Zastosowania interferencji RNA u karalucha amerykańskiego

Summary

Niniejszy protokół opisuje krok po kroku wytyczne dotyczące technik działania RNAi w P. americana.

Abstract

Karaluchy, szkodniki sanitarne, są niezbędnymi gatunkami w badaniach nad rozwojem owadów i metamorficznych ze względu na ich łatwe żerowanie i cechy hemimetaboliczne. W połączeniu z dobrze opisanymi sekwencjami genomu, te zalety sprawiły, że karaluch amerykański, Periplaneta americana, stał się ważnym modelem owadów hemimetabolicznych. Ograniczony przez niedobór strategii nokautu, skuteczny knockdown genów oparty na interferencji RNA (RNAi) staje się nieodzowną techniką w funkcjonalnych badaniach genów P. americana. Niniejszy protokół opisuje techniki operacyjne RNAi u P. americana. Protokół obejmuje (1) selekcję P. americana w odpowiednich stadiach rozwoju, (2) przygotowanie do iniekcji, (3) wstrzyknięcie dsRNA oraz (4) wykrywanie skuteczności knockdownu genu. RNAi jest potężnym odwrotnym narzędziem genetycznym u P. americana. Większość tkanek P. americana jest wrażliwa na zewnątrzkomórkowe dsRNA. Jego prostota pozwala naukowcom szybko uzyskać dysfunkcyjne fenotypy pod jednym lub wieloma celowanymi wstrzyknięciami dsRNA, umożliwiając naukowcom lepsze wykorzystanie P. americana do badań rozwojowych i metamorficznych.

Introduction

Interferencja RNA (RNAi), ewolucyjnie zachowany mechanizm, stopniowo staje się niezbędnym narzędziem odwrotnego genetyki do hamowania ekspresji genów w wielu organizmach¹, ponieważ Andrew Fire i Craig Mello² opracowali strategię wyciszania genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA (dsRNA). dsRNA jest rozszczepiane na fragmenty 21-23 nukleotydów, małych interferujących RNA (siRNA), przez enzym Dicer w komórkach, aby aktywować szlak RNAi. Następnie siRNA są włączane do indukowanego RNA kompleksu wyciszającego (RISC), który łączy się z docelowym mRNA, powoduje rozszczepienie mRNA, a ostatecznie powoduje utratę funkcji genu

Protocol

Linia P. americana została początkowo dostarczona przez Dr. Huiling Hao. Gatunek ten jest utrzymywany w chowu wsobnym od 30 lat⁹.

1. Wylęganie się i karmienie P. americana

1. Zbierz świeże oothecae (natychmiast po złożeniu jaj) P. americana i wysiaduj w ciemnym inkubatorze w temperaturze 25 °C i wilgotności 60% przez ~25 dni. Następnie zwiększ temperaturę i wilgotność do 30 °C i 75% na 3 dni przed wykluciem.
2. Użyj sitka z otworem 4 mm, aby oddzielić wyklute nimfy od oothecae.
3. Nimfy należy przechowywać w cylindrycznych pojemnikach (o średnicy 12 c....

Results

Rysunek 1 pokazuje udane wstrzyknięcie. Strzykawkę do mikroiniekcji z igłą o mikrośrednicy należy umieścić poziomo na wzmacniaczu (Rysunek 1A). Igła jest wprowadzana przez szczelinę między dwoma somitami brzusznymi poziomo do naskórka (Ryc. 1B). Upewnij się, że płyn dostanie się do brzucha P. americana. Zbyt stromy kąt wkłucia igły uszkodzi narządy wewnętrzne (Ryc. 1C), a niewłaściwe wstrzyknięcie prowadzi do wycie.......

Discussion

W raporcie tym opisano metodologiczną strategię RNAi krok po kroku u P. americana; Warto zauważyć, że można go również stosować do innych karaluchów (na przykład Blattella germanica) i wielu innych owadów z niewielkimi zmianami. Jednak skuteczność wyciszania genów RNAi nie zawsze jest wystarczająco wysoka, co ma oczywistą wadę w porównaniu ze strategią nokautu genów¹³. Następujący efekt resztkowy poziomu genu może zakłócać rzeczywiste fenotypy. Aby zapewnić skuteczność leczenia R.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
701 N 10 &mikro; L Syr (26S/51/2)	Hamilton	PN:80300	Inkubator iniekcyjny
	Ningbo Jiangnan Instrument Factory	RXZ-380A-LED	Do wylęgu i karmienia karaluchów
Pompa mikroiniekcyjna	Alcott Biotechnology	ALC-IP600	Zestaw
do klonowania pTOPO-Blunt	Aidlab Biotechnology	CV16	do
ilościowych systemów PCR w czasie rzeczywistym do wydłużania genów	Bio-Rad	CFX Connect	Do analizy qRT-PCR
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	Do syntezy dsRNA, który zawiera roztwór Rnazy A (4 μ g/μ L), Octan sodu, 3,0 M (pH 5,2), Mieszanka enzymów, T7 Express, Woda bez nukleaz, Express T7 2x Bufor , RQ1 Wolne od RNaz Termocyklery DNazy
	Bio-Rad	S1000	do amplifikacji DNA