Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Większość energii komórki jest uzyskiwana poprzez degradację glukozy, kwasów tłuszczowych i aminokwasów różnymi szlakami, które zbiegają się w mitochondrialnym systemie fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS), który jest regulowany w odpowiedzi na zapotrzebowanie komórki. Cząsteczka lipidu Koenzym Q (CoQ) jest niezbędna w tym procesie, przenosząc elektrony do kompleksu III w łańcuchu transportu elektronów (ETC) poprzez ciągłe cykle utleniania/redukcji. Stan mitochondriów i ostatecznie zdrowie komórek można ocenić, mierząc zużycie tlenu przez ETC za pomocą testów respirometrycznych. Badania te są zwykle wykonywane w ustalonych lub pierwotnych liniach komórkowych, które były hodowane przez kilka dni. W obu przypadkach uzyskane parametry oddychania mogły odbiegać od normalnych warunków fizjologicznych w danym narządzie lub tkance.
Dodatkowo, wewnętrzne cechy hodowanych pojedynczych włókien izolowanych z mięśni szkieletowych utrudniają tego typu analizę. W pracy przedstawiono zaktualizowany i szczegółowy protokół analizy oddychania w świeżo wyizolowanych mitochondriach z mięśni szkieletowych myszy. Dostarczamy również rozwiązania potencjalnych problemów, które mogą pojawić się na każdym etapie procesu. Przedstawiona tutaj metoda może być zastosowana do porównania wskaźników zużycia tlenu w różnych transgenicznych modelach myszy i zbadania odpowiedzi mitochondriów na leczenie farmakologiczne lub inne czynniki, takie jak starzenie się lub płeć. Jest to realna metoda odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące bioenergetyki mitochondrialnej, metabolizmu i regulacji.
Wprowadzenie
Mitochondria są głównymi organellami metabolicznymi w komórce1. Te wyspecjalizowane organelle otoczone błoną wykorzystują cząsteczki składników odżywczych do wytwarzania energii w postaci adenozynotrójfosforanu (ATP) firmy OXPHOS. Proces ten opiera się na przenoszeniu elektronów z cząsteczek donorowych w serii reakcji redoks w klasie ETC2. CoQ jest jedynym lipidem aktywnym redoks, który jest endogennie wytwarzany we wszystkich błonach komórkowych i krążących lipoproteinach, który wykazuje funkcję przeciwutleniającą3. Jest niezbędnym składnikiem ETC, przenoszącym elektrony z zależnego od NADH kompleksu I....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Hodowla myszy i pobieranie tkanek zostały przeprowadzone przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez Komitet Etyki Universidad Pablo de Olavide (Sewilla, Hiszpania; protokoły 24/04/2018/056 i 12/03/2021/033) zgodnie z hiszpańskim dekretem królewskim 53/2013, dyrektywą europejską 2010/63/UE i innymi odpowiednimi wytycznymi.
1. Przygotowanie zapasów, i odczynników do testów oddechowych
- Przygotuj następujące roztwory podstawowe, które można przechowywać we wskazanej temperaturze przez miesiące. We wszystkich przypadkach należy stosować ultraczystyH2O.
- Rozpuścić tabletki soli fizjologicznej bu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Protokół przedstawiony w niniejszej pracy umożliwia analizę oddychania mitochondrialnego in vivo poprzez izolację mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy. Schemat metody przedstawiono na Rysunku 1. Po wycięciu mięśni szkieletowych z kończyn tylnych (Rysunek 2), tkanki są homogenizowane, a mitochondria oczyszczane w warunkach izotonicznych poprzez seryjne wirowanie. Czystość poszczególnych frakcji otrzymanych w procesie izolacji można analizować metod.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wszystkie metody stosowane do badania oddychania mitochondrialnego mają swoje ograniczenia; Dlatego tak ważne jest, aby wybrać metodę, która najlepiej pasuje do konkretnego pytania eksperymentalnego. Praca ta zapewnia zaktualizowany i szczegółowy protokół izolacji mitochondriów od mięśni szkieletowych myszy w celu wykonania różnych testów oddechowych w celu zbadania funkcji mitochondriów. Rzeczywiście, badanie bioenergetyki mitochondriów w izolowanych mitochondriach przy użyciu technologii opartych na mikropłytkach jest .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.
Podziękowania
Pragniemy podziękować Juanowi J. Tena za korzystanie z homogenizatora oraz obiektom CABD Proteomics and Animal Husbandry za wsparcie techniczne. Praca ta była wspierana przez hiszpańskie Ministerstwo Edukacji, Kultury i Sportu poprzez stypendium FPU16/03264 dla J.D.H.C., Association Française contre les Myopathies (AFM) poprzez grant stypendialny #22450 dla C.V.-G., grant instytucjonalny MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Departament Regulacji Genów i Morfogenezy w CABD) oraz BFU2017-83150-P dla J.J.C. Junta de Andalucía przyznała P18-RT-4572, Program Finansowania FEDER z Unii Europejskiej oraz hiszpańskie Ministerstwo Nauki, Innowacji i Uniwersytetów prz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma | A5285 | Stan magazynowy przy -20 ° Przeciwciało C |
| AKT | Technologia sygnalizacji komórkowej | C67E7 | Królik (gatunek gospodarza) |
| anty-koza HRP | Sigma | 401504 | Królik (gatunek gospodarza) |
| anty-mysia | komórkowa | # 7076 | Koń (gatunek gospodarza) |
| Antymycyna A | Sigma | A8674 | Stado przy -20 ° C |
| anty-królicza | sygnalizacja komórkowa | # 7074 | Koza (gatunek gospodarza) |
| Kwas askorbinowy | Sigma | A5960 | Zapas w RT |
| Bactin przeciwciało | Sigma | MBS4-48085 | Koza (gatunek gospodarza) |
| Bio-Rad Zestaw do oznaczania białek Bio-Rad II | Bio-Rad | 5000002 | Zawiera 5x odczynnik Bradford i BSA o znanym stężeniu dla krzywej wzorcowej |
| BSA, frakcja V, Calbiochem bez kwasów tłuszczowych | 126575 | zapas w 4 stopniach; Rurka CC | |
| Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Fioletowa pokrywka | |
| Przeciwciało Calnexin | ThermoFisher | MA3-027 | Mysz (gatunek gospodarza) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Zapas w RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stan w 4 & stopni; C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stan magazynowy w RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stan magazynowy -20 ° C |
| gentleMACS Dysocjator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizator |
| HEPES | Sigma | H3375 | Zapas w RT |
| Przeciwciało HSP70 | Proteintech | 10995-1-AP | Królik (gatunek gospodarza) |
| Przeciwciało LDH-A | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Koza (gatunek gospodarza) |
| Chlorek magnezu | ChemCruz | sc-255260A | Magazyn w RT |
| Kwas jabłkowy | Sigma | P1645 | Zapas w RT |
| Spektrofotometr mikropłytkowy | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Zapas w RT |
| Milli-Q woda | System Millipore | F7HA17757A | Ultraczysta woda |
| Przeciwciało mtTFA | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Koza (gatunek gospodarza) |
| Na+/K+-ATPaza i alfa; 1 przeciwciało | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mysz (gatunek gospodarza) |
| Oligomycyna | Sigma | O4876 | Stado przy -20 ° C |
| Palmitoilo-L-karnityna | Sigma | P1645 | Zapas przy -20 ° C |
| PBS tabletki | Sigma | P4417-100TAB | 1x zapas w RT |
| Diwodorofosforan potasu | ChemCruz | sc-203211 | Zapas w RT |
| Wodorotlenek potasu | Sigma | 60377 | Zapas w RT |
| Kwas pirogronowy | Sigma | 107360 | Zapas w 4 ° C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stan magazynowy przy -20 ° C |
| Analizator strumienia mitochondrialnego Seahorse XF24 | Agilent Technologies | 420179 | Model XFe24 |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | Zestaw zawiera wkłady, mikropłytki i roztwór kalibru |
| Bursztynian | Sigma | S7626 | Zapas w RT |
| Sacharoza | Sigma | S9378 | Zapas przeciwciała RT |
| TIMM23 | Abcam | ab230253 | Królik (gatunek żywiciela) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stado przy -20 ° C |
| Przeciwciało TOMM20 | Abcam | ab56783 | Mysz (gatunek gospodarza) |
| Przeciwciało VDAC | Abcam | ab15895 | Królik (gatunek gospodarza) |
Bibliografia
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
- Turunen, M.....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
