Szybka enkapsulacja odtworzonego cytoszkieletu w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Dwuwarstwowe kompartmenty lipidowe są używane jako modelowe komórki syntetyczne do badania zamkniętych reakcji organicznych i procesów opartych na błonach lub jako moduły nośnikowe w aplikacjach dostarczania leków1^,2. Biologia oddolna z oczyszczonymi składnikami wymaga minimalnych systemów eksperymentalnych do badania właściwości i interakcji między biomolekułami, takimi jak białka i lipidy^3,4. Jednak wraz z postępem tej dziedziny rośnie zapotrzebowanie na bardziej złożone systemy eksperymentalne, które lepiej imitują warunki panujące w komórkach biologicznych. Enkapsulacja w GUV jest praktycznym podejściem, które może zaoferować niektóre z tych właściwości podobnych do komórek, zapewniając odkształcalną i selektywnie przepuszczalną dwuwarstwę lipidową oraz ograniczoną przestrzeń reakcyjną. W szczególności rekonstrukcja in vitro układów cytoszkieletu, jako modeli komórek syntetycznych, może odnieść korzyści z enkapsulacji w przedziałach błonowych⁵. Wiele białek cytoszkieletu wiąże się i oddziałuje z błoną komórkową. Ponieważ większość zespołów cytoszkieletu tworzy struktury obejmujące całą komórkę, ich kształt jest naturalnie determinowany przez uwięzienie wielkości komórki⁶.

Do generowania GUV używane są różne metody, takie jak sphing^7,8, small bubble fusion9^,10, transfer emulsji^11,12, pulsacyjny odrzutowiec¹³, oraz inne podejścia mikroprzepływowe^14,15. Chociaż te metody są nadal stosowane, każda z nich ma swoje ograniczenia. W związku z tym wysoce pożądane jest solidne i proste podejście z wysoką wydajnością enkapsulacji GUV. Chociaż techniki takie jak spontaniczne pęcznienie i pęcznienie elektryczne są szeroko stosowane do tworzenia GUV, metody te są przede wszystkim kompatybilne z określonymi składami lipidów¹⁶, o niskim stężeniu soli¹⁷, mniejszy rozmiar cząsteczki enkapsulantu¹⁸ i wymagają dużej objętości enkapsulantu. Łączenie wielu małych pęcherzyków w GUV jest z natury niekorzystne energetycznie, co wymaga specyficzności w naładowanych składach lipidowych⁹ i/lub zewnętrznych środkach indukujących fuzję, takich jak peptydy¹⁹ lub inne chemikalia. Z drugiej strony przenoszenie emulsji i metody mikroprzepływowe mogą wymagać stabilizacji kropel poprzez usunięcie środka powierzchniowo czynnego i rozpuszczalnika po utworzeniu dwuwarstwy^18,20. Złożoność konfiguracji eksperymentalnej i urządzenia w technikach mikroprzepływowych, takich jak natryskiwanie impulsowe, stanowi dodatkowe wyzwanie²¹. cDICE to metoda oparta na emulsji, wywodząca się z podobnych zasad rządzących transferem emulsji^22,23. Roztwór wodny (roztwór zewnętrzny) i mieszanina lipidowo-olejowa są rozwarstwiane przez siły odśrodkowe w obracającej się cylindrycznej komorze (komora cDICE), tworząc granicę faz nasyconą lipidami. Przenoszenie jednowarstwowych kropelek wody lipidowej do obracającej się komory cDICE powoduje zatrzaskiwanie się dwuwarstwy, gdy kropelki przechodzą przez nasycony lipidami interfejs do zewnętrznego roztworu wodnego^22,24. Podejście cDICE jest solidną techniką enkapsulacji GUV. Dzięki przedstawionej zmodyfikowanej metodzie uzyskuje się nie tylko typowy dla cDICE wysoki plon pęcherzyków przy istotnie krótszym czasie enkapsulacji (kilka sekund), ale także znacznie skraca się czas generowania GUV, który pozwala na obserwację procesów zależnych od czasu (np. tworzenia się sieci cytoszkieletowej aktyny). Protokół trwa około 15-20 minut od rozpoczęcia do pobrania GUV i obrazowania. W tym miejscu wytwarzanie GUV opisano przy użyciu zmodyfikowanej metody cDICE do enkapsulacji aktyny i białek wiążących aktynę (ABP). Przedstawiona technika ma jednak zastosowanie do enkapsulacji szerokiego zakresu reakcji biologicznych i interakcji błonowych, od składania biopolimerów, przez ekspresję białek bezkomórkowych, po transfer ładunku oparty na fuzji błonowej.

1. Przygotowanie mieszaniny olejowo-lipidowej

UWAGA: Krok ten musi być wykonany w dygestorio, przestrzegając wszystkich wytycznych bezpieczeństwa dotyczących obchodzenia się z chloroformem.

1. Pobrać 0,5 ml chloroformu do szklanej fiolki o pojemności 15 ml. Dodać 88 μl 25 mg/ml dioleoilofosfocholiny (DOPC), 9,3 μl 50 mg/ml cholesterolu i 5 μl 1 mg/ml dioleoilo-fosfoetanoloaminy-lizaminy B (rodamina PE) (patrz tabela materiałów) do 15 ml szklanej fiolki.
   UWAGA: Końcowe frakcje molowe DOPC i cholesterolu w oleju silikonowym/oleju mineralnym wynoszą odpowiednio 69,9% i 30%. Ustalono, że cholesterol o stężeniu 20-30 mol% jest zoptymalizowanym pod kątem płynności błonowej i stabilności GUV generowanych przy użyciu przedstawionej techniki^25,26. Fizjologicznie wartości te mieszczą się w zakresie stężeń cholesterolu występujących w błonach plazmatycznych komórek ssaków⁶. Zapasy lipidów są pozyskiwane w postaci roztworów chloroformu i przechowywane w temperaturze -20 °C. Fiolki z lipidami powinny być zaaklimatyzowane do temperatury pokojowej przed ich otwarciem.
2. Odmierzyć pipetą 7,2 ml oleju silikonowego i 1,8 ml oleju mineralnego do drugiej fiolki o pojemności 15 ml (patrz tabela materiałów). Ogólnie rzecz biorąc, należy to zrobić w schowku rękawicowym o niskiej wilgotności, głównie jeśli olej mineralny jest ponownie używany.
3. Mieszać oleje wirując z maksymalną prędkością obrotową (3200 obr./min) przez 10 s, dodać mieszaninę do fiolki zawierającej mieszaninę lipidów w chloroformie i natychmiast umieścić ją w mieszalniku wirowym. Wir przez 10-15 s przy maksymalnej prędkości obrotowej (3200 obr./min). Powstała mieszanina lipidów w oleju powinna być lekko mętna, ponieważ lipidy nie są całkowicie rozpuszczone w oleju, ale raczej rozproszone jako małe agregaty²⁴.
4. Umieścić dyspersję lipidów w oleju w sonikatorze kąpielowym (patrz Tabela Materiałów) o mocy ultradźwiękowej 80 W i częstotliwości roboczej 40 kHz w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Mieszaninę należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 godziny.

2. Wytwarzanie pęcherzyków

1. Zamontuj wydrukowany w 3D wałek (plik uzupełniający 1) wykonany z czarnej żywicy (patrz tabela materiałów) na płycie mieszającej na stole i ustaw prędkość obrotową na 1200 obr./min.
2. Zamontuj wydrukowaną w 3D komorę cDICE (plik uzupełniający 2) wykonaną z przezroczystej żywicy (patrz tabela materiałów) na wale ( Rysunek 1A,B).
3. Roztwory aktyny i białek wiążących aktynę (ABP) należy przygotować oddzielnie w łącznej objętości 20 μl.
   1. Przygotuj 1-10 μM aktyny w globularnym buforze aktyny (bufor G), w tym 10% aktyny ATTO 488 (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: 1x G-buffer zawiera 5 mM Tris-HCl, pH 8,0 i 0,2 mM CaCl₂.
   2. Dodaj nitkowaty bufor polimeryzacyjny aktyny (bufor F), aby rozpocząć polimeryzację aktyny na lodzie. Utrzymuj roztwory na lodzie, aby spowolnić polimeryzację aktyny przed dodaniem środka sieciującego.
      UWAGA: 1x bufor F zawiera 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂ i 3 mM ATP w 10 mM Tris, pH 7,5.
   3. Odczekaj 15 minut, aby umożliwić rozpoczęcie polimeryzacji aktyny na lodzie przed dodaniem interesujących środków sieciujących przy pożądanym stosunku molowym. Roztwór należy przechowywać na lodzie do momentu kapsułkowania.
   4. Przygotuj białka wiążące aktynę (ABP) oddzielnie w mikroprobówce (Rysunek 1C).
      UWAGA: Ten krok jest wykonywany, gdy kombinacja ABP (np. miozyna, α-aktynina, faszyna, kompleks Arp2/3) otacza się aktyną^25,26,27. W takich przypadkach żądana ilość każdego ABP jest pobierana z jego zapasu i dodawana do mikroprobówki przeznaczonej dla ABP. Ponieważ całkowity roztwór ma wynosić 20 μl, należy przygotować podstawowe porcje ABP tak, aby pożądana ilość całkowitej mieszaniny ABP nie przekraczała 5-6 μl. Jedynym ABP użytym w reprezentatywnych wynikach jest faszyna, o której przygotowaniu wspomniano poniżej.
      1. Podwielokrotność 1,57 μl faszyny z 1,75 mg/ml materiału faszynowego (patrz tabela materiałów) i bezpośrednio dodać do roztworu aktyny w kroku 2.7. Odpowiada to 2,5 μM faszyny w roztworze.
4. Dodać 7,5% pożywki o gradiencie gęstości (patrz tabela materiałów) do roztworu aktyny, aby utworzyć gradient gęstości między zewnętrzną i wewnętrzną fazą wodną, aby ułatwić sedymentację GUV.
5. Dozować 700 μl zewnętrznego roztworu 200 mM glukozy do komory (Rysunek 1D, po lewej).
   UWAGA: Osmolarność roztworu wewnętrznego decyduje o stężeniu glukozy. W tych eksperymentach osmolarność roztworu wewnętrznego wynosi ~200 mOsm, więc jako roztwór zewnętrzny stosuje się roztwór glukozy o stężeniu 200 mM.
6. Dodaj wystarczającą ilość mieszaniny lipidów i olejów (>3 ml w zależności od wielkości komory) do komory, aż 60%-80% komory zostanie wypełnione (Rysunek 1D, po prawej). Między mieszaniną lipidowo-olejową a roztworem zewnętrznym zostanie utworzony interfejs.
7. Przenieść ABP (przygotowane w kroku 2.3.4) do roztworu aktyny. Używając zwykłej pipety o pojemności 100-1000 μl, natychmiast przenieś 700 μl mieszaniny lipidów i oleju do mieszaniny aktyny-ABP (Rysunek 1E, po lewej). Pipetuj w górę i w dół 8 razy, aby wytworzyć jednowarstwowe kropelki lipidowe wielkości komórki o średnicy w zakresie 7-100 μm (Rysunek 1E, środek).
   UWAGA: Krok 2.7 należy wykonać w ciągu kilku sekund, aby uniknąć montażu sieci aktynowej przed enkapsulacją. Dlatego przed wykonaniem tego kroku upewnij się, że końcówki pipet są już włożone do pipet i gotowe do przenoszenia mieszanin.
8. Używając tej samej pipety o pojemności 100-1000 μl, natychmiast dozuj całą emulsję do komory obrotowej. Kropelki uzyskają drugą warstwę lipidów, przechodząc przez monowarstwę lipidową na granicy faz olej-zewnętrzny roztwór roztworu, tworząc w ten sposób GUV (Rysunek 1E, po prawej).
9. Wyjąć komorę z płytki mieszającej i wyrzucić większość mieszaniny lipidów i olejów, przechylając komorę w pojemniku na odpady tak, aby duża część mieszaniny lipidów i oleju została spuszczona z dużego otworu pośrodku komory.
   UWAGA: W ten sposób mieszanina lipidowo-olejowa jest wyciągana z komory, unikając mieszania mieszaniny lipidowo-olejowej z roztworem zewnętrznym w kolejnym kroku.
10. Trzymaj komorę z pokrywą skierowaną w stronę użytkownika. Otwórz pokrywę komory i lekko przechyl komorę w kierunku użytkownika. Granica faz między zewnętrznym roztworem zawierającym GUV a mieszaniną lipidów i oleju jest widoczna z otworu komory (gdzie znajduje się pokrywa).
11. Za pomocą pipety zebrać wystarczającą ilość roztworu zewnętrznego zawierającego GUV i dozować 50-300 μl roztworu zewnętrznego do płytki 96-dołkowej, aby uzyskać odpowiednią gęstość GUVs.
    UWAGA: Zgodnie z tym protokołem, w roztworze zewnętrznym wewnątrz komory uwalnia się łącznie około 2 x 10⁵ GUV. Dyspersja GUV nie została określona ilościowo; jednak średnica około 90% GUV mieści się w zakresie 12-30 μm. W populacji można znaleźć GUV o dowolnej średnicy w zakresie 7-50 μm. W zależności od zamkniętego ośrodka gradientu gęstości, wielkości GUV i głębokości roztworu w płytce studziennej, GUV potrzebuje 2-15 minut, aby osiąść na powierzchni. Wydajność GUV z rozpuszczonymi wiązkami aktyny wynosi około 90%.

3. Obrazowanie i rekonstrukcja obrazu 3D

1. Ustaw 96-dołkową płytkę na stoliku mikroskopu odwróconego wyposażonego w jednostkę konfokalną z wirującym dyskiem (lub skanowaniem laserowym), kamerę EMCCD lub sCMOS oraz soczewkę obiektywu 60x zanurzoną w oleju (patrz tabela materiałów).
2. Skoncentruj się na dowolnym obszarze zainteresowania (ROI) i utwórz sekwencję obrazów stosu z obszaru zainteresowania z interwałem kroku z wynoszącym 0,5 μm.
   UWAGA: Ponieważ GUV mogą z czasem ulegać nieznacznemu przemieszczeniu na powierzchni, zaleca się uchwycenie zestawu obrazów o wielu długościach fal w każdej płaszczyźnie z, jeśli obrazowanych jest wiele fluoroforów, tj. należy wykonać grupę obrazów o długości fali 561 nm i 488 nm na każdym pasie z naraz, aby uchwycić obrazy aktyny ATTO 488 i Rhod PE.
3. Zapisz każdą sekwencję obrazów z-stack w .tiff formacie.
4. Otwórz interesującą sekwencję obrazów w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów (ImageJ/Fiji). Zidentyfikuj obraz o największej intensywności. Przytrzymaj "ctrl+shift+c", aby otworzyć okno Jasność i kontrast i kliknij Resetuj.
5. Z menu ImageJ/Fiji przejdź do opcji Analizuj > ustaw skalę i wprowadź znaną odległość fizyczną oraz jej jednostkę dla każdego piksela obrazu.
6. Z menu ImageJ/Fiji przejdź do pozycji Image > Stacks > 3D project, aby zrekonstruować obraz 3D ze stosu z. Ustaw "Metoda projekcji" jako Punkt jasności, "Odstępy między warstwami (μm)" na 0,5 i zaznacz pole wyboru Interpoluj. Opcje domyślne mogą być używane dla pozostałych ustawień.
   UWAGA: Interwały z w niektórych mikroskopach mogą nie być skalibrowane, a rzeczywisty ruch w kierunku z może nieznacznie różnić się od wprowadzonego interwału Z (tj. 0,5 μm). W takich przypadkach do uzyskania rzeczywistego interwału Z można użyć próbki kalibracyjnej 3D, takiej jak mikrosfery fluorescencyjne o znanej średnicy. Wartość ta będzie zatem używana jako "Odstęp między warstwami (μm)" do projekcji 3D.

Aby zademonstrować udane generowanie cytoszkieletowych GUV przy użyciu obecnego protokołu, odtworzono struktury wiązki faszynowo-aktynowej w GUV. Faszyna jest krótkim środkiem sieciującym włókna aktynowe, który tworzy sztywne, równoległe wiązki aktyny i jest oczyszczany z E. coli jako białko fuzyjne S-transferazy glutationu (GST)26. Najpierw odtworzono 5 μM aktyny, w tym 0,53 μM ATTO488 aktyny w buforze polimeryzacyjnym aktyny i 7,5% pożywki o gradiencie gęstości. Po dodaniu faszyny w stężeniu 2,5 μM i zamknięciu mieszaniny faszyna-aktyna, w GUV utworzono struktury wiązek aktyny. Konfokalne sekwencje obrazów stosu Z zamkniętych w kapsułkach struktur wiązek aktyny w GUV znakowanych rodaminą PE uchwycono 1 godzinę po enkapsulacji (Figura 2A). Korzystając z tego protokołu, wcześniej zademonstrowano nieodłączną konkurencję i sortowanie zamkniętych w kapsułkach środków sieciujących aktynę, α-aktyniny i faszyny, które razem tworzą różne wzorce wiązek aktyny w sposób zależny od wielkości GUV26.

Podobnie jak zmodyfikowane podejście do emulsji odwróconej przedstawione tutaj, tradycyjny proces cDICE generuje cytoszkieletowe GUV o wysokiej wydajności, ale wymaga pompy strzykawkowej i zestawu rurki do kontrolowanego wstrzykiwania roztworu białkowego do komory obrotowej przy niskich natężeniach przepływu rzędu nanolitrów na sekundę22,28. W tym podejściu emulsja jest generowana bezpośrednio w obracającej się komorze cDICE; Cienka kapilara jest wprowadzana do fazy olejowej. Roztwór białka jest wstrzykiwany przez pompę strzykawkową. Kropelki tworzą się i są odcinane na końcu kapilary, zanim przemieszczą się w kierunku wodnej fazy zewnętrznej, gdzie zamieniają się w GUV, podobnie jak w metodzie opisanej powyżej. Rysunek 2B pokazuje pęcherzyki, które zamykają mieszaninę reakcyjną przy użyciu tego podejścia. Mieszanina reakcyjna zawiera 6 μM aktyny, która jest połączona z 0,9 μM faszyny. W tym przypadku te dwie metody i ich wyniki nie są porównywane, ale należy pamiętać, że obie generują wysoką wydajność GUV.

Rysunek 1: Eksperymentalny zestaw do generowania GUV. (A) Widok z góry i widok z boku komory cDICE. (B) Zdjęcia ustawienia komory przędzącej. (C-E) Schematyczne ilustracje krokowych procedur generowania GUV. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Enkapsulacja struktur wiązki aktyny. (A) Obrazy pokazują reprezentatywne fluorescencyjne warstwy konfokalne GUV (po lewej) i maksymalne projekcje konfokalnego stosu z kanałów aktynowych i lipidowych (po prawej). Faszyna, 2,5 μM; aktyna, 5 μM (w tym 10% aktyna ATTO 488). Podziałka = 10 μm. (B) Enkapsulacja struktur wiązek aktyny przy użyciu konwencjonalnego cDICE. Obraz przedstawia reprezentatywną maksymalną projekcję konfokalnych obrazów fluorescencyjnych zamkniętych w kapsułkach wiązek aktyny powstałych w obecności faszyny. Faszyna, 0,9 μM; Aktyna, 6 μM. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Projekt wału wydrukowany w 3D. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Projekt komory cDICE wydrukowanej w 3D. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.