Artykuł metodologiczny

Rejestrowanie prądu złącza szczelinowego z oocytów Xenopus

DOI:

10.3791/63361

⸱

21 stycznia 2022

 , 
1Department of Neuroscience, University of Connecticut School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do wyrażania białek połączeniowych w oocytach Xenopus i rejestrowania prądu połączeniowego między dwoma przypisanymi oocytami za pomocą komercyjnego wzmacniacza zaprojektowanego do zapisów napięcia z dwoma oocytami w trybie pomiaru wysokiego prądu bocznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Heterologiczna ekspresja koneksyn i inneksyn w oocytach Xenopus to potężne podejście do badania biofizycznych właściwości połączeń szczelinowych (GJ). Jednak takie podejście jest technicznie trudne, ponieważ wymaga zacisku różnicowego napięcia dwóch przeciwstawnych oocytów mających wspólną masę. Chociaż niewielkiej liczbie laboratoriów udało się wykonać tę technikę, zasadniczo wszystkie z nich używały albo wzmacniaczy domowej roboty, albo wzmacniaczy komercyjnych, które zostały zaprojektowane do nagrań z pojedynczymi oocytami. Wdrożenie tej techniki jest często wyzwaniem dla innych laboratoriów. Chociaż tryb pomiaru prądu po stronie wysokiej został włączony do komercyjnego wzmacniacza do zapisów z podwójnym cęgowaniem napięcia oocytów, nie było raportu na temat jego zastosowania aż do naszego ostatniego badania. Sprawiliśmy, że podejście do pomiaru prądu po stronie wysokiej jest bardziej praktyczne i wygodne, wprowadzając kilka modyfikacji technicznych, w tym budowę magnetycznej platformy rejestrującej, która umożliwia precyzyjne umieszczanie oocytów i różnych elektrod, zastosowanie roztworu kąpieli jako przewodnika w elektrodach różnicowych napięć, przyjęcie komercyjnej elektrody KCl o niskim wycieku jako elektrody odniesienia, Wytwarzanie elektrod prądowych i napięciowych z cienkościennych kapilar szklanych oraz pozycjonowanie wszystkich elektrod za pomocą urządzeń magnetycznych. Opisana tutaj metoda pozwala na wygodne i solidne zapisy prądu połączeniowego (Ij) między dwoma przeciwstawnymi oocytami Xenopus.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GJ to kanały międzykomórkowe, które mogą umożliwiać przepływ prądu i wymianę małych cząsteczek cytozolowych między sąsiednimi komórkami. Występują w wielu typach komórek i pełnią różne funkcje fizjologiczne. GJ u kręgowców są tworzone przez koneksyny, podczas gdy te u bezkręgowców są tworzone przez inneksyny. Każdy GJ składa się z dwóch zestawionych ze sobą półkanałów z 6 lub 8 podjednostkami na półkanał, w zależności od tego, czy są to koneksyny, czy innexins1,2,3. Ludzie mają 21 genów koneksyny4, podczas gdy powszechnie używane modele bezkręgowców C. elegans i Drosophila melanogaster mają odpowiednio 25 i 8 genów inneksyny5,6. Alternatywny splicing transkryptów genów może jeszcze bardziej zwiększyć różnorodność białek GJ, przynajmniej dla innexins7,8.

GJ można podzielić na trzy kategorie w zależności od składu molekularnego: homotypowe, heterotypowe i heteromeryczne. Homotypowy GJ ma wszystkie swoje podjednostki identyczne. Heterotypowy GJ ma dwie półkanały homomeryczne, ale te dwie półkanały są utworzone przez dwa różne białka GJ. Heteromeryczny GJ zawiera co najmniej jeden heteromeryczny półkanał. Różnorodność molekularna GJ może nadawać odrębne właściwości biofizyczne, które są ważne dla ich funkcji fizjologicznych. Właściwości biofizyczne GJ są również modulowane przez białka regulatorowe9. Aby zrozumieć, w jaki sposób GJ pełnią swoje funkcje fizjologiczne, ważne jest, aby znać ich skład molekularny, właściwości biofizyczne i rolę białek regulatorowych w ich funkcjach.

Heterologiczne systemy ekspresji są często używane do badania biofizycznych właściwości kanałów jonowych, w tym GJ, oraz wpływu białek regulatorowych na nie. Ponieważ heterologiczne systemy ekspresji umożliwiają ekspresję określonych białek, są one na ogół bardziej podatne na analizowanie funkcji białek niż tkanki natywne, w których białka o nadmiarowych funkcjach mogą komplikować analizę, a rejestracja Ij może być nieosiągalna. Niestety, większość powszechnie stosowanych linii komórkowych, z wyjątkiem komórki Neuro-2A, jest nieodpowiednia do badania właściwości biofizycznych GJ z powodu powikłań związanych z endogennymi połączeniami. Nawet komórki Neuro-2A nie zawsze nadają się do tego rodzaju analizy. Na przykład, nie mogliśmy wykryć żadnego Ij w komórkach Neuro-2A transfekowanych inneksynami UNC-7 i UNC-9 ani pod nieobecność, ani w obecności UNC-1 (nieopublikowane), co jest wymagane do funkcji UNC-9 GJ w C. elegans9,10. Z drugiej strony, oocyty Xenopus są użytecznym alternatywnym systemem do analiz elektrofizjologicznych GJ. Chociaż wyrażają endogenne białko GJ, koneksynę 38 (Cx38)11, potencjalnych powikłań można łatwo uniknąć, wstrzykując specyficzny oligonukleotyd antysensowny12. Jednak analizy GJ z oocytami Xenopus wymagają zacisku różnicowego napięcia dwóch zestawionych komórek, co jest wyzwaniem technicznym. Najwcześniejsze sukcesy dwunapięciowego zacisku blastomerów żaba zostały odnotowane około 40 lat temu13,14. Od tego czasu w wielu badaniach wykorzystano tę technikę do rejestrowania Ij w sparowanych oocytach Xenopus. Jednak zasadniczo wszystkie poprzednie badania zostały przeprowadzone na domowych wzmacniaczach12,15,16 lub komercyjnych wzmacniaczach przeznaczonych do nagrań na pojedynczych oocytach (GeneClamp 500, AxoClamp 2A lub AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20. Ponieważ nawet komercyjne wzmacniacze nie dostarczają instrukcji dotyczących podwójnego zacisku napięcia oocytów, wdrożenie tej techniki jest często wyzwaniem dla nowych lub mniej wyrafinowanych laboratoriów elektrofizjologicznych.

Tylko jeden komercyjny wzmacniacz został opracowany dla podwójnej objętości napięcia oocytów, OC-725C od Warner Instruments (Tabela materiałów, Rysunek 1A). Wzmacniacz ten może być używany zarówno w trybie standardowym (dla pojedynczych oocytów), jak i w trybie pomiaru prądu po stronie wysokiej (dla pojedynczych lub podwójnych oocytów), w zależności od tego, czy podłączone są dwa gniazda w sondzie napięcia (Rysunek 1B, C). Jednak aż do naszego ostatniego badania7, nie było ani jednej publikacji opisującej zastosowanie tego wzmacniacza w trybie pomiaru prądu po stronie wysokiej. Chociaż wzmacniacz był używany przez inne laboratorium do zapisów podwójnych oocytów, był używany w trybie standardowym, a nie w trybie high side21,22. Ten brak raportów z wykorzystaniem wzmacniacza w trybie pomiaru prądu po stronie wysokiej może wynikać z problemów technicznych. Nie byliśmy w stanie uzyskać stabilnych zapisów podwójnych oocytów w trybie high side, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Na przestrzeni lat wypróbowaliśmy trzy różne podejścia do zapisów z dwoma oocytami, w tym użycie dwóch wzmacniaczy OC-725C w trybie pomiaru prądu po stronie wysokiej, dwóch wzmacniaczy OC-725C w trybie standardowym oraz dwóch wzmacniaczy innego producenta. Ostatecznie udało nam się uzyskać stabilne nagrania tylko za pierwszym podejściem, po wielu próbach i błędach. Niniejsza publikacja opisuje i demonstruje stosowane przez nas procedury ekspresji białek GJ w oocytach Xenopus, rejestrowania Ij w trybie pomiaru prądu po stronie wysokiej oraz analizy danych elektrofizjologicznych za pomocą popularnego oprogramowania komercyjnego. Dodatkowe informacje na temat techniki podwójnej objętości napięciowej można znaleźć w innych publikacjach19,23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Operacje są wykonywane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami Szkoły Medycznej Uniwersytetu Connecticut.

1. Operacja żaby i przygotowanie odżelazionych oocytów

  1. Znieczulić dorosłą samicę afrykańskiej żaby szponiastej (Xenopus laevis) (Tabela materiałów) poprzez zanurzenie w chłodnym (z lodem) roztworze trykainy (~300 mg/L).
  2. Poczekaj (~15 min), aż żaba wykaże niewielką lub żadną reakcję na ściskanie płetwiastych stóp. Połóż żabę na stole operacyjnym brzuchem do góry.
  3. Po podłużnym nacięciu (o długości 8-10 mm) w lewej lub prawej dolnej części brzucha, delikatnie wyciągnij mały kawałek tkanki jajnika za pomocą kleszczy i odetnij tkankę jajnika małymi nożyczkami.
  4. Natychmiast zanurz wolną tkankę jajnika w roztworze ND96 wolnym od Ca2+ (NaCl 99 mM, KCl 2 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) wewnątrz 60-milimetrowej szalki Petriego.
  5. Po zamknięciu nacięcia za pomocą prostych szwów przerywanych za pomocą jedwabnego szwu 5-0 (Tabela materiałów), umieść żabę z powrotem w płytkim zbiorniku wodnym w celu odzyskania zdrowia.
    UWAGA: Nacięcie zamyka się w dwóch etapach: najpierw warstwa otrzewnej i mięśniowej, a następnie warstwa skórna. Każda żaba poddawana jest 5 operacjom z zachowaniem co najmniej 4-tygodniowej przerwy między dwiema kolejnymi operacjami.
  6. Przenieść izolowaną tkankę jajnika do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml roztworu ND96 wolnego od Ca2+ z 20 mg kolagenazy (tabela materiałów) i 20 mg hialuronidazy (tabela materiałów).
  7. Potrząśnij probówką na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej (RT), aż wszystkie oocyty zostaną odizolowane (pojedyncze).
  8. Następnie przenieś 30-50 oocytów na szalkę Petriego za pomocą szklanej pipety Pasteura i często badaj oocyty pod mikroskopem stereoskopowym (≥25x największa moc powiększenia), aby ustalić, czy są one zdefolikulowane.
    UWAGA: Pipetę Pasteura należy "przyciąć" do szerszego otworu końcówki za pomocą rysika diamentowego (Tabela materiałów) i podpalić w celu wygładzenia krawędzi tnącej.
  9. Gdy tylko 70%-80% oocytów zostanie zdeflikulowanych, zdekantuj roztwór enzymu, delikatnie przechylając probówkę. Przemyć oocyty 5 razy, napełniając probówkę roztworem ND96 (NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) i dekantując roztwór.
  10. Po ostatnim płukaniu przenieś oocyty na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą roztwór ND96. Pobrać i przenieść duże i zdrowo wyglądające oocyty na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą roztwór ND96 uzupełniony pirogronianem sodu (2 mM) i penicyliną-streptomycyną (100 U/ml) za pomocą pipety Pasteura z czystej szklanki.
    UWAGA: "duże i zdrowo wyglądające oocyty" to te w stadium V i VI, które nie wykazują oznak nadmiernego trawienia przez enzymy.
  11. Umieścić szalkę Petriego zawierającą pobrane oocyty w komorze środowiskowej (15-18 °C).

2. Ekspresja białka GJ

  1. Zsyntetyzuj komplementarne RNA (cRNA) określonego połączenia lub inneksyny in vitro przy użyciu zestawu do transkrypcji RNA (tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta.
  2. Wytrącić cRNA za pomocą metody chlorku litu opisanej w instrukcji obsługi zestawu do transkrypcji RNA.
  3. Przemyć osad 70% etanolem, rozpuścić go w 20 μl H2Owolnego od nukleaz i dodać 1 μl inhibitora rybonukleazy (40 U, tabela materiałów).
  4. Zmierz stężenie cRNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów).
  5. Wymieszaj cRNA z oligo antysensownym Cx38 tak, aby końcowe stężenia wynosiły 200-1,000 ng/μL cRNA i 100 ng/μL oligo.
    UWAGA: Sekwencja oligo to 5′-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3′, co odpowiada nukleotydom od -5 do +25 w mRNA Xenopus laevis Cx38 (Akcesja NCBI: NM_001088018)11. Oligo jest przechowywany jako roztwór podstawowy (2,0 mg/ml) przed zmieszaniem z cRNA.
  6. Wyeliminuj cząstki w cRNA, wirując w mikrowirówce (~16 000 x g) przez 2 minuty i szybko przenieś cały supernatant do nowej probówki przez pipetowanie (unikaj naruszania dna probówki mikrowirówki).
  7. Podzielić cRNA na porcje (2,5 μl/fiolkę) i przechowywać podwielokrotności w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
  8. Przygotuj naczynie do wstrzykiwania oocytów, przyklejając mały kawałek (~1 cm x 1 cm) siatki nylonowej (Tabela materiałów) do dna szalki Petriego o średnicy 35 mm za pomocą szybkoutwardzalnego kleju epoksydowego.
    UWAGA: Naczynie do wstrzykiwania oocytów jest wielokrotnego użytku. Po każdym użyciu umyj go 70% etanolem.
  9. Napełnij naczynie do wstrzykiwań oocytów mniej więcej do połowy roztworem ND96 (uzupełnionym pirogronianem i penicyliną-streptomycyną).
  10. Umieść 25-30 oocytów w rzędach wewnątrz szalki Petriego.
  11. Przygotować szklane mikropipety do wstrzykiwań do oocytów, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi automatycznego wstrzykiwacza nanolitrowego (tabela materiałów).
    UWAGA: Użycie ukosownika mikroelektrod (tabela materiałów) może pomóc w wytwarzaniu ostrych mikropipet iniekcyjnych, które powodują minimalne uszkodzenia oocytów.
  12. Napełnij mikropipetę iniekcyjną lekkim olejem mineralnym i włóż ją do uchwytu mikropipety wtryskiwacza.
  13. Przenieść cRNA z jednej z przechowywanych podwielokrotności na wewnętrzną powierzchnię pokrywy lub dna szalki Petriego za pomocą pipetowania.
  14. Zassać kroplę cRNA do końcówki mikropipety, naciskając przycisk FILL w sterowniku wtryskiwacza.
  15. Wstrzyknij cRNA (~50 nL/oocyt), naciskając przycisk INJECT.
    UWAGA: Objętość wtrysku można ustawić za pomocą przełączników DIP w sterowniku wtryskiwacza.
  16. Przenieś wstrzyknięte oocyty na nową szalkę Petriego zawierającą roztwór ND96 (uzupełniony pirogronianem i penicyliną-streptomycyną) i trzymaj je w komorze środowiskowej (15-18 °C) przez 1-3 dni (w zależności od szybkości i poziomu ekspresji białka GJ). Roztwór należy wymieniać codziennie, przenosząc oocyty na nową szalkę Petriego.

3. Parowanie oocytów

  1. Przenieś kilka wstrzykniętych oocytów na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą roztwór ND96.
  2. Użyj dwóch cienkich pęset (tabela materiałów), aby delikatnie odkleić przezroczystą błonę witelinową, która owija oocyt.
    UWAGA: Może być konieczne naostrzenie końcówek pęsety przed pierwszym użyciem i od czasu do czasu za pomocą kawałka drobnego (ziarnistość 600) papieru ściernego.
  3. Umieść 2 oocyty na studzienkę w komorze parowania oocytów (Ryc. 1D) zawierającej roztwór ND96 (uzupełniony pirogronianem i penicyliną-streptomycyną).
    UWAGA: Komora parowania oocytów jest skonstruowana poprzez przyklejenie małego kawałka minitacki Microwell (Tabela materiałów) do dna 35-milimetrowej szalki Petriego (Tabela materiałów) za pomocą szybkoutwardzalnego kleju epoksydowego. Minitray jest cięty na małe kawałki za pomocą gorącego przecinaka do drutu (tabela materiałów). Użycie Minitray do parowania oocytów zostało pierwotnie opisane przez others24. Chociaż białko GJ może rozkładać się nierównomiernie w błonie komórkowej oocytu w zależności od właściwości ładunku reszt aminokwasowych w jego domenach cytozolowych25, losowe parowanie (bez rozróżniania między zwierzęcymi i roślinnymi biegunami oocytu) wydaje się być ogólnie wystarczające.
  4. Przechowywać szalkę Petriego zawierającą sparowane oocyty w temperaturze pokojowej na stole izolacyjnym, który ma być wykorzystany do zapisów elektrofizjologicznych.
    UWAGA: Czas parowania może wynosić od kilku godzin do jednego dnia. Wygodną praktyką jest łączenie oocytów w pary późnym popołudniem i nagrywanie z nich następnego dnia.

4. Przygotowanie systemu akwizycji

  1. Skonfiguruj dwa wzmacniacze cęgów oocytów OC-725C (tabela materiałów) do trybu pomiaru prądu po stronie wysokiej, regulując wewnętrzny przełącznik DIP (Rysunek 1B).
  2. Uziemić wzmacniacze, najpierw łącząc gniazda obwodu uziemiającego na tylnych panelach, a następnie podłączając je do klatki Faradaya i światłowodu używanego do oświetlania komory nagrywania.
  3. Podłącz wzmacniacze do przetwornika sygnału analogowo-cyfrowego (Tabela materiałów) i skonfiguruj je w module Clampex oprogramowania pClamp (Tabela materiałów) postępując zgodnie z instrukcją producenta wzmacniacza.
  4. Przetestuj system akwizycji za pomocą ogniwa modelowego dostarczonego ze wzmacniaczem.
    1. Podłącz sondę VDIFF i prądowe (I) do ogniwa modelu, podłącz czerwone i czarne gniazda w sondzie VDIFF za pomocą dołączonej zworki, podłącz dowolną nogę zworki do dowolnego pinu w komórce modelu i podłącz przewód uziemiający w komórce modelu do z gniazda OBWÓD UZIEMIENIA amplifier (Rysunek 1E).
    2. Wyzeruj mierniki elektrody napięciowej (Vm) i elektrody kąpielowej (Im) amplifier, obracając odpowiednio pokrętła Vm OFFSET i Ve OFFSET, przełącz Clamp z OFF na Szybki lub WOLNY i przekręć pokrętło GAIN zgodnie z ruchem wskazówek zegara do poziomu, który pozwala na prawidłowe napięcie clamp (Rysunek 1A). Przełącznik D.C. GAIN może znajdować się w pozycji OUT lub IN.
    3. Uruchom prosty protokół akwizycji zawierający kilka kroków napięcia, aby potwierdzić, że napięcie wyświetlane w mierniku Vm zmienia się zgodnie z protokołem akwizycji oraz że ślady napięcia i prądu są prawidłowo wyświetlane w Clampex.
      UWAGA: Tylko jeden amplifier może być testowany za każdym razem przy użyciu tego podejścia.

5. Zapis Ij pomiędzy sparowanymi oocytami

  1. Utwórz protokoły akwizycji do nagrywania Ij w oprogramowaniu pClamp.
    UWAGA: Utwórz dwa protokoły akwizycji. W jednym z nich wzmacniacz #1 służy do wytwarzania szeregu kroków napięcia membranowego (Vm) (np. -150 do +90 mV w odstępach 10 mV), podczas gdy wzmacniacz #2 służy do utrzymania stałego Vm (np. -30 mV). W drugim protokole wzmacniacz #2 jest używany do wytwarzania kroków Vm, podczas gdy wzmacniacz # 1 służy do utrzymywania stałego Vm. Dodatnie i ujemne kroki Vm powinny być stosowane naprzemiennie (np. -150, +90, -140, +80 ......), które można zaprogramować w Clampex za pomocą funkcji Lista użytkowników w protokole akwizycji.
  2. Ustawianie etapu nagrywania
    1. Wrzuć jedną szalkę Petriego zawierającą sparowane oocyty do pojemnika na szalkę Petriego na platformie rejestrującej (Rysunek 2A)
    2. Wybierz parę oocytów i w razie potrzeby obróć szalkę Petriego, tak aby dwa oocyty były w lewym i prawym kierunku, a następnie zablokuj stolik w odpowiedniej pozycji za pomocą podstawy magnetycznej.
    3. Zamocuj stojaki magnetyczne przytrzymujące sondy prądu i napięcia w odpowiednich miejscach na stole izolacyjnym.
      UWAGA: Upewnij się, że sondy prądu i napięcia z jednego wzmacniacza znajdują się po lewej stronie, podczas gdy te z drugiego wzmacniacza znajdują się po prawej stronie, a sonda napięcia znajduje się przed sondą prądową z każdej strony (Rysunek 2B, C).
  3. Ustaw elektrodę odniesienia
    1. Umieść elektrodę odniesienia (Tabela Materiałów) w pobliżu krawędzi szalki Petriego w kierunku strony użytkownika (Rysunek 2B, C).
    2. Podłącz elektrodę odniesienia do czarnego gniazda (uziemienie obwodu) tylko w jednej z dwóch sond VDIFF.
  4. Ustaw elektrody VDIFF
    1. Wyciągnij parę szklanych mikropipet, odłam kawałek końcówki rysikiem diamentowym (Tabela materiałów) i wygładź krawędź końcówki przez polerowanie ogniowe.
      UWAGA: Rezystancja końcówki powinna być mniejsza niż 150 kΩ (mierzona za pomocą ND96 w pipecie). Zazwyczaj stosuje się mikropipety o rezystancji końcówki 20-150 kΩ.
    2. Trzymaj mikropipetę nad płomieniem palnika alkoholowego, aby wygiąć ją pod gładkim kątem (~130°) w odległości ~1 cm od końcówki.
      UWAGA: Gotowe mikropipety są wielokrotnego użytku. Po każdym użyciu spłucz je wodą.
    3. Całkowicie napełnij szklaną pipetę roztworem ND96, włóż ją do wstępnie napełnionego (z ND96) uchwytu mikroelektrody (tabela materiałów, rysunek 2D) i upewnij się, że w systemie nie ma pęcherzyków powietrza.
    4. Włóż 2-milimetrowy pin uchwytu mikroelektrody do 2-milimetrowego gniazda przewodu połączeniowego elektrody VDIFF (Rysunek 2D).
    5. Zacisnąć nasadkę 2 mm na zacisku magnetycznym (Rysunek 2D) i skieruj końcówkę elektrody VDIFF w stronę jednego z dwóch oocytów (Rysunek 2E).
      UWAGA: Dostosuj położenie i kąt zacisku tak, aby końcówka elektrody znajdowała się bardzo blisko oocytu
    6. Włóż 1-milimetrowy pin przewodu połączeniowego elektrody VDIFF do czerwonego gniazda (wejście VDIFF) w sondzie VDIFF po tej samej stronie.
    7. Przygotuj i podłącz elektrodę VDIFF dla drugiego oocytu i wzmacniacza, postępując zgodnie z podobnymi procedurami.
      UWAGA: Zbliżenie pary oocytów i wszystkich elektrod pokazano na Rysunek 2E.
  5. Ustaw elektrody prądowe i napięciowe
    1. Przygotować elektrody napięciowe i prądowe ze szklanych kapilarn, zasypać je (mniej więcej do połowy) roztworem KCl (KCl 3,0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4 z KOH) i włożyć je do uchwytów elektrod dostarczonych ze wzmacniaczami.
      UWAGA: Elektrody powinny mieć rezystancję ~1 MΩ. Odpowiednie elektrody można uzyskać z rodzaju cienkościennych kapilar szklanych (tabela materiałów) przy użyciu określonego zestawu parametrów ciągnięcia (tabela 1). Takie końcówki mogą z łatwością przeniknąć przez błonę komórkową oocytu bez konieczności naciskania przycisku Vm lub Ve BUZZ na wzmacniaczu.
    2. Opuść elektrody do roztworu kąpieli, wyzeruj Vm i Im mierniki, obracając pokrętła Vm OFFSET i Ve OFFSET i sprawdź rezystancję elektrody, naciskając Vm Electrode Test i Ve Electrode Test.
    3. Włóż elektrody prądowe i napięciowe do oocytów i obserwuj ujemne potencjały błonowe (zwykle od -20 do -50 mV).
      UWAGA: Mierniki Vm i Im tego samego wzmacniacza powinny wyświetlać dwie identyczne lub bardzo podobne wartości.
  6. Akwizycja danych
    1. W sekcji Clamp amplifier, upewnij się, że D.C. GAIN jest w pozycji IN, przekręć pokrętło GAIN zgodnie z ruchem wskazówek zegara do poziomu, który pozwala na prawidłowe napięcie clamp (zwykle jedna trzecia do połowy pełnego zakresu) i przekręć przełącznik Clamp z OFF na FAST.
      UWAGA: Po włączeniu cęgów mierniki Vm i Im będą wyświetlać odpowiednio napięcie podtrzymania i prąd podtrzymania. Chociaż prąd utrzymywania może się nieco różnić w zależności od warunków panujących w oocytach, jest on na ogół mały i stabilny w miejscu utrzymywania Vm (np. -30 mV).
    2. Uruchom protokół pozyskiwania.
      UWAGA: Na ekranie zostaną wyświetlone cztery ślady. Ślady napięcia i prądu z jednego wzmacniacza wskazują kroki Vm przyłożone do oocytu #1 i prąd potrzebny do wytworzenia kroków Vm, podczas gdy te z drugiego wzmacniacza wskazują stałe Vm (-30 mV) oocytu #2 oraz prąd wstrzyknięty w celu utrzymania tego stałego Vm. Prąd wstrzyknięty do oocytu #2 reprezentuje Ij.

6. Analiza danych

  1. Analiza za pomocą Clampfit.
    1. Otwórz nagrany plik abf w module Clampfit programu pClamp.
    2. Użyj kursorów 1 i 2, aby objąć segment linii bazowej przed śladami Ij.
    3. Kliknij ikonę Dostosuj linię bazową, aby wyświetlić okno linii bazowej. Wybierz opcję Odejmij średnią z kursorów 1..2 dla opcji Metoda i upewnij się, że wszystkie widoczne sygnały i Wszystkie widoczne ślady są wybrane dla opcji Wybór śledzenia.
    4. Po kliknięciu OK okno Linia bazowa zostanie zamknięte, linie bazowe wszystkich ścieżek prądu i napięcia zbiegają się na poziomie zerowym. Należy pamiętać, że kroki napięcia zmieniają się na nowe poziomy, które są równe pierwotnemu napięciu pomniejszonemu o napięcie podtrzymania (np. -30 mV).
    5. Aby wykreślić relację Ij i Vj przy użyciu stanu ustalonego Ij, umieść żądany segment śladów Ij reprezentujących stan ustalony Ij za pomocą kursorów 1 i 2, umieść kursor 3 w dowolnym miejscu w oknie czasowym kroków napięcia.
    6. Przejdź do Analizuj/Szybki wykres/ I-V, aby otworzyć okno I-V.
    7. W obszarze Oś X (napięcie) wybierz Kursor 3 z Sygnału, określ sygnał kroku napięcia (np. Napięcie 1) w menu rozwijanym i zaznacz pole Odwróć.
      UWAGA: Pole Odwróć jest zaznaczone, aby przekonwertować Vm na wartości równoważne Vj, które są zdefiniowane jako Vm oocytu #2-V m oocytu #1.
    8. W obszarze Oś Y (bieżąca) wybierz źródło sygnału Ij (np. Prąd 0) z menu rozwijanego obok opcji Sygnał, zdefiniuj Region jako Kursory 1..2 z menu rozwijanego i wybierz opcję Średnia.
      UWAGA: Aby wykreślić relacje piku Ij i Vj, kursory 1 i 2 powinny objąć segment śladów Ij zawierających pik Ij w kroku 6.1.5 i wybrać Szczyt (zamiast średniej) w kroku 6.1.8.
    9. W obszarze Opcja docelowa wybierz opcję Zamień lub Dołącz.
    10. Po kliknięciu przycisku OK w oknie I-V na ekranie wyświetlana jest zależność Ij - Vj, a odpowiednie wartości Ij i Vj można znaleźć, klikając Okno/Wynik.
  2. Wykreśl i dopasuj relację G, j-V, j w OriginPro (tabela materiałów)
    1. Skopiuj dwie kolumny zawierające wartości Vj i I j z okna Wyniki Clampfit (krok 6.1.10) do nowego skoroszytu w punkcie początkowym. Upewnij się, że wartości Vj i Ij znajdują się odpowiednio w kolumnach X i Y.
    2. Dodaj cztery nowe kolumny w skoroszycie, klikając pozycję Kolumna/ Dodaj nowe kolumny.
    3. Nazwij pierwszą nową kolumnę jako Gj, wypełnij ją, wprowadzając równanie "kolumna Ij/kolumna Vj * 1 000" w oknie Ustawianie wartości kolumny i utwórz wykres punktowy relacji Gj-V j.
      UWAGA: Mnożenie przez 1,000 (opcjonalnie) ma na celu uniknięcie niedogodności związanych z zajmowaniem się bardzo małymi liczbami w kolejnych krokach.
    4. Dopasuj punkty danych Gj do ujemnych i dodatnich zakresów Vj niezależnie od funkcji Boltzmanna. Oblicz Gj przy Vj = 0 mV, wprowadzając wartości Gjmax, Gjmin, A i V0 z dopasowania do równania Boltzmanna, co można zrobić w arkuszu kalkulacyjnym. Otrzymane w ten sposób Gj zostanie użyte jako Gjmax w następnym kroku.
      UWAGA: Równanie pasujące do funkcji Boltzmanna to: Gj = (Gjmax-G jmin)/{1 + exp[A(Vj-V 0)]} + Gjmin, w którym V0 to Vj, przy którym przewodność jest w połowie maksymalna, Gjmax jest maksymalną przewodnością, Gjmin jest V j-niewrażliwą przewodnością szczątkową23. Aby wykonać dopasowanie, najpierw dodaj równanie Boltzmanna jako nową funkcję dopasowania do OriginPro, a następnie wybierz tę funkcję do dopasowania. Wprowadź przybliżone wartości początkowe dla Gjmax, Gjmin, V0 i A przed wykonaniem funkcji dopasowania. Upewnij się, że parametr Gjmax nie jest ustalony dla tego złącza.
    5. Nazwij drugą i trzecią nową kolumnę jako nGj-L i nGj-R ("n" dla "znormalizowane") i wypełnij je, dzieląc kolumnę Gj przez wartości Gjmax pochodzące odpowiednio z lewej i prawej krzywej Gj - Vj (krok 6.2.4).
    6. Nazwij czwartą nową kolumnę jako nGj-LR i wypełnij ją, kopiując wartości z ujemnych i dodatnich zakresów Vj odpowiednio kolumn nGj-L i nGj-R.
    7. Utwórz wykres punktowy dla nGj-LR nad Vj i dopasuj punkty danych nad ujemnymi i dodatnimi zakresami Vj do funkcji Boltzmanna niezależnie. Upewnij się, że parametr Gjmax jest ustalony na 1,0 dla złączki.
    8. Zapisuj wyniki dopasowania (np. wykres dopasowania oraz wartości Gjmin, V0 i A).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UNC-7 i UNC-9 to innexiny C. elegans. Podczas gdy UNC-9 ma tylko jedną izoformę, UNC-7 ma wiele izoform, które różnią się głównie długością i sekwencją aminokwasów swoich końców aminowych7,8. Te inneksyny mogą tworzyć zarówno homotypowe, jak i heterotypowe (UNC-7 i UNC-9) GJ, gdy ulegają ekspresji w oocytach Xenopus 7,8. Reprezentatywne ślady Ij i wynikające z nich zn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optymalizacja systemu wydaje się być konieczna w przypadku eksperymentów z podwójnym zaciskiem napięcia oocytów. Bez niego nagrania mogą być bardzo niestabilne, a wzmacniacze mogą być zmuszone do wstrzyknięcia nadmiernej ilości prądu, aby dotrzeć do docelowej Vm, co skutkuje uszkodzeniem oocytów i awariami nagrywania. Kilka czynników ma kluczowe znaczenie dla uzyskania stabilnych zapisów podwójnych oocytów za pomocą metody pomiaru prądu po stronie wysokiej. Po pierwsze, elektrody prądowe i napięciowe muszą mieć ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Haiying Zhan, Qian Ge za ich zaangażowanie w początkowy etap rozwoju technicznego, Kiranmayi Vedantham za pomoc przy tworzeniu figur, oraz dr Camillo Peracchia za porady dotyczące komory parowania oocytów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Uchwyt magnetyczny Agar BridgeALA Scientific InstrumentsMPSALT-HBardziej stabilny niż zacisk rurki Narishige ze względu na większą podstawę magnetyczną, ale wymaga modyfikacji w celu dostosowania do gniazda żeńskiego 2 mm.
Auto Nanolitr InjectorDrummond Scientific Company, Broomall, PA, USANanoject IIAutomatyczny wstrzykiwacz nanolitrów
Kolagenaza, typ IIGibco-USA, Langley, OK, USA17101-015
Diamond ScriberElectron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA62108-ST
Sonda różnicowa napięciaWarner Instruments, Hamden, CT, USA7255DI
Przetwornik sygnału analogowo-cyfrowegoUrządzenia molekularne, San Jose, CA, USAPęseta Digidata 1440A
Dumont #5World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA500341
Szklane kapilaryDrummond Scientific Company, Broomall, PA, USA3-000-203-G/X
Przecinak do gorącego drutuAmazon.comProxxon 37080Alternatywą jest Hercules 8500 CWUT, który posiada pedał nożny.
Hialuronidaza, typ I-SMilliporeSigma, Burlington, MA, USAH3506
Magnetyczna podstawa uchwytuKanetec USA Corp., Bensenville, IL, USAMB-L-45
Mikroelektroda BevelerSutter Instrument, Novato, CA, USABV-10
Uchwyt mikroelektrodyWorld Precision Instruments, , Sarasota, FL, USAMEH1S15
Ściągacz do mikropipetSutter Instrument, , Novato, Kalifornia, USAP-97
mMESSAGE mMACHINETM T3Invitrogen-FisherScientificAM1348
Nunc MicroWell MiniTrayNalge Nunc International, Rochester, NY, USA438733Microwell Minitray
Nylon MeshComponent Supply Company, Sparta, TN, USAU-CMN-1000
Wzmacniacz cęgowy oocytówWarner Instrumenty, , Hamden, CT, USAOC-725C
OriginProOriginLab Corporation, Northampton, MA, USA2020b
pClampMolecular Devices, , San Jose, CA, USAWersja 10
Elektroda referencyjnaWorld Precision Instruments, Sarasota, FL, USADRIREF-2SHDane techniczne: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT (inhibitor rybonukleazy)Invitrogen-FisherScientific10777-019
Jedwabny szew 5-0Covidien, North Haven, CT, USAVS890
NanoDrop LiteThermo ScientificND-LITE-PR
Cienkościenne szklane kapiszonyPrecision Instruments, Sarasota, FL, USAZacisk
Narishige International USA, Amityville, NY, USACAT-1Gotowy do użycia, ale jego pozycja jest podatna na zmiany ze względu na małą podstawę magnetyczną.
Xenopus laevisXenopus Express, Brooksville, Floryda, Stany ZjednoczoneIMP-XL-FM
Spektrofotometr World do rur TW150F-4

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
  2. Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A resolution. Nature. 458 (7238), 597-602 (2009).
  3. Flores, J. A., et al. Connexin-46/50 in a dynamic lipid environment resolved by CryoEM at 1.9 A. Nature Communications. 11 (1), 4331(2020).
  4. Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
  5. Starich, T., Sheehan, M., Jadrich, J., Shaw, J. Innexins in C. elegans. Cell Communication & Adhesion. 8 (4-6), 311-314 (2001).
  6. Phelan, P. Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1711 (2), 225-245 (2005).
  7. Shui, Y., Liu, P., Zhan, H., Chen, B., Wang, Z. W. Molecular basis of junctional current rectification at an electrical synapse. Science Advances. 6 (27), (2020).
  8. Starich, T. A., Xu, J., Skerrett, I. M., Nicholson, B. J., Shaw, J. E. Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system. Neural Development. 4, 16(2009).
  9. Chen, B., Liu, Q., Ge, Q., Xie, J., Wang, Z. W. UNC-1 regulates gap junctions important to locomotion in C. elegans. Current Biology. 17 (15), 1334-1339 (2007).
  10. Jang, H., et al. Dissection of neuronal gap junction circuits that regulate social behavior in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1263-1272 (2017).
  11. Ebihara, L., Beyer, E. C., Swenson, K. I., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Cloning and expression of a Xenopus embryonic gap junction protein. Science. 243 (4895), 1194-1195 (1989).
  12. Barrio, L. C., et al. Gap junctions formed by connexins 26 and 32 alone and in combination are differently affected by applied voltage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8410-8414 (1991).
  13. Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Voltage dependence of junctional conductance in early amphibian embryos. Science. 204 (4391), 432-434 (1979).
  14. Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Equilibrium properties of a voltage-dependent junctional conductance. The Journal of General Physiology. 77 (1), 77-93 (1981).
  15. Qu, Y., Dahl, G. Function of the voltage gate of gap junction channels: selective exclusion of molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (2), 697-702 (2002).
  16. Swenson, K. I., Jordan, J. R., Beyer, E. C., Paul, D. L. Formation of gap junctions by expression of connexins in Xenopus oocyte pairs. Cell. 57 (1), 145-155 (1989).
  17. Tong, J. J., Liu, X., Dong, L., Ebihara, L. Exchange of gating properties between rat cx46 and chicken cx45.6. Biophysical Journal. 87 (4), 2397-2406 (2004).
  18. Landesman, Y., White, T. W., Starich, T. A., Shaw, J. E., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Innexin-3 forms connexin-like intercellular channels. Journal of Cell Science. 112, 2391-2396 (1999).
  19. Skerrett, I. M., et al. Applying the Xenopus oocyte expression system to the analysis of gap junction proteins. Methods in Molecular Biology. 154, 225-249 (2001).
  20. Nielsen, P. A., Beahm, D. L., Giepmans, B. N., Baruch, A., Hall, J. E., Kumar, N. M. Molecular cloning, functional expression, and tissue distribution of a novel human gap junction-forming protein, connexin-31.9. Interaction with zona occludens protein-1. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38272-38283 (2002).
  21. Kotsias, B. A., Salim, M., Peracchia, L. L., Peracchia, C. Interplay between cystic fibrosis transmembrane regulator and gap junction channels made of connexins 45, 40, 32 and 50 expressed in oocytes. The Journal of Membrane Biology. 214 (1), 1-8 (2006).
  22. Peracchia, C., Peracchia, L. L. Inversion of both gating polarity and CO2 sensitivity of voltage gating with D3N mutation of Cx50. American Journal of Physiology. 288 (6), 1381-1389 (2005).
  23. del Corsso, C., et al. Transfection of mammalian cells with connexins and measurement of voltage sensitivity of their gap junctions. Nature Protocols. 1 (4), 1799-1809 (2006).
  24. Peracchia, C., Wang, X. G., Peracchia, L. L. Chemical gating of gap junction channels. Methods. 20 (2), 188-195 (2000).
  25. Levine, E., Werner, R., Neuhaus, I., Dahl, G. Asymmetry of gap junction formation along the animal-vegetal axis of Xenopus oocytes. Developmental Biology. 156 (2), 490-499 (1993).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Podw jny zacisk napi ciowyekspresja koneksynekspresja inneksynprzewodnictwo po czenioweelektroda r nicy potencja wparowanie oocyt wszklane mikroelektrodypotencja b onowy

Powiązane artykuły