Artykuł metodologiczny

Bioproces adsorpcyjny poprawia wydajność melaniny z Pseudomonas stutzeri

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63339

⸱

12 stycznia 2022

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, National Institute of Technology, 2Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół bioprocesu adsorpcyjnego do produkcji produktu biologicznego, zwłaszcza pigmentu, który hamuje własną biosyntezę i hamuje wzrost mikroorganizmu, który go produkuje.

Streszczenie

Melaniny są naturalnymi pigmentami, a obecność pierścienia indolowego i licznych grup funkcyjnych sprawia, że melanina jest idealnym wyborem do wielu zastosowań, takich jak środki chroniące przed promieniowaniem UV, pielęgnacja skóry, kosmetyki itp. Morski Pseudomonas stutzeri wytwarza melaninę bez dodatku tyrozyny. Hamowanie sprzężenia zwrotnego zaobserwowano przez melaninę w hodowli bakterii morskiej wytwarzającej melaninę, Pseudomonas stutzeri. Melanina wykazała również hamowanie wzrostu drobnoustrojów. Analiza oparta na modelu Hana-Levenspiela zidentyfikowała hamowanie melaniny przez produkt niekonkurencyjny we wzroście komórek. Enzym tyrozynaza, który wytwarza melaninę, został zahamowany przez melaninę. Podwójny odwrotny wykres reakcji enzymatycznej w obecności różnych stężeń melaniny ujawnił niekonkurencyjne hamowanie produktu. Opracowano bioproces adsorpcyjny oparty na adsorbentach w celu zmniejszenia hamowania sprzężenia zwrotnego przez melaninę. Różne adsorbenty zostały przebadane, aby wybrać najlepszy adsorbent do adsorpcji melaniny. Ilość i czas dawkowania zostały zoptymalizowane w celu opracowania bioprocesu adsorpcyjnego, co spowodowało 8,8-krotne zwiększenie produkcji melaniny przez bakterie morskie Pseudomonas stutzeri (153 mg/L do 1349 mg/L) bez suplementacji tyrozyny i ekstraktu drożdżowego.

Wprowadzenie

Melaniny to związki polifenolowe, których jednostką monomeryczną jest pierścień indolowy. Melaniny są odpowiedzialne za większość czarnych, brązowych i szarych zabarwień roślin, zwierząt i mikroorganizmów1. Najczęstszymi melaninami są eumelaniny, które są ciemnobrązowymi lub czarnymi pigmentami szeroko rozpowszechnionymi u kręgowców i bezkręgowców2. Głowonogi, rośliny i drobnoustroje są głównymi źródłami melaniny3. Melanina pozyskiwana z mikroorganizmów ma kilka zalet w porównaniu z melaniną z głowonogów i roślin. Są szybkie w wzroście i nie powodują żadnych problemów związanych z wahaniami sezonowymi. Modyfikują się również w zależności od pożywki wzrostowej i zapewnionych warunków pracy. Biorąc pod uwagę wszystkie te fakty, źródła mikrobiologiczne są wykorzystywane jako główne źródło melaniny o potencjalnych zastosowaniach komercyjnych4,5,6. Guo i wsp. użyli rekombinowanego Streptomyces kathirae SC-1 do produkcji melaniny w ilości do 28,8 g/L w zoptymalizowanym medium7. Lagunas-Muñoz i wsp. Uzyskano około 6 g/L melaniny w rekombinowanym E. coli8. Wang i wsp. uzyskali około 4,2 g/L rozpuszczalnej melaniny po optymalizacji podłoża9. Naukowcy zbadali również kultury morskie w celu produkcji melaniny. Kiran i wsp. wyprodukowali melaninę z morskich gatunków Pseudomonas10. Kumar i in. wyizolowali Pseudomonas stutzeri HMGM-7 z wodorostów morskich, które wytwarzały melaninę w bulionie odżywczym. Wszyscy zgłoszeni producenci melaniny wymagają suplementów pożywki, ekstraktu drożdżowego i/lub peptonu do produkcji melaniny, co może utrudniać zwiększenie skali bioprocesu. Raman i wsp. badali produkcję melaniny przez Aspergillus fumigatus AFGRD105, który nie wymagał kosztownych dodatków11.

Do produkcji melaniny wybrano bakterię morską znaną jako Pseudomonas stutzeri, wyizolowaną z wodorostów. Mikroorganizm ten nie wymaga dodatkowej suplementacji tyrozyny i ekstraktu drożdżowego do produkcji rozpuszczalnej melaniny i rośnie w pożywkach na bazie wody morskiej, zmniejszając w ten sposób ślad wodny i średni koszt. Thaira i in. opisali zoptymalizowany proces biologiczny wykorzystujący mączkę z ciasta kokosowego do produkcji nanopigmentu melaniny przy użyciu tej morskiej bakterii w poprzedniej publikacji12. Wyprodukowana melanina została wykorzystana do wysoce efektywnego usuwania metali ciężkich z syntetycznych wód gruntowych. Jednak podczas optymalizacji pożywki zidentyfikowano prawdopodobne hamowanie sprzężenia zwrotnego melaniny na wzrost i tworzenie produktu. Dlatego w tym protokole hamowanie melaniny ze sprzężeniem zwrotnym jest badane i określane ilościowo przy użyciu uogólnionego modelu Hana-Levenspiela. Opracowano prosty i skuteczny adsorpcyjny protokół bioprocesowy w celu maksymalnego zmniejszenia hamowania sprzężenia zwrotnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wzrost i utrzymanie kultury Pseudomonas stutzeri.

  1. Bakterie Pseudomonas stutzeri należy pobrać z MTCC Chandigarh (dostarczane w postaci liofilizowanej ampułki).
    1. Zdezynfekuj powierzchnię ampułki alkoholem (70%). Zaznacz ampułkę w pobliżu środka miernika i rozbij w zaznaczonym obszarze.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas otwierania ampułki, ponieważ zawartość znajduje się w próżni. Zachowaj ostrożność podczas rozbijania ampułki, ponieważ zatrzaskowe otwarcie przyciągnie bawełnianą zatyczkę do jednego końca, a pospieszne otwarcie uwolni liofilizowane drobne cząsteczki drobnoustroju do powietrza.
    2. Ostrożnie wyjmij bawełnianą zatyczkę za pomocą wysterylizowanej pęsety i dodaj 0,3 ml bulionu Luria Bertani (LB) do ampułki. Odstaw na 30 minut.
    3. Zaszczepić 100 μl zawiesiny do 10 ml bulionu LB (w kolbie stożkowej o pojemności 100 ml) i umieścić ją w wytrząsarce inkubatora z prędkością 180 obr./min, utrzymywaną w temperaturze 37 °C. Jednocześnie przenieść 100 μl zawiesiny do stałego agaru LB i rozprowadzić w celu uzyskania izolowanych kolonii. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  2. Gdy kultura wyrośnie, przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
  3. Wykonuj subkulturę co 4 tygodnie, umieszczając kolonię na świeżej płytce agarowej LB i inkubując płytkę w temperaturze 37 °C przez noc, aby pojawiły się kolonie.

2. Badania hamowania wzrostu i aktywności enzymu melaniny

  1. Przygotować pożywkę hodowlaną, dodając odpowiednio 51,4 g/l glukozy, 49,8 g/l mączki kokosowej, 0,09 g/l, 0,03 g/l i 0,05 g/lCuSO4,FeSO4 iMgSO4 do sztucznej wody morskiej (tabela materiałów). Wykonaj wszystkie eksperymenty w kolbie wstrząsającej o pojemności 250 ml z objętością 15 ml przy 200 obr./min, 37 °C i początkowym pH 7.
  2. Dodaj różne stężenia melaniny (100 mg/L, 200 mg/L, 500 mg/L i 1000 mg/L) do każdej pożywki hodowlanej na początku bioprocesu.
  3. Zmierz określoną szybkość wzrostu, aktywność enzymatyczną komórek i melaninę w różnych odstępach czasu procesu biologicznego dla każdego dodanego stężenia melaniny (sekcja 3.2).

3. Modelowanie kinetyki hamowania melaniny

  1. Użyj poniższego uogólnionego równania Han and Levenspiel13, aby modelować kinetykę hamowania produkcji melaniny,
    figure-protocol-1 (1)
    Gdzie,
    μ = pozorna właściwa szybkość wzrostu (1/h)
    μmax = maksymalna właściwa szybkość wzrostu (1/h)
    p = stężenie produktu (g/l)
    p *= krytyczne stężenie produktu, przy którym ustaje wzrost (g/l)
    s = stężenie substratu (g/l)
    m,n = parametry
    Powyższe równanie można zapisać jako
    figure-protocol-2 (2)
    Gdzie,
    figure-protocol-3 (3)
    oraz figure-protocol-4 (4)
    Powyższe równanie można przestawić na podwójny wykres odwrotny 1/μ w porównaniu z 1/s, jak podano poniżej
    figure-protocol-5 (5)
  2. Narysuj linię prostą, korzystając z danych o różnych właściwych szybkościach wzrostu i stężeniach substratu, korzystając z powyższego równania. Punkt przecięcia na osiach Y i X daje odpowiednio μmax i Ks, które można podstawić odpowiednio w kolejności 3 i 4, aby uzyskać μobs i Kobs.
    Równanie (3) można zapisać jako
    figure-protocol-6 (6)
  3. Oblicz specyficzną szybkość wzrostu kultury wyhodowanej w kroku 2.2 i nazwij ją jako μobs.
  4. Użyć wartości właściwej szybkości wzrostu uzyskanej w kroku 3.3 równania (6). Dopasuj dane do równania liniowego i oblicz nachylenie oraz punkt przecięcia.
  5. Użyj równania (3), aby obliczyć maksymalną właściwą szybkość wzrostu przy braku melaniny.

4. Rozwój bioprocesu adsorpcyjnego

  1. Wykonaj wszystkie eksperymenty w kolbie wstrząsającej o pojemności 250 ml z objętością 15 ml przy 200 obr./min, 37 °C i początkowym pH 7.
  2. Końcowy zoptymalizowany proces biologiczny należy przeprowadzić w bioreaktorze ze zbiornikiem o pojemności 5 litrów z mieszadłem i objętością wypełniacza wynoszącą 3 litry. Utrzymuj pH kultury między 7-7,5 i rozpuszczony tlen między 50% a 60% nasycenia w badaniach bioreaktora.

5. Wybór najlepszego adsorbentu spośród różnych dostępnych adsorbentów

  1. Dodaj różne adsorbenty, takie jak tlenek glinu, zeolit, celit, ziemia foluszowa i węgiel aktywny w różnych kolbach zawierających bulion kulturowy.
  2. Dodać każdy adsorbent oddzielnie w stężeniu 1 g/l do bulionu hodowlanego i przechowywać go w wytrząsarce obrotowej z prędkością 150 obr./min przez 12 minut.
  3. Oddzielić adsorbenty przez odwirowanie przy 5000 x g przez 10 minut i zmierzyć absorbancję supernatantu przy 400 nm za pomocą spektrofotometru.
  4. Wybierz adsorbent, który adsorbuje maksymalną ilość melaniny z bulionu hodowlanego.

6. Wpływ czasu dozowania adsorbentu

  1. Rozpocznij bioproces i dodaj adsorbent dający najwyższą adsorpcję melaniny z kultury (wybrany po sekcji 5). Stężenie wybrane na etapie wstępnym wynosi 1 g/L.
  2. Zmierz maksymalną produkcję melaniny zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem12.
  3. Powtórzyć krok 6.1, dodając adsorbent po 12 godzinach od rozpoczęcia bioprocesu i zmierzyć produkcję melaniny w różnych momentach bioprocesu.
  4. Powtórz krok 6.3, dodając adsorbent po 24 godzinach, 36 godzinach i 48 godzinach od rozpoczęcia bioprocesu.
  5. Porównaj melaninę wytwarzaną w każdym przebiegu bioprocesu i określ najlepszy czas dawkowania dla maksymalnej produkcji i regeneracji melaniny.

7. Wpływ ilości dozowanego adsorbentu

  1. Dodać różne stężenia najlepszego adsorbentu (0,5, 1, 2, 4, 6, 8 i 10 g/l) do kultur w czasie określonym w sekcji 6.
  2. Zebrać bioproces przez odwirowanie w temperaturze 5000 x g przez 10 minut.
  3. Zebrać supernatant i obliczyć ilość melaniny, mierząc absorbancję przy 400 nm.
  4. Przepłukać osad zawierający adsorbent dwa razy wodą destylowaną i etanolem w celu usunięcia komórek i innych związków przyłączonych do adsorbentu. Etap mycia należy przeprowadzić przez odwirowanie przy 5000 x g przez 10 minut.
  5. Dodaj 0,1 M roztwór NaOH do przemytego adsorbentu w celu desorpcji melaniny.
  6. Odwirować mieszaninę przy 5000 x g przez 10 minut i zmierzyć ilość melaniny w supernatancie przy 400 nm za pomocą spektrofotometru.
  7. Powtórz proces desorpcji trzy razy lub do momentu, gdy adsorbent powróci do normalnego koloru.
  8. Zmniejszyć pH tego stężonego zdesorbowanego roztworu melaniny do 3 lub mniej, dodając 1 N HCl za pomocą mieszadła z kulkami magnetycznymi w celu wytrącenia melaniny. Przechowuj kwaśny roztwór w lodówce przez 1 godzinę, aby w razie potrzeby zwiększyć opady.
  9. Otrzymaną w ten sposób wytrąconą melaninę przepłukać trzykrotnie wodą destylowaną przez odwirowanie przy sile 5000 x g przez 10 minut, wysuszyć i przechowywać w temperaturze 4 °C.

8. Matematyczne modelowanie bioprocesu

  1. Kinetyka wzrostu biomasy
    1. Określ ilościowo tempo wzrostu biomasy za pomocą następującego zmodyfikowanego modelu Verhulset opracowanego w celu hamowania produktu, zgodnie z opisem równania podanego poniżej14,15,16,17,
      figure-protocol-7 (7)
      Gdzie,
      x = stężenie biomasy (g/l)
      xm = maksymalne stężenie biomasy (g/l)
      μobs = maksymalna właściwa szybkość wzrostu (1/h) określona równaniem (2)
      Vazques i in. (2008) wyprowadzili następnie następujące równanie koncentracji biomasy z równania (7)
      figure-protocol-8 (8)
      Gdzie,
      vx = tempo wzrostu biomasy (g/l/h) = μobs·x
      μobs       = obserwowana właściwa szybkość wzrostu (1/h)
      τx = czas opóźnienia (h)
      t = czas (h)
    2. Równanie (8) należy wykorzystać do obliczenia stężenia biomasy w różnych momentach bioprocesu i symulacji profilu wzrostu Pseudomonas stutzeri.
  2. Kinetyka zużycia substratu
    UWAGA: Substrat służy do wzrostu biomasy, tworzenia produktu i utrzymania w bioprocesie.
    1. Użyj poniższego równania, aby zrównoważyć wykorzystanie substratu w bioprocesie,
      figure-protocol-9 (9)
      Większość glukozy jest wykorzystywana do wytwarzania biomasy; Dlatego, dla uproszczenia, pominięcie zużycia substratu do tworzenia produktu zredukowałoby równanie (9) do,
      figure-protocol-10 (10)
      Gdzie,
      S = stężenie substratu (g/L)
      YP/S = współczynnik uzysku produktu, tj. współczynnik uzysku melaniny (g/g)
      P = stężenie produktu (g/L), tj. stężenie melaniny (g/L)
      YX/S = współczynnik plonowania biomasy (g/g)
      ms = współczynnik utrzymania (g/g/h)
      Całkowanie powyższego równania z czasu t = 0 do czasu t = t i podstawienie wartości x z równania (8) daje następujące równanie dla profilu stężenia substratu17,
      figure-protocol-11 (11)
      gdzie, s0 = początkowe stężenie substratu (g/l) i x0 = początkowe stężenie biomasy (g/l)
    2. Równanie (11) należy zastosować do obliczenia stężenia substratu w różnych odstępach czasu bioprocesu lub, jeśli znane jest stężenie substratu, należy użyć tego samego równania do oszacowania parametrów podanych w równaniu.
  3. Kinetyka produkcji melaniny
    1. Użyj równania Ludekinga-Pirata, aby zasymulować produkcję melaniny. Jednak melanina jest związana ze wzrostem i dlatego termin tworzenia produktu niezwiązany ze wzrostem jest zaniedbywany, a uproszczone równanie można zapisać jako:
      figure-protocol-12 (12)
      Gdzie,
      α = stała Ludeking-Pirate związana z powstawaniem produktu związanego ze wzrostem (g/g)
      Całkowanie równania (12) od czasu t = 0 do t = t daje następujące równanie dla profilu stężenia produktu
      figure-protocol-13 (13)
    2. Użyj równania (13), aby obliczyć α.
  4. Estymacja parametrów kinetycznych
    1. Oszacuj wszystkie wyżej wymienione parametry za pomocą nieliniowej metody najmniejszych kwadratów szacowania parametrów przy użyciu dowolnego odpowiedniego narzędzia programowego (np. solvera Microsoft Excel).
    2. Użyj danych z eksperymentu wsadowego do oszacowania parametrów i zminimalizuj sumę błędu kwadratowego (SSE) za pomocą narzędzia Solver, zgodnie z następującym równaniem
      Minimalizacja,
      figure-protocol-14 (14)
      Gdzie,
      xsim = wartość symulowana i xexp = wartość eksperymentalna

9. Techniki analityczne

  1. Ekstrakcja melaniny
    1. Odwirować kulturę wzrostu przy 5000 x g przez 10 minut, aby usunąć biomasę.
    2. Dodać równą objętość 1 M NaOH do supernatantu.
    3. Zakwasić alkaliczny supernatant do pH 2, dodając 1 N HCl w celu wytrącenia melaniny.
    4. Odwirować zakwaszony supernatant o sile 12000 x g przez 20 minut w celu zebrania melaniny.
    5. Zebraną melaninę przemyć trzykrotnie 5 ml wody destylowanej, wysuszyć przez noc w temperaturze pokojowej (RT) i przechowywać w temperaturze 4 °C18.
  2. Kwantyfikacja melaniny
    1. Przygotuj roztwory melaniny o różnych stężeniach (0-500 mg/L), rozpuszczając odpowiednią ilość melaniny w sztucznej wodzie morskiej (pH 8).
    2. Zmierz absorbancję przy 400 nm za pomocą spektrofotometru18.
    3. Przygotuj krzywą kalibracyjną, korzystając z powyższych danych.
    4. Odwirować kulturę wzrostu przy 5000 x g przez 10 minut w celu usunięcia biomasy i zmierzyć absorbancję supernatantu przy 400 nm. Obliczyć stężenie melaniny w kulturze wzrostowej, korzystając z krzywej kalibracyjnej przygotowanej w kroku 9.2.3
  3. Test tyrozynazy
    1. Postępuj zgodnie z poniższym protokołem dla testu enzymatycznego tyrozynazy opracowanego przez Ren et al. (2013)19, aby określić aktywność enzymatyczną tyrozynazy ekstrahowanej z bulionu z kultury Pseudomonas stutzeri.
    2. Odwirować kulturę bakteryjną przy 5,000 x g, aby zebrać komórki.
    3. Sonikować komórki w zimnym 100 mM buforze fosforanowym o pH 6,5 i odwirować homogenat przy 9000 x g przez 15 minut i zebrać supernatant, źródło enzymu tyrozynazy.
    4. Dodać 0,2 ml roztworu enzymatycznego otrzymanego w powyższym kroku do 2,8 ml 0,1 M buforu fosforanowego sodu (pH 6,5) zawierającego 1 mM L-tyrozynę (substrat).
    5. Obserwuj tworzenie się dopachromu, mierząc absorbancję przy 475 nm.
    6. Obliczyć aktywność tyrozynazy w następujący sposób. Jedna jednostka międzynarodowa (j.m.) aktywności tyrozynazy jest definiowana jako ilość enzymu potrzebna do utlenienia 1 μmol L-tyrozyny do dopachromu na minutę. Oblicz to, używając molowego współczynnika ekstynkcji dopachromu (3600 L·M-1·cm-1) według następującego równania
      figure-protocol-15 (15)
  4. Szacowanie biomasy
    1. Zebrać 5 ml próbek w odstępie 4 godzin w komorze bezpieczeństwa biologicznego, zachowując sterylność. Podpalić bawełniany korek kolby przed i po pobraniu próbek, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia. Zmierzyć gęstość optyczną (OD) próbek o długości fali 660 nm dla wszystkich tych próbek.
      UWAGA: Niezaszczepiona pożywka służy jako ślepa próba. Odczyty te zostaną wykorzystane do badania wzrostu mikroorganizmów.
    2. Odwirować bulion hodowlany o sile 5000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, zebrać osad komórkowy i suszyć go przez 8 godzin w temperaturze 60 °C w piecu z gorącym powietrzem w celu uzyskania suchej masy komórkowej.
    3. Przygotować krzywą kalibracyjną, używając średnicy zewnętrznej zmierzonej w kroku 9.4.1 i odpowiadającej jej biomasy uzyskanej w kroku 9.4.2
    4. Użyj krzywej kalibracyjnej (OD = 0,82٠Biomasa (g/L)) do pomiaru nieznanej ilości biomasy, mierząc gęstość optyczną bulionu hodowlanego w dowolnym momencie.
  5. Ocena DNA
    1. Oszacuj ilość DNA w próbce, mierząc gęstość optyczną przy 260 nm.
    2. Oblicz DNA, korzystając z następującego wzoru:
      figure-protocol-16 (16)
      Gdzie,
      A260 = Absorbancja przy 260 nm
      0,1 = objętość próbki
      1 = absorbancja roztworu wzorcowego DNA o stężeniu 50 μg/ml przy 260 nm
  6. Oznaczanie zawartości białka
    1. Oszacuj ilość białka w próbkach za pomocą zestawu do szacowania białka Bradford (tabela materiałów).
    2. Dodać 5 ml odczynnika Bradforda do 0,1 ml supernatantu i przechowywać przez 5 minut. Białka obecne w supernatancie reagują z odczynnikiem Bradforda, tworząc barwny kompleks.
    3. Zmierz absorbancję przy 595 nm20 za pomocą spektrofotometru.
  7. Oznaczanie zawartości cukru redukującego ogółem (TRS)
    1. Zmierz TRS metodą dinitrosalicylową (DNS)21.
    2. Przygotuj roztwór DNS, rozpuszczając 1 g DNS w 50 ml wody destylowanej. Dodać 30 g winianu sodu potasu do tego roztworu w małych ilościach, aż kolor roztworu stanie się mlecznożółty, a następnie przezroczysty pomarańczowo-żółty z dodatkiem 20 ml 2 N NaOH. Zwiększ objętość do 100 ml za pomocą wody destylowanej i przechowuj ją w ciemności.
    3. Przygotować roztwór roboczy glukozy (0,01 M), rozpuszczając 180 mg glukozy w 100 ml wody destylowanej w kolbie miarowej.
    4. Odpipetować standardowy roztwór glukozy (0,2, 0,4, 0,6, 0,8 i 1 ml) do 5 oddzielnych probówek. Użyj probówki zawierającej wodę destylowaną (1 ml) jako ślepy roztwór.
    5. Zwiększyć objętość do 2 ml w każdej probówce za pomocą wody destylowanej.
    6. Dodaj 1 ml odczynnika DNS do każdej probówki i przykryj folią aluminiową.
    7. Podgrzej probówki we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut i ostudź do temperatury RT.
    8. Dodaj 9 ml wody destylowanej do każdej probówki i dobrze wymieszaj. Zmierzyć średnicę zewnętrzną zawartości przy długości fali 575 nm za pomocą spektrofotometru.
    9. Zmierzyć stężenie za pomocą karty kalibracyjnej przygotowanej z ilością glukozy na osi X w funkcji absorbancji przy 575 nm (A575) na osi Y.
  8. Analiza wielkości cząstek
    1. Zdyspergować biosyntetyzowaną melaninę w wodzie destylowanej (1 ml) za pomocą sonikatora.
    2. Dodać zdyspersjonowany roztwór próbki (1 ml) do analizatora nanocząstek i zmierzyć wielkość cząstek zgodnie z protokołem producenta.
  9. Analiza transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)
    1. Wysuszyć melaninę w proszku otrzymanym po ekstrakcji, utrzymując go w temperaturze 60 °C przez 8 godzin.
    2. Załaduj melaninę w proszku do matrycy próbki TEM i zmierz rozmiar za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego zgodnie z protokołem operatora.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1A,B pokazuje wzrost i produkcję melaniny pod wpływem różnych początkowych stężeń melaniny. Wzrost komórek i produkcja melaniny znacznie zmniejszyły się wraz ze wzrostem początkowego stężenia melaniny. Przy początkowym stężeniu melaniny w pożywce wynoszącym 500 mg/l, biomasa i melanina zmniejszyły się do prawie 50% maksymalnej wartości uzyskanej w kontroli. Przy 1000 mg/l początkowego stężenia melaniny nastąpiła marginalna produkcja melaniny. Tempo wzrostu biomasy zm...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Hamowanie produktu jest głównym wąskim gardłem w bioprzetwórstwie, które prowadzi do zmniejszenia wydajności. Istnieje kilka metod mających na celu zmniejszenie zahamowania produktu, takich jak ciągły bioproces i techniki usuwania produktu in situ. Opcje te wymagają jednak gruntownego remontu istniejącego zakładu bioprzetwarzania 23,24,25,26,27,28.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów

Podziękowania

Dziękujemy Departamentowi Nauki i Technologii (DST/TSG/WP/2014/58), Indiom oraz Narodowemu Instytutowi Technologii Karnataka za zapewnienie funduszy na rozwój powyższego protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Tlenek glinu + A15A26A3: A13A3: A16A3: A17HiMediaGRM1909
Węgiel aktywnyHiMediaPCT1001
Sztuczne medium do wody morskiejZestawM1942
BradfordHiMediaML106
CeliteWirówka HiMediaGRM226
REMICM-8
Probówki wirówkoweHiMediaPW1207
Kwas dinitrosalicylowyHiMediaGRM1582
Kolba ErlenmeyeraBorosil4980021
ziemi foluszowejHiMediaGRM232
GlukozaHiMediaMB037
HClHiMediaAS004
L-tyrozynaHiMediaRM069
Microsoft Excel
HORIBA ScientificNanopartica SZ-100
Pożywka Agar HiMediaM001
Płytka PetriegoHiMediaPW054
Bufor fosforanowyHiMediaM1452
Wodorotlenek soduHiMediaMB095
SpektrofotometrThermofisherGenesys 10
Bioreaktor ze zbiornikiem z mieszadłemScigenicsBioferm LS
TE BuforHiMediaML060
Transmisyjny mikroskop elektronowyJEOLJEM-2100
ZeolitHiMediaGRM3834
odczynników HiMedia Analizator nanocząstek Microsoft

Bibliografia

  1. Langfelder, K., Streibel, M., Jahn, B., Haase, G., Brakhage, A. A. Biosynthesis of fungal melanins and their importance for human pathogenic fungi. Fungal Genetics and Biology. 38 (2), 143-158 (2003).
  2. Riley, P. A. Melanin. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 29 (11), 1235-1239 (1997).
  3. Madaras, F., Gerber, J. P., Peddie, F., Kokkinn, M. J. The effect of sampling methods on the apparent constituents of ink from the squid sepioteuthis australis. Journal of Chemical Ecology. 36 (11), 1171-1179 (2010).
  4. Tran-Ly, A. N., et al. Microbial production of melanin and its various applications. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 36 (11), 170(2020).
  5. Pavan, M. E., López, N. I., Pettinari, M. J. Melanin biosynthesis in bacteria, regulation and production perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (4), 1357-1370 (2019).
  6. Pombeiro-Sponchiado, S. R., Sousa, G. S., Andrade, J. C. R., Lisboa, H. F., Gonçalves, R. C. R. Production of melanin pigment by fungi and its biotechnological applications. Melanin. , IntechOpen Limited. London, UK. 47-77 (2017).
  7. Guo, J., et al. Cloning and identification of a novel tyrosinase and its overexpression in Streptomyces kathirae SC-1 for enhancing melanin production. FEMS Microbiology Letters. 362, 41(2015).
  8. Lagunas-Muñoz, V. H., Cabrera-Valladares, N., Bolívar, F., Gosset, G., Martínez, A. Optimum melanin production using recombinant Escherichia coli. Journal of Applied Microbiology. 101 (5), 1002-1008 (2006).
  9. Wang, L., Li, Y., Li, Y. Metal ions driven production, characterization and bioactivity of extracellular melanin from Streptomyces sp. ZL-24. International Journal of Biological Macromolecules. 123, 521-530 (2019).
  10. Kiran, G. S., Jackson, S. A., Priyadharsini, S., Dobson, A. D. W., Selvin, J. Synthesis of Nm-PHB (nanomelanin-polyhydroxy butyrate) nanocomposite film and its protective effect against biofilm-forming multi drug resistant Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 7, 9167(2017).
  11. Raman, N. M., Shah, P. H., Mohan, M., Ramasamy, S. Improved production of melanin from Aspergillus fumigatus AFGRD105 by optimization of media factors. AMB Express. 5 (1), 72(2015).
  12. Thaira, H., Raval, K., Manirethan, V., Balakrishnan, R. M. Melanin nano-pigments for heavy metal remediation from water. Separation Science and Technology (Philadelphia). 54 (2), 265-274 (2018).
  13. Han, K., Levenspiel, O. Extended monod kinetics for substrate, product, and cell inhibition. Biotechnology and Bioengineering. 32 (4), 430-447 (1988).
  14. Vázquez, J. A., Murado, M. A. Unstructured mathematical model for biomass, lactic acid and bacteriocin production by lactic acid bacteria in batchfermentation. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83 (1), 91-96 (2008).
  15. Rohit, S. G., Jyoti, P. K., Subbi, R. R. T., Naresh, M., Senthilkumar, S. Kinetic modeling of hyaluronic acid production in palmyra palm (Borassus flabellifer) based medium by Streptococcus zooepidemicus MTCC 3523. Biochemical Engineering Journal. 137, 284-293 (2018).
  16. Nair, A. V., Gummadi, S. N., Doble, M. Process optimization and kinetic modelling of cyclic (1→3, 1→6)-β-glucans production from Bradyrhizobium japonicum MTCC120. Journal of Biotechnology. 226, 35-43 (2016).
  17. Reddy Tadi, S. R., Limaye, A. M., Sivaprakasam, S. Enhanced production of optically pure D (-) lactic acid from nutritionally rich Borassus flabellifer sugar and whey protein hydrolysate based-fermentation medium. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (-), 279-289 (2017).
  18. Ganesh Kumar, C., Sahu, N., Narender Reddy, G., Prasad, R. B. N., Nagesh, N., Kamal, A. Production of melanin pigment from Pseudomonas stutzeri isolated from red seaweed Hypnea musciformis. Letters in Applied Microbiology. 57 (4), 295-302 (2013).
  19. Ren, Q., Henes, B., Fairhead, M., Thöny-Meyer, L. High level production of tyrosinase in recombinant Escherichia coli. BMC Biotechnology. 13, 13-18 (2013).
  20. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. Springer Protocols Handbooks. , Humana Press. (2002).
  21. Miller, G. L. Use of Dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry. 31 (3), 426-428 (1959).
  22. Dutta, A., Diao, Y., Jain, R., Rene, E. R., Dutta, S. Adsorption of cadmium from aqueous solution onto coffee grounds and wheat straw: Equilibrium and kinetic study. Journal of Environmental Engineering. 142 (9), 1-6 (2015).
  23. Dhillon, G. S., Brar, S. K., Verma, M., Tyagi, R. D. Recent advances in citric acid bio-production and recovery. Food and Bioprocess Technology. 4, 505-529 (2011).
  24. Roffler, S. R., Blanch, H. W., Wilke, C. R. In situ recovery of fermentation products. Trends in Biotechnology. 2 (5), 129-136 (1984).
  25. Maiti, S., et al. A re-look at the biochemical strategies to enhance butanol production. Biomass and Bioenergy. 94, 187-200 (2016).
  26. Prakash, G., Srivastava, A. K. Integrated yield and productivity enhancement strategy for biotechnological production of Azadirachtin by suspension culture of Azadirachta indica. Asia-Pacific Journal of Chemical Engineering. 6 (1), 129-137 (2011).
  27. Stark, D., von Stockar, U. In situ product removal (ISPR) in whole cell biotechnology during the last twenty years. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 80, 149-175 (2003).
  28. Kaur, G., Srivastava, A. K., Chand, S. Debottlenecking product inhibition in 1,3-propanediol fermentation by In-Situ Product Recovery. Bioresource Technology. 197, 451-457 (2015).
  29. Arun, G., Eyini, M., Gunasekaran, P. Characterization and biological activities of extracellular melanin produced by Schizophyllum commune (Fries). Indian Journal of Experimental Biology. 53, 380-387 (2015).
  30. Bin, L., Wei, L., Xiaohong, C., Mei, J., Mingsheng, D. In vitro antibiofilm activity of the melanin from Auricularia auricula, an edible jelly mushroom. Annals of Microbiology. 62 (4), 1523-1530 (2012).
  31. Madhusudhan, D. N., Mazhari, B. B. Z., Dastager, S. G., Agsar, D. Production and cytotoxicity of extracellular insoluble and droplets of soluble melanin by Streptomyces lusitanus DMZ-3c. BioMed Research International. 2014, 1-11 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Produkcja melaninyinhibicja produktowaenzym tyrozynazaadsorpcja melaninyinhibicja zwrotnabakterie morskieprzesiewowe badanie adsorbent winhibicja enzymatyczna
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły