Method Article

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

DOI:

10.3791/63377

⸱

February 18th, 2022

 ,  , 
1Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Genetics, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrotubule to polimery heterodimerów αβ-tubuliny, które organizują się w odrębne struktury w komórkach. Architektury i sieci oparte na mikrotubulach często zawierają podzbiory macierzy mikrotubul, które różnią się właściwościami dynamicznymi. Na przykład w dzielących się komórkach stabilne wiązki usieciowanych mikrotubul współistnieją w bliskim sąsiedztwie dynamicznych mikrotubul nieusieciowanych. Badania rekonstytucji in vitro oparte na mikroskopii TIRF umożliwiają jednoczesną wizualizację dynamiki tych różnych układów mikrotubul. W tym teście komora obrazowania jest składana z mikrotubul unieruchomionych powierzchniowo, które są albo obecne jako pojedyncze włókna, albo zorganizowane w usieciowane wiązki. Wprowadzenie tubuliny, nukleotydów i regulatorów białek umożliwia bezpośrednią wizualizację powiązanych białek oraz właściwości dynamicznych mikrotubul pojedynczych i usieciowanych. Co więcej, zmiany, które zachodzą, gdy dynamiczne pojedyncze mikrotubule organizują się w wiązki, mogą być monitorowane w czasie rzeczywistym. Opisana tutaj metoda pozwala na systematyczną ocenę aktywności i lokalizacji poszczególnych białek, a także synergicznego działania regulatorów białek na dwa różne podzbiory mikrotubul w identycznych warunkach eksperymentalnych, dostarczając tym samym mechanistycznych spostrzeżeń, które są niedostępne innymi metodami.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrotubule to biopolimery, które tworzą strukturalne rusztowania niezbędne dla wielu procesów komórkowych, począwszy od transportu wewnątrzkomórkowego i pozycjonowania organelli, a skończywszy na podziale i wydłużaniu komórek. Aby wykonać te różnorodne funkcje, poszczególne mikrotubule są zorganizowane w układy o wielkości mikronów, takie jak wrzeciona mitotyczne, aksonemy rzęskowe, wiązki neuronalne, układy międzyfazowe i układy korowe roślin. Wszechobecnym motywem architektonicznym występującym w tych strukturach jest wiązka mikrotubul usieciowanych na całej ich długości1. Intrygującą cechą kilku struktur opartych na mikrotubulach jest współ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotuj odczynniki

  1. Przygotować i odczynniki zgodnie z tabelami 1 i 2. Podczas eksperymentu wszystkie roztwory należy przechowywać na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.
rozwiązanieKomponentyZalecany okres przechowywaniaUwagi
5 modułów BRB80400 mM K-PIPES, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, pH 6,8 z ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperyment opisany powyżej został przeprowadzony przy użyciu mikrotubul biotynylowanych znakowanych fluoroforem 647 nm, mikrotubul znakowanych fluoroforem 560 nm i mieszaniny tubuliny rozpuszczalnych znakowanych fluoroforem 560 nm. Mikrotubule zostały usieciowane przez białko sieciujące PRC1 (znakowane GFP). Po wygenerowaniu unieruchomionych powierzchniowo wiązek i pojedynczych mikrotubul (krok 5.11), komora obrazowania została zamontowana na obiektywie olejowym TIRF 100X 1,49 NA i oglądana w kanałach fluorescencyjnych .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj eksperyment znacznie rozszerza zakres i złożoność konwencjonalnych testów rekonstytucji mikrotubul, które tradycyjnie wykonuje się na pojedynczych mikrotubulach lub na jednym typie matrycy. Obecny test zapewnia metodę jednoczesnego ilościowego określania i porównywania regulacyjnej aktywności MAP w dwóch populacjach, a mianowicie pojedynczych mikrotubulach i usieciowanych wiązkach. Co więcej, test ten pozwala na zbadanie dwóch rodzajów wiązek: tych, które są wstępnie uformowane ze stabilnych nasion przed za.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta grantem z NIH (nr 1DP2GM126894-01) oraz funduszami z Pew Charitable Trusts i Smith Family Foundation dla R.S. Autorzy dziękują dr Shuo Jiangowi za jego wkład w rozwój i optymalizację protokołów.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(±)-6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy kwas (Trolox)Sigma Aldrich238813
1,4-piperazynodienasulfonowy kwas (PIPES)Sigma AldrichP6757
18x18 mm #1.5 szkiełka nakrywkowe Mikroskopia elektronowa Nauki63787
2-merkaptoetanol (BME)Sigma AldrichM-6250
24x60 mm #1.5 szkiełka nakrywkoweNauki o mikroskopii elektronowej63793
405/488/560/647 nm Laser Quad Band ChromaTRF89901-NK
AcetonSigma Aldrich320110
Adenozyno-5'-trifosforan sól disodowa hydrat (ATP)Sigma AldrichA7699-5G
Avidin, NeutrAvidin® Białko wiążące biotynę (sondy molekularne®)Thermo Fischer ScientificA2666
Sonikator do kąpieli: Branson 2800 CleanerBransonCPX2800H
Beckman Coulter Rury grubościenne z poliwęglanu, 11 x 34 mmBeckman-Coulter 
Beckman Coulter Rury grubościenne z poliwęglanu, 8 x 34 mmBeckman-Coulter 
Biotyna-PEG-SVA, MW 5,000Laysan Bio#Biotin-PEG-SVA-5000
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma Aldrich2905
KatalazaSigma AldrichC40
Mini mikrowirówka Corning LSE, AC100-240VCorning6670
Chusteczki do delikatnych zadańKimtech34120
Ditiotriitol (DTT)GoldBioDTT10
Filtr emisyjnyChromaET610/75m
Etanol (200-proof)Decon Labs2705
Kwas tetraoctowy glikolu etylenowego (EGTA)Sigma Aldrich3777
Oksydaza glukozowaSigma AldrichG2133
GMPCPPJena Bioscience NU-405
Hydrat soli sodowej 5'-trifosforanu guanozyny (GTP)Sigma AldrichG8877
Hellmanex III detergent Sigma AldrichZ805939
Olejek immersyjny, typ AFisher Scientific77010
Kappa-kazeinaSigma AldrichC0406
LanolinaFisher ScientificS25376
Chusteczka do czyszczenia soczewekThorLabsMC-5
Chlorek magnezu (MgCl2)Sigma AldrichM9272
MetylocelulozaSigma AldrichM0512
Microfuge 16 Wirówka stołowaBeckman-Coulter A46474
Szkiełka mikroskopowe, szkło diamentowo-białe, 25 x 75mm, 90° Szlifowane krawędzie, BIAŁY matowyglobus Scientific1380-50W
mPEG-Walerianian sukcynimidylu, MW 5,000 Laysan Bio#NH2-PEG-VA-5K
Optima&handel; Ultrawirówka stołowa Max-XPBeckman-Coulter 
ParaffinFisher ScientificP31-500
PELCO Rewers (samozamykający), Drobna pęsetaTed Pella5377-NM
Wazelina, BiałaFisher Scientific18-605-050
, 115VHarrick PlasmaPDC-001
Wodorotlenek potasu (KOH)Sigma Aldrich221473
Wodorowęglan soduSigma AldrichS6014
SacharozaSigma AldrichS7903
Thermal-Lok 1-pozycyjna sucha kąpiel cieplnaUSA Scientific2510-1101
Blok termiczny Lok do probówek 1,5 i 2,0 mlUSA Scientific2520-0000
Thermo Scientific™ Pierce™ Łamacz obligacji i handel; Roztwór TCEP, neutralne pH; 500mMThermo Fischer ScientificPI-77720
TIRF 100X NA 1.49 Obiektyw olejowyNikonCFI Apochromat TIRF 100XC Olej Mikroskop
TIRFNikonEclipse Ti
TLA 120.1 wirnikBeckman-Coulter 
Wirnik TLA 120.2Beckman-Coulter 
Białko tubuliny (>99% czystości): mózg świniCytoszkieletT240
Białko tubuliny (biotyna):cytoszkieletT333P
Białko tubuliny (fluorescencyjne HiLyte 647):cytoszkieletTL670M
Białko tubuliny (X-rodamina): mózg bydlęcyCytoszkieletTL620M
VECTABOND® Odczynnik, wektor adhezji przekroju tkankowegoBiolabsSP-1800-7
VWR® Inkubator osobisty, 120 V, 50/60 Hz, 0,6 AVWR97025-630
343778343776393315 Myjka plazmowa 362224357656 mózgu świni mózgu świni

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  2. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal mic....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

TIRF MicroscopyMicrotubule DynamicsCrosslinked MicrotubulesSingle MicrotubulesIn Vitro ReconstitutionFluorescence ImagingMicrotubule BundlesProtein RegulatorsSurface ImmobilizationMicrotubule Organization

Related Articles