Artykuł metodologiczny

Bioproces adsorpcyjny poprawia wydajność melaniny z Pseudomonas stutzeri

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63339

⸱

12 stycznia 2022

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, National Institute of Technology, 2Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół bioprocesu adsorpcyjnego do produkcji produktu biologicznego, zwłaszcza pigmentu, który hamuje własną biosyntezę i hamuje wzrost mikroorganizmu, który go produkuje.

Streszczenie

Melaniny są naturalnymi pigmentami, a obecność pierścienia indolowego i licznych grup funkcyjnych sprawia, że melanina jest idealnym wyborem do wielu zastosowań, takich jak środki chroniące przed promieniowaniem UV, pielęgnacja skóry, kosmetyki itp. Morski Pseudomonas stutzeri wytwarza melaninę bez dodatku tyrozyny. Hamowanie sprzężenia zwrotnego zaobserwowano przez melaninę w hodowli bakterii morskiej wytwarzającej melaninę, Pseudomonas stutzeri. Melanina wykazała również hamowanie wzrostu drobnoustrojów. Analiza oparta na modelu Hana-Levenspiela zidentyfikowała hamowanie melaniny przez produkt niekonkurencyjny we wzroście komórek. Enzym tyrozynaza, który wytwarza melaninę, został zahamowany przez melaninę. Podwójny odwrotny wykres reakcji enzymatycznej w obecności różnych stężeń melaniny ujawnił niekonkurencyjne hamowanie produktu. Opracowano bioproces adsorpcyjny oparty na adsorbentach w celu zmniejszenia hamowania sprzężenia zwrotnego przez melaninę. Różne adsorbenty zostały przebadane, aby wybrać najlepszy adsorbent do adsorpcji melaniny. Ilość i czas dawkowania zostały zoptymalizowane w celu opracowania bioprocesu adsorpcyjnego, co spowodowało 8,8-krotne zwiększenie produkcji melaniny przez bakterie morskie Pseudomonas stutzeri (153 mg/L do 1349 mg/L) bez suplementacji tyrozyny i ekstraktu drożdżowego.

Wprowadzenie

Melaniny to związki polifenolowe, których jednostką monomeryczną jest pierścień indolowy. Melaniny są odpowiedzialne za większość czarnych, brązowych i szarych zabarwień roślin, zwierząt i mikroorganizmów1. Najczęstszymi melaninami są eumelaniny, które są ciemnobrązowymi lub czarnymi pigmentami szeroko rozpowszechnionymi u kręgowców i bezkręgowców2. Głowonogi, rośliny i drobnoustroje są głównymi źródłami melaniny3. Melanina pozyskiwana z mikroorganizmów ma kilka zalet w porównaniu z melaniną z głowonogów i roślin. Są szybkie w wzroście i nie powodują żadnych problemów związanych z wahaniami sezonowymi. Modyfikują się również w zależności od pożywki wzrostowej i zapewnionych warunków pracy. Biorąc pod uwagę wszystkie te fakty, źródła mikrobiologiczne są wykorzystywane jako główne źródło melaniny o potencjalnych zastosowaniach komercyjnych4,5,6. Guo i wsp. użyli rekombinowanego Streptomyces kathirae SC-1 do produkcji melaniny w ilości do 28,8 g/L w zoptymalizowanym medium7. Lagunas-Muñoz i wsp. Uzyskano około 6 g/L melaniny w rekombinowanym E. coli8. Wang i wsp. uzyskali około 4,2 g/L rozpuszczalnej melaniny po optymalizacji podłoża9. Naukowcy zbadali również kultury morskie w celu produkcji melaniny. Kiran i wsp. wyprodukowali melaninę z morskich gatunków Pseudomonas10. Kumar i in. wyizolowali Pseudomonas stutzeri HMGM-7 z wodorostów morskich, które wytwarzały melaninę w bulionie odżywczym. Wszyscy zgłoszeni producenci melaniny wymagają suplementów pożywki, ekstraktu drożdżowego i/lub peptonu do produkcji melaniny, co może utrudniać zwiększenie skali bioprocesu. Raman i wsp. badali produkcję melaniny przez Aspergillus fumigatus AFGRD105, który nie wymagał kosztownych dodatków11.

Do produkcji melaniny wybrano bakterię morską znaną jako Pseudomonas stutzeri, wyizolowaną z wodorostów. Mikroorganizm ten nie wymaga dodatkowej suplementacji tyrozyny i ekstraktu drożdżowego do produkcji rozpuszczalnej melaniny i rośnie w pożywkach na bazie wody morskiej, zmniejszając w ten sposób ślad wodny i średni koszt. Thaira i in. opisali zoptymalizowany proces biologiczny wykorzystujący mączkę z ciasta kokosowego do produkcji nanopigmentu melaniny przy użyciu tej morskiej bakterii w poprzedniej publikacji12. Wyprodukowana melanina została wykorzystana do wysoce efektywnego usuwania metali ciężkich z syntetycznych wód gruntowych. Jednak podczas optymalizacji pożywki zidentyfikowano prawdopodobne hamowanie sprzężenia zwrotnego melaniny na wzrost i tworzenie produktu. Dlatego w tym protokole hamowanie melaniny ze sprzężeniem zwrotnym jest badane i określane ilościowo przy użyciu uogólnionego modelu Hana-Levenspiela. Opracowano prosty i skuteczny adsorpcyjny protokół bioprocesowy w celu maksymalnego zmniejszenia hamowania sprzężenia zwrotnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla i utrzymanie kultury Pseudomonas stutzeri.

  1. Pozyskać bakterie Pseudomonas stutzeri z MTCC Chandigarh (dostarczone w formie liofilizowanej ampułki).
    1. Zdezynfekować powierzchnię ampułki alkoholem (70%). Zaznaczyć ampułkę w pobliżu środka pomiarowego i przełamać w zaznaczonym miejscu.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas otwierania ampułki, ponieważ jej zawartość znajduje się w próżni. Należy zachować środki ostrożności podczas przełamywania ampułki, gdyż gwałtowne otwarcie może wciągnąć bawełniany czop do jednego z końców, a zbyt szybkie otwarcie spowoduje uwolnienie liofilizowanych drobnych cząsteczek mikroorganizmu do powietrza.
    2. Ostrożnie usunąć bawełniany czop za pomocą wysterylizowanej pęsety i dodać do ampułki 0,3 mL pożywki Luria Bertani (LB). Pozostawić na 30 min.
    3. Zaszczepić 100 µL zawiesiny do 10 mL pożywki LB (w kolbie stożkowej o pojemności 100 mL) i umieścić w inkubatorze z wytrząsarką przy 180 rpm w temperaturze 37 °C. Równocześnie przenieść 100 µL zawiesiny na stałe podłoże LB agar i rozprzestrzenić w celu uzyskania pojedynczych kolonii. Inkubować w 37 °C przez noc.
  2. Po wyrośnięciu kultury przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
  3. Przeprowadzać pasaż co 4 tygodnie, kreśląc kolonię na świeżym podłożu LB agar i inkubując płytkę w 37 °C przez noc do czasu pojawienia się kolonii.

2. Badania nad hamującym wpływem melaniny na wzrost i aktywność enzymatyczną

  1. Przygotować pożywkę hodowlaną, dodając do sztucznej wody morskiej 51,4 g/L glukozy, 49,8 g/L mączki z miąższu kokosowego oraz odpowiednio 0,09 g/L, 0,03 g/L i 0,05 g/L CuSO4, FeSO4 oraz MgSO4 (Tabela materiałów). Wszystkie eksperymenty przeprowadzić w kolbie shake flask o pojemności 250 mL z objętością wypełnienia 15 mL, przy 200 rpm, 37 °C i początkowym pH wynoszącym 7.
  2. Na początku procesu biotechnologicznego do każdej pożywki dodać melaninę w różnych stężeniach (100 mg/L, 200 mg/L, 500 mg/L i 1000 mg/L).
  3. Dla każdego dodanego stężenia melaniny zmierzyć swoistą szybkość wzrostu, aktywność enzymatyczną komórek oraz zawartość melaniny w różnych odstępach czasu trwania procesu (sekcja 3.2).

3. Modelowanie kinetyki hamowania melaniny

  1. Aby zamodelować kinetykę inhibicji produkcji melaniny, należy zastosować następujące uogólnione równanie Hana i Levenspiela13:
    równanie wzrostu mikrobiologicznego; formuła; model matematyczny; bioproces; analiza fermentacji (1)
    Gdzie:
    µ = pozorna swoista szybkość wzrostu (1/h)
    µmax = maksymalna swoista szybkość wzrostu (1/h)
    p = stężenie produktu (g/L)
    p *= krytyczne stężenie produktu, przy którym wzrost ustaje (g/L)
    s = stężenie substratu (g/L)
    m,n = parametry
    Powyższe równanie można zapisać jako:
    Równanie szybkości wzrostu mikrobiologicznego; symbol; zastosowanie edukacyjne i badawcze; analiza modelu kinetycznego. (2)
    Gdzie:
    Równanie szybkości wzrostu bakterii: μobs=μmax(1−p/p*)^n; stosowane w badaniach kinetyki mikrobiologicznej. (3)
    oraz Równanie równowagi statycznej, K_obs = K_s(1-p/p*)^m, istotne dla analizy danych w badaniach naukowych. (4)
    Powyższe równanie można przekształcić do postaci wykresu podwójnych odwrotności 1/µ względem 1/s, zgodnie z poniższym zapisem:
    Równanie kinetyki enzymatycznej; odwrotność prędkości i stężenia; analiza formuły. (5)
  2. Na podstawie powyższego równania oraz danych dotyczących różnych swoistych szybkości wzrostu i stężeń substratu należy wyznaczyć linię prostą. Punkty przecięcia z osią Y i osią X dają odpowiednio wartości μmax oraz Ks, które można podstawić odpowiednio do równania 3 i 4 w celu uzyskania µobs oraz Kobs.
    Równanie (3) można zapisać jako:
    Logarytmiczne równanie wzrostu mikrobiologicznego, formuła do obliczania obserwowanej szybkości wzrostu w analizie naukowej. (6)
  3. Obliczyć swoistą szybkość wzrostu kultury hodowanej w kroku 2.2 i oznaczyć ją jako µobs.
  4. Wartość swoistej szybkości wzrostu uzyskaną w kroku 3.3 podstawić do równania (6). Dopasować dane do równania liniowego, a następnie obliczyć nachylenie i punkt przecięcia.
  5. Za pomocą równania (3) obliczyć maksymalną swoistą szybkość wzrostu w obecności melaniny.

4. Opracowanie adsorpcyjnego bioprocesu

  1. Wszystkie eksperymenty należy przeprowadzić w kolbie shake flask o pojemności 250 mL z objętością wypełnienia 15 mL, przy 200 rpm, 37 °C i początkowym pH 7.
  2. Końcowy zoptymalizowany bioproces należy przeprowadzić w bioreaktorze z mieszadłem o pojemności 5 L z objętością wypełnienia 3 L. W badaniach z użyciem bioreaktora należy utrzymywać pH hodowli w zakresie 7-7,5 oraz poziom tlenu rozpuszczonego na poziomie 50%- 60% nasycenia.

5. Wybór najlepszego adsorbentu spośród dostępnych adsorbentów

  1. Do różnych kolb zawierających pożywkę hodowlaną dodać różne adsorbenty, takie jak tlenek glinu, zeolit, celit, ziemia pełna oraz węgiel aktywny.
  2. Każdy adsorbent dodać osobno do pożywki hodowlanej w stężeniu 1 g/L i inkubować w wytrząsarce rotacyjnej przy 150 rpm przez 12 h.
  3. Adsorbenty oddzielić poprzez wirowanie przy 5000 x g przez 10 min, a następnie zmierzyć absorbancję supernatantu przy 400 nm za pomocą spektrofotometru.
  4. Wybrać adsorbent, który wykazuje największą zdolność adsorpcji melaniny z pożywki hodowlanej.

6. Wpływ czasu dozowania adsorbenta

  1. Rozpocząć bioproces i dodać adsorbent, który wykazał najwyższą adsorpcję melaniny z hodowli (wybrany w sekcji 5). Stężenie wybrane w kroku początkowym wynosi 1 g/L.
  2. Zmierzyć maksymalną produkcję melaniny zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem12.
  3. Powtórzyć krok 6.1, dodając adsorbent po 12 h od rozpoczęcia bioprocesu, i zmierzyć produkcję melaniny w różnych punktach czasowych bioprocesu.
  4. Powtórzyć krok 6.3, dodając adsorbent po 24 h, 36 h i 48 h od rozpoczęcia bioprocesu.
  5. Porównać ilość wyprodukowanej melaniny w każdym cyklu bioprocesu i określić optymalny czas podania adsorbenta dla maksymalnej produkcji i odzysku melaniny.

7. Wpływ ilości zastosowanego adsorbentu

  1. Dodaj różne stężenia najlepszego adsorbenta (0,5, 1, 2, 4, 6, 8 i 10 g/L) do kultur w czasie określonym w sekcji 6.
  2. Zakończ proces bioprocesowy poprzez wirowanie przy 5000 x g przez 10 min.
  3. Zabierz supernatant i oblicz ilość melaniny, mierząc absorbancję przy 400 nm.
  4. Przemyj osad zawierający adsorbent dwukrotnie wodą destylowaną oraz etanolem, aby usunąć komórki i inne związki przyczepione do adsorbenta. Etap płukania przeprowadź poprzez wirowanie przy 5000 x g przez 10 min.
  5. Dodaj roztwór NaOH o stężeniu 0,1 M do przemytego adsorbenta, aby zdesorbować melaninę.
  6. Odwiruj mieszaninę przy 5000 x g przez 10 min i zmierz ilość melaniny w supernatancie przy 400 nm za pomocą spektrofotometru.
  7. Powtórz proces desorpcji trzykrotnie lub do momentu, aż adsorbent odzyska swój pierwotny kolor.
  8. Obniż pH tego stężonego roztworu zdesorbowanej melaniny do wartości 3 lub mniej, dodając 1 N HCl przy użyciu mieszadła z kulkami magnetycznymi, aby wytrącić melaninę. W razie potrzeby przechowuj kwasowy roztwór w lodówce przez 1 h w celu zwiększenia ilości wytrąconego osadu.
  9. Przemyj otrzymaną w ten sposób wytrąconą melaninę trzykrotnie wodą destylowaną poprzez wirowanie przy 5000 x g przez 10 min, wysusz i przechowuj w temperaturze 4 °C.

8. Modelowanie matematyczne bioprocesu

  1. Kinetyka wzrostu biomasy
    1. Ilościowo określ szybkość wzrostu biomasy, korzystając z następującego zmodyfikowanego modelu Verhulseta opracowanego dla inhibicji produktem, zgodnie z równaniem podanym poniżej14,15,16,17,
      Równanie wzrostu logistycznego, \( \frac{dx}{dt} = \mu_{obs} \cdot x \cdot \left(\frac{x_m-x}{x_m}\right) \). (7)
      Gdzie,
      x = stężenie biomasy (g/L)
      xm = maksymalne stężenie biomasy (g/L)
      µobs = maksymalna specyficzna szybkość wzrostu (1/h), zgodnie z równaniem (2)
      Vazques i in. (2008) wyprowadzili z równania (7) następujące równanie dla stężenia biomasy
      Równanie równowagi dynamicznej w mechanice statystycznej; analiza formuły matematycznej. (8)
      Gdzie,
      vx = szybkość wzrostu biomasy (g/L/h) = µobs·x
      µobs       = obserwowana specyficzna szybkość wzrostu (1/h)
      τx = czas lag (h)
      t = czas (h)
    2. Wykorzystaj równanie (8) do obliczenia stężenia biomasy w różnych punktach czasowych bioprocesu i symulacji profilu wzrostu Pseudomonas stutzeri.
  2. Kinetyka zużycia substratu
    UWAGA: Substrat jest wykorzystywany do wzrostu biomasy, tworzenia produktu i utrzymania funkcji życiowych w bioprocesie.
    1. Użyj następującego równania do bilansowania wykorzystania substratu w bioprocesie,
      Równanie wzrostu mikrobiologicznego; analiza szybkości metabolicznej; formuła stechiometryczna. (9)
      Większość glukozy jest wykorzystywana do generowania biomasy; dlatego, w celu uproszczenia, pominięcie zużycia substratu na tworzenie produktu sprowadza równanie (9) do postaci
      Równanie kinetyki bioreaktora; symboliczna formuła szybkości konwersji substratu w procesie hodowli. (10)
      Gdzie,
      S = stężenie substratu (g/L)
      YP/S = współczynnik wydajności produktu, tj. współczynnik wydajności melaniny (g/g)
      P = stężenie produktu (g/L), tj. stężenie melaniny (g/L)
      YX/S = współczynnik wydajności biomasy (g/g)
      ms = współczynnik utrzymania (g/g/h)
      Całkowanie powyższego równania od czasu t = 0 do czasu t = t oraz podstawienie wartości x z równania (8) daje następujące równanie dla profilu stężenia substratu17,
      Równanie zachowania systemu dynamicznego, szczegółowy model matematyczny dla analizy procesu. (11)
      Gdzie, s0 = początkowe stężenie substratu (g/L) oraz x0 = początkowe stężenie biomasy (g/L)
    2. Użyj równania (11) do obliczenia stężenia substratu w różnych odstępach czasu bioprocesu lub, jeśli stężenie substratu jest znane, użyj tego samego równania do oszacowania parametrów podanych w równaniu.
  3. Kinetyka produkcji melaniny
    1. Użyj równania Ludekinga-Pirate'a do symulacji produkcji melaniny. Ponieważ jednak melanina jest powiązana ze wzrostem, pomija się człon tworzenia produktu niezwiązanego ze wzrostem, a uproszczone równanie można zapisać jako
      Równanie analizy ruchu, dp/dt = α·dx/dt, koncepcja fizyczna, obraz formuły. (12)
      Gdzie,
      α = stała Ludekinga-Pirate'a związana z tworzeniem produktu powiązanego ze wzrostem (g/g)
      Całkowanie równania (12) od czasu t = 0 do t = t prowadzi do następującego równania dla profilu stężenia produktu
      Równanie liniowej sprężystości: p = α · (x - x₀), formuła matematyczna, analiza badań i studiów. (13)
    2. Użyj równania (13) do obliczenia α.
  4. Szacowanie parametrów kinetycznych
    1. Oszacuj wszystkie wyżej wymienione parametry metodą nieliniowych najmniejszych kwadratów, korzystając z odpowiedniego narzędzia programistycznego (np. narzędzia Solver w programie Microsoft Excel).
    2. Wykorzystaj dane z eksperymentów okresowych (batch) do szacowania parametrów i zminimalizuj sumę kwadratów błędów (SSE) za pomocą narzędzia Solver, zgodnie z następującym równaniem,
      Minimalizuj,
      Formuła sumy kwadratów błędów, SSE=Σ(x_sim-x_exp)^2, równanie statystycznej analizy błędów. (14)
      Gdzie,
      xsim = wartość symulowana, a xexp = wartość eksperymentalna

9. Techniki analityczne

  1. Ekstrakcja melaniny
    1. Odwirować kulturę hodowlaną przy 5000 x g przez 10 min w celu usunięcia biomasy.
    2. Dodać do nadfiltratu równą objętość 1 M NaOH.
    3. Zakwasić zasadowy nadfiltrat do pH 2, dodając 1 N HCl, aby wytrącić melaninę.
    4. Odwirować zakwaszony nadfiltrat przy 12000 x g przez 20 min w celu zebrania melaniny.
    5. Przemyć zebraną melaninę trzykrotnie 5 mL wody destylowanej, suszyć przez noc w temperaturze pokojowej (RT) i przechowywać w 4 °C18.
  2. Oznaczanie ilości melaniny
    1. Przygotować roztwory melaniny o różnych stężeniach (0-500 mg/L), rozpuszczając odpowiednią ilość melaniny w sztucznej wodzie morskiej (pH 8).
    2. Zmierzyć absorbancję przy 400 nm za pomocą spektrofotometru18.
    3. Przygotować krzywą kalibracyjną na podstawie powyższych danych.
    4. Odwirować kulturę hodowlaną przy 5000 x g przez 10 min w celu usunięcia biomasy i zmierzyć absorbancję nadfiltratu przy 400 nm. Obliczyć stężenie melaniny w kulturze hodowlanej, korzystając z krzywej kalibracyjnej przygotowanej w kroku 9.2.3.
  3. Oznaczenie aktywności tyrozynazy
    1. Postępować zgodnie z poniższym protokołem oznaczania enzymu tyrozynazy opracowanym przez Rena i wsp. (2013)19 w celu określenia aktywności tyrozynazy wyekstrahowanej z bulionu hodowlanego Pseudomonas stutzeri.
    2. Odwirować kulturę bakteryjną przy 5,000 x g w celu zebrania komórek.
    3. poddać komórki sonikacji w zimnym 100 mM buforze fosforanowym o pH 6,5, a następnie odwirować homogenat przy 9000 x g przez 15 min i zebrać nadfiltrat będący źródłem enzymu tyrozynazy.
    4. Dodać 0,2 mL roztworu enzymu otrzymanego w poprzednim kroku do 2,8 mL 0,1 M buforu fosforanowego sodu (pH 6,5) zawierającego 1 mM L-tyrozyny (substratu).
    5. Obserwować tworzenie się dopachromu, mierząc absorbancję przy 475 nm.
    6. Obliczyć aktywność tyrozynazy w następujący sposób. Jedną jednostkę międzynarodową (IU) aktywności tyrozynazy definiuje się jako ilość enzymu wymaganą do utlenienia 1 µmol L-tyrozyny do dopachromu w ciągu minuty. Obliczyć to, stosując molowy współczynnik ekstynkcji dopachromu (3600 L·M-1·cm-1) zgodnie z następującym równaniem,
      Wzór na obliczanie aktywności enzymu; równanie analizy opartej na absorbancji; metoda analizy enzymatycznej. (15)
  4. Oznaczanie biomasy
    1. Pobrać 5 mL próbek w odstępach 4 h w komorze z laminarnym przepływem powietrza, zachowując sterylność. Przypalić płomieniem bawełniany korek kolby przed i po pobraniu próbek, aby zmniejszyć ryzyko kontaminacji. Zmierzyć gęstość optyczną (OD) wszystkich tych próbek przy 660 nm.
      UWAGA: Jako próbę ślepą służy niezaszczepione podłowo. Odczyty te zostaną wykorzystane do badania wzrostu mikroorganizmów.
    2. Odwirować bulion hodowlany przy 5000 x g przez 10 min w 4 °C, zebrać osad komórkowy i suszyć go przez 8 h w 60 °C w suszarce z wymuszonym obiegiem powietrza, aby uzyskać suchą masę komórkową.
    3. Przygotować krzywą kalibracyjną, wykorzystując wartość OD zmierzoną w kroku 9.4.1 oraz odpowiadającą jej biomasę otrzymaną w kroku 9.4.2.
    4. Użyć krzywej kalibracyjnej (OD = 0,82٠Biomasa (g/L)) do wyznaczenia nieznanej ilości biomasy poprzez pomiar gęstości optycznej bulionu hodowlanego w dowolnym czasie.
  5. Oznaczanie ilości DNA
    1. Oznaczyć ilość DNA w próbce, mierząc gęstość optyczną przy 260 nm.
    2. Obliczyć ilość DNA, stosując następujący wzór,
      Wzór na oznaczanie ilości DNA: Całkowite DNA (µg) = (A260) × (50 µg/mL) × (czynnik rozcieńczenia) × 0,1 mL. (16)
      Gdzie,
      A260= Absorbancja przy 260 nm
      0,1 = Objętość próbki
      1 = Absorbancja roztworu standardowego DNA o stężeniu 50 µg/mL przy 260 nm
  6. Oznaczanie białka
    1. Oznaczyć ilość białka w próbkach, korzystając z zestawu do oznaczania białek metodą Bradforda (Tabela materiałów).
    2. Dodać 5 mL odczynnika Bradforda do 0,1 mL nadfiltratu i pozostawić na 5 min. Białka obecne w nadfiltracie reagują z odczynnikiem Bradforda, tworząc kolorowy kompleks.
    3. Zmierzyć absorbancję przy 595 nm20 za pomocą spektrofotometru.
  7. Oznaczanie całkowitych cukrów redukujących (TRS)
    1. Zmierzyć TRS metodą kwasu dinitrosalicylowego (DNS)21.
    2. Przygotować roztwór DNS, rozpuszczając 1 g DNS w 50 mL wody destylowanej. Dodać do tego roztworu 30 g tartaranu sodowo-potasowego w małych porcjach, aż roztwór stanie się mleczno-żółty, a następnie dodać 20 mL 2 N NaOH, aż uzyska on przezroczysty pomarańczowo-żółty kolor. Uzupełnić objętość do 100 mL wodą destylowaną i przechowywać w ciemności.
    3. Przygotować roboczy roztwór glukozy (0,01 M), rozpuszczając 180 mg glukozy w 100 mL wody destylowanej w kolbie miarowej.
    4. Odmierzyć standardowy roztwór glukozy (0,2, 0,4, 0,6, 0,8 i 1 mL) do 5 oddzielnych probówek. Jako roztwór ślepy wykorzystać probówkę zawierającą wodę destylowaną (1 mL).
    5. Dopełnić objętość w każdej probówce do 2 mL, używając wody destylowanej.
    6. Dodać 1 mL odczynnika DNS do każdej probówki i przykryć folią aluminiową.
    7. Podgrzewać probówki w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia przez 5 min, a następnie schłodzić do RT.
    8. Dodać 9 mL wody destylowanej do każdej probówki i dobrze wymieszać. Zmierzyć OD zawartości przy 575 nm za pomocą spektrofotometru.
    9. Wyznaczyć stężenie, korzystając z wykresu kalibracyjnego z ilością glukozy na osi X i absorbancją przy 575 nm (A575) na osi Y.
  8. Analiza wielkości cząstek
    1. Rozproszyć biosyntetyzowaną melaninę w wodzie destylowanej (1 mL) za pomocą sonikatora.
    2. Wprowadzić rozproszony roztwór próbki (1 mL) do analizatora nanocząstek i zmierzyć wielkość cząstek zgodnie z protokołem producenta.
  9. Analiza za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)
    1. Wysuszyć proszek melaniny otrzymany po ekstrakcji, utrzymując temperaturę 60 °C przez 8 h.
    2. Nanieść proszek melaniny na matrycę próbek TEM i zmierzyć wielkość za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego, postępując zgodnie z protokołem operatora.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1A,B przedstawia wzrost i produkcję melaniny pod wpływem różnych początkowych stężeń melaniny. Wzrost komórek oraz produkcja melaniny uległy znacznemu zmniejszeniu wraz ze wzrostem początkowego stężenia melaniny. Przy początkowym stężeniu melaniny w pożywce wynoszącym 500 mg/L biomasa i zawartość melaniny zmniejszyły się do niemal 50% maksymalnej wartości uzyskanej w próbie kontrolnej. Przy początkowym stężeniu melaniny 1000 mg/L produkcja melaniny była znikoma. Temp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Hamowanie produktu jest głównym wąskim gardłem w bioprzetwórstwie, które prowadzi do zmniejszenia wydajności. Istnieje kilka metod mających na celu zmniejszenie zahamowania produktu, takich jak ciągły bioproces i techniki usuwania produktu in situ. Opcje te wymagają jednak gruntownego remontu istniejącego zakładu bioprzetwarzania 23,24,25,26,27,28.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów

Podziękowania

Dziękujemy Departamentowi Nauki i Technologii (DST/TSG/WP/2014/58), Indiom oraz Narodowemu Instytutowi Technologii Karnataka za zapewnienie funduszy na rozwój powyższego protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Tlenek glinu + A15A26A3: A13A3: A16A3: A17HiMediaGRM1909
Węgiel aktywnyHiMediaPCT1001
Sztuczne medium do wody morskiejZestawM1942
BradfordHiMediaML106
CeliteWirówka HiMediaGRM226
REMICM-8
Probówki wirówkoweHiMediaPW1207
Kwas dinitrosalicylowyHiMediaGRM1582
Kolba ErlenmeyeraBorosil4980021
ziemi foluszowejHiMediaGRM232
GlukozaHiMediaMB037
HClHiMediaAS004
L-tyrozynaHiMediaRM069
Microsoft Excel
HORIBA ScientificNanopartica SZ-100
Pożywka Agar HiMediaM001
Płytka PetriegoHiMediaPW054
Bufor fosforanowyHiMediaM1452
Wodorotlenek soduHiMediaMB095
SpektrofotometrThermofisherGenesys 10
Bioreaktor ze zbiornikiem z mieszadłemScigenicsBioferm LS
TE BuforHiMediaML060
Transmisyjny mikroskop elektronowyJEOLJEM-2100
ZeolitHiMediaGRM3834
odczynników HiMedia Analizator nanocząstek Microsoft

Bibliografia

  1. Langfelder, K., Streibel, M., Jahn, B., Haase, G., Brakhage, A. A. Biosynthesis of fungal melanins and their importance for human pathogenic fungi. Fungal Genetics and Biology. 38 (2), 143-158 (2003).
  2. Riley, P. A. Melanin. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 29 (11), 1235-1239 (1997).
  3. Madaras, F., Gerber, J. P., Peddie, F., Kokkinn, M. J. The effect of sampling methods on the apparent constituents of ink from the squid sepioteuthis australis. Journal of Chemical Ecology. 36 (11), 1171-1179 (2010).
  4. Tran-Ly, A. N., et al. Microbial production of melanin and its various applications. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 36 (11), 170(2020).
  5. Pavan, M. E., López, N. I., Pettinari, M. J. Melanin biosynthesis in bacteria, regulation and production perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (4), 1357-1370 (2019).
  6. Pombeiro-Sponchiado, S. R., Sousa, G. S., Andrade, J. C. R., Lisboa, H. F., Gonçalves, R. C. R. Production of melanin pigment by fungi and its biotechnological applications. Melanin. , IntechOpen Limited. London, UK. 47-77 (2017).
  7. Guo, J., et al. Cloning and identification of a novel tyrosinase and its overexpression in Streptomyces kathirae SC-1 for enhancing melanin production. FEMS Microbiology Letters. 362, 41(2015).
  8. Lagunas-Muñoz, V. H., Cabrera-Valladares, N., Bolívar, F., Gosset, G., Martínez, A. Optimum melanin production using recombinant Escherichia coli. Journal of Applied Microbiology. 101 (5), 1002-1008 (2006).
  9. Wang, L., Li, Y., Li, Y. Metal ions driven production, characterization and bioactivity of extracellular melanin from Streptomyces sp. ZL-24. International Journal of Biological Macromolecules. 123, 521-530 (2019).
  10. Kiran, G. S., Jackson, S. A., Priyadharsini, S., Dobson, A. D. W., Selvin, J. Synthesis of Nm-PHB (nanomelanin-polyhydroxy butyrate) nanocomposite film and its protective effect against biofilm-forming multi drug resistant Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 7, 9167(2017).
  11. Raman, N. M., Shah, P. H., Mohan, M., Ramasamy, S. Improved production of melanin from Aspergillus fumigatus AFGRD105 by optimization of media factors. AMB Express. 5 (1), 72(2015).
  12. Thaira, H., Raval, K., Manirethan, V., Balakrishnan, R. M. Melanin nano-pigments for heavy metal remediation from water. Separation Science and Technology (Philadelphia). 54 (2), 265-274 (2018).
  13. Han, K., Levenspiel, O. Extended monod kinetics for substrate, product, and cell inhibition. Biotechnology and Bioengineering. 32 (4), 430-447 (1988).
  14. Vázquez, J. A., Murado, M. A. Unstructured mathematical model for biomass, lactic acid and bacteriocin production by lactic acid bacteria in batchfermentation. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83 (1), 91-96 (2008).
  15. Rohit, S. G., Jyoti, P. K., Subbi, R. R. T., Naresh, M., Senthilkumar, S. Kinetic modeling of hyaluronic acid production in palmyra palm (Borassus flabellifer) based medium by Streptococcus zooepidemicus MTCC 3523. Biochemical Engineering Journal. 137, 284-293 (2018).
  16. Nair, A. V., Gummadi, S. N., Doble, M. Process optimization and kinetic modelling of cyclic (1→3, 1→6)-β-glucans production from Bradyrhizobium japonicum MTCC120. Journal of Biotechnology. 226, 35-43 (2016).
  17. Reddy Tadi, S. R., Limaye, A. M., Sivaprakasam, S. Enhanced production of optically pure D (-) lactic acid from nutritionally rich Borassus flabellifer sugar and whey protein hydrolysate based-fermentation medium. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (-), 279-289 (2017).
  18. Ganesh Kumar, C., Sahu, N., Narender Reddy, G., Prasad, R. B. N., Nagesh, N., Kamal, A. Production of melanin pigment from Pseudomonas stutzeri isolated from red seaweed Hypnea musciformis. Letters in Applied Microbiology. 57 (4), 295-302 (2013).
  19. Ren, Q., Henes, B., Fairhead, M., Thöny-Meyer, L. High level production of tyrosinase in recombinant Escherichia coli. BMC Biotechnology. 13, 13-18 (2013).
  20. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. Springer Protocols Handbooks. , Humana Press. (2002).
  21. Miller, G. L. Use of Dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry. 31 (3), 426-428 (1959).
  22. Dutta, A., Diao, Y., Jain, R., Rene, E. R., Dutta, S. Adsorption of cadmium from aqueous solution onto coffee grounds and wheat straw: Equilibrium and kinetic study. Journal of Environmental Engineering. 142 (9), 1-6 (2015).
  23. Dhillon, G. S., Brar, S. K., Verma, M., Tyagi, R. D. Recent advances in citric acid bio-production and recovery. Food and Bioprocess Technology. 4, 505-529 (2011).
  24. Roffler, S. R., Blanch, H. W., Wilke, C. R. In situ recovery of fermentation products. Trends in Biotechnology. 2 (5), 129-136 (1984).
  25. Maiti, S., et al. A re-look at the biochemical strategies to enhance butanol production. Biomass and Bioenergy. 94, 187-200 (2016).
  26. Prakash, G., Srivastava, A. K. Integrated yield and productivity enhancement strategy for biotechnological production of Azadirachtin by suspension culture of Azadirachta indica. Asia-Pacific Journal of Chemical Engineering. 6 (1), 129-137 (2011).
  27. Stark, D., von Stockar, U. In situ product removal (ISPR) in whole cell biotechnology during the last twenty years. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 80, 149-175 (2003).
  28. Kaur, G., Srivastava, A. K., Chand, S. Debottlenecking product inhibition in 1,3-propanediol fermentation by In-Situ Product Recovery. Bioresource Technology. 197, 451-457 (2015).
  29. Arun, G., Eyini, M., Gunasekaran, P. Characterization and biological activities of extracellular melanin produced by Schizophyllum commune (Fries). Indian Journal of Experimental Biology. 53, 380-387 (2015).
  30. Bin, L., Wei, L., Xiaohong, C., Mei, J., Mingsheng, D. In vitro antibiofilm activity of the melanin from Auricularia auricula, an edible jelly mushroom. Annals of Microbiology. 62 (4), 1523-1530 (2012).
  31. Madhusudhan, D. N., Mazhari, B. B. Z., Dastager, S. G., Agsar, D. Production and cytotoxicity of extracellular insoluble and droplets of soluble melanin by Streptomyces lusitanus DMZ-3c. BioMed Research International. 2014, 1-11 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Produkcja melaninyinhibicja produktowaenzym tyrozynazaadsorpcja melaninyinhibicja zwrotnabakterie morskieprzesiewowe badanie adsorbent winhibicja enzymatyczna
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły