Artykuł metodologiczny

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych tkanki tłuszczowej szczura w celu różnicowania w komórki produkujące insulinę

DOI:

10.3791/63348

⸱

29 sierpnia 2022

 ,  ,  , 
1Biochemistry Department, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2Pharmacology and Biochemistry Department, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 3Center for Drug Research and Development (CDRD), Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (Ad-MSC) mogą być potencjalnym źródłem MSC, które różnicują się w komórki produkujące insulinę (IPC). W tym protokole przedstawiamy szczegółowe kroki izolacji i charakterystyki Ad-MSC najądrza szczura, a następnie prosty, krótki protokół generowania IPC z tych samych Ad-MSC szczurów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) - szczególnie te wyizolowane z tkanki tłuszczowej (Ad-MSC) - zyskały szczególną uwagę jako odnawialne, obfite źródło komórek macierzystych, które nie stwarza żadnych problemów etycznych. Jednak obecne metody izolacji Ad-MSC nie są ustandaryzowane i wykorzystują skomplikowane protokoły, które wymagają specjalnego sprzętu. Wyizolowaliśmy Ad-MSC z tłuszczu najądrza szczurów Sprague-Dawley przy użyciu prostej, powtarzalnej metody. Wyizolowane Ad-MSC pojawiają się zwykle w ciągu 3 dni po izolacji, ponieważ przylegające komórki wykazują morfologię fibroblastyczną. Komórki te osiągają 80% zbieżności w ciągu 1 tygodnia od izolacji. Następnie, w pasażu 3-5 (P3-5), przeprowadzono pełną charakterystykę izolowanych Ad-MSC poprzez immunofenotypowanie charakterystycznych markerów powierzchniowych klastra różnicowania MSC (CD), takich jak CD90, CD73 i CD105, a także indukowanie różnicowania tych komórek w dół linii osteogennych, adipogennych i chondrogennych. To z kolei implikuje multipotencję izolowanych komórek. Ponadto wyindukowaliśmy różnicowanie izolowanych Ad-MSC w kierunku linii komórek produkujących insulinę (IPC) za pomocą prostego, stosunkowo krótkiego protokołu, włączając zmodyfikowaną pożywkę Eagle firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy (HG-DMEM), β-merkaptoetanol, nikotynamid i eksendynę-4. Zróżnicowanie IPC oceniono genetycznie, po pierwsze, poprzez pomiar poziomów ekspresji określonych markerów β-komórkowych, takich jak MafA, NKX6.1, Pdx-1 i Ins1, a także barwienie ditizonami dla generowanych IPC. Po drugie, ocena została również przeprowadzona funkcjonalnie za pomocą testu wydzielania insuliny stymulowanego glukozą (GSIS). Podsumowując, Ad-MSC można łatwo wyizolować, wykazując wszystkie kryteria charakterystyki MSC, i rzeczywiście mogą one stanowić obfite, odnawialne źródło IPC w laboratorium do badań nad cukrzycą.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), znane również jako mezenchymalne komórki zrębowe, są jednymi z najczęściej używanych typów komórek w medycynie regeneracyjnej1,2. Są one klasyfikowane jako dorosłe komórki macierzyste i charakteryzują się potencjałem różnicowania wieloliniowego oraz zdolnością do samoodnawiania3. MSCs można izolować i pozyskiwać z różnych źródeł, w tym z tkanki tłuszczowej, szpiku kostnego, krwi obwodowej, tkanki i krwi pępowinowej, mieszków włosowych i zębów4,5.

Izolacja komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej jest postrzegana jako zarówno atrakcyjna, jak i obiecująca ze względu na ich łatwy dostęp, szybką ekspansję in vitro i wysoką wydajność6. Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (Ad-MSC) mogą być izolowane od różnych gatunków, takich jak ludzie, bydło, myszy, szczury, a ostatnio kozy7. Udowodniono, że Ad-MSC są obecnie potencjalnymi kandydatami do inżynierii tkankowej i terapii genowej/komórkowej, które mogą być nawet wykorzystane do opracowania autologicznej alternatywy do długoterminowej naprawy uszkodzeń lub wad tkanek miękkich7,8.

Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej i Genowej (ISCT) określiło trzy minimalne kryteria, które muszą spełniać MSC, aby uzyskać pełną charakterystykę9. Po pierwsze, muszą przylegać do plastiku. Po drugie, MSC powinny wykazywać ekspresję markerów powierzchniowych mezenchymalnych komórek macierzystych, takich jak CD73, CD90 i CD105, i nie mieć ekspresji markerów krwiotwórczych CD45, CD34, CD14 lub CD11b, CD79α lub CD19 i HLA-DR. Wreszcie, MSCs powinny wykazywać zdolność do różnicowania się w trzy linie mezenchymalne: adipocyty, osteocyty i chondrocyty. Co ciekawe, MSCs mogą również różnicować się w inne linie, takie jak komórki neuronalne, kardiomiocyty, hepatocyty i komórki nabłonkowe10,11.

W rzeczywistości, MSC posiadają unikalne właściwości, które pozwalają na ich zastosowanie jako potencjalnych środków terapeutycznych w terapii regeneracyjnej dla różnych chorób. MSCs mogą wydzielać rozpuszczalne czynniki w celu indukowania środowiska immunomodulującego, które zapewnia korzyści terapeutyczne12. Ponadto MSC mogą migrować w kierunku miejsc urazów i mikrośrodowisk guza, aby zapewnić celowaną terapię; Jednak mechanizmy nie są w pełni wyjaśnione13. Ponadto MSCs mają zdolność wydzielania egzosomów, pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w nanoskali, które przenoszą ładunek niekodujących RNA, białek i czynników rozpuszczalnych, co ostatnio okazało się nowym mechanizmem potencjału terapeutycznego MSCs w różnych chorobach14.

Co ważniejsze, MSC wzbudziły znaczną uwagę ze względu na ich potencjał do różnicowania się w komórki produkujące insulinę (IPC), czy to poprzez modyfikację genetyczną15,16 lub poprzez wykorzystanie różnych czynników indukujących czynniki zewnętrzne w pożywkach hodowlanych in vitro17. Okres indukcji IPC jest bardzo zróżnicowany, ponieważ zależy od zastosowanego protokołu indukcji i wykorzystanych czynników zewnętrznych. Proces różnicowania może trwać od kilku dni do miesięcy i wymaga kombinacji czynników indukujących egzogenność, które muszą być dodawane i/lub wycofywane na różnych etapach. Wiele z tych czynników, które zostały wykorzystane do endokrynologicznego różnicowania trzustki, to biologicznie aktywne związki, które, jak wykazano, promują proliferację lub różnicowanie/neogenezę komórek β wydzielających insulinę i/lub zwiększają zawartość insuliny w IPC18,19,20,21. Warto w tym miejscu zauważyć, że MSCs mają również działanie terapeutyczne w cukrzycy i jej powikłaniach poprzez kilka mechanizmów, w tym sekretom, a także szeroki wachlarz działań immunomodulujących22,23,24.

W tym protokole przedstawiamy szczegółowy protokół etapowy izolacji i charakterystyki Ad-MSC z tłuszczu najądrza szczura, a następnie prosty, stosunkowo krótki protokół generowania IPC z Ad-MSC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi, a wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Wydziału Farmacji, Brytyjskiego Uniwersytetu w Egipcie (BUE), Kair, Egipt. Protokół izolacji Ad-MSC został przejęty od Lopeza i Spencera, z modyfikacjami15.

1. Izolacja Ad-MSCs z poduszek tłuszczowych najądrza szczura

  1. Używać samców szczurów Sprague-Dawley o wadze 250-300 g, które są w wieku nie dłuższym niż 1 miesiąc (dwa na izolację). Znieczulić zwierzęta, a następnie poddać je eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Spryskaj uśpione zwierzę 70% etanolem. Wytnij skórę i mięsień w dolnej części brzucha, a następnie wyciągnij dwa jądra, aby odsłonić poduszeczki tłuszczowe najądrza.
  2. Delikatnie odetnij poduszeczki tłuszczowe najądrza i uważaj, aby nie przeciąć naczyń krwionośnych.
  3. Odizoluj tkankę tłuszczową otaczającą najądrze, a następnie umieść ją na szalce Petriego zawierającej sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
  4. W komorze bezpieczeństwa biologicznego pokrój te poduszeczki tłuszczowe na małe kawałki za pomocą kleszczy i skalpela. Przenieś te pocięte kawałki tkanki tłuszczowej do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml sterylnego PBS.
  5. Umyj zmielone tkanki tłuszczowe 5 razy 10 ml PBS za każdym razem, aby usunąć zanieczyszczającą krew. Należy skrupulatnie przeprowadzić następujące procedury prania.
    1. Dodaj 10 ml PBS do tkanki i dokładnie mieszaj przez 45 sekund. Następnie pozwól tkance osiąść grawitacyjnie, trzymając rurkę w pozycji stojącej przez 5 minut, aby rozdzielić się na dwie warstwy.
    2. Odessać PBS z podzespołu za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i zastąpić świeżymi 10 ml PBS do ponownego przemycia.
    3. Powtórz ten krok mycia 4-5 razy, aż PBS zostanie oczyszczony z krwi. Oznacza to, że większość, jeśli nie całość, krwi jest usuwana.
  6. Po umyciu ponownie zawiesić tkankę tłuszczową w 10 ml roztworu kolagenazy (0,1% kolagenazy typu 1 w PBS). Szczelnie zamknąć probówkę parafilmem, a następnie inkubować ją w wytrząsającej łaźni wodnej (37 °C, 80 obr./min, przez 45 minut), aż tkanka będzie prawie jednorodna.
    UWAGA: Należy unikać całkowitego trawienia tkanki (gdy roztwór staje się całkowicie jednorodny z całkowitym zanikiem wszystkich pozostałości/kawałków tkanki), ponieważ wpływa to niekorzystnie na późniejsze rozmnażanie komórek. Zwykle trawienie trwa 30-45 minut.
  7. Po zakończeniu trawienia kolagenazy wiruj probówkę przez 15 s, a następnie wiruj przez 5 minut przy 300 x g. Ponownie wirować probówkę przez 10 s, a następnie odwirować przez kolejne 5 minut. Następnie będą obserwowane trzy warstwy. Ostrożnie wyrzuć warstwę oleju, a następnie warstwę wodną, nie naruszając granulatu frakcji zrębu naczyniowego (SVF).
    UWAGA: Usunąć supernatant zawierający adipocyty i roztwór kolagenazy. Najpierw usuń adipocyty i towarzyszącą im warstwę oleju za pomocą pipety o pojemności 10 ml, aby zapewnić całkowite usunięcie kropelek oleju, a następnie usuń znajdującą się pod spodem warstwę wodną.
  8. Zawiesić osad SVF na dnie probówki w 10 ml sterylnego roztworu BSA (1% albumina, roztwór frakcji V surowicy bydlęcej w PBS), a następnie odwirować probówkę przez 5 minut przy 300 x g.
  9. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i zawiesić osad SVF w 8,5 ml kompletnej pożywki dla Ad-MSC (składającej się z pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 [DMEM/F12] uzupełnionej 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B i 2 mM L-glutaminy).
  10. Hodować komórki w kolbie o średnicy 25cm2 w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 . Następnego dnia sprawdź dołączone ogniwa, usuń zawieszone ogniwa i wymień nośnik. Następnie zmieniaj nośnik co drugi dzień.
  11. Przenikaj komórki co 5-7 dni, gdy są w 80%-90% zlewające się za pomocą Trypsyny-EDTA. Użyj komórek między przejściami 3-5 do kolejnych eksperymentów opisanych w tym protokole. Schematyczne przedstawienie wszystkich etapów izolacji znajduje się w Rysunek 1.
    UWAGA: Zazwyczaj siła działania Trypisn-EDTA może się różnić w zależności od różnych dostawców, więc staraj się zminimalizować czas trypsynizacji, aby uniknąć toksycznego wpływu na komórki.

2. Charakterystyka Ad-MSCs za pomocą immunofenotypowania za pomocą analiz cytometrii przepływowej

  1. W pasażu 3 podziel komórki za pomocą trypsyny-EDTA. Przemyć PBS 2 razy, a następnie policzyć komórki hemocytometrem.
  2. Inkubować 100 000 komórek w temperaturze 4 °C w ciemności przez 20 minut z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-szczurzym CD90 lub CD105 (markery mezenchymalne) lub CD34 (marker hematopoetyczny) znakowanym izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC).
  3. Umyj komórki i zawieś je w 500 μl buforu FACS. Analiza za pomocą cytometrii przepływowej25.

3. Ocena potencjału różnicowania izolowanych Ad-MSC na różne linie mezenchymalne

  1. Różnicowanie adipogenne
    1. Ponownie zawiesić komórki w kompletnej pożywce (jak opisano w kroku 1.9), a następnie hodować komórki o gęstości 3,7 x 104 komórek/dołek na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 . Następnie zmieniaj pożywkę co 3 dni, aż komórki osiągną prawie 100% zbieżności, co zwykle trwa 3 dni.
    2. Gdy komórki osiągną pożądane zbieganie, zastąp pożywkę proliferacyjną adipogenną pożywką różnicującą (składającą się z pożywki LG-DMEM uzupełnionej 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B i 2 mM L-glutaminy 1x suplementem adipogennym, dostarczanym z zestawem do identyfikacji funkcjonalnej mezenchymalnych komórek macierzystych) w celu wywołania adipogenezy. Następnie zmieniaj pożywkę co 3 dni (0,5 ml/dołek). Uważaj, aby delikatnie wykonać wymianę pożywki, aby nie zakłócić wakuoli lipidowych.
    3. Po 21 dniach ocenić różnicowanie adipogenne za pomocą badania mikroskopowego wyglądu wakuoli lipidowych i barwienia czerwienią olejową.
    4. Przygotować roztwór podstawowy czerwieni olejowej, rozpuszczając 30 mg barwnika czerwonego oleju w 10 ml izopropanolu, a następnie przechowywać go przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj roztwór roboczy, mieszając 3 części roztworu podstawowego z 2 częściami podwójnie destylowanej wody (ddH2O), dobrze je wymieszaj i trzymaj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przefiltruj przez bibułę filtracyjną.
    5. Aby udokumentować różnicowanie adipogenne, przemyj komórki 2 razy PBS, a następnie utrwal je za pomocą neutralnie buforowanej formaliny 10% (0,75 ml / dołek) przez 15 minut. Następnie przemyj komórki 2 razy PBS przy użyciu 1 ml / studzienka i inkubuj komórki przez 5 minut za każdym razem. Ważne jest, aby całkowicie zassać PBS przed dodaniem roztworu roboczego Oil Red.
    6. Po ostatnim płukaniu dodać do komórek roztwór roboczy Oil Red i inkubować je przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Następnie usunąć roztwór plamy i delikatnie umyć komórki 2 razy PBS. Obserwuj poplamione kropelki lipidów pod mikroskopem.
  2. Różnicowanie osteogenne
    1. Wysiewaj 7,4 x 103 komórek/basenik (0,5 ml pożywki/basenik) na 24-dołkowej płytce i inkubuj je w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w kompletnych pożywkach (jak opisano w kroku 1.9.) przez 3 dni, aby osiągnąć prawie 70% konfluencji.
    2. Indukuj komórki za pomocą suplementu osteogennego (dostarczonego z zestawem) w pożywce LG-DMEM uzupełnionej 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B i 2 mM L-glutaminy.
    3. Kontynuuj indukcję osteogenną przez 21 dni, zmieniając pożywkę różnicującą co 3 dni.
    4. Przygotować roztwór roboczy barwienia czerwienią Alizaryny S, rozpuszczając 200 mg barwienia czerwieni S alizaryny w 9 ml ddH2O, a następnie dostosować pH do 4,1-4,3 za pomocą wodorotlenku amonu i HCl. Następnie uzupełnić objętość do 10 ml za pomocą ddH2O. Następnie usuń wszelkie osady przez filtrację za pomocą bibuły filtracyjnej.
    5. Umyj komórki 2 razy PBS, a następnie utrwal je za pomocą 10% buforowanej formaliny (0,75 ml / dołek) przez 15 minut. Następnie umyj komórki 2 razy za pomocą PBS (1 ml / dołek). Za każdym razem inkubuj komórki przez 5 minut.
    6. Inkubować utrwalone komórki z przygotowanym 2% roztworem czerwieni alizarynowej S przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    7. Następnie usuń roztwór barwienia, przemyj komórki 2 razy ddH2O i raz PBS, a następnie obserwuj barwioną bogatą w wapń macierz zewnątrzkomórkową, aby ocenić różnicowanie osteogenne pod mikroskopem.
  3. Różnicowanie chondrogenne
    1. Wysiewaj 7,4 x 103 komórek/basenik (0,5 ml pożywki/basenik) na 24-dołkowej płytce i inkubuj je w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w kompletnych pożywkach (jak opisano w kroku 1.9.) przez 3 dni, aby osiągnąć prawie 70% zrzeczenia się.
    2. Po osiągnięciu pożądanej konfluencji indukuj chondrogenne różnicowanie komórek za pomocą bezsurowicy DMEM/F12 zawierającego selen insulinowo-transferynowy (ITS), suplement chondrogeniczny (dostarczony z zestawem), 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B i 2 mM L-glutaminy21.
    3. Inkubuj komórki z pożywką chondrogenną przez 21 dni, zmieniając pożywkę różnicowania chondrogennego co 3 dni.
    4. Przygotuj roztwór roboczy barwnika Alcian Blue 8GX w następujący sposób: Najpierw przygotuj 3% lodowaty roztwór kwasu octowego w ddH2O, dodając 3 ml lodowatego kwasu octowego do 97 ml ddH2O. Następnie należy przygotować roztwór roboczy barwnika Alcian Blue 8GX, mieszając 0,1 g w 100 ml 3% roztworu kwasu lodowcowego i usunąć wszelkie osady przez filtrację za pomocą bibuły filtracyjnej.
    5. Umyj komórki 2 razy PBS, a następnie utrwal je za pomocą 10% buforowanej formaliny (0,75 ml / dołek) przez 15 minut. Następnie umyj komórki 2 razy za pomocą PBS (1 ml / dołek). Za każdym razem inkubuj komórki przez 5 minut.
    6. Kolejnym krokiem jest inkubacja komórek w przygotowanym 0,1% barwniku Alcian Blue 8GX w 3% lodowatym kwasie octowym przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Przebarwione komórki przemyć 2 razy ddH2O i raz PBS, a następnie obserwować wybarwione siarczanowane proteoglikany pod mikroskopem.

4. Zróżnicowanie Ad-MSC na IPC

  1. W przejściu 3 podziel Ad-MSC za pomocą Trypsyny-EDTA. Najpierw należy usunąć pożywkę, a następnie umyć komórki, nadal połączone w kolbie hodowlanej, z 5 ml PBS. Następnie dodać 5 ml trypsyny-EDTA do kolby o długości 75cm2 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-10 min.
    UWAGA: Spróbuj indukować komórki we wczesnych pasażach, zwykle między P3-P5, ponieważ późne pasaże niekorzystnie wpływają na właściwości komórek i zdolności różnicowania17,24.
  2. Następnie sprawdź komórki pod kątem oderwania i zawieszenia jednokomórkowego. Dodać 5 ml kompletnej pożywki DMEM/F12 do kolby, aby zahamować działanie trypsyny. Zebrać zawiesinę komórek i przenieść ją do probówki o pojemności 15 ml, a następnie dodać kolejne 5 ml kompletnej pożywki DMEM/F12 do probówki.
  3. Odwirować komórki przy 300 x g przez 2 minuty, aby granulować komórki.
  4. Umyj komórki raz PBS, ponownie odwiruj przy 300 x g przez 2 minuty, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 3-5 ml kompletnej pożywki DMEM/F12.
  5. Policz komórki za pomocą barwnika wykluczającego błękit trypanowy i hemocytometru.
  6. Następnie wysiewaj komórki na płytkach 6-dołkowych (1 x 106 komórek/płytkę) i płytce 12-dołkowej (do testu GSIS; 1 x 106 komórek/płytkę) i inkubuj w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 w kompletnej pożywce (jak opisano w kroku 1.9.) przez 3 dni, aby osiągnąć prawie 90% zgryźliwości.
  7. W dniu indukcji usuń pożywkę, przemyj komórki PBS, a następnie wstępnie indukuj komórki przez 2 dni za pomocą pożywki preindukcyjnej (DMEM/F12 uzupełniony 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B, 2 mM L-glutaminy, 10 mM nikotynamidu [NA] i 1mM β-merkaptoetanolu [β-ME]).
  8. Indukuj komórki przez kolejny 1 dzień za pomocą wysokiego stężenia glukozy DMEM (HG-DMEM, 4,5 g / L glukozy) uzupełnionego 2,5% FBS, 100 U / ml penicyliny, 100 μg / ml streptomycyny, 0,25 μg / ml amfoterycyny B, 2 mM L-glutaminy, 10 mM NA i 1 mM β-merkaptoetanolu. Na końcu tego etapu zbierz granulki komórek (oznaczone w tym protokole jako komórki D3).
  9. Inkubuj komórki przez dodatkowe 7 dni w końcowej pożywce indukcyjnej różnicowania składającej się z HG-DMEM uzupełnionego 2,5% FBS, 100 U / ml penicyliny, 100 μg / ml streptomycyny, 0,25 μg / ml amfoterycyny B, 2 mM L-glutaminy, 10 mM NA, 1 mM β-merkaptoetanolu i 10 nM eksendyny-4.
  10. Pod koniec określonego okresu zbierz osady komórkowe (nazwane w niniejszym protokole Końcowym) i oceń pomyślne różnicowanie komórek za pomocą barwienia DTZ i testu GSIS, jak podaje niniejszy protokół.
  11. Oceń wygenerowane IPC, wykonując kroki 5 i 6 poniżej.

5. Barwienie ditizonem

  1. Przygotować roztwór podstawowy do barwienia ditizonem (DTZ) w następujący sposób: Całkowicie rozpuścić 25 mg DTZ w 2,5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO), podzielić na podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C w ciemności do momentu użycia.
  2. Do barwienia należy przygotować roztwór roboczy w stosunku 1:100 (objętość/objętość), rozcieńczając roztwór podstawowy w kompletnej pożywce hodowlanej (HG-DMEM uzupełniony 5% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B i 2 mM L-glutaminy). Następnie przefiltruj roztwór roboczy przez filtr strzykawkowy 0,2 μm.
  3. Następnie, dla określonego DTZ, barwić komórki hodowlane na 6-dołkowej płytce i po zaessaniu pożywki hodowlanej, przemyć komórki raz PBS, a następnie dodać 2 ml roztworu roboczego DTZ do każdej studzienki. Inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .
  4. Ostrożnie umyj komórki 2 razy za pomocą PBS. Po ostatnim praniu dodaj 2 ml PBS do każdej studzienki. Następnie obserwuj szkarłatno-czerwono zabarwione IPC pod odwróconym mikroskopem. Stosować nieindukowane Ad-MSC początkowo hodowane w kompletnym pożywce wzrostowej (10% FBS - DMEM/F12) jako kontrolę.

6. Ekspresja genów markerów β-komórkowych metodą RT-qPCR

  1. Ekstrakcja RNA
    1. Po różnicowaniu zebrać granulki komórek i przechowywać je w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Zawiesić każdą osadkę komórkową (pochodzącą z sześciu studzienek jednej 6-dołkowej płytki połączonej) w 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA tiocyjanianu guanidu w probówce wolnej od nukleazy o pojemności 1,5 ml, wraz z kilkukrotnym pipetowaniem w górę iw dół. Inkubować zlizowane próbki w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby umożliwić całkowitą dysocjację kompleksów nukleoproteinowych.
    2. Dodać 200 μl chloroformu na 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA i bezpiecznie zakręcić probówki, które mają być energicznie wstrząsane ręcznie przez 15 s. Następnie inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    3. Odwirować próbki o masie 13 800 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Doprowadzi to do rozdzielenia mieszaniny na dolną fazę chloroformu, interfazę i bezbarwną górną fazę wodną, przy czym RNA pozostanie w fazie wodnej.
    4. Umieść górną fazę wodną w nowej probówce, ostrożnie unikając dotykania interfazy.
    5. Do fazy wodnej (objętość 1:1) dodać 600 μl 100% izopropanolu, następnie dokładnie wymieszać próbki przez inwersję 25 razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    6. Odwirować próbki o masie 18 800 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Wytrącone RNA tworzy mały żelowy osad po stronie probówki.
    7. Usunąć supernatant i umyć granulki 1 ml 80% lodowatego etanolu. Po dodaniu etanolu powoli przeprowadzaj wielokrotne pipetowanie granulki RNA przez 10 sekund.
    8. Odwirować próbki przez 5 minut przy 9 600 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i pozostawić granulki RNA do wyschnięcia na powietrzu przez 5-10 minut.
    9. Po wysuszeniu rozpuść granulki RNA w 25-100 μl wody wolnej od RNaz (zgodnie z początkową wielkością osadu), kilkakrotnie pipetując w górę iw dół, aż do całkowitego rozpuszczenia w probówkach bez nukleaz o pojemności 1,5 ml. Unikaj nadmiernego wysuszenia osadu RNA.
      UWAGA: Zwykle granulka staje się przezroczysta po wyschnięciu. Jednak, gdy jest czysty, natychmiast należy go ponownie zawiesić, aby uniknąć nadmiernego wysuszenia granulatu.
    10. Określ ilościowo RNA, określając gęstości optyczne (OD) przy 260 nm i 280 nm, używając wody wolnej od nukleaz jako ślepej próby.
    11. Upewnij się, że próbki mają OD260/OD280 = 1,8-2,0.
  2. Synteza cDNA
    1. Zsyntetyzuj cDNA z wyizolowanego całkowitego RNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA.
    2. Przeprowadzić reakcję syntezy cDNA zgodnie z instrukcjami producenta. W probówce PCR o pojemności 200 μl dodać objętość roztworu RNA zawierającego 0,5 μg całkowitego RNA do głównej mieszaniny reakcji przedstawionej w tabeli 1.
    3. Po dodaniu RNA do mieszanki wzorcowej wprowadzić mieszaninę przez program cykliczny w temperaturze 50 °C przez 30 minut przez jeden cykl, a następnie cykl inaktywacji w temperaturze 95 °C przez 2 minuty przy użyciu termocyklera.
    4. Rozcieńczyć cDNA wodą wolną od nukleaz do końcowego stężenia 2 ng/μl. Przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego RT-qPCR.
  3. RT-qPCR przy użyciu SYBR Green Master Mix
    1. Przeprowadzić reakcję RT-qPCR dla każdego genu docelowego przy użyciu matrycy cDNA zgodnie z mieszaniną reakcyjną przedstawioną w tabeli 2. Wykonaj wszystkie pomiary w trzech egzemplarzach.
    2. Zestawy stosowanych starterów przedstawiono w tabeli 3. Wszystkie procedury RT-qPCR należy wykonać na lodzie.
    3. Przeprowadź reakcję RT-qPCR przy użyciu maszyny do PCR w czasie rzeczywistym przy domyślnych ustawieniach programu. Warunki cykli termicznych obejmowały początkową denaturację w temperaturze 95 °C przez 10 minut, a następnie 45 cykli denaturacji (95 °C, 15 s) i połączone wyżarzanie/wydłużanie (60 °C, 1 min).
    4. Określić wartości Ct i wykryć poziomy ekspresji zgodnie z 2-ΔΔCt, z β-aktyną jako kontrolą wewnętrzną.

Główna mieszanka syntezy cDNAObjętość (μl)
5x bufor do syntezy cDNA4
Protokół dNTPcyfra arabska
Starter RNA1
Mieszanka enzymów Verso1
Wzmacniacz RT1
Woda wolna od nukleazzmienna
Całkowite RNAzmienna
Całkowita objętość reakcji20

Tabela 1: objętości głównego miksu syntezy cDNA.

Mieszanina reakcyjna RT-qPCRObjętość (μl)Stężenie końcowe w 10 μl
Zawartość cDNAcyfra arabska2 ng/studzienka
RT-qPCR Starter do przodu (3 μM)1300 nM
RT-qPCR Starter odwrócony (3 μM)1300 nM
Woda wolna od nukleaz1-------
2x SYBR Green master mix51x
Całkowita objętość reakcji10

Tabela 2: Mieszanina reakcyjna RT-qPCR.

powiedział: powiedział: ) powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:
genPodkład do przoduOdwrócony podkład
FOXA2GAGCCGTGAAGATGGAAGGATGTTGCCGGAACCACTG
PDX-1 (wersja PDX-1ATCCACCTCCCGGGGACCTTTCCCTCCGGTTCTGCTGCGTAT
NKX6.1ACACCAGACCCACATTCTCCG powiedział:ATCTCGGCTGCGTGCTTCTT powiedział:
MafA (Międzynarodowa Federacja)TTCAGCAAGGAGGAGGTCATCCGCCAACTTCTCGTATTTC powiedział:
Ins-1CACCTTTGTGGTCCTCACCTCTCCAGTGCCAAGGTCTGA
β-aktynaTGGAGAAGATTTGGCACCACAACACAGCCTGGATGGCTAC

Tabela 3: Sekwencje starterów do przodu i do tyłu.

7. Wydzielanie insuliny stymulowane glukozą

  1. Przygotowanie buforu wodorowęglanu Ringera (KRB) Kreb's Ringer
    1. Przygotować roztwór buforowy wodorowęglanu Ringera (KRB) Kreba o stężeniach glukozy 2 mM (niska glukoza) i 20 mM glukozy (wysoka glukoza) do testu wydzielania insuliny stymulowanego glukozą (GSIS). Składniki użyte do przygotowania buforu KRB podano w tabeli 4.
    2. Dostosuj pH buforu za pomocą 1 N HCl do około 7,25-7,35 (tj. 0,1-0,2 jednostki poniżej pożądanego pH 7,4, ponieważ może wzrosnąć podczas filtracji).
    3. Dodać świeżo albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 0,1 % (wagowo/objętościowo).
    4. Następnie dodaj glukozę (18 mg na 50 ml KRB, aby przygotować 2 mM bufor KRB o niskiej stężeniu glukozy i 180 mg na 50 ml KRB, aby przygotować 20 mM bufor KRB o wysokiej stężeniu glukozy).
    5. Wysterylizuj przygotowane LG i HG KRB przez filtrację przez filtr strzykawkowy 0,2 μm, aby były gotowe do testu GSIS.
  2. Test GSIS
    1. Początkowo wysiewaj 1 x 105 komórek / studzienkę na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej i indukuj te komórki przy użyciu dokładnie tego samego protokołu indukcji różnicowania.
    2. Na końcu protokołu indukcji delikatnie umyj wygenerowane IPC (w płytce) 2 razy za pomocą PBS i raz za pomocą LG-KRB.
    3. Następnie inkubować IPC z 300 μl LG-KRB/studzienkę przez 1 godzinę, a następnie wyrzucić ten bufor.
    4. Następnie inkubować IPC z 300 μl buforu KRB o pojemności 2 mM (LG) lub 20 mM (HG) przez dodatkowy 1 godzinę. Pod koniec okresu inkubacji zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego testu wydzielania insuliny przy użyciu dostępnego w handlu zestawu ELISA i postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Staraj się być tak delikatny, jak to możliwe podczas zasysania lub dodawania buforu PBS i KRB podczas wykonywania testu GSIS.
składnikkoncentracja
Chlorek magnezu (bezwodny)0,0468 g/l
Chlorek potasu0,34 g/l
chlorek sodu7,00 g/l
Fosforan sodu dwuzasadowy (bezwodny)0,1 g/l
Fosforan sodu jednozasadowy (bezwodny)0,18 g/l
Wodorowęglan sodu1,26 g/l
Chlorek wapnia0,2997 g/l

Tabela 4: Składniki użyte do przygotowania bufora KRB.

8. Analiza statystyczna

  1. Wyrazić wszystkie dane jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM). Wszystkie porównania przeprowadzono przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) i testu post hoc Tukeya przy użyciu oprogramowania statystycznego. Wyniki z wartościami p **p ≤ 0,01 i *p ≤ 0,05 uznano za istotne statystycznie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja i charakterystyka Ad-MSCs
Jak pokazano na Rysunek 2, wyizolowane komórki z tkanki tłuszczowej wykazały niejednorodną populację zaokrąglonych i podobnych do fibroblastów komórek, począwszy od następnego dnia izolacji (Rysunek 2A). 4 dni po izolacji, komórki fibroblastów zaczęły zwiększać swoją liczbę i rozmiar oraz rosnąć jako jednorodna populacja przez przejście 1 (Rysunek 2B, C). Komórki te kontynuowały w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym protokole udało nam się przedstawić szczegółowy protokół izolacji Ad-MSCs z tłuszczu najądrza szczura i różnicowania tych Ad-MSCs w IPC. W rzeczywistości tłuszcz nabłonkowy szczura jest łatwo dostępnym źródłem tkanki tłuszczowej do pozyskiwania Ad-MSC i nie wymaga żadnego specjalnego sprzętu, ani do pobierania, ani do przetwarzania 15,26,27. Izolowane Ad-MSC wykazały się doskonałą ekspansją kulturową i spełniały wsz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy współautorzy deklarują brak konfliktu interesów związanego z tą pracą.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Rawda Samir Mohamed, MSc, Specjalista Weterynarii, Wydział Farmacji, Brytyjski Uniwersytet Egiptu (BUE) za pomoc w sekcji szczurów.

Chcielibyśmy również podziękować i docenić wysiłki Wydziału Komunikacji Masowej Brytyjskiego Uniwersytetu w Egipcie (BUE) w produkcji i edycji filmu tego rękopisu.

Chcielibyśmy podziękować Pani Fatmie Masoud, mgr inż., Asystentowi Wykładowcy Języka Angielskiego, Brytyjski Uniwersytet w Egipcie (BUE) za korektę i korektę manuskryptu w języku angielskim.

Ta praca została częściowo sfinansowana przez Centrum Badań i Rozwoju Leków (CDRD), Wydział Farmacji, Brytyjski Uniwersytet w Egipcie (BUE), Kair, Egipt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumina, surowica bydlęca Frakcja VMP Biomedicals
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, USAA3157
Alizaryna Czerwień SSigma-Aldrich, USAA5533
Wodorotlenek amonuFisher Scientific, Niemcy
Przeciwciało dla szczura CD90, FITCStem Cell Technologies60024FI
Albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichA3912
Chlorek wapniaFisher Scientific, Niemcy
Przeciwciało monoklonalne CD105, FITCThermo Fisher Scientific, Invitrogen, USAMA1-19594
CD34 Przeciwciało poliklonalneThermo Fisher Scientific, Invitrogen, USAPA5-85917
ChloroformFisher Scientific, USA
Kolagenaza typu I, proszekGibco, Thermo Fisher, USA17018029
D-glukoza bezwodna, ekstra czystaFisher Scientific, NiemcyG/0450/53
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Fisher Scientific, NiemcyBP231-100
Barwienie ditizonemSigma-Aldrich, USAD5130
DMEM - Wysoka glukoza 4,5 g/LLonza, Szwajcaria12-604F
DMEM - Niska glukoza 1 g/LLonza, Szwajcaria12-707F
DMEM/F12 mediumLonza, SzwajcariaBE12-719F
Woda wolna od DNAzy/RNAzyGibco Thermo Fisher, USA10977-035
Absolutny etanol, klasa biologii molekularnejSigma-Aldrich, Niemcy24103
Exendin-4Sigma-Aldrich, NiemcyE7144
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco Thermo Fisher, Brazylia10270-106
Formaldehyd 37%Fisher Scientific
Kwas solny (HCl)Fisher Scientific, Niemcy
Izopropanol, klasa biologii molekularnejFisher Scientific, USABP2618500
L-glutaminaGibco Thermo Fisher, USA25030-024
Chlorek magnezu (bezwodny)Fisher Scientific, Niemcy
Mezenchymalny zestaw do identyfikacji funkcjonalnej komórek macierzystychR& D systems Inc., MN, USASC006
NikotynamidSigma-Aldrich, NiemcyN0636
Czerwona plama olejowaSigma-Aldrich, USAO0625
Penicylina-Streptomycyna-AmfoterycynaGibco Thermo Fisher, Stany Zjednoczone15240062
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1X, bez Ca/MgLonza, SzwajcariaBE17-516F
Potas ChlorekFisher Scientific, Niemcy
Zestaw ELISA insuliny dla szczurówCloud-Clone Corp., USACEA682Ra
Wodorowęglan soduFisher Scientific, Niemcy
Chlorek soduFisher Scientific, Niemcy
Fosforan sodu dwuzasadowy (bezwodny)Fisher Scientific, Niemcy
Sód Fosforan jednozasadowy (bezwodny)Fisher Scientific, Niemcy
SYBR Green MaximaThermo Scientific, USAK0221
Filtr strzykawkowy, 0,2 mikronaCorning, USA431224
TRIzolThermo Scientific, USA15596026
Błękit trypanowyGibco Thermo Fisher, Stany Zjednoczone15250061
Trypsin-Versene-EDTA, 1XLonza, SzwajcariaCC-5012
Zestaw do syntezy cDNA VersoThermo Scientific, USAAB-1453/A
β-merkaptoetanolSigma-Aldrich, NiemcyM3148

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43(2020).
  2. Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine. Handbook of Stem Cell Therapy. Haider, K. H. , Springer. Singapore. 1-28 (2022).
  3. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
  4. De Ugarte, D. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).
  5. Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user's guide. Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).
  6. Camara, B. O. S., et al. Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572(2021).
  7. Ren, Y., et al. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).
  8. Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).
  9. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  10. Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387(2016).
  11. Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells International. 2016, 6737345(2016).
  12. Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236(2020).
  13. Karp, J., Leng Teo, G. Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details. Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).
  14. Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  15. Lopez, M. J., Spencer, N. D. In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation. Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).
  16. Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).
  17. Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131(2018).
  18. Lee, R. H., et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).
  19. Gao, L. R., et al. Overexpression of apelin in Wharton's jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic β cell proliferation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 339(2018).
  20. Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).
  21. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Research & Therapy. 7, 108(2016).
  22. Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).
  23. Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).
  24. Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells International. 2020, 8898221(2020).
  25. Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of flow cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , Hoboken, NJ. 1-12 (2010).
  26. Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).
  27. Qi, Y., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 277(2021).
  28. Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 8 (2), 2652(2020).
  29. Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68(2019).
  30. Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).
  31. Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16(2020).
  32. Gabr, M. M., et al. From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells. BioMed Research International. 2017, 3854232(2017).
  33. Xin, Y., et al. Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia. PLoS One. 11 (1), 0145838(2016).
  34. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 484(2020).
  35. El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).
  36. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
  37. El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).
  38. Gabr, M. M., et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study. Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mezenchymalne kom rki macierzyste tkanki t uszczowejr nicowanie kom rek macierzystychfrakcja naczyniowo stromalnatrawienie kolagenazmarkery powierzchniowe CDstymulowana glukoz sekrecja insulinybarwienie dytyzonemmarkery kom rek beta

Powiązane artykuły