Artykuł metodologiczny

Porównanie metod izolowania grzybów entomopatogenicznych z próbek gleby

DOI:

10.3791/63353

⸱

6 stycznia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 2Laboratório de Taxonomia Bioquímica e Bioprospecção de Fungos/Coleção de Cultura de Fungos Filamentosos, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Departamento de Parasitologia Animal, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Entomopatogeniczne kolonie grzybów są izolowane z próbek gleby tropikalnej za pomocą przynęty Tenebrio, przynęty Galleria, a także selektywnego sztucznego podłoża, tj. agaru z dekstrozą ziemniaczaną wzbogaconego ekstraktem drożdżowym uzupełnionym chloramfenikolem, tiabendazolem i cykloheksymidem (pożywka CTC).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem niniejszego badania jest porównanie skuteczności stosowania przynęt na owady w porównaniu ze sztucznym selektywnym podłożem do izolowania grzybów entomopatogenicznych (EPF) z próbek gleby. Gleba jest bogatym siedliskiem dla mikroorganizmów, w tym EPF, szczególnie należących do rodzajów Metarhizium i Beauveria, które mogą regulować szkodniki stawonogów. Na rynku dostępne są produkty biologiczne na bazie grzybów, głównie do zwalczania szkodników stawonogów w rolnictwie. Niemniej jednak, pomimo wysokiej endemicznej różnorodności biologicznej, tylko kilka szczepów jest stosowanych w komercyjnych bioproduktach na całym świecie. W niniejszym badaniu 524 próbki gleby hodowano na agarze z dekstrozą ziemniaczaną wzbogaconym ekstraktem drożdżowym uzupełnionym chloramfenikolem, tiabendazolem i cykloheksymidem (pożywka CTC). Wzrost kolonii grzybów obserwowano przez 3 tygodnie. Wszystkie Metarhizium i Beauveria EPF zostały morfologicznie zidentyfikowane na poziomie rodzaju. Ponadto niektóre izolaty zostały zidentyfikowane molekularnie na poziomie gatunku. Dwadzieścia cztery z tych 524 próbek gleby zostały również przebadane pod kątem występowania EPF przy użyciu metody przynęty na owady (Galleria mellonella i Tenebrio molitor). Z 524 próbek gleby wyizolowano łącznie 51 szczepów EPF (41 Metarhizium spp. i 10 Beauveria spp.). Wszystkie szczepy grzybów wyizolowano albo z pól uprawnych, albo z łąk. Spośród 24 próbek wybranych do porównania, 91,7% było dodatnich na EPF przy użyciu przynęty Galleria, 62,5% przy użyciu przynęty Tenebrio, a 41,7% przy użyciu CTC. Nasze wyniki sugerują, że stosowanie przynęt na owady do izolowania EPF od gleby jest bardziej efektywne niż stosowanie pożywki CTC. Porównanie metod izolacji wraz z identyfikacją i ochroną EPF ma pozytywny wpływ na wiedzę o różnorodności biologicznej. Udoskonalanie kolekcji EPF wspiera rozwój naukowy i innowacje technologiczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gleba jest źródłem wielu mikroorganizmów, w tym grzybów entomopatogenicznych (EPF). Ta szczególna grupa grzybów jest rozpoznawana po ich zdolności do kolonizacji i często zabijania stawonogów gospodarzy, zwłaszcza owadów1. Po izolacji, charakterystyce, selekcji zjadliwych szczepów i rejestracji, EPF jest masowo produkowany do zwalczania stawonogów i szkodników, co potwierdza ich znaczenie ekonomiczne2. W związku z tym izolacja EPF jest uważana za pierwszy krok do opracowania biopestycydu. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) i Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) są najpowszechniejszymi grzybami stosowanymi do zwalczania szkodników stawonogów 3. EPF udało się wyizolować z gleby, stawonogów z widoczną grzybicą, skolonizowanych roślin i roślinnej ryzosfery4,5.

Izolacja EPF może być również przydatna do badania różnorodności, rozmieszczenia i ekologii tej konkretnej grupy. Najnowsza literatura donosiła, że stosowanie EPF jest niedoceniane, powołując się na kilka niekonwencjonalnych zastosowań EPF, takich jak ich zdolność do poprawy wzrostu roślin4, do usuwania toksycznych zanieczyszczeń z gleby i do stosowania w medycynie6. Niniejsze badanie ma na celu porównanie skuteczności izolacji EPF z gleby za pomocą przynęt na owady w porównaniu ze sztucznym podłożem hodowlanym7,8,9. Stosowanie Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) jako przynęty na owady w kontekście izolacji EPF zostało dobrze zaakceptowane. Larwy te są używane na całym świecie przez społeczność naukową jako model eksperymentalny do badania interakcji gospodarz-patogen10,11. Larwa Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) jest uważana za kolejny model owada do badań nad wirulencją i izolacją EPF, ponieważ owad ten jest łatwy do rzadkiego w laboratorium przy niskich kosztach7,12.

Metody niezależne od hodowli, takie jak użycie różnych technik PCR, mogą być stosowane do wykrywania i ilościowego oznaczania EPF na ich podłożach, w tym soil13,14. Niemniej jednak, aby prawidłowo wyizolować te kolonie grzybów, ich podłoże powinno być hodowane na selektywnym sztucznym podłożu 9, lub grzyby obecne w próbkach mogą być przynętowane za pomocą wrażliwych owadów15. Z jednej strony CTC jest sztuczną pożywką wolną od odyny, która składa się z agatora z dekstrozą ziemniaczaną wzbogaconego ekstraktem drożdżowym uzupełnionym chloramfenikolem, tiabendazolem i cykloheksymidem. To podłoże zostało opracowane przez Fernandesa i wsp.9, aby zmaksymalizować odzysk naturalnie występujących Beauveria spp. i Metarhizium spp. z gleby. Z drugiej strony, larwy G. mellonella i T. molitor mogą być również z powodzeniem stosowane jako przynęty do pozyskiwania izolatów EPF z gleby. Niemniej jednak, według Sharma et al.15, mniej badań donosiło o jednoczesnym stosowaniu i porównywaniu tych dwóch owadów-przynęt. Gleby portugalskich winnic wykazały znaczny odzysk Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin za pomocą T. larwy molitora w porównaniu z larwami G. mellonella; natomiast Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Izolacja Vuilla była związana z użyciem G. mellonella baits15. W związku z tym decyzja o tym, którą metodę izolacji EPF zastosować (tj. G. mellonella-bait, T. molitor-bait lub pożywkę CTC) powinna być rozważona zgodnie z celem badania i infrastrukturą laboratoryjną. Celem niniejszego badania jest porównanie skuteczności stosowania przynęt na owady w porównaniu ze sztucznym selektywnym podłożem do izolowania EPF od próbek gleby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ niniejsze badanie dotyczyło brazylijskiego dziedzictwa genetycznego, zostało zarejestrowane w Krajowym Systemie Zarządzania Dziedzictwem Genetycznym i Związaną Wiedzą Tradycyjną (Sisgen) pod kodem AA47CB6.

1. Pobieranie próbek gleby

  1. Zbierz 800 g gleby (z lub bez incydentalnych wtórnych korzeni roślin) na głębokość 10 cm za pomocą małej łopaty. Przechowuj je w polipropylenowych torebkach w temperaturze pokojowej do rozpoczęcia eksperymentu.
    UWAGA: Można również zbierać małe korzenie, ponieważ według doniesień EPF ma kompetencję ryzosfery. Im szybsze przetwarzanie próbek, tym lepiej, ponieważ zarodniki grzybów mogą z czasem stać się mniej żywotne. W niniejszym badaniu próbki analizowano nie później niż 7 dni po pobraniu.
  2. Użyj GPS, aby określić lokalizację pobranych próbek pod względem szerokości i długości geograficznej oraz sklasyfikować pobrany obszar według rodzaju gleby (na przykład łąki, rodzime lasy deszczowe, brzegi jezior lub pola uprawne).

2. Metody izolacji grzybów entomopatogenicznych

  1. Izolacja za pomocą selektywnego sztucznego podłoża CTC.
    1. Aby przygotować pożywkę CTC [agar z dekstrozą ziemniaczaną plus ekstrakt drożdżowy (PDAY) uzupełniony 0,5 g/l chloramfenikolu, 0,001 g/l tiabendazolu i 0,25 g/l cykloheksymidu9], zważ wszystkie odczynniki indywidualnie, wymieszaj je z wodą destylowaną i wysterylizuj pożywkę w autoklawie. W komorze bezpieczeństwa biologicznego rozłóż 23 ml pożywki na płytki Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm.
      UWAGA: Podczas ważenia odczynników CTC używaj fartucha laboratoryjnego, maski, rękawiczek i okularów, ponieważ cykloheksymym i chloramfenikol są toksyczne.
    2. Odważyć 0,35 ± 0,05 g każdej próbki gleby (z korzeniami lub bez) i umieścić ją w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml.
    3. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodać 1 ml sterylnej zawiesiny wodnej monooleinianu polioksyetylenosorbitanu o stężeniu 0,01% (obj./obj.) do mikroprobówki zawierającej glebę i wirować przez 30 s.
    4. Usunąć 50 μl supernatantu i odpipetować go na środek płytki Petriego za pomocą pożywki CTC. Zawiesiny rozprowadzić równomiernie na powierzchni podłoża za pomocą sterylnej szpatułki Drigalskiego (o średnicy 6 mm).
      UWAGA: Dla każdej próbki gleby należy przygotować co najmniej trzy powtórzenia.
    5. Inkubować płytki w komorach klimatycznych (25 ± 1 °C, wilgotność względna ≥80%) w ciemności i obserwować wzrost kolonii grzybów po 7, 14 i 21 dniach inkubacji.
    6. Obserwuj makromorfologię i mikromorfologię kolonii grzybów poszukujących EPF. Przenieść kultury EPF na podłoże z dekstrozą ziemniaczaną z dodatkiem 0,05% chloramfenikolu (PDAC) aż do uzyskania czystych kultur.
      UWAGA: Do identyfikacji kolonii EPF należy użyć kluczy opisowych przedstawionych poniżej w kroku 3.
  2. Izolacja za pomocą przynęt na owady
    1. Stosować zdezynfekowane powierzchniowo larwy G. mellonella i T. molitor w późnym stadium. Zanurz larwy w 0,5% podchlorynie sodu na 1 minutę w celu sterylizacji. Umyj larwy dwukrotnie sterylną wodą.
      UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano larwy G. mellonella z czwartego etapu. Stadia larwalne T. molitor nie były standaryzowane.
    2. Użyj plastikowych doniczek do złożenia przynęt. Dodaj 250 g zebranej ziemi do każdej plastikowej doniczki (98 mm szerokości x 47 mm wysokości x 142 mm długości). Oddziel 15 larw każdego gatunku (T. molitor i G. mellonella) i umieść pięć larw w plastikowej doniczce. Przechowuj doniczki w temperaturze 25 ± 1 °C, a wilgotność względna ≥ 80% w ciemności.
      UWAGA: Wywierć 10 małych otworów (o średnicy 2 mm) w pokrywkach garnków, aby umożliwić wentylację. Do wiercenia otworów można użyć ostrego, rozgrzanego żelazka.
    3. Homogenizuj glebę co drugi dzień, aby umożliwić maksymalny kontakt larw z glebą.
      UWAGA: Wilgoć jest ważna, aby wspierać infekcję grzybiczą larw. Aby utrzymać wilgoć w glebie, w razie potrzeby spryskaj powierzchnię gleby sterylną wodą destylowaną. Nie moczyć próbki gleby w wodzie.
    4. Codziennie analizuj doniczki w poszukiwaniu martwych owadów.
      UWAGA: Codziennie obserwuj pozostałe larwy w kolonii pod kątem patologicznych objawów bezkręgowców, aby upewnić się, że owady nie są zainfekowane. Alternatywnie do badania można włączyć doniczki kontrolne ze sterylną glebą w celu sprawdzenia stanu zdrowia larw owadów.
    5. Usuń martwe owady i wysterylizuj je powierzchniowo 0,5% podchlorynem sodu przez 1 min. Umieść sterylne owady w wilgotnej komorze (wilgotność względna ≥ 80%) w temperaturze 25 ± 1 °C na 7 dni, aby sprzyjać eksterioryzacji grzybów entomopatogenicznych (grzybicy).
    6. W przypadku grzybicy zbierz konidia z powierzchni owada. Użyj pętli mikrobiologicznej, aby umieścić konidia na pożywce PDAC pod mikroskopem stereoskopowym. Alternatywnie należy umieścić całe zainfekowane larwy na pożywce PDAC. Inkubować płytki hodowlane w komorze klimatycznej w temperaturze 25 ± 1 °C i wilgotności względnej ≥ 80%.
    7. Obserwuj makromorfologię i mikromorfologię kolonii grzybów na płytkach, aby potwierdzić tożsamość EPF. Powtarzaj hodowlę na PDAC, aż do uzyskania czystych kolonii grzybów.
      UWAGA: Do identyfikacji kolonii EPF należy użyć kluczy opisowych przedstawionych poniżej w kroku 3.

3. Identyfikacja EPF (Metarhizium spp. i Beauveria spp.)

  1. Przeanalizuj cechy makromorfologiczne kultur grzybów na płytkach (tj. powierzchnię i odwrotność kolonii, ich kształt, krawędź, tempo wzrostu, kolor, teksturę, dyfuzyjny pigment, wysięki i konidia powietrzne) po 14 dniach w temperaturze 25 ± 1 °C i wilgotności względnej ≥ 80%.
  2. Przenieś konidia powietrzne do kultur szkiełkowych (technika mikrokultur)16 przez 3 dni w temperaturze 25 ± 1 °C i wilgotności względnej ≥ 80% i zabarwić błękitem laktofenolowym, aby obserwować cechy mikroskopowe (tj. układ konidiów, konidiofory, kształt i rozmiar konidii)17,18,19,20.
  3. Obserwuj mikroskopijne struktury grzybów pod kątem 400x za pomocą mikroskopu optycznego, aby potwierdzić identyfikację EPF.
    UWAGA: Klucze morfologiczne dla EPF są opisane w raportach Bischoffa i wsp., Rehnera i wsp., Seiferta i wsp., oraz Humber17,18,19,20. Makromorfologia i mikromorfologia kolonii grzybów są najczęstszymi kryteriami stosowanymi do identyfikacji grzybów strzępkowych na poziomie rodzaju. W zależności od rodzaju EPF te cechy morfologiczne ulegną zmianie. Humber20 przedstawia klucz identyfikacyjny do głównych rodzajów entomopatogenów grzybów. Na przykład kolonie Metarhizium spp. są zwykle okrągłe, sproszkowane, mają różne odcienie zieleni i mogą wykazywać wysięk. Mikroskopowo kolonie te mają komórki konidiogenne wierzchołkowe na szeroko rozgałęzionych, gęsto splecionych konidioforach tworzących zwarte hymenium oraz konidia cylindryczne do elipsoidalnych w równoległych łańcuchach tworzących kolumny lub masy przypominające płytki. Kolonie Beauveria spp. są zwykle białe, pudrowe lub podobne do bawełny. Wykazują komórki konidiogenne z rozszerzoną częścią podstawną rozciągającą się wierzchołkowo w kierunku zygzakowatym. Konidiofory Beauveria tworzą gęste skupiska konidiów w kształcie kuli. Analizy molekularne są potrzebne do identyfikacji EPF na poziomie gatunku.
  4. Przeprowadzanie analiz molekularnych izolatów w celu identyfikacji taksonomicznej na poziomie gatunku. Dla szczepów EPF wyizolowanych w tym badaniu, a mianowicie Metarhizium spp. i Beauveria spp., należy przeprowadzić analizy molekularne w oparciu o raporty Bischoffa i wsp.17 oraz Rehnera i wsp.18.
  5. Po potwierdzeniu, że izolaty są EPF, należy je zdeponować w kolekcji kultur grzybów. W niniejszym badaniu izolaty zdeponowano w kolekcji entomopatogenicznych kultur grzybów z Laboratorium Kontroli Mikrobiologicznej (LCM) na Federalnym Uniwersytecie Wiejskim w Rio de Janeiro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W latach 2015-2018 w stanie Rio de Janeiro w Brazylii zebrano łącznie 524 próbki gleby z użytków zielonych: pastwisk dla zwierząt gospodarskich (165 próbek), rodzimych lasów tropikalnych (90 próbek), brzegów jezior (42 próbki) i pól uprawnych/uprawnych (227 próbek). Szczegółowe informacje na temat współrzędnych geograficznych próbek dodatnich na obecność EPF podano w tabeli uzupełniającej 1.

Z 524 próbek gleby, 500 próbek było analizowanych tylko przy użyciu pożywki CTC, a 24 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naturalne i rolnicze siedliska glebowe są typowymi środowiskami dla EPF22 i doskonałym naturalnym zbiornikiem. W niniejszym badaniu omówiono dwie metody izolacji EPF przy użyciu przynęt na owady w porównaniu z pożywką selektywną. Pierwszym krokiem do izolacji jest pobranie próbek gleby. Kluczowe znaczenie ma właściwe przechowywanie i identyfikacja próbek gleby. Informacje o szerokości i długości geograficznej, typie gleby i biomie są niezbędne do badań z udziałem podmiotów epidemiologicznych, mode...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) z Brazylii, kod finansowy 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (numer projektu E-26/010.001993/2015), oraz Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) z Brazylii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AutoklawPhoenix Luferco9451
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoAirstream ESCOAC2-4E3
ChloramfenikolSigma-AldrichC0378
Komory klimatyczneEletrolabEL212/3
Szkiełko nakrywkoweRBR3871
CykloheksymidSigma-AldrichC7698
Szpatułka DrigalskiegoMarienfeld1800024
Aplikacja GPSAplikacja geolokalizacyjna2.1.2005
Roztwór niebieskiego laktofenoluSigma-Aldrich61335
Mikroskop Zeiss Axio star plus1169 149
Kamera mikroskopowaZeiss Axiocam 105 kolor426555-0000-000
Mikroskop softwereZen lite Zeiss 3.0
Szkiełko mikroskopoweOlenk5-7105-1
MikroprobówkaBRANDZ336769-1PAK
Płytki PetriegoKasviK30-6015
Końcówka do pipetVattenVT-230-200C/VT-230-1000C
PippetteHTL - LabmateproLMP 200 / LMP 1000
Doniczki plastikowePrafesta descartá veis8314
Worki polipropylenoweExtrusa38034273/5561
Agar z dekstrozą ziemniaczanąKasviK25-1022
Oprogramowanie Prism 9.1.2Łopata do grafiki
Tramontina77907009
Tenebrio mollitorSafariQP98DLZ36
TiabendazolSigma-AldrichT8904
Tween 80Vetec60REAVET003662
VortexBiomixerQL-901
Ekstraktdrożdżowy KasviK25-1702

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
  2. do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
  3. Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
  4. Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
  5. Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
  6. Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S. Entomopathogenic fungi: unconventional applications. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19, 23-42 (2020).
  7. Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
  8. Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
  9. Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
  10. Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
  11. Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
  12. Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
  13. Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933(2016).
  14. Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
  15. Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method' as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
  16. Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
  17. Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
  18. Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
  19. Seifert, K. A., Gams, W. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. 9, 903-906 (2011).
  20. Humber, R. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. Lacey, L. A. , Academic Press. Washington. 151-187 (2012).
  21. Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
  22. St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
  23. Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
  24. Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
  25. Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
  26. Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
  27. Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
  28. Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
  29. Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
  30. Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
  31. Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
  32. Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
  33. Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
  34. Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
  35. Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metoda przyn ty dla owad wsztuczne pod o e selektywnegatunki Metarhiziumgatunki Beauveriapod o e CTCizolacja grzyb widentyfikacja morfologicznabiologiczne rodki kontroli

Powiązane artykuły