Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja transportu żelaza przez łożysko myszy in vivo przy użyciu nieradioaktywnych izotopów żelaza

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63378

⸱

10 maja 2022

 , 
1Center for Iron Disorders, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł pokazuje, jak przygotować i podawać nieradioaktywne izotopowe żelazo związane z transferyną do badań nad transportem żelaza w ciąży myszy. Opisano również podejście do ilościowego oznaczania izotopowego żelaza w przedziałach płodowo-łożyskowych.

Streszczenie

Żelazo jest niezbędne dla zdrowia matki i płodu podczas ciąży, a około 1 g żelaza jest potrzebne ludziom do utrzymania zdrowej ciąży. Zaopatrzenie płodu w żelazo jest całkowicie zależne od transferu żelaza przez łożysko, a zaburzenia tego transferu mogą prowadzić do niekorzystnych wyników ciąży. U myszy pomiar strumieni żelaza przez łożysko tradycyjnie opierał się na radioaktywnych izotopach żelaza, co było bardzo czułym, ale uciążliwym podejściem. Stabilne izotopy żelaza (57Fe i 58Fe) stanowią nieradioaktywną alternatywę do stosowania w badaniach nad ciążą u ludzi.

W warunkach fizjologicznych, żelazo związane z transferyną jest dominującą formą żelaza pobieranego przez łożysko. W związku z tym 58Fe-transferyny przygotowano i wstrzyknięto dożylnie ciężarnym matkom, aby bezpośrednio ocenić transport żelaza przez łożysko i ominąć wchłanianie żelaza przez jelita matki jako zmienną zakłócającą. Izotopowe żelazo oznaczono ilościowo w łożysku i tkankach embrionalnych myszy za pomocą spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS). Metody te mogą być również stosowane w innych modelach zwierzęcych, systemach fizjologii lub chorób w celu ilościowego określenia dynamiki żelaza in vivo.

Wprowadzenie

Żelazo jest kluczowe dla różnych procesów metabolicznych, w tym wzrostu i rozwoju, produkcji energii i transportu tlenu1. Utrzymanie homeostazy żelaza jest dynamicznym, skoordynowanym procesem. Żelazo jest wchłaniane z pożywienia w dwunastnicy i transportowane po organizmie w krążeniu związanym z białkiem transportującym żelazo transferyną (Tf). Jest wykorzystywany przez każdą komórkę do procesów enzymatycznych, włączany do hemoglobiny w powstających erytrocytach i poddawany recyklingowi ze starzejących się erytrocytów przez makrofagi. Żelazo jest magazynowane w wątrobie, gdy jest w nadmiarze i jest tracone z organizmu w wyniku krwotoku lub złuszczania się komórek. Ilość żelaza w obiegu jest wynikiem równowagi między spożyciem a podażą żelaza, przy czym to ostatnie jest ściśle regulowane przez hormon wątrobowy hepcydynę (HAMP), centralny regulator homeostazy żelaza1. Funkcje hepcydyny ograniczają biodostępność żelaza we krwi poprzez okluzję lub indukcję ubikwitynacji i degradację eksportera żelaza ferroportyny (FPN)2. Zmniejszenie funkcjonalnego FPN prowadzi do zmniejszonego wchłaniania żelaza w diecie, sekwestracji żelaza w wątrobie i zmniejszonego recyklingu żelaza z makrofagów1.

Hepcydyna jest regulowana przez stan żelaza, stan zapalny, napęd erytropoetyczny i ciążę (przejrzane w 3). Biorąc pod uwagę, że homeostaza żelaza jest bardzo dynamiczna, ważne jest, aby zrozumieć i zmierzyć całkowitą pulę żelaza oraz rozkład i obrót żelazem. Badania na zwierzętach tradycyjnie opierały się na radioaktywnych izotopach żelaza, które są bardzo czułym, ale uciążliwym podejściem do pomiaru dynamiki żelaza. Jednak w nowszych badaniach, w tym w badaniu przedstawionym tutaj4, nieradioaktywne, stabilne izotopy żelaza (58Fe) są wykorzystywane do pomiaru transportu żelaza podczas ciąży5,6,7,8,9. Stabilne izotopy są cennymi narzędziami do badania metabolizmu składników odżywczych (recenzja w 10). Zastosowanie stabilnych izotopów żelaza w badaniach na ludziach wykazało, że i) wchłanianie żelaza wzrasta pod koniec ciąży5,6, ii) transfer żelaza z diety do płodu zależy od stanu żelaza u matki7, iii) żelazo hemowe spożywane przez matkę jest łatwiej wchłaniane przez płód niż żelazo niehemowe8oraz iv) transfer żelaza do płodu jest ujemnie skorelowany z poziomem hepcydyny u matki8,9. Eksperymenty te mierzyły izotopy żelaza w surowicach lub ich włączenie do erytrocytów; jednak pomiar żelaza zawartego w samych erytrocytach może zaniżać rzeczywistą absorpcję żelaza9. W obecnym badaniu w tkankach mierzy się zarówno żelazo hemowe, jak i niehemowe.

Podczas ciąży żelazo jest niezbędne do wspomagania zwiększania objętości czerwonych krwinek matki oraz do transferu przez łożysko, aby wspierać wzrost i rozwój płodu11. Zaopatrzenie płodu w żelazo jest całkowicie zależne od transportu żelaza przez łożysko. Podczas ciąży human12 i gryzoń4,13 poziom hepcydyny drastycznie spada, zwiększając dostępność żelaza w osoczu do transferu do płodu.

Podstawy transportu żelaza przez łożysko zostały początkowo scharakteryzowane w latach 1950-70 za pomocą radioaktywnych znaczników (59Fe i 55Fe). Badania te wykazały, że transport żelaza przez łożysko jest jednokierunkowy14,15 i że transferyna diferryczna jest głównym źródłem żelaza dla łożyska i płodu16,17. Obecna wiedza na temat transportu żelaza przez łożysko jest bardziej kompletna, chociaż niektóre kluczowe transportery żelaza i mechanizmy regulacyjne pozostają nieznane. Modele mysie były niezbędne do zrozumienia regulacji i transportu żelaza18, ponieważ kluczowe transportery i mechanizmy są niezwykle podobne. Zarówno ludzkie, jak i mysie łożyska są hemochoralne, co oznacza, że krew matki jest w bezpośrednim kontakcie z kosmówką płodu19. Istnieją jednak pewne znaczące różnice strukturalne.

Syncytiotrofoblast to warstwa komórek łożyska, która oddziela krążenie matki i płodu oraz aktywnie transportuje żelazo i inne składniki odżywcze20. U ludzi syncytiotrofoblast jest pojedynczą warstwą połączonych komórek. Natomiast łożysko myszy składa się z dwóch warstw syncytiotrofoblastu21, Syn-I i Syn-II. Jednak połączenia szczelinowe na granicy Syn-I i Syn-II umożliwiają dyfuzję składników odżywczych między warstwami22,23. W ten sposób warstwy te funkcjonują jako pojedyncza warstwa syncytialna podobna do ludzkiego syncytiotroblastu. Dodatkowe podobieństwa i różnice między ludzkimi i mysimi łożyskami są analizowane przez Rossanta i Cross21. Transport żelaza przez łożysko jest wyzwalany przez wiązanie żelaza-Tf z krwi matki z receptorem transferyny (TfR1) zlokalizowanym po wierzchołkowej stronie syncytiotroblastu24. Ta interakcja indukuje internalizację żelaza-Tf / TfR1 poprzez endocytozę za pośrednictwem klatryny25. Żelazo jest następnie uwalniane z Tf w kwaśnym endosomie26, redukowane do żelaza żelazawego przez nieokreśloną ferryreduktazę i eksportowane z endosomu do cytoplazmy przez jeszcze nieokreślony transporter. Do opisania pozostaje również sposób, w jaki żelazo jest opiekowane w syncytiotrofoblastach. Żelazo jest ostatecznie transportowane na stronę płodu przez eksporter żelaza, FPN, zlokalizowany na podstawowej lub skierowanej w stronę płodu powierzchni syncytiotrofoblastu (recenzja w27).

Aby zrozumieć, jak fizjologiczna i patologiczna regulacja TfR1, FPN i hepcydyny wpływa na transport żelaza przez łożysko, wykorzystano stabilne izotopy żelaza do ilościowego określenia transportu żelaza z krążenia matki do łożyska i zarodka in vivo4. W pracy przedstawiono metody przygotowania i podawania izotopowej transferyny żelaza ciężarnym myszom, przetwarzania tkanek w kierunku ICP-MS oraz obliczania stężeń żelaza w tkankach. Zastosowanie stabilnych izotopów żelaza in vivo można dostosować do badania regulacji i dystrybucji żelaza w różnych modelach zwierzęcych w celu zbadania fizjologicznej i patologicznej regulacji żelaza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt oraz procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles.

1. Przygotowanie 58Fe-Tf

UWAGA: Protokół wykorzystuje 58Fe; jednak identyczny protokół można zastosować dla 57Fe. Każdy z izotopów może być używany i utylizowany jako standardowy odczynnik żelaza bez dodatkowych środków ostrożności.

  1. Rozpuścić 58Fe w 12 N HCl przy 50 µL HCl/mg 58Fe.
    1. Dodać HCl do metalu w szklanej fiolce dostarczonej przez dostawcę i lekko zakręcić nakrętką. Aby rozpuścić żelazo, należy podgrzać 58roztwór Fe/HCl do 60 °C przez 1 h. Jeśli substancja nadal nie jest rozpuszczona, należy pozostawić roztwór na noc w temperaturze pokojowej w dygestorium do całkowitego rozpuszczenia.
      UWAGA: Rozpuszczony 58Roztwór Fe/HCl ma żółto-pomarańczowy kolor.
      Fe3O4(s) + 8HCl(roztw.) → Fe(II)Cl2(aq) + 2Fe(III)Cl3(aq) + 4 h2O
  2. Utlenić pozostały Fe(II)Cl2 do wygenerowania Fe(III)Cl3 roztwór
    1. Podgrzać 58roztwór Fe/HCl do 60 °C bez zakrętki, aby ułatwić utlenianie.
    2. Dodaj 1 µL 35% H2O22O2 na 50 µL z 58roztwór Fe/HCl w celu dalszego ułatwienia utleniania.
      Fe(II)Cl2(aq) + O2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) + 2 h2O
  3. Przygotuj chlorek żelaza (III) (58Fe(III)Cl3) roztwór.
    1. Pozostawić roztwór chlorku żelaza(III) w dygestorium w temperaturze 60 °C z odkręconą zakrętką w celu odparowania próbki.
      UWAGA: Odparowywanie może trwać od jednego do kilku dni.
    2. Rekonstytuuj 58Fe(III)Cl3 do 100 mM za pomocą ultrapure H2O2O, a następnie oblicz ilość ultrapure H2O wymagane na podstawie początkowej masy metalu użytej w kroku 1.1 (masa cząsteczkowa) 58Fe(III)Cl3 wynosi 162,2).
  4. Przygotuj 58Fe(III)-nitrilotrioctan (NTA) poprzez inkubację 58Fe(III)Cl3 z NTA w stosunku molowym 1:5 w obecności 20 mM NaHCO33.
    1. Przygotować 500 mM NTA w 1 N NaOH.
    2. Przygotować 5-krotny bufor do ładowania transferyny (0,5 M HEPES, pH 7,5; 0,75 M NaCl).
    3. Przygotuj 1 M NaHCO33 w ultrapure H2O2O.
    4. Do probówki stożkowej o pojemności 15 ml dodać 150 µL 100 mM 58Fe(III)Cl3 roztwór (z kroku 1.3.2), 150 µL 500 mM NTA przygotowanego w 1 N NaOH, 480 µL ultraczystego H2O, 200 µL buforu do ładowania transferyny 5x oraz 20 µL 1 M NaHCO33 roztwór
    5. Inkubować mieszaninę przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  5. Nasyć apo-Tf za pomocą 58Fe(III)-formularz NTA 58Fe-Tf.
    UWAGA: Protokół ten został opracowany na podstawie metody McCarthy'ego i Kosmana28.
    1. Rozpuścić 500 mg apo-Tf w 4 ml 1x buforu do ładowania Tf.
    2. Do probówki stożkowej o pojemności 15 ml z kroku 1.4.4, zawierającej 1 ml 58Fe(III)-roztwór NTA, dodać 4 mL roztworu apo-Tf.
      UWAGA: Jest to stosunek molowy 3:1 58Fe-NTA z apo-Tf. Każda cząsteczka Tf zawiera 2 miejsca wiązania Fe; nadmiar 58Dodano Fe-NTA, aby zapewnić pełne nasycenie Tf.
    3. Aby umożliwić maksymalne załadowanie 58dodanie Fe-NTA do apo-Tf, sprawdzenie, czy pH roztworu wynosi 7,5, i ewentualna korekta pH za pomocą NaHCO33 lub HCl.
    4. Inkubować przez 2,5 h w temperaturze pokojowej.
  6. Usunąć nadmiar niezwiązanej frakcji 58Fe(III)-NTA oraz uwolnione NTA.
    1. Przenieś 58roztwór Fe-Tf do kolumny z ograniczoną masą cząsteczkową (próg 30 kDa) i wirować przy 2500 × g przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    2. Przemyj kolumnę 10 ml 1x buforu do ładowania transferyny i wiruj przy 2500 × g przez 15 min w temperaturze pokojowej. Powtórzyć płukanie i wirowanie, przeprowadzić płukanie solą fizjologiczną przy użyciu 10 mL soli fizjologicznej, a następnie wirować przy 2500 × g przez 15 min w temperaturze pokojowej.
  7. Oblicz stężenie 58Fe-Tf.
    UWAGA: Ze względu na dodanie nadmiaru 58Fe w kroku 1.5.2; przyjmijmy, że cała transferyna jest dferryczna. Ponieważ zużyto 500 mg apo-Tf, otrzymano ~500 mg 58Fe-Tf zostało otrzymane w kroku 1.5.4.
    1. Zmierz objętość odzyskaną po wirowaniu po przemyciu solą fizjologiczną w kroku 1.6.2.
    2. Podziel 500 mg przez odzyskaną objętość, aby wyznaczyć stężenie (w mg/ml) preparatu 58roztwór Fe-Tf
  8. Sterylizować 58roztwór Fe-Tf przy użyciu 0.22 µm filtr strzykawkowy; przechowywać w 4 °C do momentu użycia.
    UWAGA: 58Roztworu Fe-Tf używano w okresie od 1 do 4 tygodni po przygotowaniu.

2. Przygotowanie myszy w określonym czasie ciąży

  1. Należy użyć samic myszy w wieku od 6 do 8 tygodni. Zwierzęta należy poddać diecie niskiejżelazowej (4 ppm żelaza) lub standardowej karmie (185 ppm żelaza) przez 2 tygodnie przed kojeniem i utrzymywać na odpowiednich dietach przez cały okres ciąży.
  2. Opcja 01: Potwierdzenie ciąży poprzez przyrost masy ciała w dniu E7,5.
    1. Należy przygotować wiele klatek hodowlanych. W każdej klatce należy połączyć 2 samice z 1 samcem na noc; następny dzień, w którym zwierzęta zostają rozdzielone, uznaje się za dzień embrionalny (E)0,5. Samice należy zważyć w dniu E7,5, aby określić, czy są w ciąży. Samce należy ponownie skojarzyć z samicami, które nie wykazały przyrostu masy ciała.
      UWAGA: U myszy WT C57BL/6 przyrost masy ciała o 1 g w dniu E7,5 jest dobrym wskaźnikiem ciąży. Metoda ta zapewnia, że implantacja nastąpiła w określonym oknie czasowym wynoszącym 16 h, co pozwala na synchroniczne traktowanie wszystkich zwierząt, które zaciążyły w tym samym okresie kojenia.
  3. Opcja 02: Potwierdzenie ciąży poprzez sprawdzanie obecności czopa kopulacyjnego.
    1. Należy połączyć 2 samice z 1 samcem i codziennie sprawdzać obecność czopa, aby określić, czy doszło do kopulacji.
      UWAGA: Metoda ta może prowadzić do niesynchronicznych ciąż, a obecność czopa nie gwarantuje zajścia w ciążę.

3. Dożylne podanie 58Fe-Tf u ciężarnych myszy w dniu E17.5

  1. Przygotować 58Fe-Tf z kroku 1.8 do iniekcji.
    1. Przygotować roztwór 58Fe-Tf o stężeniu 35 mg/mL w soli fizjologicznej; wstrzyknąć 100 µL myszy.
    2. Napełnić strzykawkę insulinową 100 µL roztworu 58Fe-Tf.
      UWAGA: Każda dawka zawiera 3,5 mg ludzkiego 58Fe-Tf (5 µg 58Fe).
  2. Zanestetyzować ciężarną mysz izofluranem.
    1. Użyć regulatora izofluranu z komorą.
    2. Zastosować następujące ustawienia: 5% izofluranu, 2 L/mL O2, 2 min.
    3. Potwierdzić znieczulenie myszy, sprawdzając brak reakcji na uciśnięcie palca u stopy.
    4. Nanieść lubrykant do oczu na powierzchnię gałki ocznej i umieścić mysz na podkładce grzewczej.
  3. Powoli i ostrożnie wstrzyknąć roztwór 58Fe-Tf do zatoki zaocznej.
  4. Pozostawić mysz do wybudzenia z narkozy; nie pozostawiać zwierzęcia bez nadzoru, dopóki nie odzyska wystarczającej świadomości, aby utrzymać pozycję sternalną.
  5. Sześć godzin po iniekcji eutanazować ciężarne samice w dniu E17.5 poprzez przedawkowanie izofluranu.
    1. Wykonać punkcję serca w celu upuszczenia krwi z myszy jako formę wtórnej eutanazji.
    2. Przymocować stopy igłami w celu stabilizacji.
  6. Pobrać łożyska i wątroby embrionów.
    1. Za pomocą sterylnej pęsety i nożyczek sekcyjnych ostrożnie usunąć macicę z ciężarnej myszy. Wyciąć jednostkę płodowo-łożyskową, która składa się z pojedynczego płodu i łożyska w pęcherzyku owodniowym, otoczonych fragmentem macicy.
    2. Ostrożnie przeciąć macicę i pęcherzyk owodniowy, nie uszkadzając płodu i łożyska.
    3. Odchylić pęcherzyk owodniowy i wyjąć płód oraz łożysko.
    4. Przeciąć pępowinę.
    5. Osuszyć płód i łożysko na czystej chusteczce bezpyłowej, aby usunąć nadmiar płynu owodniowego.
    6. Zważyć całe łożyska i zapisać wyniki.
    7. Przeciąć każde łożysko na pół za pomocą żyletki, umieścić każdą połowę w probówce 2,0 mL i zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie.
      UWAGA: Ponieważ 58Fe nie wymaga specjalnych środków ostrożności przy obchodzeniu się i utylizacji, jedną połowę łożysk można wykorzystać do pomiaru 58Fe, a drugą do innych analiz, w tym do ilościowego oznaczenia ekspresji receptora transferyny (TFR1) i ferroportyny (FPN) metodą western blotting oraz qPCR.
    8. W celu pobrania wątrób embrionów, uśmiercić embrion: użyć żyletki do szybkiej dekapitacji embrionu.
      UWAGA: W dniu E17.5 wszystkie embriony w macicy muszą zostać eutanazowane indywidualnie, nawet jeśli nie są wykorzystywane w badaniu.
    9. Przymocować embrion dla stabilizacji, pozostawiając brzuch odsłonięty.
    10. Za pomocą nożyczek sekcyjnych wykonać małe nacięcie w miejscu przyczepu pępowiny, wsunąć jeden koniec nożyczek do nacięcia i wykonać cięcie w płaszczyźnie pośrodkowej w kierunku płaszczyzny czołowej na około ¼ cala. Następnie wykonać cięcia w płaszczyźnie poprzecznej, aby odsłonić wątrobę płodową.
    11. Użyć pęsety do usunięcia wątroby płodowej.
    12. Zważyć całe wątroby embrionów i zapisać wyniki.
    13. Umieścić całe wątroby embrionów w probówkach 2 mL i zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie.
      UWAGA: Alternatywnie, jeśli planowane są dodatkowe analizy, do pomiaru 58Fe można wykorzystać tylko część wątroby embrionu. Użycie probówek 2,0 mL umożliwia lepszą homogenizację tkanki niż w przypadku probówek 1,5 mL.
  7. Przechowywać tkanki bezterminowo w temperaturze -80 °C.

4. Przygotowanie tkanek do ilościowej analizy żelaza metodą ICP-MS

  1. Przygotuj łożyska i wątroby płodów do oznaczania ilości żelaza niehemowego.
    1. Rozmroź połówki łożysk oraz całe wątroby płodów, a następnie zważ połówki łożysk (patrz krok 3.6.12 w celu zapisania masy wątrob płodów).
    2. Dodaj 400 µL roztworu do wytrącania białek (0,53 N HCl, 5,3% TCA).
    3. Zhomogenizuj tkankę za pomocą homogenizatora elektrycznego.
    4. Inkubuj próbki w temperaturze 100 °C przez 1 h.
    5. Schłodź próbki w wodzie o temperaturze pokojowej przez 2 min.
    6. Otwórz nakrętki, aby wyrównać ciśnienie, a następnie ponownie zamknij probówki.
    7. Wiruj z prędkością 17 000 × g przez 10 min w temperaturze pokojowej, aby osadzić resztki tkankowe.
    8. Ostrożnie przenieś nadsącz do nowej, opisanej probówki.
    9. Przekaż próbki do analizy ICP-MS.
  2. Przygotuj łożyska i wątroby płodów do oznaczania ilości żelaza hemowego.
    UWAGA: Po ekstrakcji żelaza niehemowego w kroku 1, żelazo pozostające w osadzie jest głównie żelazem hemowym.
    1. Zapisz masę każdego osadu z kroku 4.1.7.
    2. Poddaj osady trawieniu w 10 mL stężonego 70% HNO3 z dodatkiem 1 mL 30% H2O2
      UWAGA: Skonsultuj się z jednostką lub centrum ICP-MS w celu optymalizacji objętości HNO3 dla konkretnych badań; objętość ta będzie częściowo zależna od masy próbki.
    3. Ogrzewaj próbki w temperaturze 200 °C przez 15 min.
    4. Przekaż próbki do analizy ICP-MS.
      UWAGA: Jeśli rozróżnienie między źródłami żelaza hemowego i niehemowego nie jest wymagane i mierzone jest jedynie całkowite żelazo, w pierwszym kroku można przeprowadzić trawienie całej tkanki w HNO3.

5. Analiza danych

UWAGA: Dane z ICP-MS zostały przedstawione jako stężenia 56Fe i 58Fe w ng/mL lub mg, ppb (Tabela 1). 56Fe jest najliczniejszym izotopem żelaza w naturze i jego pomiar odzwierciedla akumulację żelaza w łożysku/zarodku w trakcie całej ciąży, podczas gdy pomiar 58Fe odzwierciedla żelazo, które zostało przetransportowane w ciągu 6 h po iniekcji.

  1. Odjąć naturalną zawartość 58Fe (0,28% całkowitego Fe) od zmierzonych wartości 58Fe.
  2. Obliczyć całkowitą zawartość niehemowego 58Fe.
    1. Obliczyć całkowitą ilość niehemowego żelaza (ng) w wątrobie zarodka, mnożąc stężenie żelaza (ng/mL) obliczone w kroku 5.1 przez objętość (mL) podczas wstępnego przetwarzania w kroku 4.1.2, aby oszacować całkowitą ilość 58Fe.
    2. Obliczyć ilość żelaza w całej łożysku, biorąc całkowitą masę łożyska zmierzoną w kroku 3.6.6 i dzieląc ją przez masę łożyska przetworzonego w kroku 4.1.1. Pomnożyć tę wartość przez całkowitą ilość niehemowego żelaza (ng) obliczoną w kroku 5.2.1, aby uzyskać całkowitą zawartość niehemowego 58Fe w łożysku.
  3. Obliczyć całkowitą zawartość hemowego 58Fe.
    1. Obliczyć całkowitą zawartość hemowego 58Fe, mnożąc stężenie żelaza (ng/mg) obliczone w kroku 5.1 przez masę osadu (w mg) zmierzoną w kroku 4.2.1.
    2. Następnie podzielić całkowitą masę łożyska zmierzoną w kroku 3.5.1 przez masę osadu z łożyska zmierzoną w kroku 4.2.1. Pomnożyć tę wartość przez całkowitą ilość hemowego żelaza (ng) obliczoną w kroku 5.3.1, aby uzyskać całkowitą zawartość hemowego 58Fe w łożysku.
  4. Zsumować obliczone wartości niehemowego i hemowego 58Fe, aby określić całkowitą zawartość żelaza dla każdej tkanki.

Schemat przygotowania, podania, pobierania i przetwarzania Fe-Tf do analizy ICP-MS.
Rycina 1: Podsumowanie wizualne kroków protokołu. (A) Przygotowanie 58Fe-transferyny. (B) Podanie 58Fe-transferyny in vivo. (C) Pobieranie i przechowywanie tkanek. (D) Przetwarzanie łożyska i wątroby zarodka w celu oznaczania ilościowego gatunków metali za pomocą ICP-MS. Skróty: Fe = żelazo; NTA = kwas nitrilotrioctowy; Tf = transferyna; PPS = roztwór do wytrącania białek; Sup = nadsącz; TCA = kwas trójchlorooctowy; ICP-MS = spektrometria mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wcześniejsze badanie z wykorzystaniem stabilnych izotopów żelaza do pomiaru jego transportu wykazało, że niedobór żelaza u matki prowadzi do obniżenia ekspresji łożyskowego eksportera żelaza, FPN4. FPN jest jedynym znanym u ssaków eksporterem żelaza, a jego brak podczas rozwoju prowadzi do śmierci zarodka przed dniem E9.529. Aby ustalić, czy zaobserwowany spadek ekspresji FPN przekłada się funkcjonalnie na zmniejszony transport żelaza przez łożysko, do ciężarnych samic wstr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Żelazo jest ważne dla wielu procesów biologicznych, a jego ruch i dystrybucja w organizmie są bardzo dynamiczne i regulowane. Stabilne izotopy żelaza stanowią spójną i wygodną alternatywę dla izotopów promieniotwórczych do oceny dynamiki homeostazy żelaza. Krytycznym krokiem w protokole jest śledzenie wszystkich mas i objętości tkanek. Żelazo jest pierwiastkiem i dlatego nie może być syntetyzowane ani rozkładane. W ten sposób, jeśli wszystkie masy i objętości są dokładnie rejestrowane, całe żelazo w systemie można rozlic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

EN jest naukowym współzałożycielem Intrinsic LifeSciences i Silarus Pharma oraz konsultantem dla Protagonist, Vifor, RallyBio, Ionis, Shield Therapeutics i Disc Medicine. Program VS deklaruje brak konfliktów.

Podziękowania

Autorzy dziękują za pomoc w optymalizacji protokołu dla 58pomiarów Fe w ramach ICP-MS w UC Center for Environmental Implications of Nanotechnology in CNSI na UCLA. Badanie było wspierane przez NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (K01DK127004, do VS) oraz NIH National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD096863, do EN).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
58Fe-żelazometalTrace Sciences International FiltrFe-58
Amicon ultra-15, 30 kDa odcięcieMillipore Probówki wirówkowe Millipore SigmaUFC903024
15 mlFisher Scientific14-959-49B
Probówki wirówkowe, 50 mlMillipore SigmaCLS430829
Wirówka, Sorvall Legend Micro 17 MikrowirówkaFisher Scientific75002432
Wirówka, Sorvall Legend RT
Delikatne wycieraczki do zadańFisher Scientific06-666
Dieta: z niedoborem żelaza (4 ppm żelaza)Envigo TekladTD.80396
Dieta: standardowa karma (185 ppm żelaza)PicoLab5053
Nożyczki preparacyjne z krawędziątnącą 30 mmVWR25870-002
Kleszcze o długości 4-1/2 calaMcKesson157-469
HEPESFisher ScientificBP310-500
Homogenizator, Bio-Gen PRO200PROScientific01-01200
Ludzka apo-transferyna (apo-Tf)Celliance4452-01nie jest już dostępna, alternatywa: Millipore 616419
Kwas solny (HCl)Fisher ScientificA144S-500
Nadtlenek wodoru (H2O2), 35% wag. roztwór w wodzieCole-ParmerEW-88216-36
Strzykawki insulinowe, BD Lo-Dose U-100Fisher Scientific14-826-79
IsofluraneVETone502017
Parownik izofluranuSummit Anesthesia Solutions
Metalowy blok grzewczyFisher Scientific
Mikroprobówka wirówkowa z płaską nakrętkąVWR16466-064
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml o niskiej retencjiFisher Scientific02-681-320
Probówki do mikrowirówek 2,0 ml o niskiej retencjiFisher Scientific02-681-321
Filtr strzykawkowy Millex-GP, 0,22 i mikro; m, polieterosulfon, 33 mm, sterylizowany promieniami gammaMillipore SigmaSLGP033RS
Kwas nitrylotrioctowy (NTA)Sigma72560-100G
Igła 25 G x 5/8 cala podskórne ogólnego zastosowaniaPaski pH Fisher Scientific14-826AA
, plastikowe pH5,0-9,0Fisher Scientific13-640-519
Żyletki 0,22 mmVWR55411-050
Waga (g)Waga METTLER TOLEDOPB1502-S
(mg)Mettler ToledoBalance XS204
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)SigmaS5761-500G
Chlorek sodu (NaCl)Fisher ScientificS671-3
Wodorotlenek sodu (NaOH)Fisher ScientificSS266-1
Sterylna strzykawka, końcówka poślizgowa (1 ml)Fisher Scientific309659
Kwas trichlorooctowy (TCA)Fisher ScientificA322-500
Oprogramowanie
ImageLabBio-Rad
SigmaPlotSystat
odśrodkowy ,

Bibliografia

  1. Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
  2. Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131 (8), 899-910 (2018).
  3. Sangkhae, V., Nemeth, E. Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin. Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).
  4. Sangkhae, V., et al. Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).
  5. Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes. British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).
  6. Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).
  7. O'Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).
  8. Young, M. F., et al. Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources. Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).
  9. Delaney, K. M., et al. Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored. American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).
  10. Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).
  11. Fisher, A. L., Nemeth, E. Iron homeostasis during pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 106, Suppl 6 1567-1574 (2017).
  12. van Santen, S., et al. The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).
  13. Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat. Gut. 53 (5), 655-660 (2004).
  14. Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta. American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).
  15. Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies. Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).
  16. Contractor, S. F., Eaton, B. M. Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta. Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).
  17. Baker, E., Morgan, E. H. The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit. Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).
  18. Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. Knockout mouse models of iron homeostasis. Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).
  19. Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. Hemochorial placentation: development, function, and adaptations. Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).
  20. Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. Regulation of placental nutrient transport--a review. Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).
  21. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  22. Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier. Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).
  23. Shin, B. C., et al. Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta. Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).
  24. Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver. British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).
  25. Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).
  26. Tsunoo, H., Sussman, H. H. Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).
  27. Sangkhae, V., Nemeth, E. Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits. Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).
  28. McCarthy, R. C., Kosman, D. J. Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB. Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).
  29. Donovan, A., et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).
  30. Stefanova, D., et al. Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron. Blood. 130 (3), 245-257 (2017).
  31. Ramos, E., et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).
  32. Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase. Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).
  33. Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).
  34. Gunshin, H., et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transport żelaza przez łożyskostabilne izotopy żelazażelazo związane z transferrynąanaliza ICP-MSżelazo w wątrobie płoduhomogenizacja tkanekoznaczanie ilości żelaza
Kwantyfikacja transportu żelaza przez łożysko myszy in vivo przy użyciu nieradioaktywnych izotopów żelaza
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.