywkoweMarienfeld117530
Kalkulator olejków immersyjnychCytiva Life Scienceshttps://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator
L-glutaminaVWRICNA1680149
MATLAB R2020a Mathworks
Neurobaseal mediaInvitrogen21103049
OMX SRDelta Vision OMX
PrimocinInvivoGenant-pm-1
ProLong Gold Nośnik montażowyInvitrogenP10144
softWoRx DeconvolutionCytiva Life Sciences
Superfrost SlidesEprediaISO 8037/1
TetraSpeck mikrosfery 0,1 i mikro; mThermoFisherT7279
Triton-XSigmaX100
przeciwciało pakiet

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leterrier, C. The Axon initial segment, 50 years later: A nexus for neuronal organization and function. Current Topics in Membranes. 77, 185-233 (2016).
  2. Leterrier, C., Dargent, B. No pasaran! Role of the axon initial segment in the regulation of protein transport and the maintenance of axonal identity. Seminars in Cell & Developmental Biology. 27, 44-51 (2014).
  3. Brachet, A., et al. Ankyrin G restricts ion channel diffusion at the axonal initial segment before the establishment of the diffusion barrier. Journal of Cell Biology. 191 (2), 383-395 (2010).
  4. Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nature Cell Biology. 5 (7), 626-632 (2003).
  5. Song, A. H., et al. A selective filter for cytoplasmic transport at the axon initial segment. Cell. 136 (6), 1148-1160 (2009).
  6. Sun, X., et al. Selective filtering defect at the axon initial segment in Alzheimer's disease mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (39), 14271-14276 (2014).
  7. Winckler, B., Forscher, P., Mellman, I. A diffusion barrier maintains distribution of membrane proteins in polarized neurons. Nature. 397 (6721), 698-701 (1999).
  8. Kole, M. H., et al. Action potential generation requires a high sodium channel density in the axon initial segment. Nature Neuroscience. 11 (2), 178-186 (2008).
  9. Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339 (6118), 452-456 (2013).
  10. Leterrier, C., et al. Nanoscale architecture of the axon initial segment reveals an organized and robust scaffold. Cell Reports. 13 (12), 2781-2793 (2015).
  11. Leterrier, C. The axon initial segment: An updated viewpoint. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2135-2145 (2018).
  12. Hamdan, H., et al. Mapping axon initial segment structure and function by multiplexed proximity biotinylation. Nature Communications. 11 (1), 100(2020).
  13. Zhou, R., et al. Proteomic and functional analyses of the periodic membrane skeleton in neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Valli, J., et al. Seeing beyond the limit: A guide to choosing the right super-resolution microscopy technique. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100791(2021).
  15. Wang, T., et al. Radial contractility of actomyosin rings facilitates axonal trafficking and structural stability. Journal of Cell Biology. 219 (5), 201902001(2020).
  16. Abouelezz, A., Stefen, H., Segerstråle, M., Micinski, D., Minkeviciene, R., Lahti, L., Hardeman, E., Gunning, P., Hoogenraad, C., Taira, T., Fath, T., Hotulainen, P. Tropomyosin Tpm3.1 is required to maintain the structure and function of the axon initial segment. iScience. 23 (5), 101053(2020).
  17. Muller, M., Monkemoller, V., Hennig, S., Hubner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7, 10980(2016).
  18. Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915(2015).
  19. Stauffer, W., Sheng, H., Lim, H. N. EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms. Scientific Reports. 8 (1), 15764(2018).
  20. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
  21. Lahti, L. Data analysis supplement to the research article Abouelezz, Stefen, Segerstråle, Micinski, Minkeviciene, Lahti, Hardeman, Gunning, Hoogenraad, Taira, Fath, & Hotulainen. Tropomyosin Tpm3.1 Is Required to Maintain the Structure and Function of the Axon Initial Segment. , (2021).
  22. Abouelezz, A., Micinski, D., Lipponen, A., Hotulainen, P. Sub-membranous actin rings in the axon initial segment are resistant to the action of latrunculin. Journal of Biological Chemistry. 400 (9), 1141-1146 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Membrane Periodic SkeletonAxon Initial SegmentStructured Illumination MicroscopyActin RingsSuper Resolution MicroscopyProtein ColocalizationHippocampal NeuronsFluorescence MicroscopyAnkyrin GPearson Correlation

Powiązane artykuły