Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

5.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63336

⸱

10 lutego 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, CSIC-UPO-JA, Universidad Pablo de Olavide, 2CIBERER, Instituto de Salud Carlos III

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Streszczenie

Większość energii komórki jest uzyskiwana poprzez degradację glukozy, kwasów tłuszczowych i aminokwasów różnymi szlakami, które zbiegają się w mitochondrialnym systemie fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS), który jest regulowany w odpowiedzi na zapotrzebowanie komórki. Cząsteczka lipidu Koenzym Q (CoQ) jest niezbędna w tym procesie, przenosząc elektrony do kompleksu III w łańcuchu transportu elektronów (ETC) poprzez ciągłe cykle utleniania/redukcji. Stan mitochondriów i ostatecznie zdrowie komórek można ocenić, mierząc zużycie tlenu przez ETC za pomocą testów respirometrycznych. Badania te są zwykle wykonywane w ustalonych lub pierwotnych liniach komórkowych, które były hodowane przez kilka dni. W obu przypadkach uzyskane parametry oddychania mogły odbiegać od normalnych warunków fizjologicznych w danym narządzie lub tkance.

Dodatkowo, wewnętrzne cechy hodowanych pojedynczych włókien izolowanych z mięśni szkieletowych utrudniają tego typu analizę. W pracy przedstawiono zaktualizowany i szczegółowy protokół analizy oddychania w świeżo wyizolowanych mitochondriach z mięśni szkieletowych myszy. Dostarczamy również rozwiązania potencjalnych problemów, które mogą pojawić się na każdym etapie procesu. Przedstawiona tutaj metoda może być zastosowana do porównania wskaźników zużycia tlenu w różnych transgenicznych modelach myszy i zbadania odpowiedzi mitochondriów na leczenie farmakologiczne lub inne czynniki, takie jak starzenie się lub płeć. Jest to realna metoda odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące bioenergetyki mitochondrialnej, metabolizmu i regulacji.

Wprowadzenie

Mitochondria są głównymi organellami metabolicznymi w komórce1. Te wyspecjalizowane organelle otoczone błoną wykorzystują cząsteczki składników odżywczych do wytwarzania energii w postaci adenozynotrójfosforanu (ATP) firmy OXPHOS. Proces ten opiera się na przenoszeniu elektronów z cząsteczek donorowych w serii reakcji redoks w klasie ETC2. CoQ jest jedynym lipidem aktywnym redoks, który jest endogennie wytwarzany we wszystkich błonach komórkowych i krążących lipoproteinach, który wykazuje funkcję przeciwutleniającą3. Jest niezbędnym składnikiem ETC, przenoszącym elektrony z zależnego od NADH kompleksu I i zależnego od FADH2 kompleksu II do kompleksu III, chociaż wiele innych reduktaz może napędzać redukcję mitochondrialnego CoQ do ubichinolu jako obowiązkowy krok w wielu komórkowych szlakach metabolicznych4,5.

W trakcie procesu, na wewnętrznej błonie mitochondrialnej powstaje elektrochemiczny gradient protonów, który jest przekształcany w biologicznie aktywną energię przez kompleks syntazy ATP V2. W związku z tym dysfunkcja mitochondriów prowadzi do niezliczonych stanów patologicznych, które dotykają głównie tkanki o wysokim zapotrzebowaniu na energię - mózg, serce i mięśnie szkieletowe6,7. Dlatego fundamentalne znaczenie ma opracowanie metod dokładnej analizy bioenergetyki mitochondriów w celu zbadania jej roli w zdrowiu i chorobie, szczególnie w tkankach wysokoenergetycznych, takich jak mięśnie szkieletowe.

Elektroda tlenowa typu Clark była klasycznie używana w badaniach nad oddychaniem mitochondrialnym8. Jednak system ten był stopniowo wypierany przez technologie o wyższej rozdzielczości, przy czym szczególnie popularne są technologie zużycia tlenu oparte na mikropłytkach, takie jak analizatory Agilent Seahorse XF9. W dziedzinie mięśni szkieletowych badania te są zwykle przeprowadzane w hodowanych komórkach, głównie w unieśmiertelnionej linii komórkowej myszy C2C12 lub w kulturach pierwotnych pochodzących z komórek satelitarnych10,11. Jednak badania te nie oddają w pełni sytuacji in vivo, zwłaszcza gdy bada się biologię mitochondriów i ich funkcjonowanie na poziomie tkanek w przypadku określonych zniewag, interwencji niegenetycznych lub manipulacji genetycznych.

Ponadto, testy oddychania w komórkach są bardziej skomplikowane ze względu na dodatkowe czynniki, w tym pozamitochondrialne zapotrzebowanie na ATP i substraty testowe lub zdarzenia sygnalizacyjne, które mogłyby zmylić interpretację wyników. Alternatywnie możliwe jest również użycie pojedynczych lub wiązek świeżo wyizolowanych włókien mięśniowych z mięśni. Jednak metoda izolacji jest technicznie trudna i możliwa do wykonania tylko dla kilku typów mięśni. W tym przypadku używane są głównie mięśnie zginacza palca krótkiego (FDB) i prostownika długiego palca (EDL)10,12,13, chociaż kilka raportów opisuje również użycie innych typów mięśni14,15.

Opisano również profilowanie bioenergetyczne sekcji mięśni szkieletowych16. Główną zaletą tej metody jest to, że można badać nienaruszone mięśnie (autorzy wykazują, że przecinanie włókien nie zaburza wyników w porównaniu z izolowanymi włóknami mięśniowymi). Jednak dostęp mitochondriów do substratów i inhibitorów testów jest ograniczony, a zatem można zmierzyć tylko kilka parametrów16. Wreszcie, izolowane mitochondria mogą być również zastosowane9,17,18,19. W takim przypadku mitochondria tracą środowisko cytozolowe, co może wpływać na ich funkcjonowanie. W przeciwieństwie do tego, metoda ta gwarantuje dostęp do substratów i inhibitorów, umożliwia analizę wielu typów próbek i zazwyczaj wymaga mniejszej ilości materiału.

Ten artykuł opisuje metodę przeprowadzania bioenergetycznego profilowania wyizolowanych mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach (Rysunek 1). W szczególności szczegółowo opisano trzy protokoły: test sprzęgający, CA do oceny stopnia sprzężenia między ETC a maszynerią OXPHOS; test przepływu elektronów, NNKT do pomiaru aktywności poszczególnych kompleksów ETC; oraz test BOX w celu określenia zdolności mitochondrialnej β utleniania. Warto zauważyć, że w porównaniu z konwencjonalnymi metodami respirometrii wymagane są tylko niewielkie ilości próbek. Zastosowany tutaj protokół izolacji został zmodyfikowany w stosunku do metody opublikowanej w innym miejscu18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Hodowla myszy i pobieranie tkanek zostały przeprowadzone przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez Komitet Etyki Universidad Pablo de Olavide (Sewilla, Hiszpania; protokoły 24/04/2018/056 i 12/03/2021/033) zgodnie z hiszpańskim dekretem królewskim 53/2013, dyrektywą europejską 2010/63/UE i innymi odpowiednimi wytycznymi.

1. Przygotowanie zapasów, i odczynników do testów oddechowych

  1. Przygotuj następujące roztwory podstawowe, które można przechowywać we wskazanej temperaturze przez miesiące. We wszystkich przypadkach należy stosować ultraczystyH2O.
    1. Rozpuścić tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) wH2O(1 tabletka na 200 mlH2O) w celu przygotowania 1x PBS. Roztwór należy sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Rozpuścić 2 g granulek NaOH w 50 mlH2O, aby przygotować 1 M NaOH.
    3. Przygotuj zapasy KOH o pojemności 0,1 M, 1 M, 5 M i 10 M do kalibracji pH.
    4. Dodać 14,612 g EDTA do 70 ml H2O. Dodawać granulki NaOH, aż pH osiągnie 8,0, aby EDTA całkowicie się rozpuścił. DodaćH2O quantum satis (QS) do 100 ml. Otrzymany roztwór 0,5 M EDTA (pH 8) należy przelać w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    5. Dodać 19 g EGTA do 70 ml H2O. Dodawać granulki NaOH, aż pH osiągnie 8,0, aby umożliwić EGTA całkowite rozpuszczenie. DodaćH2OQS do 100 ml. Otrzymany roztwór o stężeniu 0,5 M EGTA (pH 8) należy przeznaczyć w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    6. Dodaj 2 ml 0,5 M EDTA do 98 ml PBS. Otrzymany roztwór 10 mM EDTA/PBS należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
    7. Rozpuścić 5,958 g HEPES w 40 ml H2O. Dostosować pH do 7,2 za pomocą KOH i QS do 50 ml za pomocąH2O. Przefiltrować powstały bufor HEPES 0,5 M przez siatkę 0,45 μm i przechowywać go w temperaturze pokojowej.
    8. Rozpuścić 3,402 g KH2PO4 w objętości do 50 mlH2O. Otrzymany roztwór 0,5 M KH2PO4 przefiltrować przez siatkę 0,45 μm i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    9. Rozpuścić 9,521 g bezwodnego MgCl2 w objętości do 100 mlH2O. Powstały roztwór 1 M MgCl2 należy rozpuścić w autoklawie i przechowywać w temperaturze RT.
      UWAGA: Ponieważ jest to reakcja egzotermiczna, należy postępować ostrożnie i rozpuścić MgCl2 na lodzie.
  2. Przygotować roztwory podstawowe substratu i inhibitora (patrz Tabela 1). Porcjować i przechowywać w temperaturze -20 °C. Unikać cykli zamrażania i rozmrażania. W drodze wyjątku kwas pirogronowy należy zawsze przygotowywać bezpośrednio przed użyciem.
    1. Przygotować w ultraczystymH2O: 0,5 M bursztynian, 0,5 M kwasu pirogronowego, 0,5 M kwasu jabłkowego, 100 mM ADP, 1 M kwasu askorbinowego i 50 mM N,N,N′,N′-tetrametylo-para-fenylenodiaminy (TMPD) (chronić przed światłem).
    2. Przygotować w 100% dimetylosulfotlenku (DMSO): 50 mM palmitoilo-L-karnityny, 4 mM rotenonu, 20 mM cyjanku karbonylu-p-trifluorometoksyfenylohydrazonu (FCCP), 4 mM oligomycyny i 5 mM antymycyny A.
      UWAGA: Nie przekraczać 0,1% końcowego stężenia DMSO w studzienkach mikropłytki. Dlatego należy przygotować wysoce skoncentrowane roztwory podstawowe, aby utrzymać się poniżej tego limitu.
  3. Przygotować do izolacji mitochondriów i kwantyfikacji białek świeżo w dniu eksperymentu. We wszystkich przypadkach należy stosować ultraczystyH2O, a wszystkie należy przechowywać na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.
    UWAGA: Aby zaoszczędzić czas, wszystkie odczynniki można zważyć i przechowywać w odpowiednich pojemnikach (np. probówkach 15 ml) w odpowiedniej temperaturze poprzedniego dnia.
    1. Aby przygotować 10% wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) BSA, należy dokładnie rozpuścić 150 mg FFA BSA w 1,5 mlH2Oza pomocą koła inwersyjnego/obrotowego. Nie wirować, aby uniknąć pienienia.
    2. Aby przygotować 1x odczynnik Bradforda, rozcieńczyć 5x komercyjny roztwór podstawowyH2Oi trzymać go w ciemności w temperaturze RT.
    3. Aby przygotować 8x bufor mitochondrialny (MB), rozpuść 4,112 g sacharozy i 763 mg HEPES w 15 ml H2O. Dostosuj pH do 7,2, dodaj 1,6 ml 10% FFA BSA i QS do 20 ml z H2O.
    4. Aby przygotować 20 ml buforu izolacyjnego 1 (IB1) (4 ml na próbkę), rozpuść 400 μl 0,5 M EDTA, 784 mg D-mannitolu i 2,5 ml 8x MB w 15 ml H2O. Dostosuj pH do 7,2 i QS za pomocą H2O.
    5. Aby przygotować 5 ml buforu izolacyjnego 2 (IB2) (500 μl na próbkę), rozpuść 30 μl 0,5 M EGTA, 196 mg D-mannitolu i 625 μl 8x MB w 4 mlH2O. Dostosuj pH do 7,2 i QS za pomocąH2O.
    6. Aby przygotować 5 ml buforu do sporządzania zawiesiny (RB) (200 μl na próbkę), rozpuścić 120 mg sacharozy, 191,3 mg D-mannitolu, 50 μl 0,5 M HEPES i 10 μL 0,5 M EGTA w 4 ml H2O. Dostosować pH do 7,2 i QS za pomocąH2O.
    7. Aby przygotować 2x Mitochondrialny roztwór testowy-1 (MAS-1), rozpuść 1,199 g sacharozy, 2,8 g mannitolu, 1 ml 0,5 M KH2PO4, 250 μL 1 M MgCl2, 200 μL 0,5 M HEPES i 100 μL 0,5 M EGTA w 20 ml H2O. Dostosuj pH do 7,2 i QS do 25 ml za pomocąH2O. Trzymaj w lodzie przez krótki czas Okresy. Przez dłuższy czas utrzymuj go w temperaturze 4 °C, aby uniknąć opadów.
    8. Aby przygotować 1x pożywkę do testu sprzęgającego (CAM), przygotuj dwa różne na bazie MAS-1: 1) CAM+BSA dla właściwego testu CA i 2) CAM-BSA do przygotowania inhibitorów testu. Zawsze utrzymuj stosunek pirogronianu do jabłczanu na poziomie 10:1,
      UWAGA: Ponieważ BSA może zatkać porty iniekcyjne, należy rozcieńczyć inhibitory w CAM wolnym od BSA.
      1. Aby przygotować CAM+BSA, rozcieńczyć 300 μl 0,5 M kwasu pirogronowego, 30 μl 0,5 M kwasu jabłkowego i 7,5 ml 2x MAS-1 w 6 mlH2O. Dostosować pH do 7,2. Dodać 300 μl 10% FFA, BSA i QS do 15 ml zH2O.
      2. Aby przygotować CAM-BSA, rozcieńczyć 120 μl 0,5 M kwasu pirogronowego, 12 μl 0,5 M kwasu jabłkowego i 3 ml 2x MAS-1 w 2 mlH2O. Dostosować pH do 7,2 i QS do 6 ml za pomocąH2O.
    9. Aby przygotować 1x pożywkę do oznaczania przepływu elektronów (EFAM), należy przygotować zarówno EFAM zawierające BSA, jak i wolne od BSA.
      1. Aby przygotować EFAM+BSA, rozcieńczyć 300 μl 0,5 M kwasu pirogronowego, 60 μL 0,5 M kwasu jabłkowego, 3 μL 20 mM FCCP i 7,5 ml 2x MAS-1 w 6 ml H2O. Dostosować pH do 7,2. Dodać 300 μl 10% FFA, BSA i QS do 15 ml zH2O.
      2. Aby przygotować EFAM-BSA, rozcieńczyć 120 μl 0,5 M kwasu pirogronowego, 24 μl 0,5 M kwasu jabłkowego, 1,2 μl 20 mM FCCP i 3 ml 2x MAS-1 w 2 ml H2O. Dostosować pH do 7,2 i QS do 6 ml za pomocąH2O.
    10. Aby przygotować 1x pożywkę utleniającą β (BOXM), przygotuj roztwory BOXM zawierające BSA i wolne od BSA.
      1. Aby przygotować BOXM+BSA, rozcieńczyć 12 μl 50 mM palmitoilo-L-karnityny, 30 μl 0,5 M kwasu jabłkowego i 7,5 ml 2x MAS-1 w 7 mlH2O. Dostosować pH do 7,2. Dodać 300 μl 10% FFA, BSA i QS do 15 ml zH2O.
      2. Aby przygotować BOXM-BSA, rozcieńczyć 4,8 μl 50 mM palmitoilo-L-karnityny, 12 μl 0,5 M kwasu jabłkowego i 3 ml 2x MAS-1 w 2 mlH2O. Dostosuj pH do 7,2 i QS do 6 ml za pomocąH2O.

2. Sekcja mięśni, homogenizacja i izolacja mitochondriów

  1. Umieść wszystkie materiały i na lodzie. Upewnij się, że wszystkie materiały są lodowato zimne podczas całej procedury, aby chronić mitochondria przed uszkodzeniem.
  2. Umieścić trzy zlewki o pojemności 50 ml na próbkę na lodzie i dodać następujące roztwory: 10 ml PBS w zlewce 1, 10 ml 10 ml EDTA/PBS w zlewce 2 i 4 ml IB1 w zlewce 3.
  3. Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Należy unikać eutanazji CO2 , ponieważ mięśnie szkieletowe mogą ulec niedotlenieniu, co zakłóca analizy oddechu.
  4. Spryskaj prawą tylną kończynę 70% etanolem, aby zapobiec zrzucaniu sierści, i przyklej kończynę do korkowej deski preparującej. Przyklej również lewą kończynę przednią.
  5. Wykonaj nacięcie sterylnym jednorazowym skalpelem przez skórę od kolana do palca u nogi.
  6. Chwyć skórę ząbkowanymi kleszczami na wysokości kostki i przetnij ją cienkimi nożyczkami wokół kostki.
  7. Odsuń skórę od leżących pod nią mięśni za pomocą pęsety z cienką końcówką w jednej ręce, a drugą podciągnij ją kleszczami zębatymi.
  8. Przeanalizuj wszystkie mięśnie szkieletowe od kostki do kolana (Rysunek 2).
    1. Usuń całą tkankę łączną nad mięśniem piszczelowym przednim (TA), aby ułatwić ekstrakcję mięśni za pomocą cienkiej pęsety i nożyczek.
    2. Znajdź cztery dystalne ścięgna mięśnia EDL i przekrój je blisko ich przyczepów w palcach u stóp. Zlokalizuj dystalne ścięgno TA i przetnij je blisko jego przyczepu, zawsze poniżej kostki.
    3. Ostrożnie pociągnij ścięgna TA i EDL powyżej kostki, aby uwolnić luźne końce.
    4. Chwyć luźne końce ścięgien i odsuń mięśnie od reszty mięśni i kości, podciągając je do góry. Użyj cienkiej pęsety lub nożyczek, aby ułatwić proces. Postępuj ostrożnie, aby uniknąć skurczu włókien mięśniowych.
    5. Przetnij ścięgno proksymalne EDL i mięsień TA jak najbliżej rzepki.
    6. Odwróć mysz do góry nogami, aby kontynuować ekstrakcję mięśnia brzuchatego łydki (GA) i mięśnia płaszczkowatego.
    7. Chwyć kieszeń utworzoną między mięśniem dwugłowym uda a GA za pomocą kleszczy zębatych. Użyj cienkich nożyczek, aby oddzielić te mięśnie i uwidocznić proksymalne ścięgno GA.
    8. Chwyć ścięgno Achillesa cienkimi kleszczami i ostrożnie przetnij je cienkimi nożyczkami. Uwolnij mięśnie GA i płaszczkowate z leżącej poniżej kości, podciągając je do góry przez ścięgna. Przeciąć proksymalne ścięgno GA, uwalniając je wraz z leżącym pod nim płaszczkowatym.
    9. Ostrożnie wypreparuj pozostałe mięśnie od ścięgna do ścięgna, postępując zgodnie z tą samą procedurą, aż pozostaną tylko kości.
    10. Ponownie przypnij mysz do pozycji wyjściowej, aby wyciąć mięsień czworogłowy
      11. .
    11. Wyrzuć tkankę tłuszczową na mięsień czworogłowy uda po stronie bliższej za pomocą kleszczy zębatych i drobnych nożyczek.
    12. Włóż cienką pęsetę między mięsień czworogłowy uda a kość udową i przesuwaj je w obu kierunkach wzdłuż osi kości udowej, aby oddzielić mięsień od kości.
    13. Chwyć dystalne ścięgna mięśnia czworogłowego uda za pomocą kleszczy zębatych i przetnij ścięgno cienkimi nożyczkami jak najbliżej rzepki.
    14. Pociągnij mięsień czworogłowy uda do góry i uwolnij go w miejscu bliższego przyczepu za pomocą cienkich nożyczek.
  9. Powtórz kroki 4-8 z tej sekcji dla lewej kończyny tylnej.
  10. Najpierw opłucz wszystkie mięśnie w zlewce 1, a następnie w zlewce 2.
  11. Przenieś wszystkie mięśnie do zlewki 3 i drobno zmiel wszystkie mięśnie ostrymi nożyczkami na lodzie.
  12. Przenieść zawiesinę do rurki C (fioletowa pokrywka), zawsze trzymając ją w lodzie.
  13. Szczelnie zamknij rurkę C i przymocuj ją do góry nogami na tulei homogenizatora. Upewnij się, że sample materiał znajduje się w obszarze rotatora/stojana. Wybierz 1-minutowy program o nazwie m_mito_tissue_01.
  14. Podzielić homogenat na dwie wstępnie schłodzone probówki wirówkowe o pojemności 2 ml i wirować w temperaturze 700 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej.
  15. Przenieść supernatanty do nowych, wstępnie schłodzonych probówek o pojemności 2 ml, ostrożnie unikając tłuszczu i niehomogenizowanej tkanki. Przechowuj granulki w temperaturze -80 °C w celu oznaczenia czystości rozdrobnienia (frakcja N) (Rysunek 3).
  16. Odwirować supernatanty w temperaturze 10 500 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  17. Przenieść supernatanty do nowych wstępnie schłodzonych probówek o pojemności 2 ml i oznaczyć je jako supernatant numer 1 (SN1). Przechowuj je w temperaturze -80 °C w celu określenia czystości rozdrobnienia (Rysunek 3).
  18. Ponownie zawiesić i połączyć oba granulki w łącznej objętości 500 μl IB2 w lodzie.
  19. Wirować w temperaturze 10 500 × g przez 10 minut w temperaturze 4°C.
  20. Przenieść supernatant do nowej wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 2 ml i oznaczyć ją jako supernatant numer 2 (SN2). Przechowywać w temperaturze -80 °C w celu określenia czystości fragmentacji (Rysunek 3).
  21. Zawiesić końcowy osad mitochondrialny w 200 μl RB. Szybko odłóż 10 μl do ilościowego oznaczania białka i natychmiast dodaj 10 μl 10% FFA BSA do pozostałej zawiesiny mitochondrialnej, aby zapobiec uszkodzeniu.
  22. Określ stężenie białka za pomocą testu Bradforda.
    1. Dla krzywej wzorcowej należy przygotować 30 μl seryjnych rozcieńczeń o znanym stężeniu białka w buforze RB. Na przykład użyj 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/mL, 0,125 mg/mL, 0,0625 mg/ml i 0 mg/ml BSA.
    2. Przygotować seryjne rozcieńczenia próbek mitochondrialnych w stosunku 1:3 i 1:6 w buforze RB.
    3. W 96-dołkowej płytce z płaskim dnem najpierw załaduj 2,5 μl próbki/wzorca na studzienkę. Następnie dodaj 10 μL 1 M NaOH do każdej próbki, a na koniec 200 μL 1x odczynnika Bradforda. Dobrze wymieszaj, unikając pęcherzyków powietrza. Sprawdź wzrokowo, czy kolor próbek mieści się w linii kalibracji. Analizę należy zawsze wykonywać w trzech egzemplarzach.
    4. Inkubować płytki przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności i odczytać absorbancję przy 595 nm w spektrofotometrze do mikropłytek.
    5. Obliczyć krzywą wzorcową, wykreślając wartości absorbancji (oś y) w stosunku do odpowiadającego im stężenia białka w rozcieńczeniach przygotowanych w kroku 22.1 w tej sekcji (oś x).
    6. Obliczyć całkowitą ilość białka w próbkach mitochondrialnych przez ekstrapolację z krzywą wzorcową.

3. Przygotowanie testów respirometrycznych na podstawie mikropłytek

  1. Uwodnić czujnik do testu respirometrycznego co najmniej 12 godzin przed eksperymentem za pomocą 1 ml buforu kalibracyjnego na studzienkę. Inkubować w temperaturze 37 °C (bez CO2 ).
    UWAGA: Czujniki nawodnione mogą być używane do 72 godzin. Na tym etapie należy obchodzić się z wkładem ostrożnie: jeśli coś dotknie czujników, może to mieć wpływ na czułość pomiaru.
  2. Schłodzić wirówkę preparatywną za pomocą obracającego się wirnika do mikropłytek z wahliwym wiadrem i odpowiednimi adapterami do mikropłytek w temperaturze 4 °C.
  3. Włącz komputer, otwórz oprogramowanie analityczne i wybierz żądany protokół.
    UWAGA: Gdy oprogramowanie połączy się z przyrządem do pomiaru zużycia tlenu, słychać kliknięcie. Czujnik ogrzewania powinien być zielony i mieć temperaturę 37 °C przed rozpoczęciem eksperymentu.
  4. Przygotować roztwory inhibitorów z zapasów wskazanych w sekcji 1 krok 2 zgodnie z testem, który ma być przeprowadzony. Przygotuj wystarczającą objętość dla każdego roztworu. Zobacz tabelę 1 i tabelę 2 w celach informacyjnych.
  5. Dodać odpowiednią objętość każdego inhibitora do każdego portu, włożyć wkład do przyrządu do pomiaru zużycia tlenu i rozpocząć kalibrację.
    UWAGA: Dodanie inhibitora do wkładu i włożenie wkładu do instrumentu zajmuje 15-20 minut. Upewnij się, że zostały wprowadzone odpowiednie elementy wkładu. Pokrywę wkładu i wzmacniacz hydrauliczny można wyrzucić, gdy potrzebny jest wkład czujnika i miejsce użytkowe.
  6. Odwirować stężoną zawiesinę mitochondrialną z sekcji 2, krok 21 w temperaturze 10 500 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Zawiesić osad mitochondrialny w 100 μl 1x CAM+BSA, 1x EFAM+BSA lub 1x BOXM+BSA, w zależności od protokołu, który ma być wykonany.
  8. Następnie rozcieńczyć zagęszczoną próbkę mitochondrialną do końcowego stężenia 0,2 μg/μl w odpowiednim pożywce do oznaczania.
  9. Wysiać 50 μl zawiesiny (łącznie 10 μg białka) na basenik we wstępnie schłodzonej 24-dołkowej mikropłytce na lodzie. Nie dodawaj mitochondriów w studzienkach korekcyjnych tła; Dodać tylko odpowiednie podłoże do oznaczania. Pozostałą zawiesinę mitochondrialną należy przechowywać w temperaturze -80 °C w celu oznaczenia czystości fragmentacji (Rysunek 3).
  10. Obracać mikropłytkę w schłodzonej wirówce preparatywnej o masie 2 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przeciwwagę odpowiednio zrównoważyć.
  11. Pozostałe podłoże do oznaczania ogrzać w temperaturze 37 °C podczas wirowania mikropłytek.
  12. Po odwirowaniu pozostawić mikropłytkę na stole na 5 minut w celu wyrównania. Dodać 450 μl ciepłej pożywki do oznaczania, aby uzyskać końcową objętość 500 μl na basenik w temperaturze pokojowej. Rób to powoli i ostrożnie, dodając pożywkę do ściany studzienek, aby uniknąć odłączenia mitochondriów.
  13. Natychmiast umieścić mikropłytkę w przyrządzie do pomiaru zużycia tlenu bez pokrywki i rozpocząć protokół (Tabela 3). Upewnij się, że pierwszym krokiem jest 10-minutowa inkubacja, aby mikropłytka mogła się ogrzać.
  14. Po zakończeniu eksperymentu wyjmij wkład i mikropłytkę, wyłącz przyrząd i rozpocznij analizę.

4. Analiza wyników

  1. W przypadku testów CA i BOX należy wykonać następujące analizy:
    1. Rejestruj niemitochondrialne zużycieO2, które odpowiada średniej wartości uzyskanych po wstrzyknięciu antymycyny A i rotenonu.
      UWAGA: Antymycyna A i rotenon są odpowiednio inhibitorami kompleksu III i I.
    2. Oblicz oddychanie podstawowe, odejmując niemitochondrialne zużycieO2 od wartości podstawowych (punkty pomiarowe 1 i 2).
    3. Odejmij niemitochondrialne zużycie O2 od wartości po wstrzyknięciu kompleksu V substratu ADP (wstrzyknięcie A) w celu określenia stanu mitochondrialnego III.
    4. Odejmij niemitochondrialne zużycie O2 od wartości oddychania po wstrzyknięciu kompleksu V inhibitora oligomycyny (wstrzyknięcie B), aby uzyskać stan mitochondrialny IVo.
    5. Oblicz stan mitochondrialny IIIu, odejmując niemitochondrialne zużycieO2 z oddychania po wstrzyknięciu FCCP (wstrzyknięcie C).
      UWAGA: FCCP jest silnym mitochondrialnym rozprzęgaczem fosforylacji oksydacyjnej. Synteza ATP jest pomijana w jego obecności, a ETC osiąga maksymalną aktywność.
    6. Odejmij wartości oddychania podstawowego od wartości stanu mitochondrialnego IIIu, aby uzyskać wolną pojemność mitochondriów, czyli zdolność do generowania dodatkowego ATP w przypadku zwiększonego zapotrzebowania na energię.
    7. Podziel stan mitochondrialny IIIu przez wartości stanu IVo, aby uzyskać współczynnik kontroli oddechowej (RCR).
      UWAGA: Ujemne lub zerowe wartości RCR wskazują, że dotyczy to sprzężenia mitochondrialnego.
  2. W odniesieniu do obszarów proekologicznych należy wykonać następujące obliczenia:
    1. Aktywność resztkową obliczyć obliczając średnią wartość po wstrzyknięciu rotenonu i antymycyny A (wstrzyknięcia A i C).
    2. Obliczyć aktywność kompleksu od I do IV (CI-Civ), odejmując aktywność resztkową od wartości podstawowych (punkty pomiarowe 1 i 2).
    3. Odejmij aktywność resztkową od wartości po wstrzyknięciu bursztynianu substratu CII (wstrzyknięcie B), aby uzyskać aktywność CII-CIII-CIV.
    4. Obliczyć aktywność CIV, odejmując aktywność resztkową od wartości uzyskanych po wstrzyknięciu środków redukujących cytochrom c, kwasu askorbinowego i TMPD (wstrzyknięcie D).
  3. Przedstaw wszystkie wyniki za pomocą wykresów słupkowych, jak w Rysunek 4, aby wyciągnąć odpowiednie wnioski.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół przedstawiony w niniejszej pracy umożliwia analizę oddychania mitochondrialnego in vivo poprzez izolację mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy. Schemat metody przedstawiono na Rysunku 1. Po wycięciu mięśni szkieletowych z kończyn tylnych (Rysunek 2), tkanki są homogenizowane, a mitochondria oczyszczane w warunkach izotonicznych poprzez seryjne wirowanie. Czystość poszczególnych frakcji otrzymanych w procesie izolacji można analizować metod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wszystkie metody stosowane do badania oddychania mitochondrialnego mają swoje ograniczenia; Dlatego tak ważne jest, aby wybrać metodę, która najlepiej pasuje do konkretnego pytania eksperymentalnego. Praca ta zapewnia zaktualizowany i szczegółowy protokół izolacji mitochondriów od mięśni szkieletowych myszy w celu wykonania różnych testów oddechowych w celu zbadania funkcji mitochondriów. Rzeczywiście, badanie bioenergetyki mitochondriów w izolowanych mitochondriach przy użyciu technologii opartych na mikropłytkach jest ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

Pragniemy podziękować Juanowi J. Tena za korzystanie z homogenizatora oraz obiektom CABD Proteomics and Animal Husbandry za wsparcie techniczne. Praca ta była wspierana przez hiszpańskie Ministerstwo Edukacji, Kultury i Sportu poprzez stypendium FPU16/03264 dla J.D.H.C., Association Française contre les Myopathies (AFM) poprzez grant stypendialny #22450 dla C.V.-G., grant instytucjonalny MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Departament Regulacji Genów i Morfogenezy w CABD) oraz BFU2017-83150-P dla J.J.C. Junta de Andalucía przyznała P18-RT-4572, Program Finansowania FEDER z Unii Europejskiej oraz hiszpańskie Ministerstwo Nauki, Innowacji i Uniwersytetów przyznało P.N. RED2018-102576-T.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ADPSigmaA5285Stan magazynowy przy -20 ° Przeciwciało C
AKTTechnologia sygnalizacji komórkowejC67E7Królik (gatunek gospodarza)
anty-koza HRPSigma401504Królik (gatunek gospodarza)
anty-mysiakomórkowa# 7076Koń (gatunek gospodarza)
Antymycyna ASigmaA8674Stado przy -20 ° C
anty-króliczasygnalizacja komórkowa# 7074Koza (gatunek gospodarza)
Kwas askorbinowySigmaA5960Zapas w RT
Bactin przeciwciałoSigmaMBS4-48085Koza (gatunek gospodarza)
Bio-Rad Zestaw do oznaczania białek Bio-Rad IIBio-Rad5000002Zawiera 5x odczynnik Bradford i BSA o znanym stężeniu dla krzywej wzorcowej
BSA, frakcja V, Calbiochem bez kwasów tłuszczowych126575zapas w 4 stopniach; Rurka CC
Miltenyi Biotec130-093-237Fioletowa pokrywka
Przeciwciało CalnexinThermoFisherMA3-027Mysz (gatunek gospodarza)
D-mannitolSigmaM4125Zapas w RT
EDTABDH280254DStan w 4 & stopni; C
EGTASigmaE-4378Stan magazynowy w RT
FCCPSigmaC2920Stan magazynowy -20 ° C
gentleMACS DysocjatorMiltenyi Biotec130-093-235Homogenizator
HEPESSigmaH3375Zapas w RT
Przeciwciało HSP70Proteintech10995-1-APKrólik (gatunek gospodarza)
Przeciwciało LDH-ASanta Cruz BiotechnologySC27230Koza (gatunek gospodarza)
Chlorek magnezuChemCruzsc-255260AMagazyn w RT
Kwas jabłkowySigmaP1645Zapas w RT
Spektrofotometr mikropłytkowyBMG LABTECH GmbHPOLARstar OMEGA S/N 415-0292Zapas w RT
Milli-Q wodaSystem MilliporeF7HA17757AUltraczysta woda
Przeciwciało mtTFASanta Cruz BiotechnologySC23588Koza (gatunek gospodarza)
Na+/K+-ATPaza i alfa; 1 przeciwciałoNovus BiologicalsNB300-14755Mysz (gatunek gospodarza)
OligomycynaSigmaO4876Stado przy -20 ° C
Palmitoilo-L-karnitynaSigmaP1645Zapas przy -20 ° C
PBS tabletkiSigmaP4417-100TAB1x zapas w RT
Diwodorofosforan potasuChemCruzsc-203211Zapas w RT
Wodorotlenek potasuSigma60377Zapas w RT
Kwas pirogronowySigma107360Zapas w 4 ° C
RotenoneSigmaR8875Stan magazynowy przy -20 ° C
Analizator strumienia mitochondrialnego Seahorse XF24Agilent Technologies420179Model XFe24
Seahorse XFe24 FluxPak miniAgilent Technologies102342-100Zestaw zawiera wkłady, mikropłytki i roztwór kalibru
BursztynianSigmaS7626Zapas w RT
SacharozaSigmaS9378Zapas przeciwciała RT
TIMM23Abcamab230253Królik (gatunek żywiciela)
TMPDSigmaT7394Stado przy -20 ° C
Przeciwciało TOMM20Abcamab56783Mysz (gatunek gospodarza)
Przeciwciało VDACAbcamab15895Królik (gatunek gospodarza)
sygnalizacja HRP HRP

Bibliografia

  1. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
  2. Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
  3. Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
  4. Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
  5. Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
  6. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080(2016).
  7. Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
  8. Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
  9. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746(2011).
  10. Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977(2018).
  11. Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
  12. Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
  13. Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
  14. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
  15. Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
  16. Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
  17. Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350(2015).
  18. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452(2011).
  19. Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
  20. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
  21. Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
  22. Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42(2016).
  23. Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
  24. Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217(2015).
  25. Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
  26. Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja mitochondri wzu ycie tlenua cuch transportu elektron woddychanie mitochondrialnecentryfugacja seryjnakwantyfikacja bia ekelektroforeza Blue Nativemarkery b on mitochondrialnych
Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.