Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Podsumowanie

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Streszczenie

Mikrotubule to polimery heterodimerów αβ-tubuliny, które organizują się w odrębne struktury w komórkach. Architektury i sieci oparte na mikrotubulach często zawierają podzbiory macierzy mikrotubul, które różnią się właściwościami dynamicznymi. Na przykład w dzielących się komórkach stabilne wiązki usieciowanych mikrotubul współistnieją w bliskim sąsiedztwie dynamicznych mikrotubul nieusieciowanych. Badania rekonstytucji in vitro oparte na mikroskopii TIRF umożliwiają jednoczesną wizualizację dynamiki tych różnych układów mikrotubul. W tym teście komora obrazowania jest składana z mikrotubul unieruchomionych powierzchniowo, które są albo obecne jako pojedyncze włókna, albo zorganizowane w usieciowane wiązki. Wprowadzenie tubuliny, nukleotydów i regulatorów białek umożliwia bezpośrednią wizualizację powiązanych białek oraz właściwości dynamicznych mikrotubul pojedynczych i usieciowanych. Co więcej, zmiany, które zachodzą, gdy dynamiczne pojedyncze mikrotubule organizują się w wiązki, mogą być monitorowane w czasie rzeczywistym. Opisana tutaj metoda pozwala na systematyczną ocenę aktywności i lokalizacji poszczególnych białek, a także synergicznego działania regulatorów białek na dwa różne podzbiory mikrotubul w identycznych warunkach eksperymentalnych, dostarczając tym samym mechanistycznych spostrzeżeń, które są niedostępne innymi metodami.

Wprowadzenie

Mikrotubule to biopolimery, które tworzą strukturalne rusztowania niezbędne dla wielu procesów komórkowych, począwszy od transportu wewnątrzkomórkowego i pozycjonowania organelli, a skończywszy na podziale i wydłużaniu komórek. Aby wykonać te różnorodne funkcje, poszczególne mikrotubule są zorganizowane w układy o wielkości mikronów, takie jak wrzeciona mitotyczne, aksonemy rzęskowe, wiązki neuronalne, układy międzyfazowe i układy korowe roślin. Wszechobecnym motywem architektonicznym występującym w tych strukturach jest wiązka mikrotubul usieciowanych na całej ich długości¹. Intrygującą cechą kilku struktur opartych na mikrotubulach jest współistnienie mikrotubul wiązkowych i nieusieciowanych pojedynczych mikrotubul w bliskiej odległości przestrzennej. Te subpopulacje mikrotubul mogą wykazywać wyraźnie różną dynamikę polimeryzacji od siebie, w zależności od potrzeb ich prawidłowego funkcjonowania^2,3,4,5. Na przykład w obrębie wrzeciona mitotycznego stabilne usieciowane wiązki i dynamiczne pojedyncze mikrotubule są obecne w obszarze skali mikronowej w centrum komórki⁶. Badanie, w jaki sposób określa się właściwości dynamiczne współistniejących populacji mikrotubul, ma zatem kluczowe znaczenie dla zrozumienia budowy i funkcji struktur opartych na mikrotubulach.

Mikrotubule to dynamiczne polimery, które cyklicznie przechodzą między fazami polimeryzacji i depolimeryzacji, przełączając się między dwiema fazami w zdarzeniach znanych jako katastrofa i ratunek⁷. Dynamika mikrotubul komórkowych jest regulowana przez niezliczone białka związane z mikrotubulami (MAP), które modulują szybkość polimeryzacji i depolimeryzacji mikrotubul oraz częstotliwość katastrof i zdarzeń ratunkowych. Badanie aktywności MAP na przestrzennie proksymalnych układach w komórkach jest trudne ze względu na ograniczenia rozdzielczości przestrzennej w mikroskopii świetlnej, zwłaszcza w obszarach o dużej gęstości mikrotubul. Co więcej, obecność wielu MAP w tym samym regionie komórkowym utrudnia interpretację badań biologicznych komórek. Testy rekonstytucji in vitro, wykonywane w połączeniu z mikroskopią fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), pozwalają uniknąć wyzwań związanych z badaniem mechanizmów, za pomocą których określone podzbiory MAP regulują dynamikę proksymalnych macierzy mikrotubul komórkowych. W tym przypadku dynamika mikrotubul złożonych in vitro jest badana w obecności jednego lub więcej rekombinowanych MAP w kontrolowanych warunkach^8,9,10. Jednak konwencjonalne testy rekonstytucji są zwykle wykonywane na pojedynczych mikrotubulach lub na jednym typie matrycy, co wyklucza wizualizację współistniejących populacji.

Tutaj prezentujemy testy rekonstytucji in vitro, które umożliwiają jednoczesną wizualizację dwóch populacji mikrotubul w tych samych warunkach roztworu¹¹. Opisujemy metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu MAP na pojedynczych mikrotubulach i na wiązkach mikrotubul usieciowanych przez białko związane z wrzecionem mitotycznym PRC1. Białko PRC1 preferencyjnie wiąże się na nakładaniu się antyrównoległych mikrotubul, sieciując je⁹. W skrócie, protokół ten składa się z następujących etapów: (i) przygotowanie roztworów podstawowych i odczynników, (ii) czyszczenie i obróbka powierzchni szkiełek nakrywkowych używanych do stworzenia komory obrazowania do eksperymentów mikroskopowych, (iii) przygotowanie stabilnych "zarodków" mikrotubul, z których inicjowana jest polimeryzacja podczas eksperymentu, (iv) specyfikacja ustawień mikroskopu TIRF w celu wizualizacji dynamiki mikrotubul, (v) immobilizacja zarodków mikrotubul i wytwarzanie usieciowanych wiązek mikrotubul w komorze obrazowania oraz (vi) wizualizacja dynamiki mikrotubul w komorze obrazowania za pomocą mikroskopii TIRF, po dodaniu rozpuszczalnej tubuliny, MAP i nukleotydów. Testy te umożliwiają jakościową ocenę i ilościowe badanie lokalizacji MAP i jej wpływu na dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Ponadto ułatwiają one ocenę synergicznego wpływu wielu MAP na te populacje mikrotubul w szerokim zakresie warunków eksperymentalnych.

Protokół

1. Przygotuj odczynniki

1. Przygotować i odczynniki zgodnie z tabelami 1 i 2. Podczas eksperymentu wszystkie roztwory należy przechowywać na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.

rozwiązanie	Komponenty		Zalecany okres przechowywania	Uwagi
5 modułów BRB80	400 mM K-PIPES, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, pH 6,8 z KOH, sterylizacja filtra		do 2 lat	Przechowywać w temperaturze 4 °C
1X BRB80	80 mM K-PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8		do 2 lat	Przechowywać w temperaturze 4 °C
BRB80-Naziemna telewizja cyfrowa	1X BRB80, 1 mM naziemna telewizja cyfrowa		do 2 dni
Bufor testowy	80 mM K-PIPES, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8, 5% sacharozy (OR 1X BRB80, 5% sacharozy, 2 mM MgCl2)		do 1 roku	Przechowywać w temperaturze 4 °C
Bufor główny (MB)	Bufor testowy, 5mM TCEP		1 tydzień	Przygotuj się w dniu eksperymentu; Podzielić na dwie rurki: MB-ciepła w temperaturze pokojowej i MB-zimna na lodzie; zawierają 1 mM DTT w przypadku stosowania barwników fluorescencyjnych
Bufor główny z metylocelulozą (MBMC)	1X BRB80, 0,8% metylocelulozy, 5 mM TCEP, 5 mM MgCl2		1 tydzień	Przygotuj się w dniu eksperymentu; dołącz 1 mM DTT, jeśli używasz barwników fluorescencyjnych
Bufor do rozcieńczania białek (DB)	MB, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 1 μM ATP		1 dzień, na lodzie	Przygotuj się w dniu eksperymentu; dołącz 1 mM DTT, jeśli używasz barwników fluorescencyjnych
Mieszanka oczyszczająca tlen (OSM)	MB, 389 μg/ml katalazy, 4,44 mg/ml oksydazy glukozowej, 15,9 mM 2-merkaptoetanol (BME)		1 dzień, na lodzie	Przygotuj się w dniu eksperymentu
Finał oczyszczania tlenu (OSF)	MB, 350 μg/ml katalazy, 4mg/ml oksydazy glukozowej, 14,3 mM BME, 15 mg/ml glukozy		zużyć w ciągu 30 minut	Przygotuj bezpośrednio przed użyciem, dodając 1 μL glukozy do 9 μL OSM

Tabela 1: Lista używanych w tym protokole i ich komponentów. Zobacz kolumnę "Zalecany czas przechowywania", aby uzyskać wskazówki dotyczące tego, z jakim wyprzedzeniem można przygotować każdy bufor.

Odczynnik

Koncentracja pamięci

Rozpuszczalnik do przechowywania

Temperatura przechowywania

Koncentracja robocza

Koncentracja końcowa

Zalecany czas przechowywania

Uwagi

Neutrawidyna (NA)

5 mg/ml

1X BRB80

-80°C

0,2 mg/ml

0,2 mg/ml

do 1 roku

Służy do unieruchamiania mikrotubul poprzez połączenie biotyna-neutrawidyna-biotyna; przechowywać w małych porcjach

Kazeina Kappa (KC)

5 mg/ml

1X BRB80

-80°C

0,5 mg/ml

0,5 mg/ml

do 2 lat

Służy do blokowania powierzchni komory obrazowania; Przechowywać w małych porcjach; W dniu eksperymentu odłóż niewielką objętość na bok w temperaturze pokojowej

Albumina surowicy bydlęcej (BSA)

50 mg/ml

1X BRB80

-20°C

1 mg/ml (w DB)

Nie dotyczy

do 2 lat

przechowuj w małych porcjach

Katalaza

3,5 mg/ml

1X BRB80

-80°C

350 μg/ml (w OSF)

35 μg/ml

do 2 lat

składnik mieszanki do oczyszczania tlenu; przechowywać w małych porcjach

Oksydaza glukozowa

40 mg/ml

1X BRB80

-80°C

4 mg/ml (w OSF)

0,4 mg/ml

do 2 lat

składnik mieszanki do oczyszczania tlenu; przechowywać w małych porcjach

tubulina

Liofilizowany

Nie dotyczy

4°C

10 mg/ml

2,12 mg/ml (w mieszance tubuliny)

do 1 roku

Gdy tubulina znajdzie się w roztworze, trzymaj ją w chłodzie, aby uniknąć polimeryzacji.

Adenozynotrójfosforan (ATP)

100 mM

ultraczysta woda

-20°C

10 mM

1 mM

6 miesięcy

Przygotuj roztwór w wodzie sterylizowanej filtrem, dostosuj pH do ~7.0 i zamroź w małych porcjach.

Trifosforan guanozyny (GTP)

100 mM

ultraczysta woda

-20°C

10 mM

1.29 mM (w mieszance tubuliny)

6 miesięcy

Przygotuj roztwór w wodzie sterylizowanej filtrem, dostosuj pH do ~7.0 i zamroź w małych porcjach.

Guanozyno-5'-[(α,β)-metyleno] trifosforan (GMPCPP)

10 mM

ultraczysta woda

-20°C

10 μM

0,5 μM

6 miesięcy

Dithiothreitol (DTT)

1 M

sterylna woda

-20°C

1 mM

Nie dotyczy

do 2 lat

Tris(2-karboksyetylo)fosfina (TCEP)

0,5 mln

woda sterylizowana filtrem

Temperatura pokojowa

5 mM

Nie dotyczy

do 2 lat

Metyloceluloza

1%

sterylna woda

Temperatura pokojowa

0.8% (w MBMC)

0,21% (w mieszance tubuliny)

do 1 roku

Rozpuść metylocelulozę, powoli dodając ją do prawie wrzącej wody. Pozostawić do ostygnięcia, ciągle mieszając.

Beta-merkaptoetanol (BME)

143 mM

sterylna woda

Temperatura pokojowa

14.3 mM (w OSF)

1.43 mM

do 5 lat

143 mM to rozcieńczenie BME w stosunku 1:100

Glukoza

150 mg/ml

1X BRB80

-80°C

15 mg/ml (w OSF)

1,5 mg/ml

do 2 lat

Dodaj do OSM bezpośrednio przed użyciem

(±)-6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy kwas (Trolox)

10mM

1X BRB80

-80°C

10 mM

1 mM

do 1 roku

Nie rozpuszcza się całkowicie. Dodaj trochę NaOH, mieszaj przez ~ 4 godziny i wysterylizuj filtr przed użyciem

mPEG-Walerianian sukcynimidylu, MW 5,000

proszek

Nie dotyczy

-20°C

333 mg/ml (w 0,1 M wodorowęglanu sodu)

324 mg/ml (w 0,1 M wodorowęglanu sodu)

6 miesięcy

Przygotuj porcje ~34 mg, oznaczając każdą probówkę dokładną wagą proszku. Przepuścić azot gazowy przez ciało stałe, uszczelnić probówki parafilmem i przechowywać w temperaturze -20°C w pojemniku ze środkiem osuszającym.

Biotyna-PEG-SVA, MW 5,000

proszek

Nie dotyczy

-20°C

111 mg/ml (w 0,1 M wodorowęglanu sodu)

3,24 mg/ml (w 0,1 M wodorowęglanu sodu)

6 miesięcy

Przygotuj porcje ~3 mg, oznaczając każdą probówkę dokładną wagą proszku. Przepuścić azot gazowy przez ciało stałe, uszczelnić probówki parafilmem i przechowywać w temperaturze -20°C w pojemniku ze środkiem osuszającym.

Tabela 2: Lista odczynników używanych w tym protokole. Uwzględniono zalecane warunki przechowywania i stężenia, stężenia robocze roztworów podstawowych użytych podczas eksperymentu oraz końcowe stężenie w komorze obrazowania. Dodatkowe uwagi znajdują się w skrajnej prawej kolumnie.

2. Przygotuj preparaty Biotin-PEG

UWAGA: Przygotuj komory obrazowania jak najbliżej rozpoczęcia eksperymentu i nie więcej niż 2 tygodnie wcześniej.

1. Czyste szkiełka nakrywkowe
   1. Umieść równą liczbę szkiełek nakrywkowych 24 x 60 mm i 18 x 18 mm #1.5 (Rysunek 1F) odpowiednio w słoikach do barwienia szkiełek i stojakach do mycia szkiełek ( Rysunek 1A,B). Umieścić stojaki do mycia szkiełek zawierających szkiełka nakrywkowe o pojemności 18 x 18 mm w zlewce o pojemności 100 ml.
   2. Wypłucz wszystkie szkiełka nakrywkowe 5-6 razy w ultraczystej wodzie (rezystywność 18,2 MΩ-cm) i usuń nadmiar płynu po każdym płukaniu za pomocą końcówki pipety podłączonej do rurki próżniowej (Rysunek 1C).
   3. Napełnij zlewki i słoiki do barwienia szkiełek zawierających szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą, uszczelnij parafilmem i poddaj sonikacji przez 10 minut.
   4. Napełnij dwie zlewki o pojemności 150 ml 200-procentowym etanolem. Za pomocą pęsety zanurz każde szkiełko nakrywkowe w jednej zlewce wypełnionej etanolem, a następnie w drugiej.
   5. Za pomocą pęsety przenieś szkiełka nakrywkowe na stojak do suszenia szkiełek (Rysunek 1D), wysusz je pod strumieniem azotu i inkubuj w temperaturze 37 °C aż do całkowitego wyschnięcia (~15 min).
   6. Umieść wysuszone szkiełka nakrywkowe w jednej warstwie wewnątrz myjki plazmowej. Uformuj uszczelnienie próżniowe, a następnie ustaw poziom częstotliwości radiowej (RF) myjki plazmowej na ~8 MHz.
   7. Po wytworzeniu plazmy pozostaw szkiełka nakrywkowe w myjce plazmowej na 5 minut. Wyłącz myjkę plazmową i powoli zwolnij odkurzacz.
   8. Po zwolnieniu uszczelki próżniowej odwróć szkiełka nakrywkowe i powtórz czyszczenie plazmowe przez 5 minut dla drugiej strony szkiełek nakrywkowych.
   9. Alternatywa dla czyszczenia plazmowego: Zamiast kroków 2.1.2-2.1.3, sonikować szkiełka nakrywkowe w ciepłym roztworze 2% detergentu (w ultraczystej wodzie) przez 10 minut. Następnie dokładnie umyj szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą i poddaj sonikacji w ultraczystej wodzie 2-3 razy (po 10 minut). Następnie umyć w etanolu i wysuszyć jak w krokach 2.1.4-2.1.5. Pomiń kroki 2.1.6-2.1.8.
2. Leczenie biotyną-PEG
   1. Bezpośrednio przed użyciem rozpuścić 400 μl 3-Aminopropylotrietoksysilanu w 40 ml acetonu. Za pomocą pęsety przenieś oczyszczone plazmowo szkiełka nakrywkowe do stojaka do mycia szkiełek i słoików do barwienia szkiełek. Zanurz szkiełka nakrywkowe w roztworze 3-aminopropylotrietoksysilanu i inkubuj przez 5 min^12,13.
   2. Umyj wszystkie szkiełka nakrywkowe 5-6 razy ultraczystą wodą.
   3. Przenieść szkiełka nakrywkowe na suszarkę do szkiełek, wysuszyć je pod strumieniem azotu i inkubować w temperaturze 37 °C aż do całkowitego wyschnięcia (~20 min).
   4. Połóż wysuszone szkiełka nakrywkowe na delikatnych chusteczkach roboczych i oznacz każde szkiełko nakrywkowe na jednym rogu, np. "p" na każdym szkiełku nakrywkowym o wymiarach 18 x 18 mm i "b" na każdym szkiełku nakrywkowym o wymiarach 24 x 60 mm (patrz Rysunek 2).
   5. W dniu eksperymentu należy przygotować świeży 0,1 M roztwór wodorowęglanu sodu, rozpuszczając 0,84 mg NaHCO₃ w 10 ml ultraczystej wody.
   6. Bezpośrednio przed użyciem doprowadzić porcje walerianianu mPEG-Sukcynimidylu (PEG-SVA) i Biotyny-PEG-SVA do temperatury pokojowej. Patrz uwagi dotyczące podwielokrotnego przygotowania glikolu polietylenowego (PEG) w tabeli 2.
      UWAGA: Pracuj szybko, ponieważ okres półtrwania hydrolizy ugrupowania walerianianu sukcynimidylu (SVA) wynosi ~30 min.
   7. Dodać 102 μl 0,1 M NaHCO₃ do 34 mg PEG-SVA, wirować w mikrowirówce stołowej z prędkością 2,656 x g przez 20 s, a następnie mieszać pipetując w górę i w dół. Rozpuścić 3 mg Biotyny-PEG-SVA w 27 μl 0,1 M NaHCO₃ poprzez pipetowanie w górę i w dół. Dostosuj objętości rozcieńczenia zgodnie z dokładną wagą PEG podaną na probówkach (patrz Tabela 2).
   8. Przygotować mieszaninę PEG:biotyna-PEG w proporcji 100:1, łącząc 75 μl roztworu PEG-SVA i 2,25 μl roztworu Biotin-PEG-SVA na 20 szkiełek nakrywkowych, 100 μl i 3 μl na 30 szkiełek nakrywkowych lub 125 μl i 3,75 μl na 40 szkiełek nakrywkowych.
   9. Zbuduj komorę nawadniającą, umieszczając mokre ręczniki papierowe pod stojakiem na końcówki na dnie pustego pudełka na końcówki o pojemności 10 μl (Rysunek 1E). Zapobiegnie to parowaniu roztworów PEG.
   10. Odpipetować 6 μl mieszaniny 100:1 PEG-SVA:biotyna-PEG na środek jednego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 x 60 mm po stronie oznaczonej etykietą. Umieść kolejne szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 x 60 mm na pierwszym szkiełku nakrywkowym tak, aby para utworzyła kształt litery X, tak aby boki oznaczone literą "b" były skierowane do siebie. Umieść parę na pustym stojaku na końcówki w komorze hydracyjnej i powtórz dla pozostałych szkiełek nakrywkowych o wymiarach 24 x 60 mm.
   11. Odpipetować 6 μl PEG-SVA na środek jednego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 18 x 18 mm po oznaczonej stronie. Umieść kolejne szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 x 18 mm na pierwszym szkiełku nakrywkowym, tak aby boki oznaczone "p" były skierowane do siebie. Umieść parę na pustym stojaku na końcówki w komorze hydracyjnej i powtórz dla pozostałych szkiełek nakrywkowych 18 x 18 mm.
   12. Zamknij komorę hydracyjną i inkubuj przez 3 godziny lub przez noc.
   13. Oddziel pary szkiełek nakrywkowych i spłucz w ultraczystej wodzie.
   14. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe strumieniem azotu i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C do całkowitego wyschnięcia.
   15. Aby zbudować komorę obrazowania, należy nakleić trzy paski taśmy dwustronnej na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 x 60 mm po stronie oznaczonej literą "b". Po drugiej stronie pasków taśmy przymocuj szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 x 18 mm stroną oznaczoną literą "p" skierowaną w stronę większego szkiełka nakrywkowego. W ten sposób powstają dwie komory przepływowe do eksperymentów mikroskopowych, z obrabianymi powierzchniami zwróconymi do siebie (Rysunek 2 i Rysunek 1G).

Rysunek 1: Sprzęt do obróbki szkiełek nakrywkowych i przygotowania komory obrazowania. (A) słoiki do barwienia szkiełek nakrywkowych 24 x 60 mm, (B) stojaki do mycia szkiełek nakrywkowych 18 x 18 mm, (C) ustawienie próżniowe, (D) stojak do suszenia szkiełek, (E) komora hydralacyjna, (F) szkiełka nakrywkowe, (G) komora obrazowania, (H) uchwyt na szkiełka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schemat przygotowania komór obrazowania przy użyciu taśmy dwustronnej (szarej) i szkiełek nakrywkowych pokrytych PEG/Biotyną-PEG. Stworzony z BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Polimeryzacja mikrotubul

1. Przygotowanie nasion GMPCPP
   UWAGA: Nasiona GMPCPP należy przygotować w chłodni, przechowując wszystkie odczynniki, końcówki i probówki w temperaturze 4 °C. Nasiona GMPCPP można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku. Umieścić wirnik ultrawirówki o stałym kącie nachylenia, zawierający 1 ml probówek wirówkowych, w ultrawirówce i ustawić temperaturę na 4 °C.
   1. Zawiesić liofilizowaną tubulinę (Tabela 2) do ~10 mg / ml w 1X BRB80, bezpośrednio przed użyciem.
   2. Wymieszać składniki nasion GMPCPP zgodnie z opisem w tabeli 3.
      UWAGA: Utrzymuj wszystkie składniki tubuliny na lodzie tak długo, jak to możliwe, aby zminimalizować polimeryzację rozpuszczalnej tubuliny.
   3. Klarować mieszaninę w wirniku ultrawirówki o stałym kącie nachylenia przy 352 700 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Rozdzielić supernatant na 5 μl podwielokrotności, zamrozić je w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
2. Polimeryzuj nasiona w dniu eksperymentu
   1. Podgrzej 1-2 ml BRB80-DTT (Tabela 1) do 37 °C.
   2. Umieścić 5 μl porcji nasion GMPCPP (-80 °C) z kroku 3.1.4 na lodzie i natychmiast rozpuścić w 20 μl ciepłego BRB80-DTT. Wirować z prędkością 2 000 x g przez 5 s w temperaturze pokojowej i dotknij, aby wymieszać.
      UWAGA: Początkowa objętość rozcieńczenia może wahać się od 13 μl do 21 μl i jest określana empirycznie dla każdej partii nasion. Jeśli nasiona nie polimeryzują, należy rozwiązać problem, uzupełniając bufor do początkowego rozcieńczania (krok 3.2.2) 0,5 μM GMPCPP.
   3. Chronić przed światłem i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30-45 min.
      UWAGA: Długość mikrotubul zależy od czasu trwania inkubacji. W przypadku krótkich mikrotubul czas inkubacji może wynosić nawet 15 minut. W przypadku długich mikrotubul czas inkubacji może wynosić nawet 2 godziny. Mikrotubule biotynylowane zwykle wymagają dłuższego czasu inkubacji niż mikrotubule niebiotynylowane.
   4. Umieścić wirnik ultrawirówki o stałym kącie nachylenia, zawierający 500 μl probówek wirówkowych, w ultrawirówce i wstępnie ogrzać do temperatury 30 °C.
   5. Po inkubacji dodać 50 μl ciepłego BRB80-DTT (krok 3.2.1) do spolimeryzowanych nasion GMPCPP i przenieść mieszaninę do probówki wirówkowej o pojemności 500 μl. Umyj pustą probówkę, w której znajdowały się nasiona GMPCPP, kolejnymi 50 μl ciepłego BRB80-DTT, pipetuj w górę i w dół, a następnie dodaj ten bufor do probówki wirówkowej o pojemności 500 μl zawierającej mieszaninę.
   6. Przed wirowaniem zaznacz krawędź probówki wirówki, aby wskazać, gdzie będzie pelet (pellet będzie zbyt mały, aby go zobaczyć). Wirować przez 10 minut przy 244 900 x g w temperaturze 30 °C¹².
   7. Ostrożnie odpipetować supernatant i wyrzucić. Zawiesić granulat w 100 μl ciepłego BRB80-DTT. Stuknij, aby wymieszać.
   8. Wirować przez 10 minut w temperaturze 244 900 x g w temperaturze 30 °C, wyrównując oznakowanie z wirnikiem, aby granulować w tym samym miejscu.
   9. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 16 μl ciepłego BRB80-DTT. Przenieść roztwór mikrotubul do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,6 ml. Chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze pokojowej lub wyższej.
      UWAGA: Po polimeryzacji utrzymuj mikrotubule w temperaturze pokojowej lub wyższej. Jeśli ostygną, ulegną depolimeryzacji. Inkubować w temperaturze 28 °C dla zwiększenia stabilności.
3. Sprawdź mikrotubule za pomocą mikroskopii TIRF
   1. Odpipetować mieszaninę 4,5 μl BRB80-DTT i 1 μl roztworu mikrotubul (krok 3.2.9) na szkiełko mikroskopowe. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 18 x 18 mm i uszczelnij krawędzie przezroczystym lakierem do paznokci lub mieszaniną wazeliny, lanoliny i parafiny w proporcji 1:1:1 (uszczelniacz valap), która jest stała w temperaturze pokojowej i płynna w temperaturze 95 °C.
   2. Umieść obiektyw TIRF pod szkiełkiem nakrywkowym (patrz krok 4, aby zapoznać się z zalecanymi ustawieniami mikroskopu) i zwizualizuj nowo spolimeryzowane mikrotubule na długości fali odpowiedniej dla tubuliny znakowanej fluorescencyjnie w mieszance Bright (Tabela 3), aby określić, jakie rozcieńczenie mikrotubul należy zastosować w nadchodzących eksperymentach.

pkt. pkt.

Odczynnik	Jasna mieszanka (μL)	Kolejność dodawania	Jasna mieszanka + biotyna (μL)	Kolejność dodawania
Tubulina fluorescencyjna, 10 mg/ml	cyfra arabska	6	cyfra arabska	7
Biotyna-tubulina, 10 mg/ml	0	N/a	cyfra arabska	6
Tubulina nieznakowana, 10 mg/ml	20	5	Rozdział 18	5
GMPCPP, 10 mM	Rozdział 30	4	Rozdział 30	4
naziemna telewizja cyfrowa, 0,2 m	0,7	3	0,7	3
5 modułów BRB80	Pytanie 26,4	cyfra arabska	Pytanie 26,4	cyfra arabska
sterylna woda	52,9	1	52,9	1
Całkowita objętość (μL)	Rozdział 132		Rozdział 132

Tabela 3: Mieszanka nasion GMPCPP. Składniki nasion mikrotubul GMPCPP, w tym objętość i kolejność dodawania. Przygotować 5 μl porcji i przechowywać przez okres do 1 roku w temperaturze -80 °C.

4. Ustawienia mikroskopu

1. Temperatura: Ustaw temperaturę mikroskopu na 28 °C, aby view dynamiczne mikrotubule.
2. Filtry: Użyj najlepszej kombinacji kostek filtracyjnych i filtrów emisyjnych, w zależności od kanałów fluorescencyjnych, które mają być obrazowane. Aby zobrazować długości fal 488 nm, 560 nm i 647 nm w tym samym eksperymencie, użyj czteropasmowego zestawu laserowego 405/488/560/647 nm w połączeniu z filtrami emisyjnymi dla wyznaczonych długości fal.
3. Wyrównaj lasery: Upewnij się, że wiązki laserowe użyte w eksperymencie są wyrównane. Określ natężenie lasera dla eksperymentu empirycznie, tak aby wszystkie białka fluorescencyjne mogły być obrazowane z najwyższym możliwym stosunkiem sygnału do szumu, ale nie były poddawane znaczącemu fotowybielaniu w trakcie trwania eksperymentu.
4. Obiektyw: Użyj papieru do soczewek, aby wyczyścić obiektyw 100x z 70% etanolem. Przed obrazowaniem dodaj do obiektywu kroplę olejku immersyjnego do mikroskopu.
5. Konfigurowanie sekwencji obrazowania
   1. W przypadku eksperymentu z biotynylowanymi mikrotubulami znakowanymi fluoroforem o długości fali 647 nm, niebiotynylowanymi mikrotubulami i rozpuszczalną tubuliną znakowanymi fluoroforem o długości fali 560 nm oraz białkiem znakowanym GFP, obraz przez 20 minut. Obraz kanałów 560 nm i 488 nm co 10 s oraz kanału 647 nm co 30 s.
   2. Aby uchwycić obraz referencyjny wiązek przed dodaniem rozpuszczalnej tubuliny i MAP, należy ustawić sekwencję z jednym obrazem każdy w długościach fal 560 nm i 647 nm.

5. Generuj unieruchomione powierzchniowo wiązki mikrotubul

UWAGA: W następnych krokach, przelej wszystkie roztwory do komory przepływowej, pipetując na jedną otwartą stronę, jednocześnie kładąc bibułę filtracyjną na drugiej stronie. Chroń komorę obrazowania przed światłem, aby zmniejszyć fotowybielanie białek znakowanych fluorescencyjnie. Przyklej przyklej przyklejoną komorę obrazowania do uchwytu na szkiełko (Rysunek 1G,H). Postępuj zgodnie z krokami podanymi w Tabeli 4, które odpowiadają protokołowi steps 5.2-6.4.

1. Przygotować rozpuszczalną mieszankę tubuliny zgodnie z tabelą 5 i przechowywać ją na lodzie.
   UWAGA: Rozpuszczalna tubulina musi być zawsze umieszczana na lodzie, aby zapobiec polimeryzacji. Przygotowuj świeżą rozpuszczalną mieszankę tubuliny mniej więcej co 2 godziny lub gdy mikrotubule przestają polimeryzować.
2. Aby unieruchomić mikrotubule za pomocą wiązania biotyna-neutrawzyna-biotyna, należy najpierw przelać roztwór neutrawidyny (NA) do momentu napełnienia komory (~7,5 μL) i inkubować przez 5 minut.
3. Umyć 10 μl MB-cold.
4. Wlej 7,5 μl białka blokującego κ-kazeinę (KC) i inkubuj przez 2 minuty.
5. Przemyć 10 μl MB-warm w celu przygotowania komory do wprowadzenia mikrotubul.
6. Rozcieńczyć zapas biotynylowanych mikrotubul (zgodnie z obserwacjami w kroku 3.3.2) w 1X BRB80-DTT i dodać 1 μl tego rozcieńczenia do 9 μl ciepłego MB. Przelej mieszaninę do komory i inkubuj przez 10 minut. Użyj wyższego stężenia mikrotubul, aby uzyskać więcej wiązek.
7. Nieunieruchomione mikrotubule zmyć 10 μl ciepłego MB.
8. Wlać 7,5 μl ciepłego KC do komory i inkubować przez 2 minuty.
9. Podczas inkubacji przygotować 2 nM roztwór białka sieciującego PRC1 w ciepłym KC. Przelać 10 μL tego roztworu do komory przepływowej i inkubować przez 5 min.
   UWAGA: Rekombinowany PRC1 ulega ekspresji i oczyszcza się z komórek bakteryjnych, jak opisano wcześniej¹³.
10. Aby utworzyć wiązki, należy wlać 10 μl niebiotynylowanych mikrotubul do komory i inkubować przez 10 minut. PRC1 usieciuje niebiotynylowane i unieruchomione biotynylowane mikrotubule ^15,16 (Rysunek 3).
    UWAGA: Patrz krok 6.1, aby zapoznać się z przygotowaniem mieszaniny do oznaczania w czasie inkubacji.
11. Umyć komorę dwukrotnie 10 μl MB-warm. Dołączone mikrotubule są stabilne przez około 20 minut od tego momentu.

.

krok	Odczynnik	Objętość (μL)	Czas inkubacji (minuty)
1	Neutrawidyna	7,5	5
cyfra arabska	MB-zimno	10	-
3	κ-kazeina	7,5	cyfra arabska
4	MB-ciepły	10	-
5	Biotynylowana mikrotubula (rozcieńczona w MB-ciepłym)	10	10
6	MB-ciepły	10	-
7	Ciepła κ-kazeina	7,5	cyfra arabska
8	2 nM PRC1 rozcieńczony w κ-kazeinie	10	5
9	Mikrotubule niebiotynylowane	10	10
10	MB-ciepły x 2	10	-
11	Mieszanina testowa	10	-
Dołączone nasiona są w tym momencie stabilne przez około 20 minut

Tabela 4: Etapy testowania. Wykaz odczynników dodanych do komory obrazowania, ze wskazaniem czasu przemywania (-) lub inkubacji.

Odczynnik	Objętość (μL)
Tubulina z recyklingu, 10 mg/ml	10
MB-Zimno	Rozdział 10.3
Biblioteka MBMC	13,7
BRB80-Naziemna telewizja cyfrowa	3.4
GTP, 10 mM	6.7
ATP, 10 mM (W przypadku używania kinezyny)	6.7
Tubulina znakowana fluorescencyjnie, 10 mg/ml	1 (Ponownie zawiesić liofilizowaną znakowaną tubulinę w zimnym BRB80-DTT)

Tabela 5: Rozpuszczalne składniki mieszanki tubuliny. Wymieszaj na początku eksperymentu i trzymaj na lodzie.

Rysunek 3: Schemat dodawania składników testowych do tworzenia i obrazowania fluorescencyjnie znakowanych wiązek i pojedynczych mikrotubul.Biotynylowane nasiona są pokazane w kolorze niebieskim, nasiona niebiotynylowane i rozpuszczalna tubulina w kolorze czerwonym, PRC1 w kolorze czarnym, a białko będące przedmiotem zainteresowania w kolorze cyjanu. Numery kroków na rysunku odpowiadają numerom w tabeli 4. Panel odpowiadający krokowi 9 pokazuje wstępnie uformowaną wiązkę (na dole po lewej); Krok 11 pokazuje nowo utworzony pakiet (w lewym górnym rogu). Stworzony z BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Dynamika mikrotubul obrazu

1. Podczas 10-minutowego czasu inkubacji opisanego w kroku 5.10 należy przygotować 10 μl mieszanki testowej zawierającej interesujące białka, rozpuszczalną tubulinę, nukleotydy, zmiatacze tlenu¹⁴ i przeciwutleniacze zgodnie z tabelą 6. Trzymaj mieszankę na lodzie.
2. Załaduj przygotowaną komorę obrazowania, przyklejoną taśmą do uchwytu szkiełka, na obiektyw TIRF 100x. Użyj kanałów 560 nm i 647 nm, aby znaleźć pole widzenia, które zawiera optymalną liczbę i gęstość pojedynczych mikrotubul i wiązek.
   UWAGA: Jeśli zarówno biotynylowane, jak i niebiotynylowane mikrotubule są znakowane tym samym fluoroforem, analizy liniowe intensywności fluorescencji mogą rozróżnić pojedyncze mikrotubule i wiązki.
3. Po zidentyfikowaniu pola widzenia wykonaj zdjęcie referencyjne.
4. Ostrożnie przepływać w mieszance testowej, nie naruszając komory obrazowania.
5. Uszczelnij otwarte końce komory uszczelniaczem valap.
6. Rozpocznij sekwencję obrazowania zgodnie z opisem w kroku 4.5.1.

Odczynnik	Objętość (μL)
Rozpuszczalna mieszanka tubuliny	4
Osf	1
Trolox (w przypadku stosowania mikrotubul oznaczonych łatwo fotowybielającym fluoroforem)	1
ATP, 10 mM (W przypadku używania kinezyny)	1
PRC1 (lub preferowany środek sieciujący)	1
Interesujące białka	Z
MB-zimno	2-krotny

Tabela 6: Składniki mieszanki testowej. Wymieszać, przelać do komory obrazowania i zobrazować dynamikę mikrotubul w ciągu 30 minut.

Wyniki

Eksperyment opisany powyżej został przeprowadzony przy użyciu mikrotubul biotynylowanych znakowanych fluoroforem 647 nm, mikrotubul znakowanych fluoroforem 560 nm i mieszaniny tubuliny rozpuszczalnych znakowanych fluoroforem 560 nm. Mikrotubule zostały usieciowane przez białko sieciujące PRC1 (znakowane GFP). Po wygenerowaniu unieruchomionych powierzchniowo wiązek i pojedynczych mikrotubul (krok 5.11), komora obrazowania została zamontowana na obiektywie olejowym TIRF 100X 1,49 NA i oglądana w kanałach fluorescencyjnych ...

Dyskusja

Opisany tutaj eksperyment znacznie rozszerza zakres i złożoność konwencjonalnych testów rekonstytucji mikrotubul, które tradycyjnie wykonuje się na pojedynczych mikrotubulach lub na jednym typie matrycy. Obecny test zapewnia metodę jednoczesnego ilościowego określania i porównywania regulacyjnej aktywności MAP w dwóch populacjach, a mianowicie pojedynczych mikrotubulach i usieciowanych wiązkach. Co więcej, test ten pozwala na zbadanie dwóch rodzajów wiązek: tych, które są wstępnie uformowane ze stabilnych nasion przed za...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
(±)-6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy kwas (Trolox)	Sigma Aldrich	238813
1,4-piperazynodienasulfonowy kwas (PIPES)	Sigma Aldrich	P6757
18x18 mm #1.5 szkiełka nakrywkowe	Mikroskopia elektronowa Nauki	63787
2-merkaptoetanol (BME)	Sigma Aldrich	M-6250
24x60 mm #1.5 szkiełka nakrywkowe	Nauki o mikroskopii elektronowej	63793
405/488/560/647 nm Laser Quad Band	Chroma	TRF89901-NK
Aceton	Sigma Aldrich	320110
Adenozyno-5'-trifosforan sól disodowa hydrat (ATP)	Sigma Aldrich	A7699-5G
Avidin, NeutrAvidin® Białko wiążące biotynę (sondy molekularne®)	Thermo Fischer Scientific	A2666
Sonikator do kąpieli: Branson 2800 Cleaner	Branson	CPX2800H
Beckman Coulter Rury grubościenne z poliwęglanu, 11 x 34 mm	Beckman-Coulter
Beckman Coulter Rury grubościenne z poliwęglanu, 8 x 34 mm	Beckman-Coulter
Biotyna-PEG-SVA, MW 5,000	Laysan Bio	#Biotin-PEG-SVA-5000
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma Aldrich	2905
Katalaza	Sigma Aldrich	C40
Mini mikrowirówka Corning LSE, AC100-240V	Corning	6670
Chusteczki do delikatnych zadań	Kimtech	34120
Ditiotriitol (DTT)	GoldBio	DTT10
Filtr emisyjny	Chroma	ET610/75m
Etanol (200-proof)	Decon Labs	2705
Kwas tetraoctowy glikolu etylenowego (EGTA)	Sigma Aldrich	3777
Oksydaza glukozowa	Sigma Aldrich	G2133
GMPCPP	Jena Bioscience	NU-405
Hydrat soli sodowej 5'-trifosforanu guanozyny (GTP)	Sigma Aldrich	G8877
Hellmanex III detergent	Sigma Aldrich	Z805939
Olejek immersyjny, typ A	Fisher Scientific	77010
Kappa-kazeina	Sigma Aldrich	C0406
Lanolina	Fisher Scientific	S25376
Chusteczka do czyszczenia soczewek	ThorLabs	MC-5
Chlorek magnezu (MgCl2)	Sigma Aldrich	M9272
Metyloceluloza	Sigma Aldrich	M0512
Microfuge 16 Wirówka stołowa	Beckman-Coulter	A46474
Szkiełka mikroskopowe, szkło diamentowo-białe, 25 x 75mm, 90° Szlifowane krawędzie, BIAŁY matowy	globus Scientific	1380-50W
mPEG-Walerianian sukcynimidylu, MW 5,000	Laysan Bio	#NH2-PEG-VA-5K
Optima&handel; Ultrawirówka stołowa Max-XP	Beckman-Coulter
Paraffin	Fisher Scientific	P31-500
PELCO Rewers (samozamykający), Drobna pęseta	Ted Pella	5377-NM
Wazelina, Biała	Fisher Scientific	18-605-050
, 115V	Harrick Plasma	PDC-001
Wodorotlenek potasu (KOH)	Sigma Aldrich	221473
Wodorowęglan sodu	Sigma Aldrich	S6014
Sacharoza	Sigma Aldrich	S7903
Thermal-Lok 1-pozycyjna sucha kąpiel cieplna	USA Scientific	2510-1101
Blok termiczny Lok do probówek 1,5 i 2,0 ml	USA Scientific	2520-0000
Thermo Scientific™ Pierce™ Łamacz obligacji i handel; Roztwór TCEP, neutralne pH; 500mM	Thermo Fischer Scientific	PI-77720
TIRF 100X NA 1.49 Obiektyw olejowy	Nikon	CFI Apochromat TIRF 100XC Olej Mikroskop
TIRF	Nikon	Eclipse Ti
TLA 120.1 wirnik	Beckman-Coulter
Wirnik TLA 120.2	Beckman-Coulter
Białko tubuliny (>99% czystości): mózg świni	Cytoszkielet	T240
Białko tubuliny (biotyna):	cytoszkielet	T333P
Białko tubuliny (fluorescencyjne HiLyte 647):	cytoszkielet	TL670M
Białko tubuliny (X-rodamina): mózg bydlęcy	Cytoszkielet	TL620M
VECTABOND® Odczynnik, wektor adhezji przekroju tkankowego	Biolabs	SP-1800-7
VWR® Inkubator osobisty, 120 V, 50/60 Hz, 0,6 A	VWR	97025-630