Artykuł metodologiczny

Monitorowanie kinetyki agregacji białek in vivo przy użyciu automatycznego zliczania inkluzji u Caenorhabditis elegans

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63365

⸱

17 grudnia 2021

 ,  ,  , 
1Bijvoet Centre for Biomolecular Research, Utrecht University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentowana jest metoda analizy kinetyki agregacji białek u nicieni Caenorhabditis elegans. Zwierzęta z populacji zsynchronizowanej pod względem wieku są obrazowane w różnych punktach czasowych, a następnie następuje półautomatyczne zliczanie inkluzji w CellProfiler i dopasowywanie do modelu matematycznego w AmyloFit.

Streszczenie

Agregacja białek w nierozpuszczalne inkluzje jest cechą charakterystyczną wielu chorób ludzkich, z których wiele jest związanych z wiekiem. Nicień Caenorhabditis elegans jest dobrze ugruntowanym organizmem modelowym, który jest szeroko stosowany w tej dziedzinie do badania agregacji i toksyczności białek. Jego przezroczystość optyczna umożliwia bezpośrednią wizualizację agregacji białek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Co więcej, szybki cykl rozrodczy i krótka długość życia sprawiają, że nicienie są odpowiednim modelem do badań przesiewowych genów i cząsteczek, które modulują ten proces.

Jednak kwantyfikacja łącznego obciążenia u żywych zwierząt jest słabo ustandaryzowana, zazwyczaj wykonywana przez ręczne liczenie inkluzji pod mikroskopem fluorescencyjnym w jednym punkcie czasowym. Takie podejście może skutkować dużą zmiennością między obserwatorami i ogranicza zrozumienie procesu agregacji. W przeciwieństwie do tego, agregacja białek podobnych do amyloidu in vitro jest rutynowo monitorowana przez fluorescencję tioflawiny T w sposób wysoce ilościowy i rozdzielczy w czasie.

Tutaj przedstawiono analogiczną metodę bezstronnej analizy kinetyki agregacji u żyjących C. elegans, przy użyciu wysokoprzepustowego mikroskopu konfokalnego w połączeniu z niestandardową analizą obrazu i dopasowaniem danych. Przydatność tej metody wykazano poprzez monitorowanie tworzenia się inkluzji znakowanego fluorescencyjnie białka poliglutaminy (polyQ) w komórkach mięśniowych ściany ciała. Proces analizy obrazu pozwala na określenie liczby inkluzji w różnych punktach czasowych, które są dopasowane do modelu matematycznego opartego na niezależnych zdarzeniach zarodkowania w poszczególnych komórkach mięśniowych. Opisana tutaj metoda może okazać się przydatna do oceny wpływu czynników proteostazy i potencjalnych terapii chorób agregacji białek u żywego zwierzęcia w solidny i ilościowy sposób.

Wprowadzenie

Nagromadzenie nieprawidłowo sfałdowanych białek w nierozpuszczalne osady występuje w szerokim zakresie chorób. Dobrze znanymi przykładami są agregacja amyloidu-β i tau w chorobie Alzheimera, α-synukleiny w chorobie Parkinsona oraz huntingtyny ze spienionym poliQ w chorobie Huntingtona1,2. Nieprawidłowe fałdowanie tych polipeptydów w włókienka amyloidowe wiąże się z toksycznością i śmiercią komórek przez mechanizmy, które są nadal w dużej mierze niejasne. Wyjaśnienie mechanizmów powstawania amyloidu będzie miało kluczowe znaczenie dla opracowania skutecznych terapii, które są obecnie niedostępne.

Szczegółowe badania nad powstawaniem amyloidu zostały przeprowadzone in vitro na podstawie pomiarów fluorescencji tioflawiny T, co doprowadziło do mechanistycznego zrozumienia procesu agregacji i wpływu cząsteczek hamujących3,4,5. Nie jest jednak jasne, czy te same mechanizmy agregacji są prawdziwe w złożonym środowisku żywych komórek i organizmów. Nicień Caenorhabditis elegans jest odpowiednim organizmem modelowym do badania agregacji białek in vivo. Ma stosunkowo prostą anatomię, ale składa się z wielu tkanek, w tym mięśni, jelit i układu nerwowego. Jest dobrze scharakteryzowany genetycznie, a narzędzia do modyfikacji genetycznej są łatwo dostępne. Ponadto ma krótki czas generowania wynoszący ~3 dni i całkowitą żywotność 2-3 tygodnie. W związku z tym agregacja białek może być badana przez całe życie zwierzęcia w dogodnej dla doświadczenia skali czasowej. Wreszcie, nicienie są optycznie przezroczyste, co umożliwia śledzenie agregacji białek znakowanych fluorescencyjnie u żywych zwierząt.

Te cechy C. elegans były wcześniej wykorzystywane do badania agregacji białek polyQ jako modelu dla choroby Huntingtona i innych chorób związanych z ekspansją polyQ. Powyżej progu patogennego 35-40 reszt glutaminy, można zaobserwować, że białka polyQ znakowane żółtym białkiem fluorescencyjnym (YFP) tworzą nierozpuszczalne inkluzje w tkance mięśniowej6,7, neurons8, oraz intestine9,10. Cechy te są szeroko stosowane do badań przesiewowych genów11,12,13 i modyfikatorów małocząsteczkowych14 agregacji i toksyczności białek.

C. elegans ma potencjał, aby odegrać ważną rolę w wypełnianiu luki między badaniami in vitro agregacji białek a bardziej złożonymi modelami chorób, takimi jak myszy15. C. elegans jest podatny na badania przesiewowe leków16, ale może być również wykorzystany do uzyskania podstawowego zrozumienia molekularnych mechanizmów agregacji białek in vivo, jak wykazano niedawno17. Jednak w przypadku obu zastosowań niezwykle ważne jest wyodrębnienie ilościowej i powtarzalnej miary agregacji białek. W tym przypadku osiąga się to za pomocą wysokoprzepustowego mikroskopu konfokalnego w połączeniu z dedykowanym potokiem analizy obrazu (Rysunek 1).

Protokół

1. Wzrost populacji C. elegans zsynchronizowanej z wiekiem

  1. Szczepy C. elegans należy utrzymywać na płytkach pożywki dla nicieni (NGM) wysianych Escherichia coli OP50 w temperaturze 20 °C zgodnie ze standardowymi procedurami18.
  2. Wykonaj zsynchronizowane składanie jaj, umieszczając 10 dorosłych nicieni na 6-centymetrowej płytce NGM z nasionami za pomocą platynowego kilofa. Pozostaw dorosłe osobniki do złożenia jaj na ~2 godziny w temperaturze 20 °C przed ich usunięciem. Przygotuj 1-4 płytki na szczep, w zależności od płodności szczepu i liczby punktów czasowych, które należy pobrać.
  3. Umieścić płytki z jajami w inkubatorze w temperaturze 20 °C. Monitorować rozwój zwierząt aż do osiągnięcia przez nie dorosłości.
    UWAGA: Dzień, w którym zwierzęta osiągnęły dorosłość, jest tutaj zdefiniowany jako dzień 1. Zazwyczaj jest to trzy dni po złożeniu jaj.
  4. Począwszy od 1 dnia, codziennie przenoś zwierzęta na nowe płytki NGM, aby oddzielić je od potomstwa. Aby zrekompensować zwierzęta, które padły lub zostały utracone podczas przenoszenia, przenieś ~40 zwierząt na szczep razy liczbę punktów do zobrazowania (patrz krok 2). Kontynuuj, aż zwierzęta przestaną składać zapłodnione jaja (~ dzień 6 dorosłego życia).
    UWAGA: Wykluczyć zwierzęta z workami lub innymi fenotypami rozwojowymi. Bagging jest powszechnie obserwowany w szczepach eksprymujących białka podatne na agregację.

2. Przygotowanie próbki C. elegans w płytce wielodołkowej

UWAGA: Ponieważ procedura obrazowania wymaga środków znieczulających, które ostatecznie zabiją zwierzęta, te same zwierzęta nie mogą być ponownie użyte w kolejnych punktach czasowych. Zamiast tego różne zwierzęta z tej samej partii zsynchronizowanej pod względem wieku są obrazowane w różnych dniach. Mimo że większość szczepów będzie miała niewiele inkluzji w dniu 1, zaleca się uwzględnienie tego punktu czasowego jako punktu odniesienia.

  1. Przygotować płytkę 384-dołkową, wypełniając wymaganą liczbę studzienek 100 μl buforu M9 uzupełnionego 25 mM NaN3 jako środkiem znieczulającym. Napełnij jedną studzienkę na szczep, który ma być zobrazowany.
    UWAGA: Azydek sodu (NaN3) jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
  2. Dla każdej odmiany przenieś 20 zwierząt do jednego dołka za pomocą kilofa do robaków platynowych.
    UWAGA: Robaki należy umieścić na zewnątrz trawnika bakteryjnego przed umieszczeniem ich w studni. Bakterie sprawiają, że zwierzęta przylegają do wytrycha, co może zapobiec ich uwolnieniu i zmącić zawartość studzienki. Ogólnie rzecz biorąc, 20 to optymalna liczba zwierząt na studzienkę, aby zapobiec nakładaniu się robaków, jednocześnie ograniczając niepotrzebne obrazowanie pustej przestrzeni studni.
  3. Przykryj płytkę pokrywką, aby zapobiec parowaniu, i zobrazuj płytkę w ciągu 1 godziny po przygotowaniu.
  4. Kroki 2.1-2.3 należy powtarzać codziennie, aż do osiągnięcia stałego stabilu w liczbie inkluzji lub do momentu, gdy większość zwierząt padnie. Przygotowanie próbki i obrazowanie należy wykonywać o tej samej porze każdego dnia, aby zapewnić odstępy 24 godzin.

3. Akwizycja obrazu za pomocą wysokoprzepustowego mikroskopu konfokalnego

UWAGA: Ten eksperyment można również przeprowadzić na zwykłym mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem z uchwytem na płytkę wielodołkową. Kamera o dużym polu widzenia jest korzystna w ograniczaniu liczby kafelków, które muszą być obrazowane, aby objąć całą studnię. Szczegółowe informacje na temat mikroskopu i oprogramowania używanego w tym protokole można znaleźć w Tabeli materiałów.

  1. Włącz instrument i otwórz oprogramowanie.
  2. Uruchom nowy protokół, przechodząc do Ustawienia pomiaru | Nowy. Wybierz odpowiedni typ płytki wielodołkowej i kliknij przycisk Create a New Measurement Setting (Utwórz nowe ustawienie pomiaru).
  3. Skonfiguruj kanał dla fluorescencji, przechodząc do kanału 1. Ustaw obiektyw na 10x. Wybierz 488 nm jako źródło światła i BP525/25 jako filtr emisyjny, aby zobrazować YFP. Ustaw binowanie na 2x2, aby zmniejszyć rozmiar pliku.
  4. Kliknij Dodaj kanał i wybierz Brightfield jako metodę.
  5. Aby dodać do pomiaru obraz fluorescencji konfokalnej ze stosem z, wybierz opcję Akwizycja fluorescencji 3D w obszarze Lista działań. Przejdź do Select (Wybierz) i wybierz Ch 1. Aby zminimalizować rozmiary plików, ustaw opcję Przetwarzanie obrazu na Maksimum, tak aby zapisywany był maksymalny obraz projekcji, a nie cały stos z.
  6. Kliknij Pozyskiwanie BF/Ph | Wybierz punkt menu | Ch 2 dla kanału jasnego pola.
  7. Kliknij przycisk odtwarzania (poszukaj symbolu trójkąta skierowanego w prawo) obok opcji Rozładuj płytki dołkowe i umieść płytkę 384-dołkową w mikroskopie.
  8. W obszarze Akwizycja fluorescencji 3D kliknij przycisk Test i wybierz studzienkę zawierającą robaki, aby określić optymalną odległość, przy której robaki są prawidłowo wyśrodkowane. Ustaw odległość narastania na 50 μm, odległość malejącą na -50 μm i interwał krojenia na 2 μm, aby uchwycić całą grubość zwierząt w stosie z.
  9. Zoptymalizuj czas ekspozycji, aby uzyskać dobrą intensywność sygnału dla wszystkich czterech szczepów, unikając nasycenia. Użyj tego samego czasu ekspozycji dla wszystkich szczepów i punktów czasowych.
  10. Wybierz studzienki, które mają być obrazowane w obszarze Ustawienia skanowania płytki studziennej. Wybierz Kafelek i zdobądź całą studnię.
  11. Zapisz ustawienie pomiaru i rozpocznij eksperyment, klikając przycisk Rozpocznij pomiar. Dla kolejnych punktów czasowych otwórz to samo ustawienie pomiaru i dostosuj odległość przesunięcia oraz dołki, które mają być obrazowane.

4. Łączenie obrazów kafelkowych w ImageJ

UWAGA: Ten krok jest wymagany tylko w przypadku korzystania z celu większego niż 4x, dla którego obraz każdej studni jest uzyskiwany jako wiele płytek. W tym procesie analizy zszywanie płytek odbywa się za pomocą bezpłatnego oprogramowania FIJI/ImageJ19 (Rysunek 2). W zależności od instrumentu użytego w kroku 3 możliwe może być również wykonanie szycia bezpośrednio w dołączonym oprogramowaniu.

  1. Pobierz FIJI20 i otwórz go.
  2. Przejdź do Wtyczki | Szwy | Siatka/Kolekcja Stitching21.
  3. W wyskakującym okienku, Siatka/Zszywanie kolekcji, wybierz typ i kolejność, w jakiej płytki zostały zebrane. Wybierz Siatka: wiersz po wierszu i Prawo i dół.
  4. W następnym oknie, Zszywanie siatki: Siatka: wiersz po wierszu, W prawo i w dół, wstaw liczbę płytek w kierunkach x i y. W przypadku użytego tutaj celu 10x wybierz 2 jako rozmiar siatki x, 3 jako rozmiar siatki y i 0 jako zakładkę kafelka.
  5. Kliknij przycisk Browse (Przeglądaj) i wybierz folder zawierający obrazy TIFF, które mają zostać zszyte.
  6. Wstaw wspólną nazwę pliku w obszarze Nazwy plików dla kafelków, używając {i} w miejscu numeru kafelka w każdej nazwie pliku.
  7. Odznacz wszystkie pola poniżej.
  8. Uruchom wtyczkę.
  9. Zapisz wynikowe obrazy jako pliki TIFF do analizy w następnym kroku.

5. Automatyczne zliczanie włączeń za pomocą CellProfiler22

  1. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym, CellProfiler23. Pobierz potok InclusionCounting.cpproj z github.com/sinnigelab/aggregate-quantification.
  2. Otwórz program CellProfiler i przeciągnij potok do okna Upuść plik potoku w tym miejscu. Kliknij przycisk Tak, aby załadować projekt.
  3. Kliknij moduł wejściowy Obrazy i przeciągnij zszyte obrazy do okna Upuść pliki i folder tutaj.
  4. Kliknij moduł wprowadzania metadanych. Dostosuj wyrażenie regularne, aby wyodrębnić z nazwy pliku zgodnie z nazwami zszytych obrazów.
  5. Kliknij moduł wejściowy NamesandTypes i dostosuj Wybierz kryteria reguły, aby dopasować kanały w nazwach plików.
    UWAGA: W domyślnych ustawieniach potoku nazwy plików zawierające BF są rozpoznawane jako obrazy w jasnym polu i są nazywane robakami. Nazwy plików zawierające YFP są rozpoznawane jako obrazy fluorescencyjne i noszą nazwę Fluorescencja.
  6. Kliknij Wyświetl ustawienia wyjściowe, aby wybrać domyślny folder, w którym chcesz zapisać dane wyjściowe z CellProfiler.
  7. Kliknij przycisk Uruchom tryb testowy, aby sprawdzić ustawienia potoku przy użyciu pierwszego zestawu danych obrazowania. Kliknij pozycję Uruchom, aby uruchomić wszystkie moduły w potoku, lub krok, aby uruchomić potok po jednym module naraz. Aby dostosować kontury robaka w module EditObjectsManual, kliknij Pomoc, aby wyświetlić instrukcje, a następnie kliknij Gotowe, aby kontynuować uruchamianie potoku.
    UWAGA: Wyodrębnione pomiary nie zostaną wyeksportowane w trybie testowym. Parametry progowe do wykrywania robaków i inkluzji mogą wymagać dostosowania w zależności od zastosowanych szczepów i powiększenia.
  8. Kliknij Wyjdź z trybu testowego i przeanalizuj obrazy.
  9. Otwórz folder wyjściowy, aby wyświetlić pliki wyjściowe. Otwórz obrazy z oryginalną nazwą pliku, po której następują kontury, aby sprawdzić, czy robaki i inkluzje zostały prawidłowo nałożone.
    UWAGA: Liczbę inkluzji na robaka można znaleźć w pliku o nazwie ExpandedWormObjects. Więcej informacji na temat obrazów wejściowych można znaleźć w pliku o nazwie Obraz. Dodatkowe dane wyjściowe można wybrać w module ExportToSpreadsheet w potoku.

6. Globalne dopasowanie danych dotyczących liczby inkluzji za pomocą AmyloFit5

UWAGA: Ten krok może być wykonany tylko wtedy, gdy dostępne są dane dla wielu stężeń białka. Dla Q40-YFP wcześniej stworzono zestaw czterech szczepów o różnych poziomach nadekspresji w komórkach mięśniowych ściany ciała17. W innych przypadkach nowe szczepy powinny być generowane za pomocą mikroiniekcji plazmidu i integracji genomowej24.

  1. Przejdź do bezpłatnej internetowej platformy dopasowania do kinetyki agregacji AmyloFit25. Zarejestruj się lub zaloguj na istniejące konto.
    UWAGA: W celu uzyskania dodatkowej pomocy można uzyskać dostęp do obszernej instrukcji dotyczącej korzystania z AmyloFit. Więcej informacji można znaleźć pod linkiem w lewym górnym rogu strony internetowej (po zalogowaniu).
  2. Aby rozpocząć korzystanie z AmyloFit, nazwij projekt i kliknij Utwórz projekt. Otwórz projekt, klikając Otwórz i utwórz sesję, nadając jej nazwę i klikając Utwórz i załaduj sesję.
  3. Kliknij przycisk Dodaj dane i prześlij plik zawierający średnią liczbę inkluzji na zwierzę, zgodnie z wymaganiami dotyczącymi formatu danych wyświetlanymi w lewym panelu. Kliknij przycisk Załaduj nowe dane.
  4. Pomiń kroki przetwarzania wstępnego, które nie są wymagane w przypadku danych dotyczących liczby włączeń, ustawiając liczbę punktów do uśrednienia dla przesunięcia punktu zerowego i liczbę punktów do uśrednienia dla plateau na 0. Kliknij przycisk Prześlij. Powtórz ten krok dla każdego stężenia białka (tj. każdej kolumny w przesłanym pliku).
  5. Wybierz opcję Niestandardowe w panelu modelu, wprowadź Ncells*(1-exp(-Kcell*m**(n)*(t-1))) w polu równania i kliknij Załaduj model.
    UWAGA: Ponieważ AmyloFit został pierwotnie zaprojektowany do analizy danych kinetycznych z testów in vitro, należy załadować niestandardowy model w celu analizy danych dotyczących liczby inkluzji C. elegans. W użytym tutaj równaniu Nkomórek to liczba komórek, w których zachodzi inkluzja, komórka K to stała szybkość zarodkowania, m to stężenie białka wewnątrzkomórkowego, a n to kolejność zarodkowania reakcji.
  6. Ustaw typy parametrów na Global Const dla Nkomórek, Global fit dla Kcell i n oraz Const dla m. Ustaw wartość Nkomórek na 95 dla komórek mięśniowych ściany ciała i początkowe przypuszczenie dla komórki K i n na 1. Wprowadź wartości m dla różnych odkształceń w lewym panelu.
    UWAGA: Początkowe przypuszczenia nie mają znaczenia dla zastosowanego tutaj stosunkowo prostego modelu. W przypadku bardziej złożonych modeli korzystne jest wprowadzenie oszacowania oczekiwanych wartości w celu skrócenia czasu obliczeń.
  7. Pozostaw liczbę przeskoków w umywalce bez zmian i kliknij przycisk Dopasuj w panelu dopasowania.
  8. Wyodrębnij dopasowanie, klikając Pobierz dane i dopasuj.
    UWAGA: Parametry wyodrębnione przez globalne dopasowanie modelu zostaną wymienione w prawym dolnym rogu. Wykres danych i dopasowania zostanie automatycznie wygenerowany w prawym górnym panelu. Wykres ten można wyodrębnić, klikając przycisk Pobierz plik pdf i dostosować, przechodząc do opcji wyświetlania wykresu. Komórka K ma jednostki stężenia cząsteczek-n czas-1 komórka-1. Aby porównać wartości z różnymi n, komórkę K można przekształcić na szybkość zarodkowania przy danym stężeniu białka, mnożąc ją przez mn.

Wyniki

Metoda opisana w niniejszym materiale (Rysunek 1) została wykorzystana do analizy kinetyki agregacji konstruktu składającego się z 40 glutamin połączonych z YFP (Q40-YFP). Białko to jest ekspresjonowane pod kontrolą promotora unc-54, który kieruje ekspresję do komórek mięśni ściany ciała. Ponieważ są one stosunkowo duże i łatwe do wizualizacji, użycie obiektywu 10x jest wystarczające do rozdzielenia inkluzji tworzonych przez Q40-YFP w tej tkance. Wcześniej opracowano cztery szczepy (linie A-D) wykazujące różny poziom ekspresji białka, aby ocenić zależność agregacji polyQ od stężenia in vivo17.

Populacje linii A-D zsynchronizowane pod względem wieku uzyskano poprzez 2-godzinne składanie jaj, a następnie codzienne przenoszenie osobników po osiągnięciu przez potomstwo wieku dorosłego. Od 1. do 10. dnia wieku dorosłego 20 zwierząt z każdej z czterech linii obrazowano w płytce 384-dołkowej przy użyciu wysokoprzepustowego mikroskopu konfokalnego. Obrazy dołków pozyskiwano w formie 6 kafelków, które następnie łączono za pomocą wtyczki w programie ImageJ21 (Rysunek 2). Połączone obrazy analizowano następnie przy użyciu specjalnie opracowanego rurociągu CellProfiler22 (Rysunek 3), aby określić średnią liczbę inkluzji na zwierzę dla każdej linii i punktu czasowego.

Następnie dane dopasowano do modelu matematycznego w programie AmyloFit5 (Rycina 4). Model opiera się na założeniu, że każda z 95 komórek mięśni ścian ciała niezależnie nabywa jedną inkluzję w wyniku limitującego szybkość zdarzenia nukleacji, po którym następuje szybki wzrost agregatu17. Dopasowanie pozwoliło wyznaczyć stałą szybkości nukleacji wynoszącą 9.9 × 105 molecules M-2.1 d-1 cell-1 oraz rząd reakcji 2.1, co odpowiada szybkości nukleacji 0.38 molecules d-1 cell-1 przy wewnątrzkomórkowym stężeniu białka 1 mM. Dwie niezależne powtórzenia biologiczne pozwoliły uzyskać zbliżone wartości szybkości nukleacji i rzędu reakcji, które są zgodne z poprzednim badaniem przeprowadzonym z użyciem podobnego protokołu17 (Tabela 1).

Proces wzrostu z synchronizacją wieku wraz z akwizycją obrazów, zliczaniem inkluzji i dopasowaniem danych; schemat.
Rysunek 1: Schematyczny przegląd metody. (A) Populacje C. elegans z synchronizacją wieku są generowane poprzez kontrolowane czasowo składanie jaj. (B) Zwierzęta z tej samej populacji są obrazowane w płytce 384-dołkowej w różnych punktach czasowych. (C) Kafelki są łączone w celu utworzenia obrazów całych dołków, które są analizowane w programie CellProfiler w celu określenia liczby inkluzji na zwierzę. (D) Dane są dopasowywane do modelu matematycznego przy użyciu programu AmyloFit. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Konfiguracja składania obrazów; ustawienia wtyczki oprogramowania ImageJ, schemat, konfiguracja siatki prawy-dół.
Rysunek 2: Zrzuty ekranu procedury składania obrazów w programie ImageJ przy użyciu wtyczki Grid/Collection stitching21. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schematy obrazowania w polu jasnym i YFP pokazujące surowe dane oraz identyfikację obiektów w procesie analizy obrazu.
Rysunek 3: Schemat potoku analizy w programie CellProfiler służącego do kwantyfikacji liczby inkluzji. (A-C) Obraz w polu jasnym (A) służy do identyfikacji nicieni (B, zbliżenie w C). (D-G) Obraz fluorescencyjny (D, zbliżenie w E) służy do identyfikacji inkluzji (F). Nicienie i inkluzje są ze sobą powiązane, aby określić liczbę inkluzji dla każdego nicienia w dołku (G). Przedstawione obrazy pochodzą od zwierząt linii Q40 A w 3. dniu wieku dorosłego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Przebieg pracy w programie AmyloFit: przesyłanie danych, ładowanie modelu z równaniami, dopasowanie parametrów, wykres wyników.
Rycina 4: Dopasowanie danych do modelu matematycznego w programie AmyloFit. (A) Dane są przesyłane do programu AmyloFit. (B) Wprowadzono niestandardowe równanie w celu modelowania tworzenia inkluzji, zakładając niezależne zdarzenia nukleacji w każdej komórce. (C) Dopasowanie kinetyki agregacji dla linii C. elegans A-D wykazujących różne poziomy Q40-YFP. Dane są reprezentatywne dla dwóch niezależnych powtórzeń biologicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Zbiór danych 1Zbiór danych 2Sinnige et al.17
n2.11.91.6
Kcell (molecules M-n d-1 cell-1)9.9 x 1051.4 x 1053.1 x 104
Szybkość nukleacji przy 1 mM (molecules d-1 cell-1)0.380.210.35

Tabela 1: Wartości szybkości nukleacji i rzędu reakcji agregacji Q40-YFP. Dane dla dwóch niezależnych powtórzeń biologicznych protokołu oraz porównanie z wcześniej opublikowanymi danymi17.

Dyskusja

Przedstawiona w niniejszym dokumencie metoda umożliwia bezstronną i ilościową analizę kinetyki agregacji białek w organizmie modelowym C. elegans. Zależy to od czterech kluczowych elementów (ryc. 1): 1) utrzymania populacji nicieni zsynchronizowanej z wiekiem; 2) mikroskopia fluorescencyjna na płytkach wielodołkowych; 3) automatyczne zliczanie włączeń w CellProfiler; 4) dopasowanie danych w AmyloFit. W porównaniu z ręcznym liczeniem inkluzji u swobodnie poruszających się zwierząt lub na podstawie zapisanych obrazów26, kwantyfikacja w CellProfiler jest zarówno szybsza, jak i bardziej bezstronna. Innym kluczowym osiągnięciem protokołu jest pozyskiwanie danych kinetycznych, a nie pojedynczych punktów czasowych, co zapewnia ilościowy wgląd w mechanizm agregacji po dopasowaniu danych do modelu matematycznego.

Cztery elementy protokołu mogą być używane jako niezależne moduły, które mogą być modyfikowane w zależności od aplikacji. Populacje zsynchronizowane wiekowo mogą być również utrzymywane przy użyciu 5-fluoro-2′-deoksyurydyny (FUDR) do sterylizacji zwierząt. Związek ten wpływa na długość życia i proteostazę24,25 i jest wysoce rakotwórczy dla eksperymentatora; Wyklucza to jednak ręczne przenoszenie robaków, co może być pracochłonne w przypadku obsługi dużej liczby. Inne alternatywy to użycie sterylnych mutantów29 lub urządzeń filtrujących w celu oddzielenia potomstwa30.

Etap mikroskopii fluorescencyjnej można również dostosować, na przykład za pomocą większych powiększeń do monitorowania agregacji białek w neuronach. Mikroskopia szerokokątna może być wystarczająca do monitorowania agregacji poliQ w komórkach mięśniowych, gdy względna różnica między warunkami jest ważniejsza niż bezwzględna liczba inkluzji. W takich przypadkach potok CellProfiler może być nadal używany, chociaż ustawienia rozpoznawania robaków i inkluzji będą musiały zostać dostosowane przez użytkownika. Wydajność tej techniki jest obecnie ograniczona ze względu na konieczność ręcznego pobierania zwierząt na płytkę 384-dołkową. Temu problemowi można potencjalnie zaradzić za pomocą urządzeń mikroprzepływowych16. Azydek sodu jest stosunkowo ostrym środkiem znieczulającym, który można zastąpić fizycznym unieruchomieniem za pomocą hydrożeli lub kulek28,29.

Przedstawiona tutaj analiza w AmyloFit opiera się na mechanizmie agregacji składającym się z niezależnych zdarzeń zarodkowania w poszczególnych komórkach. W przypadkach, w których model ten nie pasuje, użytkownik powinien rozważyć alternatywę, taką jak opracowany wcześniej model agregacji kooperacyjnej17. Ograniczeniem tego podejścia jest to, że muszą być dostępne szczepy wyrażające białko będące przedmiotem zainteresowania w różnych stężeniach, chociaż można je wytworzyć przy użyciu rutynowych metod C. elegans 24.

Podsumowując, protokół ten zapewnia środki do uzyskania wysokiej jakości danych dotyczących kinetyki agregacji białek w systemie modelowym in vivo , co pozwala na szczegółową analizę mechanizmów agregacji17. Chociaż metoda została zademonstrowana w przypadku agregacji polyQ w tkance mięśniowej C. elegans , przyszłe zastosowania protokołu mogą obejmować inne białka i tkanki oraz wpływ czynników proteostazy i małych cząsteczek.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy laboratorium Morimoto za szczepy C. elegans i Esmeralda Bosman za pomoc przy wysokoprzepustowym mikroskopie konfokalnym. Praca ta została sfinansowana z grantu na rozpoczęcie działalności przez Uniwersytet w Utrechcie dla T.S.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 384-dołkowaGreiner781091z płaskim przezroczystym dnem
AmyloFitKnowles labv2.0Dostęp do www.amylofit.ch.cam.ac.uk
C. elegans Q40 linia AMorimoto labAM1228Genotyp rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]
>C. elegans Q40 linia BMorimoto labAM1229Genotyp rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]
C. elegans Q40 linia CMorimoto labAM1230Genotyp rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]
>C. elegans Q40 linia DMorimoto labAM1231Genotyp rmIs404[unc-54p:: Q40::YFP]
CellProfilerBroad Institute4.1.3Pobrane z https://cellprofiler.org
E. coli OP50Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)OP50
FIDŻIOpen-source(Fidżi to po prostu) ImageJ v2.1/1.5.3jPobrane z https://imagej.net/software/fiji/
Wysokoprzepustowy mikroskopkonfokalnyYokogawaCellVoyager CV7000S
bufor M9Domowej roboty3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0,5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4
NGM Płytkidomowej roboty  17 g/L agar, 2,5 g/L baktopepton, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 bufor pH 6,0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterolu
Pipeta PasteuraWU Mainz250Aby zrobić robaka,
Drut platynowo-irydowyAlfa Aesar39383Do produkcji kilofa, średnica 0,25 mm
Azydek soduSigma-AldrichS2002
StereoskopLeicaS9
o długości 150 mm

Bibliografia

  1. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).
  2. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: a summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).
  3. Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326 (5959), 1533-1537 (2009).
  4. Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9758-9763 (2013).
  5. Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11 (2), 252-272 (2016).
  6. Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5750-5755 (2000).
  7. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  8. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  9. Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
  10. Prahlad, V., Morimoto, R. I. Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14204-14209 (2011).
  11. Nollen, E. A. A. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  12. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438(2011).
  13. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9, 1-16 (2014).
  14. Calamini, B., et al. Small-molecule proteostasis regulators for protein conformational diseases. Nature Chemical Biology. 8 (2), 185-196 (2012).
  15. Sinnige, T., Stroobants, K., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Biophysical studies of protein misfolding and aggregation in in vivo models of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Quarterly Reviews of Biophysics. 49, 22(2020).
  16. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023(2016).
  17. Sinnige, T., et al. Kinetic analysis reveals that independent nucleation events determine the progression of polyglutamine aggregation in C. elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 202188118(2021).
  18. Brenner, S. Caenorhabditis elegans. Methods. 77 (1), 71-94 (1974).
  19. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  20. FIJI/ImageJ. , Available from: https://imagej.net/downloads (2012).
  21. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  22. Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. BioTechniques. 42 (1), 71-75 (2007).
  23. CellProfiler. Broad Institute. , Available from: https://cellprofiler.org/releases (2021).
  24. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  25. Knowles group, University of Cambridge. , Available from: https://amylofit.com/amylofitmain/login/ (2021).
  26. Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantifying tissue-specific proteostatic decline in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), (2021).
  27. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964(2014).
  28. Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 141-142, 1-4 (2014).
  29. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS Biology. 8 (8), 47-48 (2010).
  30. Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. Caenorhabditis sieve: A low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
  31. Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73(2018).
  32. Dong, L., et al. Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms. PLoS One. 13 (3), 0193989(2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mikroskopia fluorescencyjnamikroskopia konfokalnaanaliza obrazubiałko poliglutaminowemodel nukleacjiczynniki proteostazy
Monitorowanie kinetyki agregacji białek in vivo przy użyciu automatycznego zliczania inkluzji u Caenorhabditis elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.