Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera

DOI:

10.3791/63337

⸱

13 maja 2022

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, 2Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra (INIMEC), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj proponujemy usystematyzowany, dostępny i powtarzalny protokół do wykrywania komórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) w komórkach glejowych Müllera (MGC). Ta metoda określa ilościowo całkowite komórkowe poziomy ROS za pomocą cytometru przepływowego. Ten protokół jest bardzo łatwy w użyciu, odpowiedni i powtarzalny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Równowaga redoks odgrywa ważną rolę w utrzymaniu homeostazy komórkowej. Zwiększona generacja reaktywnych form tlenu (ROS) sprzyja modyfikacji białek, lipidów i DNA, co ostatecznie może prowadzić do zmiany funkcji komórkowych i śmierci komórki. Dlatego korzystne dla komórek jest zwiększenie obrony antyoksydacyjnej w odpowiedzi na szkodliwe zniewagi, albo poprzez aktywację szlaku przeciwutleniającego, takiego jak Keap1 / Nrf2, albo poprzez poprawę zmiataczy redoks (między innymi witaminy A, C i E, β-karoten i polifenole). Stan zapalny i stres oksydacyjny są zaangażowane w patogenezę i progresję retinopatii, takich jak retinopatia cukrzycowa (DR) i retinopatia wcześniaków (ROP). Ponieważ komórki glejowe Müllera (MGC) odgrywają kluczową rolę w homeostazie nerwowej tkanki siatkówki, uważa się je za idealny model do badania tych komórkowych mechanizmów ochronnych. W tym sensie ilościowe określenie poziomów ROS za pomocą powtarzalnej i prostej metody jest niezbędne do oceny udziału szlaków lub cząsteczek, które uczestniczą w mechanizmie obrony komórek przeciwutleniających. W tym artykule przedstawiamy pełny opis procedur wymaganych do pomiaru ROS za pomocą sondy DCFH-DA i cytometrii przepływowej w MGC. Przedstawiono tutaj kluczowe kroki przetwarzania danych cytometrii przepływowej za pomocą oprogramowania, dzięki czemu czytelnicy będą mogli mierzyć poziomy ROS (geometryczne średnie FITC) i analizować histogramy fluorescencji. Narzędzia te są bardzo pomocne nie tylko w ocenie wzrostu ROS po uszkodzeniu komórkowym, ale także w badaniu działania przeciwutleniającego niektórych cząsteczek, które mogą działać ochronnie na komórki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siatkówka nerwowa to bardzo zorganizowana tkanka, która posiada dobrze zdefiniowane warstwy neuronalne. W nich neurony (komórki ganglionowe, amakrynowe, dwubiegunowe, poziome i fotoreceptorowe) są połączone ze sobą, a także z komórkami glejowymi Müllera (MGC) i astrocytami, co prowadzi do odpowiedniej fototransdukcji i przetwarzania informacji wizualnej1,2. Wiadomo, że MGC odgrywają ważną rolę w utrzymaniu homeostazy siatkówki, ponieważ przecinają cały odcinek siatkówki, a tym samym mogą wchodzić w interakcje ze wszystkimi typami komórek, które modulują wiele procesów ochronnych. Doniesiono, że MGC pełnią kilka ważnych funkcji dla utrzymania i przetrwania neuronów siatkówki, w tym glikolizę w celu dostarczania energii neuronom, usuwanie odpadów neuronalnych, recykling neuroprzekaźników i uwalnianie czynników neurotroficznych, między innymi3,4,5.

Z drugiej strony, stany zapalne, stres oksydacyjny i nitrosative są zaangażowane w patogenezę i postęp wielu chorób ludzkich, w tym retinopatii6,7,8,9,10,11. Równowaga redoks w komórkach zależy od ścisłej regulacji poziomu ROS. ROS są stale generowane w warunkach fizjologicznych, głównie w wyniku oddychania tlenowego. Głównymi członkami rodziny ROS są reaktywne wolne rodniki, takie jak anion ponadtlenkowy (O2͘͘͘͘•−), rodniki hydroksylowe (•OH), różne nadtlenki (ROOR′), wodoronadtlenki (ROOH) i bezrodnikowy nadtlenek wodoru (H2O2)12,13. W ostatnich latach stało się jasne, że ROS odgrywa ważną rolę sygnalizacyjną w komórkach, kontrolując podstawowe procesy. MGC mają silną obronę antyoksydacyjną poprzez aktywację czynnika 2 związanego z erytroidem-2 (Nrf2) i późniejszą ekspresję białek przeciwutleniających w celu wyeliminowania nadmiernej produkcji ROS w warunkach patologicznych14,15,16. Kiedy komórki tracą równowagę redoks z powodu nadmiernej produkcji ROS lub wadliwej zdolności do usuwania ROS, akumulacja stresu oksydacyjnego sprzyja szkodliwym modyfikacjom białek, lipidów i DNA, prowadząc do stresu komórkowego lub śmierci. Wzrost systemu obrony antyoksydacyjnej siatkówki poprawia rozdzielczość i zapobieganie retinopatiom, takim jak ROP i RD17,18,19,20,21,22,23,24. Dlatego pomiar produkcji ROS w czasie rzeczywistym jest potężnym i użytecznym narzędziem.

Istnieje kilka metod pomiaru produkcji ROS lub stresu oksydacyjnego w komórkach. Wśród nich sonda dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) jest jedną z najczęściej stosowanych technik bezpośredniego ilościowego określania stanu redoks komórki25,26,27,28. Ta sonda jest lipofilowa i niefluorescencyjna. Dyfuzja tej sondy przez błonę komórkową umożliwia jej rozszczepienie przez wewnątrzkomórkowe esterazy na dwóch wiązaniach estrowych, wytwarzając stosunkowo polarny i nieprzepuszczalny dla błony komórkowej produkt, 2′,7′-dichlorofluoresceinę (H2DCF). Ta niefluorescencyjna cząsteczka gromadzi się wewnątrzkomórkowo, a następnie utlenianie przez ROS daje wysoce fluorescencyjny produkt DCF. Utlenianie sondy jest produktem działania wielu rodzajów ROS (nadtlenoazotynów, rodników hydroksylowych, tlenku azotu lub nadtlenków), które można wykryć za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii konfokalnej (emisja przy 530 nm i wzbudzenie przy 485 nm). Ograniczeniem tej techniki jest to, że nadtlenek i nadtlenek wodoru nie reagują silnie z H2DCF25,29. W tym artykule używamy sondy DCFH-DA do pomiaru i ilościowego oznaczania ROS za pomocą cytometrii przepływowej. Z tego powodu indukujemy produkcję ROS poprzez stymulację MGC za pomocą induktora ROS, A lub B, przed załadowaniem komórek sondą fluorescencyjną. Dodatkowo stosujemy związek przeciwutleniający. Na koniec pokazujemy reprezentatywne i wiarygodne dane uzyskane za pomocą tego protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Kompozycje patrz Tabela 1.

1. Przygotowanie hodowli komórkowej

UWAGA: Opisane tutaj jest przygotowanie hodowli komórek MIO-M1, spontanicznie unieśmiertelnionej ludzkiej linii komórek glejowych Müllera (Moorfield's/Institute of Ophthalmology- Müller 1). Zawsze stosuj odpowiednią technikę aseptyczną i pracuj w okapie z przepływem laminarnym.

  1. Przygotuj zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco. Do DMEM zawierającego 4,5 g/l D-glukozy i 110 mg/l pirogronianu sodu dodaj 10% inaktywowanego termicznie FBS, 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 2 mM L-glutaminy i 50 U/ml penicyliny/streptomycyny. Przygotuj świeżą pożywkę w dniu, w którym komórki MIO-M1 zostaną rozmrożone.
  2. Rozmrozić zamrożone komórki MIO-M1 w dniu 1.
    1. W tym celu należy usunąć kriowial zawierający 5 x 105 komórek MIO-M1 w FBS z 10% DMSO z magazynu ciekłego azotu i natychmiast umieścić go w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Zawsze noś maskę na twarz lub okulary ochronne, ponieważ kriofiale przechowywane w ciekłym azocie stwarzają ryzyko wybuchu po rozmrożeniu.
    2. Szybko rozmrozić komórki MIO-M1 (w czasie krótszym niż 1 minuta), ogrzewając fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż w fiolce pozostanie tylko niewielka ilość lodu.
    3. Przetrzeć zewnętrzną część fiolki 70% etanolem i przenieść ją do okapu z przepływem laminarnym.
    4. Przenieś rozmrożone komórki z fiolki do sterylnej probówki o pojemności 15 ml, a następnie dodaj kroplami 6 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki DMEM.
    5. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu około 600 x g przez 5 minut. Po odwirowaniu zostanie uwidoczniony klarowny supernatant i kompletny osad. Odrzucić supernatant za pomocą pipety, nie naruszając osadu komórkowego.
    6. Delikatnie oddzielić osad i ponownie zawiesić komórki w 10 ml kompletnego podłoża DMEM. Przenieść zawiesinę komórkową na płytkę do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm i inkubować płytkę przez około 2 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. Gdy komórki MIO-M1 zlewają się w 80%-90% w 4 dniu, wykonaj następujące czynności.
    1. Przenieść płytkę z inkubatora do okapu z przepływem laminarnym. Ostrożnie usunąć sklarowany osad i przemyć 2x 5 ml sterylnego i wstępnie podgrzanego PBS. Zassać PBS.
    2. Dozować 1 ml 0,5% roztworu trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przez 3-5 minut w celu odłączenia komórek.
    3. Dodaj 7 ml kompletnej pożywki DMEM, aby zahamować działanie trypsyny. Zdezagreguj zgrupowane trypsynizowane MGC, powoli pipetując w górę iw dół (P1000). Zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.
    4. Wirować przy 600 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant. Delikatnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml kompletnego podłoża DMEM. Przenieść 1 ml tej zawiesiny komórkowej na płytkę o średnicy 100 mm zawierającą 9 ml wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki DMEM.
    5. Powtórz czynność z kolejną płytką 100 mm. Inkubować płytkę przez około 1 dzień w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
  4. Gdy obie płytki zlewają się w 80%-90% (w 6 dniu), przenieś płytkę do okapu z przepływem laminarnym. Wykonaj krok 1.3. w celu uzyskania osadu komórkowego.
  5. Delikatnie oddzielić osad i ponownie zawiesić komórki w 5 ml kompletnego podłoża DMEM. Policz komórki MIO-M1 za pomocą hemocytometru (komora Neubauera) i roztworu błękitu trypanowego, wykonując poniższe czynności.
    1. Umieść szklaną pokrywę na centralnej części komory Neubauera. Umieść komorę na płaskiej powierzchni (np. stole lub stole warsztatowym).
    2. Wymieszaj równą objętość niebieskiego barwnika trypanowego z komórkami. Na przykład wymieszaj 60 μl błękitu trypanowego z 60 μl komórek w celu rozcieńczenia 1:2.
    3. Z tej mieszaniny załadować 10 μl za pomocą mikropipety do komory Neubauera.
    4. Umieść załadowaną komorę Neubauera na stoliku mikroskopu. Następnie włącz światło i dostosuj jasność.
    5. Przesuń stolik mikroskopu do optymalnej pozycji i dostosuj ostrość, aż do uzyskania ostrego obrazu komórek.
    6. Policz komórki wewnątrz czterech kwadratów (podzielonych na 16) znajdujących się w rogu hemocytometru (objętość: 0,1 mm3 każdy).
    7. Oblicz stężenie komórek, korzystając z poniższych równań.
      Koncentracja = (liczba komórek x 10.000)/Liczba kwadratów
      Koncentracja = (liczba komórek x 10.000)/4
      Koncentracja = liczba komórek x 2500
      UWAGA: Jeśli przeprowadza się rozcieńczanie komórek, uzyskane stężenie należy przeliczyć na pierwotne stężenie przed rozcieńczeniem.
      Koncentracja = (liczba komórek x 2500 x 2) = (liczba komórek x 5000 komórek/ml)
    8. Dostosuj zawiesinę komórek do 1 x 105 komórek/ml w kompletnym podłożu DMEM i umieść 2 ml tej zawiesiny komórek na płytce 6-dołkowej (2 x 105 komórek/basenik). Delikatnie potrząśnij płytką, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Inkubować 6-dołkową płytkę przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .

2. Warunki testu i kontrole

  1. Do każdego eksperymentu należy dołączyć następujące kontrole eksperymentalne:
    1. Kontrola autofluorescencji (ogniwa bez sondy DCFH-DA, kontrola do ustawiania parametrów cytometru przepływowego).
    2. Kontrola podstawowa (komórki niestymulowane).
    3. Kontrola pozytywna (komórki poddane działaniu induktora ROS, A lub B).
    4. Kontrola negatywna (komórki poddane działaniu związku przeciwutleniającego)
    5. Próbka (komórki poddane działaniu związku przeciwutleniającego i induktora ROS, A lub B).

3. Przeprowadzanie testu

UWAGA: Test jest wykonywany w dniu 7. Zawsze stosuj odpowiednią technikę aseptyczną i pracuj w okapie z przepływem laminarnym, chyba że zalecono inaczej.

  1. Przygotuj DMEM o niskim poziomie surowicy. Suplement DMEM zawierający 4,5 g/L D-glukozy i 110 mg/l pirogronianu sodu z 0,5% inaktywowanym termicznie FBS, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutaminy i 50 U/ml penicyliny/streptomycyny. Przygotuj świeżą pożywkę w dniu, w którym MIO-M1 będzie poddawany zabiegowi.
  2. Przenieść 6-dołkową płytkę (60%-70% konfluencji) do okapu z inkubatora z przepływem laminarnym. Odessać supernatant i przemyć komórki 1x PBS. Dodać 2 ml DMEM o niskiej surowicy na dołek i inkubować 6-dołkową płytkę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Ma to na celu zagłodzenie komórek.
  3. Po głodzeniu surowicy traktuj komórki związkiem przeciwutleniającym przez 6 godzin.
    1. Odessać supernatant i dodać 2 ml rozcieńczonego wywaru do następujących warunków: kontrola ujemna (komórki poddane działaniu związku przeciwutleniającego) i próbki (komórki poddane działaniu związku przeciwutleniającego i induktora ROS, A lub B).
    2. Inkubować płytkę 6-dołkową przez 6 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
      UWAGA: W przypadku stosowania innego związku przeciwutleniającego lub inhibitora ROS należy ustandaryzować optymalny czas i stężenie dla bodźców.
  4. Po 6 godzinach inkubacji należy traktować komórki induktorem ROS, A lub B, przez 30 minut.
    1. Dodaj bodźce do następujących warunków: kontrola pozytywna (komórki traktowane induktorem ROS, A lub B) i studzienki próbek (komórki traktowane związkiem przeciwutleniającym i induktorem ROS, A lub B).
      UWAGA: Roztwory podstawowe należy przechowywać na lodzie.
    2. Inkubować 6-dołkową płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
      UWAGA: W przypadku stosowania innego induktora ROS należy odpowiednio ustandaryzować optymalny czas i stężenie dla bodźców.
  5. Załaduj ogniwa za pomocą sondy DCFH-DA.
    1. Odessać supernatant i przemyć komórki na płytce 6-dołkowej 3x PBS, aby usunąć wszystkie bodźce.
    2. Wyłącz światło okapu z przepływem laminarnym i pracuj w ciemności. Przygotować rozcieńczenie 1:1000 roztworu podstawowego sondy 5 mM DCFH-DA w celu uzyskania końcowego stężenia 5 μM DCFH-DA w DMEM bez czerwieni fenolowej w probówce o pojemności 15 ml.
    3. Delikatnie wymieszać za pomocą wiru i dodać 1 ml tego roztworu do następujących studzienek: kontrola podstawowa (komórki niestymulowane), kontrola pozytywna (komórki traktowane induktorem ROS), kontrola ujemna (komórki traktowane związkiem przeciwutleniającym) i studzienki na próbki (komórki traktowane związkiem przeciwutleniającym i induktorem ROS, A lub B).
    4. Dodaj 1 ml DMEM bez czerwieni fenolowej do komórek kontrolnych autofluorescencji.
    5. Inkubować 6-dołkową płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
      UWAGA: Sonda jest wrażliwa na światło. Wyrzuć cały niewykorzystany roztwór sondy.

4. Przygotowanie komórek do cytometrii przepływowej

  1. Po 6 godzinach trzymaj talerz na lodzie. Od tego kroku nie jest konieczne stosowanie odpowiedniej techniki aseptycznej i praca w okapie z przepływem laminarnym.
  2. Umyj komórki 3x 2 ml zimnego PBS na studzienkę. Dodać 0,5 ml zimnego buforu odłączającego do każdej studzienki. Zbierz komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety P1000.
  3. Zebrać je do oznakowanych probówek o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Podczas pobierania komórek należy unikać tworzenia się pęcherzyków, ustawiając pipetę P1000 na 0.4 ml. Od tego kroku pracuj szybko.
  4. Po zakończeniu wirowania umieść oznakowane probówki o pojemności 1,5 ml z komórkami na lodzie. Ostrożnie odrzucić supernatant i delikatnie oddzielić osad komórkowy przez stuknięcie.
  5. Dodaj 1 ml buforu FACS do każdej oznaczonej probówki o pojemności 1,5 ml, aby przepłukać komórki. W razie potrzeby użyj wiru o najniższej intensywności, aby całkowicie zdysocjować osad komórkowy. Odwirować je przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć te czynności jeszcze 2 razy. (Wykonaj w sumie trzy prania).
  6. Po zakończeniu ostatniego prania oznacz probówki z polistyrenu okrągłodennego o pojemności 5 ml (probówki do cytometrii przepływowej) dla wszystkich warunków doświadczalnych (patrz krok 2.).
  7. Po zakończeniu wirowania ponownie zawieś granulki komórek w 200 μl buforu FACS. Delikatnie rozdzielić osad w każdej probówce o pojemności 1,5 ml za pomocą wiru. Przenieść do oznakowanych probówek okrągłodennych o pojemności 5 ml. Trzymaj probówki na lodzie, dopóki nie zostaną przeanalizowane na cytometrze przepływowym.

5. Akwizycja danych w cytometrze przepływowym

  1. Korzystając z oprogramowania do cytometrii przepływowej, utwórz nowy eksperyment. Aby to zrobić, na pasku menu przejdź do pozycji Eksperyment i kliknij pozycję Nowy eksperyment (Ctrl+E).
  2. Ponadto na pasku menu przejdź do pozycji Widok i kliknij następujące opcje: Pasek narzędzi, Pasek stanu, Przeglądarka, Cytometr, Inspektor, Arkusz roboczy, Pulpit nawigacyjny akwizycji i Edytor dwuwykładniczy, aby wyświetlić te okna w obszarze roboczym.
  3. Po lewej stronie oprogramowania kliknij przycisk Specimen_001 . Spowoduje to otwarcie listy lamp (Tube_001, Tube_002 itp.). Aby oznaczyć probówki dla kontroli i różnych warunków eksperymentalnych, kliknij dwukrotnie Tube_001, Tube_002 itd. i zmień ich nazwy (patrz krok 2.).
  4. Wybierz kanały/parametry do analizy (FSC, SSC, FITC i APC lub dowolny inny fluorochrom, aby zobaczyć kwadrant) w pierwszej probówce z ustawień cytometru eksperymentu.
  5. Kliknij ikonę Bieżący wskaźnik rury, aby wybrać rurkę, a ikona zmieni kolor na zielony. Umieść rurkę "kontroli autofluorescencji" na ramieniu aspiratora, ostrożnie przesuwając podstawę tylko w lewo.
    1. Aby uruchomić próbkę "kontroli autofluorescencji", przejdź do okna Pulpit nawigacyjny akwizycji i kliknij przycisk Uzyskaj dane. Otwórz wykres punktowy dla FSC (na osi x) w porównaniu z SSC (na osi y).
    2. Szybko dostosuj napięcie rozproszenia do przodu i boku, aby upewnić się, że zdarzenia pojawiają się na wykresie. W oknie Pulpit nawigacyjny pozyskiwania kliknij przycisk Zatrzymaj nabywanie. W tym eksperymencie zastosowano następujące ustawienia napięcia: FSC - 200 V, SSC - 423 V.
  6. Aby ustawić napięcie FITC, uruchom "kontrolę pozytywną (ogniwa potraktowane induktorem ROS, A lub B)". Dostosuj napięcie tak, aby wszystkie zdarzenia pojawiały się na histogramie FITC. W takim przypadku należy użyć napięcia 280 V. W oknie Pulpit nawigacyjny pobierania kliknij przycisk Zatrzymaj nabywanie.
  7. Umieść ponownie rurkę "kontroli autofluorescencji" na ramieniu aspiratora. W oknie Pulpit nawigacyjny pozyskiwania kliknij opcję Uzyskaj dane, a następnie pozycję Rejestruj dane i wybierz żądane warunki zatrzymania (na przykład 50 000 zdarzeń). Narysuj bramkę wokół interesujących komórek, z wyłączeniem martwych komórek i gruzu.
    UWAGA: Są one obserwowane jako znacznie mniejsze zdarzenia niż główna populacja komórek i pojawiają się w lewym dolnym rogu wykresu.
  8. Po zakończeniu akwizycji wyjmij rurkę z ramienia aspiratora. Sprzęt sam się umyje. W oknie Pulpit nawigacyjny akwizycji kliknij Next Tube i uruchom kontrolkę Basal (komórki niestymulowane). Kliknij przycisk Pobierz dane, a następnie pozycję Nagraj dane.
    1. Z początkowej bramki (bramki, która wyklucza martwe komórki i szczątki) utwórz kolejny wykres punktowy FITC (na osi x) w porównaniu z APC (na osi y). Narysuj bramkę kwadrantową i dostosuj współrzędne, aby zobrazować zdarzenia w lewym dolnym kwadrancie wykresu FITC w porównaniu z APC.
  9. Aby nagrać następne próbki, wyjmij probówkę i kliknij przycisk Następna probówka > Acquire Data (Uzyskaj dane> Record Data.
    UWAGA: Zastosowany tutaj cytometr przepływowy (patrz >Tabela materiałów) rejestruje maksymalnie 1 x 106 zdarzeń na probówkę.
  10. Po zakończeniu nagrywania wszystkich lamp wyeksportuj dane na dysk D. Aby to zrobić, kliknij Plik > Eksportuj > pliki FCS > Wybierz wersję 3.0 lub 3.1.<br /> UWAGA: Chociaż pozyskiwanie danych za pomocą jednego oprogramowania (patrz tabela materiałów) jest szczegółowo opisane w tym protokole, można użyć dowolnego innego oprogramowania do cytometrii przepływowej. Parametry akwizycji (FSC, SSC i FITC) można ustawić w ten sam sposób, aby uzyskać wyniki.

6. Analiza pozyskanych danych

  1. Otwórz oprogramowanie i dodaj próbki za pomocą przycisku akcji Dodaj próbki, który znajduje się na pasku zadań lub w paśmie nawigacji.
    1. Kliknij przycisk Dodaj próbki.
    2. Korzystając z przeglądarki plików, przejdź do folderu Eksperymentalny.
    3. Wybierz folder Experimental (Eksperymentalny) i kliknij przycisk Choose.
      UWAGA: Przykładowe pliki są ładowane w ramach grupy "Wszystkie przykłady" do obszaru roboczego.
  2. Kliknij dwukrotnie pierwszą próbkę w przestrzeni roboczej: Autofluorescence Control.
    UWAGA: Ta akcja otwiera okno Wykres przedstawiające zdarzenia wzdłuż parametrów rozproszenia do przodu (FSC-A na osi x) i rozrzutu bocznego (SSC-A na osi y).
  3. Narysuj bramkę wielokątną, aby wyizolować interesujące komórki, z wyłączeniem martwych komórek i szczątków.
    1. Kliknij narzędzie Brama wielokątna.
    2. Kliknij w obrębie działki, aby utworzyć bramę wielokąta. Zrób tyle boków, ile potrzeba.
    3. Kliknij dwukrotnie w ostatnim punkcie, aby zamknąć wielokąt i utworzyć żądaną bramę.
    4. Podaj nazwę bramki, na przykład "Komórki MIO-M1", a następnie naciśnij OK.
      UWAGA: Pojawi się nowe okno wykresu wyświetlające tylko zdarzenia MIO-M1 bez martwych komórek i szczątków.
    5. Powtórz tę czynność ze wszystkimi próbkami do analizy.
  4. Zmień wykres na histogram. W tym celu kliknij etykietę parametru osi X i wybierz FITC-A. Kliknij etykietę parametru osi Y i wybierz opcję Histogram. Spowoduje to zmianę wykresu na jednowymiarowy histogram.
  5. Dodaj statystyki za pomocą okna Dodaj statystykę.
    1. Pod wykresem histogramu kliknij Dodaj statystyki. Program otworzy nowe okno statystyk.
    2. Po lewej stronie nowego okna wybierz statystykę Średnia geometryczna.
    3. Zaznacz komórki Population MIO-M 1 (Wypełnianie MIO-M 1).
    4. Z listy dostępnych parametrów wybierz FIT-C.
    5. Kliknij przycisk Dodaj, aby zastosować je do analizy.
      UWAGA: Spowoduje to utworzenie nowych statystyk "średnia geometryczna: FITC" w przykładowym drzewie bramkowania, a ich wartości są wyświetlane w obszarze roboczym.
  6. Umieść te średnie geometryczne w programie statystycznym i przeanalizuj.
  7. Kliknij ikonę L, aby otworzyć Edytor układu; ta ikona znajduje się w zakładce Menu w przestrzeni roboczej. Umieść okno przestrzeni roboczej i Edytor układu obok siebie.
    UWAGA: Edytor układu to oddzielne okno przestrzeni roboczej z narzędziami do wyświetlania wielu wykresów, wykresów i statystyk w prostym raporcie graficznym. Można go wyeksportować za pomocą preferowanego pliku rozszerzenia, takiego jak między innymi PDF lub JPG.
    1. Z drzewa bramkowania próbki w oknie Obszar roboczy przeciągnij populację komórek MIO-M 1 do Edytora układu.
    2. Upewnij się, że wykres histogramu zawierający zdarzenia w bramie jest wyświetlany w Edytorze układu. Dodatkowe informacje podstawowe zostaną szczegółowo opisane w polu tekstowym poniżej.
    3. Przeciągnij wszystkie próbki, aby porównać je na tym samym wykresie. Program będzie się na nie nakładał.
    4. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres histogramu i wybierz polecenie Właściwości. Program otworzy nowe okno Definicja wykresu. To okno zawiera cztery karty (Opis, Czcionki, Legenda i Określ). Kliknij kartę Określ i zmień oś y z automatycznej na modalną. Kliknij przycisk Zastosuj.
    5. Kliknij próbkę prawym przyciskiem myszy i zmień Kolorowanie, Styl linii, Grubość linii itp., aby spersonalizować wykres.
    6. Aby wyeksportować obraz, kliknij kartę Plik, a zaraz po niej wybierz opcję Zapisz obraz w paśmie Dokument. Wybierz preferowany typ pliku obrazu (np. PDF).
      UWAGA: Zostanie otwarte okno dialogowe zapisywania z monitem o wybranie lokalizacji zapisywania. Kliknij Zapisz.
  8. Zapisz analizę jako plik przestrzeni roboczej (.wsp).
    1. W lewym górnym rogu kliknij ikonę Analiza cytometryczna i wybierz opcję Zapisz jako.
    2. Wybierz opcję Zapisz jako obszar roboczy (WSP), aby zapisać dokument z danymi i analizą.
    3. Wprowadź nazwę pliku obszaru roboczego.
    4. Kliknij Zapisz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak opisano w sekcji protokołu, pokazaliśmy reprezentatywne i ilościowe dane demonstrujące wykrywanie produkcji ROS za pomocą cytometrii przepływowej za pomocą sondy fluorescencyjnej DCFH-DA z komórek MIO-M1 stymulowanych induktorem ROS, A lub B. Zgodnie z oczekiwaniami zaobserwowaliśmy zmiany we fluorescencji FITC w niestymulowanych komórkach powyżej poziomów autofluorescencji (Rysunek 1A, porównaj "kontrolę podstawową" z "kontrolą autofluorescencji", wykres z wykresami kropkowymi). Nastąpiło to z po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kilka stanów patologicznych, takich jak rak, choroby zapalne, niedokrwienie/reperfuzja, choroba niedokrwienna serca, cukrzyca i retinopatie, a także sytuacje fizjologiczne, takie jak starzenie się, prowadzi do nadprodukcji ROS 6,7,8,9,10,11. Dlatego wykrywanie, pomiar i zrozumienie szlaku zaangażowanego w modulację ROS jest ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Maríi Pilar Crespo i Pauli Alejandrze Abadie z CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentyna) za pomoc w cytometrii przepływowej oraz Gabrieli Furlan i Noelii Maldonado za pomoc w hodowli komórek. Dziękujemy również Victorowi Diazowi (Pro-Sekretarzowi ds. Komunikacji Instytucjonalnej FCQ) za produkcję i montaż wideo.

Ten artykuł został sfinansowany z grantów od Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), oraz Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 No 1314 (wszystkie dla M.C.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2′,7′-DCFH-DASigma35845-1G
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)Gibco firmy life technologies15630-080
Cytometr przepływowy BD FACSCanto IIBD BiosciencesFACSCanto
BD FACSDiva oprogramowanieBD Biosciences
Naczynia do hodowli komórkowych 100x20 mmCell Star- Greiner Bio-One664 160
WirówkaThermoSorvall legend micro 17 R
Probówki wirówkowe (15 ml)ProbówkiCFT011150
(50 ml)BIOFILCFT011500
CryovialCRYO. S - Greiner Bio-One126263
DimethylsulfoxideSigma-AldrichW387520-1KG
Fosforan disodowo-wodorowy siedmiowodnyMerck106575
DMEM bez czerwieni fenolowejGibco firmy life technologies31053-028
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)Gibco by life technologies11995065
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), sól disodowa, dwuwodzianMerck324503
Płodowa surowica bydlęcaInternegocios
FlowJo v10 OprogramowanieBD Biosciences
GlukozaMerck108337
hemocytometr, komora NeubaueraBOECO,Niemcy
Okap z przepływem laminarnymESCOAC2-6E8
L-glutamina (GlutaMAX)Gibco by life technologiesA12860-01
MitoSOX RedInvitrogen  M36008
Penicylina/StreptomycynaGibco firmy life technologies15140-122
Chlorek potasuMerck104936
Diwodorofosforan potasuMerck4878
Okrągłe rurki polistyrenowe 5 ml (probówki do cytometrii przepływowej)Falcon - CorningBD-352008
Azydek soduMerck822335
Chlorek soduMerck106404
Wodorotlenek soduMerck106462
Mikroprobówka wirówkowa SPINWIN 1,5 mlTarson500010-N
Płytka do kultur tkankowych 6-dołkowaBIOFILTCP011006
Trypan BlueMerck111732
Trypsin-EDTA 0,5% 10XGibco firmy life technologies15400-054
Mieszalnik wirowyLabnet International, Inc.
wirówkowe BIOFIL

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
  2. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  3. Subirada, P. V., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).
  4. Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. Müller cells and diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 93-100 (2017).
  5. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).
  6. Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).
  7. Feng, Y., et al. Transcription of inflammatory cytokine TNFα is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia. Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).
  8. Rojas, M., et al. NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence. Antioxidants. 6 (2), 43(2017).
  9. Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy. Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).
  10. Wilkinson-Berka, J. L., et al. NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy. Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).
  11. Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity. JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).
  12. Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
  13. Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
  14. Navneet, S., et al. Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal Müller glial cells. Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).
  15. Navneet, S., et al. Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of Müller glial cells and NRF2. Redox Biology. 24, 101199(2019).
  16. Wang, J., et al. Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal Müller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger. Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).
  17. Nakamura, S., et al. Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).
  18. Xu, Z., et al. NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice. Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).
  19. Chen, W. J., et al. Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light. Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).
  20. Wei, Y., et al. Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).
  21. Wei, Y., et al. Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury. Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).
  22. Wei, Y., et al. Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).
  23. Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy. Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).
  24. Xu, Z., et al. Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion. Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).
  25. Armstrong, D. Advanced protocols in oxidative stress III. Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).
  26. Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to FcγR cross-linking. Journal of Visualized Experiments. (145), e59167(2019).
  27. Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), e3357(2011).
  28. Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
  29. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
  30. Fernandes, D. C. Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).
  31. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
  32. Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV. Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

stres oksydacyjnyobrona antyoksydacyjnar wnowaga redokshistogram fluorescencjihomeostaza kom rkowakwantyfikacja ROS

Powiązane artykuły