Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja transportu żelaza przez łożysko myszy in vivo przy użyciu nieradioaktywnych izotopów żelaza

DOI:

10.3791/63378

⸱

10 maja 2022

 , 
1Center for Iron Disorders, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł pokazuje, jak przygotować i podawać nieradioaktywne izotopowe żelazo związane z transferyną do badań nad transportem żelaza w ciąży myszy. Opisano również podejście do ilościowego oznaczania izotopowego żelaza w przedziałach płodowo-łożyskowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żelazo jest niezbędne dla zdrowia matki i płodu podczas ciąży, a około 1 g żelaza jest potrzebne ludziom do utrzymania zdrowej ciąży. Zaopatrzenie płodu w żelazo jest całkowicie zależne od transferu żelaza przez łożysko, a zaburzenia tego transferu mogą prowadzić do niekorzystnych wyników ciąży. U myszy pomiar strumieni żelaza przez łożysko tradycyjnie opierał się na radioaktywnych izotopach żelaza, co było bardzo czułym, ale uciążliwym podejściem. Stabilne izotopy żelaza (57Fe i 58Fe) stanowią nieradioaktywną alternatywę do stosowania w badaniach nad ciążą u ludzi.

W warunkach fizjologicznych, żelazo związane z transferyną jest dominującą formą żelaza pobieranego przez łożysko. W związku z tym 58Fe-transferyny przygotowano i wstrzyknięto dożylnie ciężarnym matkom, aby bezpośrednio ocenić transport żelaza przez łożysko i ominąć wchłanianie żelaza przez jelita matki jako zmienną zakłócającą. Izotopowe żelazo oznaczono ilościowo w łożysku i tkankach embrionalnych myszy za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS). Metody te mogą być również stosowane w innych modelach zwierzęcych, systemach fizjologii lub chorób w celu ilościowego określenia dynamiki żelaza in vivo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żelazo jest kluczowe dla różnych procesów metabolicznych, w tym wzrostu i rozwoju, produkcji energii i transportu tlenu1. Utrzymanie homeostazy żelaza jest dynamicznym, skoordynowanym procesem. Żelazo jest wchłaniane z pożywienia w dwunastnicy i transportowane po organizmie w krążeniu związanym z białkiem transportującym żelazo transferyną (Tf). Jest wykorzystywany przez każdą komórkę do procesów enzymatycznych, włączany do hemoglobiny w powstających erytrocytach i poddawany recyklingowi ze starzejących się erytrocytów przez makrofagi. Żelazo jest magazynowane w wątrobie, gdy jest w nadmiarze i jest tracone z organizmu w wyniku krwotoku lub złuszczania się komórek. Ilość żelaza w obiegu jest wynikiem równowagi między spożyciem a podażą żelaza, przy czym to ostatnie jest ściśle regulowane przez hormon wątrobowy hepcydynę (HAMP), centralny regulator homeostazy żelaza1. Funkcje hepcydyny ograniczają biodostępność żelaza we krwi poprzez okluzję lub indukcję ubikwitynacji i degradację eksportera żelaza ferroportyny (FPN)2. Zmniejszenie funkcjonalnego FPN prowadzi do zmniejszonego wchłaniania żelaza w diecie, sekwestracji żelaza w wątrobie i zmniejszonego recyklingu żelaza z makrofagów1.

Hepcydyna jest regulowana przez stan żelaza, stan zapalny, napęd erytropoetyczny i ciążę (przejrzane w 3). Biorąc pod uwagę, że homeostaza żelaza jest bardzo dynamiczna, ważne jest, aby zrozumieć i zmierzyć całkowitą pulę żelaza oraz rozkład i obrót żelazem. Badania na zwierzętach tradycyjnie opierały się na radioaktywnych izotopach żelaza, które są bardzo czułym, ale uciążliwym podejściem do pomiaru dynamiki żelaza. Jednak w nowszych badaniach, w tym w badaniu przedstawionym tutaj4, nieradioaktywne, stabilne izotopy żelaza (58Fe) są wykorzystywane do pomiaru transportu żelaza podczas ciąży5,6,7,8,9. Stabilne izotopy są cennymi narzędziami do badania metabolizmu składników odżywczych (recenzja w 10). Zastosowanie stabilnych izotopów żelaza w badaniach na ludziach wykazało, że i) wchłanianie żelaza wzrasta pod koniec ciąży5,6, ii) transfer żelaza z diety do płodu zależy od stanu żelaza u matki7, iii) żelazo hemowe spożywane przez matkę jest łatwiej wchłaniane przez płód niż żelazo niehemowe8oraz iv) transfer żelaza do płodu jest ujemnie skorelowany z poziomem hepcydyny u matki8,9. Eksperymenty te mierzyły izotopy żelaza w surowicach lub ich włączenie do erytrocytów; jednak pomiar żelaza zawartego w samych erytrocytach może zaniżać rzeczywistą absorpcję żelaza9. W obecnym badaniu w tkankach mierzy się zarówno żelazo hemowe, jak i niehemowe.

Podczas ciąży żelazo jest niezbędne do wspomagania zwiększania objętości czerwonych krwinek matki oraz do transferu przez łożysko, aby wspierać wzrost i rozwój płodu11. Zaopatrzenie płodu w żelazo jest całkowicie zależne od transportu żelaza przez łożysko. Podczas ciąży human12 i gryzoń4,13 poziom hepcydyny drastycznie spada, zwiększając dostępność żelaza w osoczu do transferu do płodu.

Podstawy transportu żelaza przez łożysko zostały początkowo scharakteryzowane w latach 1950-70 za pomocą radioaktywnych znaczników (59Fe i 55Fe). Badania te wykazały, że transport żelaza przez łożysko jest jednokierunkowy14,15 i że transferyna diferryczna jest głównym źródłem żelaza dla łożyska i płodu16,17. Obecna wiedza na temat transportu żelaza przez łożysko jest bardziej kompletna, chociaż niektóre kluczowe transportery żelaza i mechanizmy regulacyjne pozostają nieznane. Modele mysie były niezbędne do zrozumienia regulacji i transportu żelaza18, ponieważ kluczowe transportery i mechanizmy są niezwykle podobne. Zarówno ludzkie, jak i mysie łożyska są hemochoralne, co oznacza, że krew matki jest w bezpośrednim kontakcie z kosmówką płodu19. Istnieją jednak pewne znaczące różnice strukturalne.

Syncytiotrofoblast to warstwa komórek łożyska, która oddziela krążenie matki i płodu oraz aktywnie transportuje żelazo i inne składniki odżywcze20. U ludzi syncytiotrofoblast jest pojedynczą warstwą połączonych komórek. Natomiast łożysko myszy składa się z dwóch warstw syncytiotrofoblastu21, Syn-I i Syn-II. Jednak połączenia szczelinowe na granicy Syn-I i Syn-II umożliwiają dyfuzję składników odżywczych między warstwami22,23. W ten sposób warstwy te funkcjonują jako pojedyncza warstwa syncytialna podobna do ludzkiego syncytiotroblastu. Dodatkowe podobieństwa i różnice między ludzkimi i mysimi łożyskami są analizowane przez Rossanta i Cross21. Transport żelaza przez łożysko jest wyzwalany przez wiązanie żelaza-Tf z krwi matki z receptorem transferyny (TfR1) zlokalizowanym po wierzchołkowej stronie syncytiotroblastu24. Ta interakcja indukuje internalizację żelaza-Tf / TfR1 poprzez endocytozę za pośrednictwem klatryny25. Żelazo jest następnie uwalniane z Tf w kwaśnym endosomie26, redukowane do żelaza żelazawego przez nieokreśloną ferryreduktazę i eksportowane z endosomu do cytoplazmy przez jeszcze nieokreślony transporter. Do opisania pozostaje również sposób, w jaki żelazo jest opiekowane w syncytiotrofoblastach. Żelazo jest ostatecznie transportowane na stronę płodu przez eksporter żelaza, FPN, zlokalizowany na podstawowej lub skierowanej w stronę płodu powierzchni syncytiotrofoblastu (recenzja w27).

Aby zrozumieć, jak fizjologiczna i patologiczna regulacja TfR1, FPN i hepcydyny wpływa na transport żelaza przez łożysko, wykorzystano stabilne izotopy żelaza do ilościowego określenia transportu żelaza z krążenia matki do łożyska i zarodka in vivo4. W pracy przedstawiono metody przygotowania i podawania izotopowej transferyny żelaza ciężarnym myszom, przetwarzania tkanek w kierunku ICP-MS oraz obliczania stężeń żelaza w tkankach. Zastosowanie stabilnych izotopów żelaza in vivo można dostosować do badania regulacji i dystrybucji żelaza w różnych modelach zwierzęcych w celu zbadania fizjologicznej i patologicznej regulacji żelaza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły i procedury eksperymentalne dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles.

1. Przygotowanie 58Fe-Tf

UWAGA: Protokół używa 58Fe; jednak identyczny protokół może być użyty dla 57Fe. Każdy izotop może być używany i utylizowany jako standardowa substancja chemiczna żelaza bez dodatkowych środków ostrożności.

  1. Rozpuścić 58Fe w 12 N HCl w 50 μl HCl/mg 58Fe.
    1. Dodaj HCl do metalu w szklanej fiolce dostarczonej przez sprzedawcę i luźno załóż nakrętkę. Aby rozpuścić żelazko, należy ogrzać roztwór 58Fe/HCl do temperatury 60 °C przez 1 godzinę. Jeśli roztwór nadal nie jest rozpuszczony, pozostaw go na noc w temperaturze pokojowej w dygestoriach do rozpuszczenia.
      UWAGA: Rozpuszczony roztwór 58Fe/HCl ma kolor żółtawo-pomarańczowy.
      Fe3O4(s) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl2(aq) + 2Fe(III)Cl3(aq) + 4H2O
  2. Utlenić pozostały Fe(II)Cl2 w celu wytworzenia roztworu Fe(III)Cl3.
    1. Podgrzej roztwór 58Fe/HCl do temperatury 60 °C ze zdjętą nakrętką, aby ułatwić utlenianie.
    2. Dodać 1 μl 35%H2O2 na 50 μl roztworu 58Fe/HCl, aby jeszcze bardziej ułatwić utlenianie.
      Fe(II)Cl2(aq) + O2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) + 2H2O
  3. Przygotować roztwór chlorku żelaza (58Fe(III)Cl3).
    1. Pozostawić roztwór chlorku żelaza w okapie w temperaturze 60 °C ze zdjętą nakrętką w celu odparowania próbki.
      UWAGA: Parowanie może potrwać od jednego do kilku dni.
    2. Rozpuść 58Fe(III)Cl3 do 100 mM ultraczystymH2Oi oblicz wymaganą ilość ultraczystegoH2Ona podstawie początkowej masy metalu użytego w kroku 1.1 (masa cząsteczkowa 58Fe(III)Cl3 wynosi 162.2).
  4. Przygotować 58Fe(III)-nitrylotriooctan (NTA) przez inkubację 58Fe(III)Cl3 z NTA w stosunku molowym 1:5 w obecności 20 mM NaHCO3.
    1. Przygotować 500 mM NTA w 1 N NaOH.
    2. Przygotować 5x bufor ładujący transferynę (0,5 M HEPES, pH 7,5; 0,75 M NaCl).
    3. Przygotować 1 M NaHCO3 w ultraczystymH2O.
    4. Do stożkowej probówki o pojemności 15 ml dodać 150 μl 100 mM roztworu 58Fe(III)Cl3 (z kroku 1.3.2), 150 μl 500 mM NTA przygotowanego w 1 N NaOH, 480 μl ultraczystegoH2O, 200 μl 5-krotnego buforu ładującego transferynę i 20 μl 1 M roztworu NaHCO3.
    5. Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Załaduj apo-Tf 58Fe(III)-NTA, aby utworzyć 58Fe-Tf.
    UWAGA: Ten protokół został zaadaptowany z McCarthy and Kosman28.
    1. Rozpuścić 500 mg apo-Tf w 4 ml 1x buforu ładującego Tf.
    2. Do stożkowej probówki o pojemności 15 ml w kroku 1.4.4 zawierającej 1 ml roztworu 58Fe(III)-NTA, dodać 4 ml roztworu apo-Tf.
      UWAGA: Jest to stosunek molowy 3:1 58Fe-NTA z apo-Tf. Każdy Tf zawiera 2 miejsca wiązania Fe; nadmiar 58Fe-NTA został dodany, aby upewnić się, że Tf jest w pełni załadowany.
    3. Aby umożliwić maksymalne obciążenie 58Fe-NTA apo-Tf, sprawdź, czy roztwór ma pH 7,5 i w razie potrzeby dostosuj pH za pomocąNaHCO3 lub HCl.
    4. Inkubować przez 2,5 godziny w temperaturze pokojowej.
  6. Usunąć nadmiar niezwiązanego 58Fe(III)-NTA i uwolnionego NTA.
    1. Przenieść roztwór 58Fe-Tf do kolumny odcinającej masę cząsteczkową (odcięcie 30 kDa) i odwirować przy 2 500 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Przemyć kolumnę 10 ml 1x buforu ładującego transferynę i odwirować przy 2 500 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Powtórzyć mycie i odwirowanie, przepłukać solą fizjologiczną 10 ml soli fizjologicznej i odwirować przy 2500 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Obliczyć stężenie 58Fe-Tf.
    UWAGA: Ze względu na dodanie nadmiaru 58Fe w kroku 1.5.2 należy założyć, że cała transferyna jest diferryczna. Ponieważ użyto 500 mg apo-Tf, w kroku 1.5.4 wyprodukowano ~500 mg 58Fe-Tf.
    1. Zmierzyć objętość odzyskaną z wirowania po przemyciu solą fizjologiczną w kroku 1.6.2.
    2. Podzielić 500 mg przez odzyskaną objętość, aby określić stężenie (w mg/ml) roztworu 58Fe-Tf.
  8. Wysterylizować roztwór 58Fe-Tf za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm; przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do użycia.
    UWAGA: Roztwór 58Fe-Tf stosowano od 1 do 4 tygodni po przygotowaniu.

2. Ustaw ciąże myszy z czasem

  1. Użyj 6- do 8-tygodniowych samic myszy. Umieść zwierzęta na diecie o niskiej zawartości żelaza (4 ppm żelaza) lub standardowej karmie (185 ppm żelaza) na 2 tygodnie przed kryciem i utrzymuj zwierzęta na odpowiednich dietach przez całą ciążę.
  2. Opcja 01: Potwierdź ciążę poprzez przyrost masy ciała w E7.5.
    1. Skonfiguruj wiele klatek hodowlanych. W każdej klatce połącz 2 samice z 1 samcem na noc; następny dzień, w którym zwierzęta są rozdzielane, uważa się dzień embrionalny (E)0,5. Zważ samice w E7.5, aby określić, czy jest w ciąży. Ponownie kojarz samce z samicami, które nie przybrały na wadze.
      UWAGA: W WT C57BL/6 przyrost masy ciała o 1 g przy E7,5 jest dobrym wskaźnikiem ciąży. Metoda ta zapewnia, że implantacja nastąpiła w określonym przedziale czasowym 16 godzin, co pozwala na synchroniczne leczenie wszystkich zwierząt, które zaszły w ciążę w tym samym okresie krycia.
  3. Opcja 02: Potwierdź ciążę za pomocą kontroli wtyczki.
    1. Połącz 2 samice z 1 samcem i wykonuj codzienne kontrole wtyczek, aby ustalić, czy doszło do kopulacji.
      UWAGA: Ta metoda może skutkować rozłożeniem ciąży w czasie, a obecność zatyczki nie gwarantuje ciąży.

3. Podaj dożylnie 58Fe-Tf ciężarnym myszom z E17.5

  1. Przygotować 58Fe-Tf z kroku 1.8 do wstrzyknięcia.
    1. Przygotować 58roztworów Fe-Tf o stężeniu 35 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej; wstrzyknąć 100 μl na mysz.
    2. Napełnij strzykawkę insulinową 100 μl roztworu 58Fe-Tf.
      UWAGA: Każda dawka zawiera 3,5 mg ludzkiego 58Fe-Tf (5 μg 58Fe).
  2. Znieczulij ciężarną mysz za pomocą izofluranu.
    1. Użyj regulatora izofluranu z komorą.
    2. Użyj następujących ustawień: 5% izofluranu, 2 l/mlO2, 2 min.
    3. Upewnij się, że mysz jest znieczulona, szukając braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
    4. Nałóż smar do oczu na powierzchnię oka i umieść mysz na poduszce grzewczej.
  3. Powoli i ostrożnie wstrzyknąć roztwór 58Fe-Tf do zatoki zaoczodołowej.
  4. Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu; nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.
  5. Sześć godzin po wstrzyknięciu poddać eutanazji ciężarne kobiety E17,5 przez przedawkowanie izofluranu.
    1. Wykonaj nakłucie serca w celu wykrwawienia myszy jako formę wtórnej eutanazji.
    2. Przypnij stopy igłami w celu stabilizacji.
  6. Zbierz łożyska i wątroby zarodków.
    1. Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek preparacyjnych ostrożnie usuń macicę z ciężarnej myszy. Odetnij łożyskową jednostkę płodowo-łożyskową, która składa się z pojedynczego płodu i łożyska w worku owodniowym otoczonym częścią macicy.
    2. Ostrożnie przeciąć macicę i worek owodniowy, nie naruszając płodu i łożyska.
    3. Oderwij worek owodniowy i usuń płód i łożysko.
    4. Przetnij pępowinę.
    5. Osusz płód i łożysko czystą chusteczką, aby usunąć nadmiar płynu owodniowego.
    6. Zapisz masę całego łożyska.
    7. Przetnij każde łożysko na pół żyletką, umieść każdą połówkę w probówce o pojemności 2,0 ml i zamroź w ciekłym azocie.
      UWAGA: Ponieważ 58Fe nie wymaga specjalnych środków ostrożności związanych z obchodzeniem się i usuwaniem, połowa łożyska może być wykorzystana do pomiaru 58Fe, a druga połowa do wszelkich innych analiz, w tym do oznaczania ilościowego receptora transferyny (TFR1) i ekspresji ferroportyny (FPN) za pomocą western blotting i qPCR.
    8. Aby zebrać wątrobę zarodka, poświęć zarodek: użyj żyletki, aby szybko odciąć głowę zarodka.
      UWAGA: W przypadku E17.5 wszystkie zarodki w macicy muszą zostać poddane eutanazji indywidualnie, nawet jeśli nie są wykorzystywane w badaniu.
    9. Przygwoźdź zarodek w celu stabilizacji, pozostawiając odsłonięty brzuch.
    10. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj małe nacięcie w miejscu, w którym przymocowana była pępowina, włóż jeden koniec nożyczek preparacyjnych do nacięcia i wykonaj środkowe cięcie płaszczyzny w kierunku płaszczyzny koronalnej około 1/4 cala. Następnie wykonaj cięcia w płaszczyźnie poprzecznej, aby odsłonić wątrobę płodu.
    11. Użyj kleszczy, aby usunąć wątrobę płodu.
    12. Zapisać masę całego zarodka wątroby.
    13. Umieść całe wątroby zarodków w probówkach o pojemności 2 ml i zamroź je w ciekłym azocie.
      UWAGA: Alternatywnie, tylko część wątroby zarodka może być użyta do pomiaru 58Fe, jeśli pożądane są dodatkowe analizy. Stosowanie probówek o pojemności 2,0 ml pozwala na lepszą homogenizację tkanek niż probówki o pojemności 1,5 ml.
  7. Przechowywać tkanki przez czas nieokreślony w temperaturze -80 °C.

4. Przetwarzanie tkanek do ilościowej analizy żelaza za pomocą ICP-MS

  1. Przetwórz łożyska i wątrobę płodu w celu ilościowego oznaczenia żelaza niehemowego.
    1. Rozmrozić połówki łożyska i całe wątroby płodu oraz zważyć połówki łożyska (patrz krok 3.6.12 w celu zarejestrowania masy wątroby płodu).
    2. Dodać 400 μl roztworu do wytrącania białek (0,53 N HCl, 5,3% TCA).
    3. Homogenizuj tkankę za pomocą homogenizatora elektrycznego.
    4. Próbki należy inkubować w temperaturze 100 °C przez 1 godzinę.
    5. Schłodzić próbki w wodzie o temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    6. Otwórz nakrętki, aby zwolnić ciśnienie, a następnie ponownie zamknij rurki.
    7. Wirować przy 17 000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia szczątków tkanki.
    8. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej, oznakowanej probówki.
    9. Wyślij próbki do analizy ICP-MS.
  2. Przetwarzaj łożyska i wątroby płodu w celu ilościowego oznaczenia żelaza hemowego.
    UWAGA: Po ekstrakcji żelaza niehemowego w kroku 1, żelazo pozostałe w granulkach składa się głównie z hemu.
    1. Zanotować masę każdego granulu z kroku 4.1.7.
    2. Trawić granulki w 10 ml stężonego 70% HNO3 uzupełnionego 1 ml 30% H2O2
      UWAGA: Skonsultuj się z rdzeniem lub ośrodkiem ICP-MS, aby zoptymalizować objętość HNO3 dla określonych badań; Objętość będzie częściowo zależała od masy próbki.
    3. Podgrzewać próbki do temperatury 200 °C przez 15 minut.
    4. Wyślij próbki do analizy ICP-MS.
      UWAGA: Jeśli rozróżnienie między źródłami żelaza hemowego i niehemowego nie jest wymagane i mierzy się tylko żelazo całkowite, w pierwszym kroku można trawić całą tkankę w HNO3.

5. Analiza danych

UWAGA: Dane z ICP-MS zostały dostarczone jako 56Fe i 58Fe stężenia w ng/ml lub mg, ppb (Tabela 1). 56 Rozdział 56Fe jest najobficiej występującym izotopem żelaza w przyrodzie, a jego pomiar odzwierciedla akumulację żelaza w łożysku/zarodku przez całą ciążę, podczas gdy pomiar 58Fe odzwierciedla żelazo, które zostało przeniesione w ciągu 6 godzin po wstrzyknięciu.

  1. Odejmij naturalną obfitość 58Fe (0,28% całkowitego Fe) od zmierzonych wartości 58Fe.
  2. Obliczać całkowity nonhem 58Fe.
    1. Obliczyć całkowite stężenie żelaza niehemowego (ng) w wątrobie zarodka, mnożąc najpierw stężenie żelaza (ng/ml) obliczone w kroku 5.1 przez objętość (ml) podczas wstępnego przetwarzania w kroku 4.1.2, aby oszacować całkowite stężenieżelaza (Fe) w wątrobie zarodka, aby oszacować całkowite stężenie żelaza (ng).
    2. Obliczyć ilość żelaza w całym łożysku, biorąc całkowitą masę łożyska zmierzoną w kroku 3.6.6 i dzieląc ją przez masę łożyska przetworzonego w kroku 4.1.1. Pomnóż tę wartość przez całkowitą zawartość żelaza niehemowego (ng) obliczoną w kroku 5.2.1, aby uzyskać całkowitą zawartość niehemu 58Fe w łożysku.
  3. Oblicz całkowity hem 58Fe.
    1. Obliczyć całkowity hem 58Fe, mnożąc najpierw stężenie żelaza (ng/mg) obliczone w kroku 5.1 przez masę osadu (w mg) zmierzoną w kroku 4.2.1.
    2. Następnie należy podzielić całkowitą masę łożyska zmierzoną w kroku 3.5.1 przez masę osadu łożyska zmierzoną w kroku 4.2.1. Pomnóż tę wartość przez całkowitą zawartość hemu żelaza (ng) obliczoną w kroku 5.3.1, aby uzyskać całkowitą zawartość hemu 58Fe w łożysku.
  4. Zsumuj obliczone wartości nonhemu i hemu 58Fe, aby określić całkowitą zawartość żelaza w każdej tkance.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Wizualne podsumowanie kroków w protokole. (A) Przygotowanie 58Fe-transferyny. (B) Podawanie in vivo 58Fe-transferyny. (C) Pobieranie i przechowywanie tkanek. (D) Przetwarzanie łożyska i wątroby zarodka w celu ilościowego oznaczania gatunków metali za pomocą ICP-MS. Skróty: Fe = żelazo; NTA = kwas nitrylotroctowy; Tf = transferyna; PPS = roztwór do wytrącania białek; Sup = supernatant; TCA = kwas trichlorooctowy; ICP-MS = spektrometria mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniejsze badanie z użyciem stabilnych izotopów żelaza do pomiaru transportu żelaza wykazało, że niedobór żelaza u matki spowodował obniżenie poziomu eksportera żelaza przez łożysko, FPN4. FPN jest jedynym znanym eksporterem żelaza u ssaków, a brak FPN podczas rozwoju powoduje śmierć zarodka przed E9.529. Aby ustalić, czy obserwowany spadek ekspresji FPN przekłada się funkcjonalnie na zmniejszony transport żelaza przez łożysko, 58Fe-Tf wstrzyknięto dożylnie ci...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żelazo jest ważne dla wielu procesów biologicznych, a jego ruch i dystrybucja w organizmie są bardzo dynamiczne i regulowane. Stabilne izotopy żelaza stanowią spójną i wygodną alternatywę dla izotopów promieniotwórczych do oceny dynamiki homeostazy żelaza. Krytycznym krokiem w protokole jest śledzenie wszystkich mas i objętości tkanek. Żelazo jest pierwiastkiem i dlatego nie może być syntetyzowane ani rozkładane. W ten sposób, jeśli wszystkie masy i objętości są dokładnie rejestrowane, całe żelazo w systemie można rozlic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EN jest naukowym współzałożycielem Intrinsic LifeSciences i Silarus Pharma oraz konsultantem dla Protagonist, Vifor, RallyBio, Ionis, Shield Therapeutics i Disc Medicine. Program VS deklaruje brak konfliktów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za pomoc w optymalizacji protokołu dla 58pomiarów Fe w ramach ICP-MS w UC Center for Environmental Implications of Nanotechnology in CNSI na UCLA. Badanie było wspierane przez NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (K01DK127004, do VS) oraz NIH National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD096863, do EN).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
58Fe-żelazometalTrace Sciences International FiltrFe-58
Amicon ultra-15, 30 kDa odcięcieMillipore Probówki wirówkowe Millipore SigmaUFC903024
15 mlFisher Scientific14-959-49B
Probówki wirówkowe, 50 mlMillipore SigmaCLS430829
Wirówka, Sorvall Legend Micro 17 MikrowirówkaFisher Scientific75002432
Wirówka, Sorvall Legend RT
Delikatne wycieraczki do zadańFisher Scientific06-666
Dieta: z niedoborem żelaza (4 ppm żelaza)Envigo TekladTD.80396
Dieta: standardowa karma (185 ppm żelaza)PicoLab5053
Nożyczki preparacyjne z krawędziątnącą 30 mmVWR25870-002
Kleszcze o długości 4-1/2 calaMcKesson157-469
HEPESFisher ScientificBP310-500
Homogenizator, Bio-Gen PRO200PROScientific01-01200
Ludzka apo-transferyna (apo-Tf)Celliance4452-01nie jest już dostępna, alternatywa: Millipore 616419
Kwas solny (HCl)Fisher ScientificA144S-500
Nadtlenek wodoru (H2O2), 35% wag. roztwór w wodzieCole-ParmerEW-88216-36
Strzykawki insulinowe, BD Lo-Dose U-100Fisher Scientific14-826-79
IsofluraneVETone502017
Parownik izofluranuSummit Anesthesia Solutions
Metalowy blok grzewczyFisher Scientific
Mikroprobówka wirówkowa z płaską nakrętkąVWR16466-064
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml o niskiej retencjiFisher Scientific02-681-320
Probówki do mikrowirówek 2,0 ml o niskiej retencjiFisher Scientific02-681-321
Filtr strzykawkowy Millex-GP, 0,22 i mikro; m, polieterosulfon, 33 mm, sterylizowany promieniami gammaMillipore SigmaSLGP033RS
Kwas nitrylotrioctowy (NTA)Sigma72560-100G
Igła 25 G x 5/8 cala podskórne ogólnego zastosowaniaPaski pH Fisher Scientific14-826AA
, plastikowe pH5,0-9,0Fisher Scientific13-640-519
Żyletki 0,22 mmVWR55411-050
Waga (g)Waga METTLER TOLEDOPB1502-S
(mg)Mettler ToledoBalance XS204
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)SigmaS5761-500G
Chlorek sodu (NaCl)Fisher ScientificS671-3
Wodorotlenek sodu (NaOH)Fisher ScientificSS266-1
Sterylna strzykawka, końcówka poślizgowa (1 ml)Fisher Scientific309659
Kwas trichlorooctowy (TCA)Fisher ScientificA322-500
Oprogramowanie
ImageLabBio-Rad
SigmaPlotSystat
odśrodkowy ,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
  2. Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131 (8), 899-910 (2018).
  3. Sangkhae, V., Nemeth, E. Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin. Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).
  4. Sangkhae, V., et al. Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).
  5. Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes. British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).
  6. Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).
  7. O'Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).
  8. Young, M. F., et al. Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources. Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).
  9. Delaney, K. M., et al. Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored. American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).
  10. Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).
  11. Fisher, A. L., Nemeth, E. Iron homeostasis during pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 106, Suppl 6 1567-1574 (2017).
  12. van Santen, S., et al. The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).
  13. Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat. Gut. 53 (5), 655-660 (2004).
  14. Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta. American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).
  15. Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies. Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).
  16. Contractor, S. F., Eaton, B. M. Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta. Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).
  17. Baker, E., Morgan, E. H. The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit. Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).
  18. Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. Knockout mouse models of iron homeostasis. Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).
  19. Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. Hemochorial placentation: development, function, and adaptations. Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).
  20. Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. Regulation of placental nutrient transport--a review. Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).
  21. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  22. Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier. Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).
  23. Shin, B. C., et al. Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta. Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).
  24. Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver. British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).
  25. Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).
  26. Tsunoo, H., Sussman, H. H. Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).
  27. Sangkhae, V., Nemeth, E. Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits. Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).
  28. McCarthy, R. C., Kosman, D. J. Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB. Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).
  29. Donovan, A., et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).
  30. Stefanova, D., et al. Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron. Blood. 130 (3), 245-257 (2017).
  31. Ramos, E., et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).
  32. Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase. Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).
  33. Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).
  34. Gunshin, H., et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transport elaza przez o yskostabilne izotopy elazaelazo zwi zane z transferrynanaliza ICP MSelazo w w trobie p oduhomogenizacja tkanekoznaczanie ilo ci elaza

Powiązane artykuły