Artykuł metodologiczny

Bioproces adsorpcyjny poprawia wydajność melaniny z Pseudomonas stutzeri

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63339

⸱

12 stycznia 2022

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, National Institute of Technology, 2Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół bioprocesu adsorpcyjnego do produkcji produktu biologicznego, zwłaszcza pigmentu, który hamuje własną biosyntezę i hamuje wzrost mikroorganizmu, który go produkuje.

Streszczenie

Melaniny są naturalnymi pigmentami, a obecność pierścienia indolowego i licznych grup funkcyjnych sprawia, że melanina jest idealnym wyborem do wielu zastosowań, takich jak środki chroniące przed promieniowaniem UV, pielęgnacja skóry, kosmetyki itp. Morski Pseudomonas stutzeri wytwarza melaninę bez dodatku tyrozyny. Hamowanie sprzężenia zwrotnego zaobserwowano przez melaninę w hodowli bakterii morskiej wytwarzającej melaninę, Pseudomonas stutzeri. Melanina wykazała również hamowanie wzrostu drobnoustrojów. Analiza oparta na modelu Hana-Levenspiela zidentyfikowała hamowanie melaniny przez produkt niekonkurencyjny we wzroście komórek. Enzym tyrozynaza, który wytwarza melaninę, został zahamowany przez melaninę. Podwójny odwrotny wykres reakcji enzymatycznej w obecności różnych stężeń melaniny ujawnił niekonkurencyjne hamowanie produktu. Opracowano bioproces adsorpcyjny oparty na adsorbentach w celu zmniejszenia hamowania sprzężenia zwrotnego przez melaninę. Różne adsorbenty zostały przebadane, aby wybrać najlepszy adsorbent do adsorpcji melaniny. Ilość i czas dawkowania zostały zoptymalizowane w celu opracowania bioprocesu adsorpcyjnego, co spowodowało 8,8-krotne zwiększenie produkcji melaniny przez bakterie morskie Pseudomonas stutzeri (153 mg/L do 1349 mg/L) bez suplementacji tyrozyny i ekstraktu drożdżowego.

Wprowadzenie

Melaniny to związki polifenolowe, których jednostką monomeryczną jest pierścień indolowy. Melaniny są odpowiedzialne za większość czarnych, brązowych i szarych zabarwień roślin, zwierząt i mikroorganizmów1. Najczęstszymi melaninami są eumelaniny, które są ciemnobrązowymi lub czarnymi pigmentami szeroko rozpowszechnionymi u kręgowców i bezkręgowców2. Głowonogi, rośliny i drobnoustroje są głównymi źródłami melaniny3. Melanina pozyskiwana z mikroorganizmów ma kilka zalet w porównaniu z melaniną z głowonogów i roślin. Są szybkie w wzroście i nie powodują żadnych problemów związanych z wahaniami sezonowymi. Modyfikują się również w zależności od pożywki wzrostowej i zapewnionych warunków pracy. Biorąc pod uwagę wszystkie te fakty, źródła mikrobiologiczne są wykorzystywane jako główne źródło melaniny o potencjalnych zastosowaniach komercyjnych4,5,6. Guo i wsp. użyli rekombinowanego Streptomyces kathirae SC-1 do produkcji melaniny w ilości do 28,8 g/L w zoptymalizowanym medium7. Lagunas-Muñoz i wsp. Uzyskano około 6 g/L melaniny w rekombinowanym E. coli8. Wang i wsp. uzyskali około 4,2 g/L rozpuszczalnej melaniny po optymalizacji podłoża9. Naukowcy zbadali również kultury morskie w celu produkcji melaniny. Kiran i wsp. wyprodukowali melaninę z morskich gatunków Pseudomonas10. Kumar i in. wyizolowali Pseudomonas stutzeri HMGM-7 z wodorostów morskich, które wytwarzały melaninę w bulionie odżywczym. Wszyscy zgłoszeni producenci melaniny wymagają suplementów pożywki, ekstraktu drożdżowego i/lub peptonu do produkcji melaniny, co może utrudniać zwiększenie skali bioprocesu. Raman i wsp. badali produkcję melaniny przez Aspergillus fumigatus AFGRD105, który nie wymagał kosztownych dodatków11.

Do produkcji melaniny wybrano bakterię morską znaną jako Pseudomonas stutzeri, wyizolowaną z wodorostów. Mikroorganizm ten nie wymaga dodatkowej suplementacji tyrozyny i ekstraktu drożdżowego do produkcji rozpuszczalnej melaniny i rośnie w pożywkach na bazie wody morskiej, zmniejszając w ten sposób ślad wodny i średni koszt. Thaira i in. opisali zoptymalizowany proces biologiczny wykorzystujący mączkę z ciasta kokosowego do produkcji nanopigmentu melaniny przy użyciu tej morskiej bakterii w poprzedniej publikacji12. Wyprodukowana melanina została wykorzystana do wysoce efektywnego usuwania metali ciężkich z syntetycznych wód gruntowych. Jednak podczas optymalizacji pożywki zidentyfikowano prawdopodobne hamowanie sprzężenia zwrotnego melaniny na wzrost i tworzenie produktu. Dlatego w tym protokole hamowanie melaniny ze sprzężeniem zwrotnym jest badane i określane ilościowo przy użyciu uogólnionego modelu Hana-Levenspiela. Opracowano prosty i skuteczny adsorpcyjny protokół bioprocesowy w celu maksymalnego zmniejszenia hamowania sprzężenia zwrotnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla i utrzymanie kultury Pseudomonas stutzeri.

  1. Pozyskać bakterie Pseudomonas stutzeri z MTCC Chandigarh (dostarczone w formie liofilizowanej ampułki).
    1. Zdezynfekować powierzchnię ampułki alkoholem (70%). Zaznaczyć ampułkę w pobliżu środka pomiaru i przełamać w zaznaczonym miejscu.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas otwierania ampułki, ponieważ zawartość znajduje się w próżni. Należy zachować środki ostrożności podczas przełamywania ampułki, gdyż gwałtowne otwarcie może wciągnąć bawełniany korek na jeden z końców, a zbyt szybkie otwarcie może spowodować uwolnienie liofilizowanych drobnych cząsteczek mikroorganizmu do powietrza.
    2. Ostrożnie usunąć bawełniany korek za pomocą wysterylizowanej pęsety i dodać do ampułki 0,3 mL pożywki Luria Bertani (LB). Pozostawić na 30 min.
    3. Zaszczepić 100 µL zawiesiny do 10 mL pożywki LB (w kolbie stożkowej o pojemności 100 mL) i umieścić w inkubatorze z wytrząsarką przy 180 rpm w temperaturze 37 °C. Jednocześnie przenieść 100 µL zawiesiny na stałe podłoże agar LB i rozprzestrznić w celu uzyskania izolowanych kolonii. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  2. Po namnożeniu kultury przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
  3. Przeprowadzać pasaż co 4 tygodnie poprzez wymazanie kolonii na nową płytkę z agarem LB i inkubowanie płytki w temperaturze 37 °C przez noc do pojawienia się kolonii.

2. Badania nad inhibicją wzrostu i aktywności enzymatycznej przez melaninę

  1. Przygotować pożywkę hodowlaną, dodając do sztucznej wody morskiej 51,4 g/L glukozy, 49,8 g/L mączki z miąższu kokosowego oraz odpowiednio 0,09 g/L CuSO4, 0,03 g/L FeSO4 i 0,05 g/L MgSO4 (Tabela materiałów). Wszystkie doświadczenia przeprowadzić w kolbach z wytrząsarką o pojemności 250 mL, z objętością wypełnienia 15 mL, przy 200 rpm, 37 °C i początkowym pH 7.
  2. Na początku bioprocesu do każdej pożywki dodać różne stężenia melaniny (100 mg/L, 200 mg/L, 500 mg/L i 1000 mg/L).
  3. W różnych odstępach czasu trwania bioprocesu zmierzyć swoistą prędkość wzrostu, aktywność enzymatyczną komórek oraz zawartość melaniny dla każdego z dodanych stężeń melaniny (sekcja 3.2).

3. Modelowanie kinetyki hamowania melaminy

  1. Użyj następującego uogólnionego równania Hana i Levenspiela13 do modelowania kinetyki inhibicji produkcji melaniny,
    figure-protocol-1 (1)
    Gdzie,
    µ = pozorna swoista szybkość wzrostu (1/h)
    µmax = maksymalna swoista szybkość wzrostu (1/h)
    p = stężenie produktu (g/L)
    p *= krytyczne stężenie produktu, przy którym wzrost ustaje (g/L)
    s = stężenie substratu (g/L)
    m,n = parametry
    Powyższe równanie można zapisać w postaci
    figure-protocol-2 (2)
    Gdzie,
    figure-protocol-3 (3)
    oraz figure-protocol-4 (4)
    Powyższe równanie można przekształcić do wykresu podwójnych odwrotności 1/µ względem 1/s, zgodnie z poniższym zapisem
    figure-protocol-5 (5)
  2. Wykreśl linię prostą, wykorzystując dane dla różnych swoistych szybkości wzrostu i stężeń substratu zgodnie z powyższym równaniem. Odcinki na osi Y i X dają odpowiednio μmax oraz Ks, które można podstawić odpowiednio do równania 3 i 4, aby otrzymać µobs oraz Kobs.
    Równanie (3) można zapisać jako
    figure-protocol-6 (6)
  3. Oblicz swoistą szybkość wzrostu kultury hodowanej w kroku 2.2 i oznacz ją jako µobs.
  4. Wstaw wartość swoistej szybkości wzrostu uzyskaną w kroku 3.3 do równania (6). Dopasuj dane do równania liniowego i oblicz nachylenie oraz punkt przecięcia z osią.
  5. Użyj równania (3) do obliczenia maksymalnej swoistej szybkości wzrostu w obecności melaniny.

4. Opracowanie adsorpcyjnego bioprocesu

  1. Wszystkie eksperymenty należy przeprowadzić w kolbie shake flask o pojemności 250 mL, przy objętości wypełnienia 15 mL, prędkości 200 rpm, temperaturze 37 °C i początkowym pH 7.
  2. Końcowy zoptymalizowany bioproces należy przeprowadzić w bioreaktorze z mieszadłem o pojemności 5 L, przy objętości wypełnienia 3 L. W badaniach z użyciem bioreaktora należy utrzymywać pH kultury w zakresie 7-7,5, a tlen rozpuszczony na poziomie 50%- 60% nasycenia.

5. Wybór najlepszego adsorbentu spośród dostępnych adsorbentów

  1. Do poszczególnych kolb zawierających pożywkę hodowlaną dodać różne adsorbenty, takie jak tlenek glinu, zeolit, celit, ziemia pełniarska oraz węgiel aktywny.
  2. Każdy adsorbent dodać oddzielnie do pożywki hodowlanej w stężeniu 1 g/L, a następnie inkubować w wytrząsarce rotacyjnej przy 150 rpm przez 12 h.
  3. Adsorbenty oddzielić poprzez wirowanie przy 5000 x g przez 10 min, a następnie zmierzyć absorbancję nadnadkładu przy 400 nm za pomocą spektrofotometru.
  4. Wybrać adsorbent, który wykazuje najwyższą zdolność do adsorpcji melaniny z pożywki hodowlanej.

6. Wpływ czasu dozowania adsorbenta

  1. Rozpocząć bioproces i dodać adsorbent, który wykazał najwyższą adsorpcję melaniny z hodowli (wybrany po sekcji 5). Stężenie wybrane w kroku początkowym wynosi 1 g/L.
  2. Zmierzyć maksymalną produkcję melaniny zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem12.
  3. Powtórzyć krok 6.1, dodając adsorbent po 12 h od rozpoczęcia bioprocesu, i zmierzyć produkcję melaniny w różnych punktach czasowych bioprocesu.
  4. Powtórzyć krok 6.3, dodając adsorbent po 24 h, 36 h i 48 h od rozpoczęcia bioprocesu.
  5. Porównać ilość melaniny wytworzonej w każdym cyklu bioprocesu i określić optymalny czas podania adsorbenta dla maksymalnej produkcji i odzysku melaniny.

7. Wpływ ilości dawki adsorbenta

  1. Do kultur w czasie określonym w sekcji 6 dodać różne stężenia najlepszego adsorbenta (0,5, 1, 2, 4, 6, 8 i 10 g/L).
  2. Zbiór bioprocesu przeprowadzić poprzez wirowanie przy 5000 x g przez 10 min.
  3. Zebrać nadsącz i obliczyć ilość melaniny, mierząc absorbancję przy 400 nm.
  4. Osad zawierający adsorbent przemyć dwukrotnie wodą destylowaną oraz dwukrotnie etanolem, aby usunąć komórki i inne związki przyłączone do adsorbenta. Etap płukania przeprowadzić poprzez wirowanie przy 5000 x g przez 10 min.
  5. Do przemytego adsorbenta dodać roztwór NaOH 0,1 M w celu desorpcji melaniny.
  6. Mieszaninę wirować przy 5000 x g przez 10 min, a następnie zmierzyć ilość melaniny w nadsączu przy 400 nm za pomocą spektrofotometru.
  7. Proces desorpcji powtórzyć trzykrotnie lub do momentu powrotu adsorbenta do jego normalnego koloru.
  8. Obniżyć pH tego skoncentrowanego roztworu desorbowanej melaniny do wartości 3 lub mniej, dodając 1 N HCl przy użyciu mieszadła z kulkami magnetycznymi, aby wytrącić melaninę. W razie potrzeby przechowywać kwaśny roztwór w lodówce przez 1 h w celu zwiększenia stopnia wytrącania.
  9. Otrzymaną w ten sposób wytrąconą melaninę przemyć trzykrotnie wodą destylowaną poprzez wirowanie przy 5000 x g przez 10 min, wysuszyć i przechowywać w temperaturze 4 °C.

8. Modelowanie matematyczne bioprocesu

  1. Kinetyka wzrostu biomasy
    1. Ilościowo określ szybkość wzrostu biomasy, korzystając z następującego zmodyfikowanego modelu Verhulset opracowanego dla inhibicji produktem, opisanego poniższym równaniem14,15,16,17,
      figure-protocol-7 (7)
      Gdzie,
      x = stężenie biomasy (g/L)
      xm = maksymalne stężenie biomasy (g/L)
      µobs = maksymalna specyficzna szybkość wzrostu (1/h) zgodnie z równaniem (2)
      Vazques i wsp. (2008) wyprowadzili z równania (7) następujące równanie dla stężenia biomasy
      figure-protocol-8 (8)
      Gdzie,
      vx = szybkość wzrostu biomasy (g/L/h) = µobs·x
      µobs       = obserwowana specyficzna szybkość wzrostu (1/h)
      τx = czas adaptacji (h)
      t = czas (h)
    2. Użyj równania (8), aby obliczyć stężenie biomasy w różnych momentach bioprocesu i zasymulować profil wzrostu Pseudomonas stutzeri.
  2. Kinetyka zużycia substratu
    UWAGA: Substrat jest wykorzystywany do wzrostu biomasy, tworzenia produktu i utrzymania funkcji życiowych w bioprocesie.
    1. Użyj następującego równania do bilansu wykorzystania substratu w bioprocesie,
      figure-protocol-9 (9)
      Większość glukozy jest wykorzystywana do generowania biomasy; zatem w celu uproszczenia pominięcie zużycia substratu na tworzenie produktu sprowadza równanie (9) do postaci,
      figure-protocol-10 (10)
      Gdzie,
      S = stężenie substratu (g/L)
      YP/S = współczynnik wydajności produktu, tj. współczynnik wydajności melaniny (g/g)
      P = stężenie produktu (g/L), tj. stężenie melaniny (g/L)
      YX/S = współczynnik wydajności biomasy (g/g)
      ms = współczynnik utrzymania (g/g/h)
      Całkowanie powyższego równania od czasu t = 0 do czasu t = t oraz podstawienie wartości x z równania (8) daje następujące równanie dla profilu stężenia substratu17,
      figure-protocol-11 (11)
      Gdzie, s0 = początkowe stężenie substratu (g/L) i x0 = początkowe stężenie biomasy (g/L)
    2. Użyj równania (11), aby obliczyć stężenie substratu w różnych odstępach czasu bioprocesu lub, jeśli stężenie substratu jest znane, użyj tego samego równania do oszacowania parametrów zawartych w równaniu.
  3. Kinetyka produkcji melaniny
    1. Użyj równania Ludekinga-Pirate'a, aby zasymulować produkcję melaniny. Ponieważ jednak melanina jest produktem związanym ze wzrostem, pomija się człon tworzenia produktu niezwiązanego ze wzrostem, a uproszczone równanie można zapisać jako,
      figure-protocol-12 (12)
      Gdzie,
      α = stała Ludekinga-Pirate'a związana z tworzeniem produktu zależnym od wzrostu (g/g)
      Całkowanie równania (12) od czasu t = 0​ do t = t prowadzi do następującego równania dla profilu stężenia produktu
      figure-protocol-13 (13)
    2. Użyj równania (13), aby obliczyć α.
  4. Szacowanie parametrów kinetycznych
    1. Oszacuj wszystkie wymienione powyżej parametry metodą nieliniowych najmniejszych kwadratów, korzystając z dowolnego odpowiedniego narzędzia programistycznego (np. narzędzia Solver w programie Microsoft Excel).
    2. Do szacowania parametrów wykorzystaj dane z eksperymentów okresowych (batch) i zminimalizuj sumę kwadratów błędów (SSE) za pomocą narzędzia Solver, zgodnie z poniższym równaniem,
      Minimalizuj,
      figure-protocol-14 (14)
      Gdzie,
      xsim = wartość symulowana i xexp = wartość eksperymentalna

9. Techniki analityczne

  1. Ekstrakcja melaniny
    1. Wirować kulturę hodowlaną przy 5000 x g przez 10 min w celu usunięcia biomasy.
    2. Do supernatantu dodać taką samą objętość 1 M NaOH.
    3. Zakwasić zasadowy supernatant do pH 2, dodając 1 N HCl, aby wytrącić melaninę.
    4. Wirować zakwaszony supernatant przy 12000 x g przez 20 min w celu zebrania melaniny.
    5. Zebraną melaninę przemyć trzykrotnie 5 mL wody destylowanej, suszyć przez noc w temperaturze pokojowej (RT) i przechowywać w 4 °C18.
  2. Ilościowe oznaczenie melaniny
    1. Przygotować roztwory melaniny o różnych stężeniach (0-500 mg/L), rozpuszczając odpowiednią ilość melaniny w sztucznej wodzie morskiej (pH 8).
    2. Zmierzyć absorbancję przy 400 nm za pomocą spektrofotometru18.
    3. Przygotować krzywą kalibracyjną na podstawie powyższych danych.
    4. Wirować kulturę hodowlaną przy 5000 x g przez 10 min w celu usunięcia biomasy, a następnie zmierzyć absorbancję supernatantu przy 400 nm. Obliczyć stężenie melaniny w kulturze hodowlanej, korzystając z krzywej kalibracyjnej przygotowanej w kroku 9.2.3
  3. Oznaczenie aktywności tyrozynazy
    1. W celu określenia aktywności enzymatycznej tyrozynazy wyekstrahowanej z bulionu hodowlanego Pseudomonas stutzeri zastosować poniższy protokół oznaczenia enzymu tyrozynazy opracowany przez Ren i wsp. (2013)19 .
    2. Wirować kulturę bakteryjną przy 5,000 x g w celu zebrania komórek.
    3. Poddać komórki sonikacji w zimnym 100 mM buforze fosforanowym o pH 6,5, a następnie wirować homogenat przy 9000 x g przez 15 min i zebrać supernatant będący źródłem enzymu tyrozynazy.
    4. Do 2,8 mL 0,1 M buforu fosforanowego sodu (pH 6,5) zawierającego 1 mM L-tyrozyny (substrat) dodać 0,2 mL roztworu enzymu otrzymanego w poprzednim kroku.
    5. Obserwować powstawanie dopachromu poprzez pomiar absorbancji przy 475 nm.
    6. Obliczyć aktywność tyrozynazy w następujący sposób. Jedną jednostkę międzynarodową (IU) aktywności tyrozynazy definiuje się jako ilość enzymu potrzebną do utlenienia 1 µmol L-tyrozyny do dopachromu w ciągu minuty. Obliczyć tę wartość, korzystając z molowego współczynnika ekstynkcji dopachromu (3600 L·M-1·cm-1) zgodnie z poniższym równaniem,
      figure-protocol-15 (15)
  4. Oszacowanie biomasy
    1. Pobrać 5 mL próbek w odstępach 4 h w komorze z laminarnym przepływem powietrza, zachowując sterylność. Przed i po pobraniu próbek opalić ogniem korek watowy kolby, aby zmniejszyć ryzyko kontaminacji. Zmierzyć gęstość optyczną (OD) wszystkich tych próbek przy 660 nm.
      UWAGA: Jako próbka ślepa służy niezaszczepiona pożywka. Odczyty te zostaną wykorzystane do badania wzrostu mikroorganizmów.
    2. Wirować bulion hodowlany przy 5000 x g przez 10 min w 4 °C, zebrać osad komórkowy i suszyć go przez 8 h w 60 °C w suszarce z wymuszonym obiegiem powietrza, aby uzyskać suchą masę komórkową.
    3. Przygotować krzywą kalibracyjną, korzystając z OD zmierzonej w kroku 9.4.1 oraz odpowiadającej jej biomasy uzyskanej w kroku 9.4.2
    4. Użyć krzywej kalibracyjnej (OD = 0,82٠Biomasa (g/L)) do wyznaczenia nieznanej ilości biomasy poprzez pomiar gęstości optycznej bulionu hodowlanego w dowolnym czasie.
  5. Oszacowanie ilości DNA
    1. Oszacować ilość DNA w próbce poprzez pomiar gęstości optycznej przy 260 nm.
    2. Obliczyć ilość DNA korzystając z poniższego wzoru,
      figure-protocol-16 (16)
      gdzie,
      A260 = absorbancja przy 260 nm
      0,1 = objętość próbki
      1 = absorbancja standardowego roztworu DNA o stężeniu 50 µg/mL przy 260 nm
  6. Oszacowanie ilości białka
    1. Oszacować ilość białka w próbkach, korzystając z zestawu do oznaczania białek metodą Bradforda (Tabela materiałów).
    2. Do 0,1 mL supernatantu dodać 5 mL odczynnika Bradforda i pozostawić na 5 min. Białka obecne w supernatancie reagują z odczynnikiem Bradforda, tworząc barwny kompleks.
    3. Zmierzyć absorbancję przy 595 nm20 za pomocą spektrofotometru.
  7. Oszacowanie całkowitej zawartości cukrów redukujących (TRS)
    1. Zmierzyć TRS metodą kwasu dinitrosalicylowego (DNS)21.
    2. Przygotować roztwór DNS poprzez rozpuszczenie 1 g DNS w 50 mL wody destylowanej. Do roztworu dodawać niewielkimi porcjami 30 g winianu sodowo-potasowego, aż roztwór nabierze mleczno-żółtej barwy, a następnie dodać 20 mL 2 N NaOH, aby uzyskać przejrzysty kolor pomarańczowo-żółty. Uzupełnić objętość do 100 mL wodą destylowaną i przechowywać w ciemności.
    3. Przygotować roboczy roztwór glukozy (0,01 M), rozpuszczając 180 mg glukozy w 100 mL wody destylowanej w kolbie miarowej.
    4. Odmierzyć standardowy roztwór glukozy (0,2, 0,4, 0,6, 0,8 i 1 mL) do 5 oddzielnych probówek. Jako próbkę ślepą zastosować probówkę zawierającą wodę destylowaną (1 mL).
    5. Uzupełnić objętość w każdej probówce do 2 mL za pomocą wody destylowanej.
    6. Do każdej probówki dodać 1 mL odczynnika DNS i przykryć folią aluminiową.
    7. Ogrzewać probówki w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia przez 5 min, a następnie schłodzić do RT.
    8. Do każdej probówki dodać 9 mL wody destylowanej i dokładnie wymieszać. Zmierzyć OD zawartości przy 575 nm za pomocą spektrofotometru.
    9. Wyznaczyć stężenie korzystając z wykresu kalibracyjnego, w którym na osi X naniesiono ilość glukozy, a na osi Y absorbancję przy 575 nm (A575).
  8. Analiza wielkości cząstek
    1. Rozproszyć biosyntetyzowaną melaninę w wodzie destylowanej (1 mL) przy użyciu sonikatora.
    2. Przenieść 1 mL roztworu rozproszonej próbki do analizatora nanocząstek i zmierzyć wielkość cząstek zgodnie z protokołem producenta.
  9. Analiza za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM)
    1. Osuszyć proszek melaniny otrzymany po ekstrakcji, pozostawiając go w temperaturze 60 °C przez 8 h.
    2. Nanieść proszek melaniny na matrycę próbek TEM i zmierzyć wielkość za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego zgodnie z protokołem operatora.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1A,B przedstawia wzrost i produkcję melaniny pod wpływem różnych początkowych stężeń melaniny. Wzrost komórek oraz produkcja melaniny uległy znacznemu zmniejszeniu wraz ze wzrostem początkowego stężenia melaniny. Przy początkowym stężeniu melaniny w pożywce wynoszącym 500 mg/L biomasa i melanina zredukowały się do niemal 50% maksymalnej wartości uzyskanej w próbie kontrolnej. Przy początkowym stężeniu melaniny 1000 mg/L produkcja melaniny była minimalna. Szybkość wzr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Hamowanie produktu jest głównym wąskim gardłem w bioprzetwórstwie, które prowadzi do zmniejszenia wydajności. Istnieje kilka metod mających na celu zmniejszenie zahamowania produktu, takich jak ciągły bioproces i techniki usuwania produktu in situ. Opcje te wymagają jednak gruntownego remontu istniejącego zakładu bioprzetwarzania 23,24,25,26,27,28.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów

Podziękowania

Dziękujemy Departamentowi Nauki i Technologii (DST/TSG/WP/2014/58), Indiom oraz Narodowemu Instytutowi Technologii Karnataka za zapewnienie funduszy na rozwój powyższego protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Tlenek glinu + A15A26A3: A13A3: A16A3: A17HiMediaGRM1909
Węgiel aktywnyHiMediaPCT1001
Sztuczne medium do wody morskiejZestawM1942
BradfordHiMediaML106
CeliteWirówka HiMediaGRM226
REMICM-8
Probówki wirówkoweHiMediaPW1207
Kwas dinitrosalicylowyHiMediaGRM1582
Kolba ErlenmeyeraBorosil4980021
ziemi foluszowejHiMediaGRM232
GlukozaHiMediaMB037
HClHiMediaAS004
L-tyrozynaHiMediaRM069
Microsoft Excel
HORIBA ScientificNanopartica SZ-100
Pożywka Agar HiMediaM001
Płytka PetriegoHiMediaPW054
Bufor fosforanowyHiMediaM1452
Wodorotlenek soduHiMediaMB095
SpektrofotometrThermofisherGenesys 10
Bioreaktor ze zbiornikiem z mieszadłemScigenicsBioferm LS
TE BuforHiMediaML060
Transmisyjny mikroskop elektronowyJEOLJEM-2100
ZeolitHiMediaGRM3834
odczynników HiMedia Analizator nanocząstek Microsoft

Bibliografia

  1. Langfelder, K., Streibel, M., Jahn, B., Haase, G., Brakhage, A. A. Biosynthesis of fungal melanins and their importance for human pathogenic fungi. Fungal Genetics and Biology. 38 (2), 143-158 (2003).
  2. Riley, P. A. Melanin. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 29 (11), 1235-1239 (1997).
  3. Madaras, F., Gerber, J. P., Peddie, F., Kokkinn, M. J. The effect of sampling methods on the apparent constituents of ink from the squid sepioteuthis australis. Journal of Chemical Ecology. 36 (11), 1171-1179 (2010).
  4. Tran-Ly, A. N., et al. Microbial production of melanin and its various applications. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 36 (11), 170(2020).
  5. Pavan, M. E., López, N. I., Pettinari, M. J. Melanin biosynthesis in bacteria, regulation and production perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (4), 1357-1370 (2019).
  6. Pombeiro-Sponchiado, S. R., Sousa, G. S., Andrade, J. C. R., Lisboa, H. F., Gonçalves, R. C. R. Production of melanin pigment by fungi and its biotechnological applications. Melanin. , IntechOpen Limited. London, UK. 47-77 (2017).
  7. Guo, J., et al. Cloning and identification of a novel tyrosinase and its overexpression in Streptomyces kathirae SC-1 for enhancing melanin production. FEMS Microbiology Letters. 362, 41(2015).
  8. Lagunas-Muñoz, V. H., Cabrera-Valladares, N., Bolívar, F., Gosset, G., Martínez, A. Optimum melanin production using recombinant Escherichia coli. Journal of Applied Microbiology. 101 (5), 1002-1008 (2006).
  9. Wang, L., Li, Y., Li, Y. Metal ions driven production, characterization and bioactivity of extracellular melanin from Streptomyces sp. ZL-24. International Journal of Biological Macromolecules. 123, 521-530 (2019).
  10. Kiran, G. S., Jackson, S. A., Priyadharsini, S., Dobson, A. D. W., Selvin, J. Synthesis of Nm-PHB (nanomelanin-polyhydroxy butyrate) nanocomposite film and its protective effect against biofilm-forming multi drug resistant Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 7, 9167(2017).
  11. Raman, N. M., Shah, P. H., Mohan, M., Ramasamy, S. Improved production of melanin from Aspergillus fumigatus AFGRD105 by optimization of media factors. AMB Express. 5 (1), 72(2015).
  12. Thaira, H., Raval, K., Manirethan, V., Balakrishnan, R. M. Melanin nano-pigments for heavy metal remediation from water. Separation Science and Technology (Philadelphia). 54 (2), 265-274 (2018).
  13. Han, K., Levenspiel, O. Extended monod kinetics for substrate, product, and cell inhibition. Biotechnology and Bioengineering. 32 (4), 430-447 (1988).
  14. Vázquez, J. A., Murado, M. A. Unstructured mathematical model for biomass, lactic acid and bacteriocin production by lactic acid bacteria in batchfermentation. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83 (1), 91-96 (2008).
  15. Rohit, S. G., Jyoti, P. K., Subbi, R. R. T., Naresh, M., Senthilkumar, S. Kinetic modeling of hyaluronic acid production in palmyra palm (Borassus flabellifer) based medium by Streptococcus zooepidemicus MTCC 3523. Biochemical Engineering Journal. 137, 284-293 (2018).
  16. Nair, A. V., Gummadi, S. N., Doble, M. Process optimization and kinetic modelling of cyclic (1→3, 1→6)-β-glucans production from Bradyrhizobium japonicum MTCC120. Journal of Biotechnology. 226, 35-43 (2016).
  17. Reddy Tadi, S. R., Limaye, A. M., Sivaprakasam, S. Enhanced production of optically pure D (-) lactic acid from nutritionally rich Borassus flabellifer sugar and whey protein hydrolysate based-fermentation medium. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (-), 279-289 (2017).
  18. Ganesh Kumar, C., Sahu, N., Narender Reddy, G., Prasad, R. B. N., Nagesh, N., Kamal, A. Production of melanin pigment from Pseudomonas stutzeri isolated from red seaweed Hypnea musciformis. Letters in Applied Microbiology. 57 (4), 295-302 (2013).
  19. Ren, Q., Henes, B., Fairhead, M., Thöny-Meyer, L. High level production of tyrosinase in recombinant Escherichia coli. BMC Biotechnology. 13, 13-18 (2013).
  20. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. Springer Protocols Handbooks. , Humana Press. (2002).
  21. Miller, G. L. Use of Dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry. 31 (3), 426-428 (1959).
  22. Dutta, A., Diao, Y., Jain, R., Rene, E. R., Dutta, S. Adsorption of cadmium from aqueous solution onto coffee grounds and wheat straw: Equilibrium and kinetic study. Journal of Environmental Engineering. 142 (9), 1-6 (2015).
  23. Dhillon, G. S., Brar, S. K., Verma, M., Tyagi, R. D. Recent advances in citric acid bio-production and recovery. Food and Bioprocess Technology. 4, 505-529 (2011).
  24. Roffler, S. R., Blanch, H. W., Wilke, C. R. In situ recovery of fermentation products. Trends in Biotechnology. 2 (5), 129-136 (1984).
  25. Maiti, S., et al. A re-look at the biochemical strategies to enhance butanol production. Biomass and Bioenergy. 94, 187-200 (2016).
  26. Prakash, G., Srivastava, A. K. Integrated yield and productivity enhancement strategy for biotechnological production of Azadirachtin by suspension culture of Azadirachta indica. Asia-Pacific Journal of Chemical Engineering. 6 (1), 129-137 (2011).
  27. Stark, D., von Stockar, U. In situ product removal (ISPR) in whole cell biotechnology during the last twenty years. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 80, 149-175 (2003).
  28. Kaur, G., Srivastava, A. K., Chand, S. Debottlenecking product inhibition in 1,3-propanediol fermentation by In-Situ Product Recovery. Bioresource Technology. 197, 451-457 (2015).
  29. Arun, G., Eyini, M., Gunasekaran, P. Characterization and biological activities of extracellular melanin produced by Schizophyllum commune (Fries). Indian Journal of Experimental Biology. 53, 380-387 (2015).
  30. Bin, L., Wei, L., Xiaohong, C., Mei, J., Mingsheng, D. In vitro antibiofilm activity of the melanin from Auricularia auricula, an edible jelly mushroom. Annals of Microbiology. 62 (4), 1523-1530 (2012).
  31. Madhusudhan, D. N., Mazhari, B. B. Z., Dastager, S. G., Agsar, D. Production and cytotoxicity of extracellular insoluble and droplets of soluble melanin by Streptomyces lusitanus DMZ-3c. BioMed Research International. 2014, 1-11 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Produkcja melaninyinhibicja produktowaenzym tyrozynazaadsorpcja melaninyinhibicja zwrotnabakterie morskieprzesiewowe badanie adsorbent winhibicja enzymatyczna
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły