Niniejszy protokół opisuje krok po kroku wytyczne dotyczące technik działania RNAi w P. americana.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zastosowania interferencji RNA u karalucha amerykańskiego
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Karaluchy, szkodniki sanitarne, są niezbędnymi gatunkami w badaniach nad rozwojem owadów i metamorficznych ze względu na ich łatwe żerowanie i cechy hemimetaboliczne. W połączeniu z dobrze opisanymi sekwencjami genomu, te zalety sprawiły, że karaluch amerykański, Periplaneta americana, stał się ważnym modelem owadów hemimetabolicznych. Ograniczony przez niedobór strategii nokautu, skuteczny knockdown genów oparty na interferencji RNA (RNAi) staje się nieodzowną techniką w funkcjonalnych badaniach genów P. americana. Niniejszy protokół opisuje techniki operacyjne RNAi u P. americana. Protokół obejmuje (1) selekcję P. americana w odpowiednich stadiach rozwoju, (2) przygotowanie do iniekcji, (3) wstrzyknięcie dsRNA oraz (4) wykrywanie skuteczności knockdownu genu. RNAi jest potężnym odwrotnym narzędziem genetycznym u P. americana. Większość tkanek P. americana jest wrażliwa na zewnątrzkomórkowe dsRNA. Jego prostota pozwala naukowcom szybko uzyskać dysfunkcyjne fenotypy pod jednym lub wieloma celowanymi wstrzyknięciami dsRNA, umożliwiając naukowcom lepsze wykorzystanie P. americana do badań rozwojowych i metamorficznych.
Wprowadzenie
Interferencja RNA (RNAi), ewolucyjnie zachowany mechanizm, stopniowo staje się niezbędnym narzędziem odwrotnego genetyki do hamowania ekspresji genów w wielu organizmach1, ponieważ Andrew Fire i Craig Mello2 opracowali strategię wyciszania genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA (dsRNA). dsRNA jest rozszczepiane na fragmenty 21-23 nukleotydów, małych interferujących RNA (siRNA), przez enzym Dicer w komórkach, aby aktywować szlak RNAi. Następnie siRNA są włączane do indukowanego RNA kompleksu wyciszającego (RISC), który łączy się z docelowym mRNA, powoduje rozszczepienie mRNA, a ostatecznie powoduje utratę funkcji genu3,4,5. Wśród gatunków owadów do tej pory zgłoszono wiele eksperymentów z układowym RNAi w wielu rzędach owadów, takich jak Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera i Blattodea5,6,7,8.
Karaluchy (Blattaria) są istotną rodziną owadów w badaniach rozwojowych i metamorficznych dzięki swoim szybkim cyklom wzrostu, silnym zdolnościom adaptacyjnym do środowiska i wysokiej plastyczności rozwojowej9. Przed odkryciem, że RNAi jest kompatybilne z karaluchami, wcześniejsze badania koncentrowały się tylko na zapobieganiu i kontroli karaluchów ze względu na niedobór technik manipulacji genetycznej u karaluchów. Unikalna struktura ootheca karalucha sprawiła, że przeprowadzenie nokautu genowego opartego na wstrzyknięciu zarodka za pomocą systemu CRISPR-Cas9 było trudne. Poza tym większość tkanek karaluchów (takich jak P. americana) wykazuje silną odpowiedź układową RNAi, co pozwala na szybkie generowanie dysfunkcyjnych fenotypów poprzez wstrzyknięcie jednego lub więcej ukierunkowanych dsRNAs9,10,11. Cechy te sprawiły, że RNAi stało się nieodzowną techniką w badaniach funkcjonalnych genów u P. americana.
Mimo że zgłoszono użycie RNAi w badaniach funkcjonalnych genów u P. americana, nie było dostępnego szczegółowego ani szczegółowego opisu krok po kroku. Niniejszy raport zawiera krok po kroku wytyczne operacyjne dotyczące RNAi u P. americana, przydatne do badania funkcji genów u innych karaluchów. Co więcej, ten przewodnik nie ogranicza się do Blattodea i może być stosowany do wielu innych owadów z niewielkimi modyfikacjami.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Linia P. americana została początkowo dostarczona przez Dr. Huiling Hao. Gatunek ten jest utrzymywany w chowu wsobnym od 30 lat9.
1. Wylęganie się i karmienie P. americana
- Zbierz świeże oothecae (natychmiast po złożeniu jaj) P. americana i wysiaduj w ciemnym inkubatorze w temperaturze 25 °C i wilgotności 60% przez ~25 dni. Następnie zwiększ temperaturę i wilgotność do 30 °C i 75% na 3 dni przed wykluciem.
- Użyj sitka z otworem 4 mm, aby oddzielić wyklute nimfy od oothecae.
- Nimfy należy przechowywać w cylindrycznych pojemnikach (o średnicy 12 cm i wysokości 10 cm) w ciemności w temperaturze 28 °C, wilgotności 70%. Posmaruj wewnętrzną krawędź pojemników wazeliną, aby zapobiec ucieczce karaluchów. Zapewnij szczurom karmę, wodę i schronienie (tacki na jajka). Zwracaj uwagę na aktywność nimf i regularnie sprzątaj kał i zanieczyszczenia.
2. Wybór nimf w odpowiednim stadium rozwojowym
- Użyj szklanej tubki, aby wybrać świeżo wylinienie P. americana (biały kolor ciała). Przechowuj je w nowych pojemnikach i poczekaj na właściwy etap obróbki.
UWAGA: Po ~19 dniach w powyższych warunkach karmienia, nimfy w 3. stadium będą dostępne do wstrzyknięcia. Kolor świeżo wyliniałych karaluchów jest biały, a początki są klarowane przez czas linienia.
3. Przygotowanie fragmentu docelowego z promotorami T7
- Używając cDNA P. americana jako matrycy, zaprojektuj sparowane startery do przeprowadzenia PCR w celu uzyskania fragmentu DNA docelowego genu o długości 300-800 pz 9. Następnie sklonuj fragment PCR do wektora pTOPO (patrz Tabela materiałów) w celu sekwencjonowania.
- Używając docelowego fragmentu DNA jako matrycy, zsyntetyzuj jedną nową parę starterów z sekwencją promotora T7 (5'-GGATCCTAATACGACTACTATAGG-3') na końcach 5' i wykonaj kolejną rundę PCR, aby uzyskać fragment docelowy z promotorami T7 po każdej stronie9.
4. Transkrypcja i synteza dsRNA in vitro
- Dodać 10 μl buforu T7 2X, 2 μl mieszanki enzymów, T7 Express (patrz tabela materiałów) i 2 μg produktu PCR (otrzymanego w kroku 3.2) do układu reakcyjnego i dodać całkowitą objętość do 20 μL z ddH2O. Delikatnie wymieszać ręcznie do góry nogami i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min i 70 °C przez 10 min, a następnie powoli schładzać do temperatury pokojowej.
- Rozcieńczyć roztwór RNazy A (4 μg/μL) ddH2O w stosunku 1:200. Następnie dodać 1 μl DNazy wolnej od RNaz RQ1 (1 U/μL) i 1 μL rozcieńczonego roztworu RNazy A do systemu (patrz Tabela Materiałów).
UWAGA: Teraz objętość pojedynczego systemu wynosi 22 μL. - Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Następnie dodać 10% całkowitej objętości (przy jednoczesnym przeprowadzaniu reakcji N całkowita objętość wynosi N x 22 μL) octanu sodu i trzy objętości całkowitej objętości izopropanolu.
- Delikatnie wymieszać ręcznie do góry nogami, umieścić na lodzie na 5 minut i odwirować przy 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Usunąć supernatant za pomocą pipety, przemyć pozostałość 75% etanolem (25% wodą uzdatnioną pirowęglanem dietylu (DEPC)), a następnie odwirować przy 13 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Ponownie usunąć supernatant. Suszyć granulat na powietrzu przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Użyj ~100 μl wody DEPC do rozpuszczenia dsRNA, a następnie rozcieńcz dsRNA do końcowych 2 μg/μL.
UWAGA: dsRNA może być przechowywane w temperaturze -80 °C przez 6 miesięcy.
5. Ładowanie roztworu dsRNA do strzykawki
- Ustaw program w pompie mikrowtryskowej (patrz Tabela materiałów) z wyprzedzeniem, aby upewnić się, że objętość każdego wtrysku jest stała. Przed użyciem strzykawki należy ją oczyścić, napełniając ją wodą DEPC 8-10 razy.
- Zainstalować strzykawkę o pojemności 10 μl na pompie do mikroiniekcji, uruchomić pompę i napełnić strzykawkę 10 μl roztworu dsRNA (przygotowanego w kroku 4.6). Wstrzyknąć 1 μl dsRNA do nimfy w trzecim stadium rozwojowym (patrz krok 2) i upewnić się, że nie wycieka ona do organizmu.
6. Wstrzykiwanie dsRNA do P. americana
- Znieczulić karaluchy zwiększonym stężeniem CO2 w pojemniku, aż karaluchy przestaną się poruszać, a następnie natychmiast przystąpić do wstrzyknięcia.
- Delikatnie podnieś karalucha pęsetą i poprowadź karalucha w kierunku igły ręką. Następnie wbij igłę przez szczelinę między dwoma somitami brzusznymi poziomo do naskórka. Jeśli chodzi o głębokość wkładki, im płytsza, tym lepiej.
- Następnie wstrzyknij roztwór dsRNA do karalucha. Na koniec wyciągnij końcówkę igły. Upewnij się, że końcówka igły znajduje się jak najbliżej naskórka, aby uniknąć uszkodzenia narządów wewnętrznych.
UWAGA: Wstrzyknięcie należy wykonać pod mikroskopem preparacyjnym. - Umieść wstrzyknięte karaluchy w czystych pojemnikach do testów biologicznych. Odczekaj około 10-20 minut, aby mogły zregenerować się po skutkach CO2 . Oznacz pojemniki datą wstrzyknięcia, rodzajem i dawką dsRNA oraz wiekiem P. americana.
- Umieść wstrzyknięte karaluchy w ciemnym otoczeniu w temperaturze 28 °C, wilgotności 70%, zapewnij wodę, paszę i schronienie oraz regularnie obserwuj możliwe zmiany w fenotypie karaluchów.
7. Potwierdzenie knockdownu i analiza fenotypowa
- Oceń skuteczność RNAi przy użyciu wszelkich dostępnych technik biologii molekularnej, takich jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) i Western blot. Szczegółowe procedury qRT-PCR i Western blotting można znaleźć w References1,12.
- Aby obserwować i analizować fenotypy związane z RNAi, użyj mikroskopu odpowiedniego dla żywych zwierząt.
UWAGA: RNAi może wpływać na morfologię, zachowanie, linienie, regenerację kończyn i inne czynności fizjologiczne karaluchów. Specyficzna częstość fenotypu jest obliczana zgodnie z określonymi warunkami.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1 pokazuje prawidłową iniekcję. Strzykawka do mikroiniekcji z igłą o niewielkiej średnicy powinna zostać umieszczona poziomo na manipulatorze (Rycina 1A). Igłę wprowadza się poprzez szczelina między dwoma somytami brzusznymi w przekroju poziomym względem naskórka (Rycina 1B). Upewnij się, że ciecz przedostanie się do *P. americana* brzucha. Zbyt stromy kąt wprowadzenia igły spowoduje uszkodzenie organów wew...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W raporcie tym opisano metodologiczną strategię RNAi krok po kroku u P. americana; Warto zauważyć, że można go również stosować do innych karaluchów (na przykład Blattella germanica) i wielu innych owadów z niewielkimi zmianami. Jednak skuteczność wyciszania genów RNAi nie zawsze jest wystarczająco wysoka, co ma oczywistą wadę w porównaniu ze strategią nokautu genów13. Następujący efekt resztkowy poziomu genu może zakłócać rzeczywiste fenotypy. Aby zapewnić skuteczność leczenia R...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (granty nr 32070500, 31620103917, 31330072 i 31572325 dla C.R., Sh.L.), przez Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Guangdong (grant nr 2021B1515020044 i 2020A1515011267 dla C.R.), przez Departament Nauki i Technologii w prowincji Guangdong (granty nr 2019B090905003 i 2019A0102006), przez Departament Nauki i Technologii w Kantonie (grant nr 202102020110), przez Shenzhen Science and Technology Program (grant nr. KQTD20180411143628272 do Sh.L.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 701 N 10 &mikro; L Syr (26S/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Inkubator iniekcyjny |
| Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | Do wylęgu i karmienia karaluchów | |
| Pompa mikroiniekcyjna | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Zestaw |
| do klonowania pTOPO-Blunt | Aidlab Biotechnology | CV16 | do |
| ilościowych systemów PCR w czasie rzeczywistym do wydłużania genów | Bio-Rad | CFX Connect | Do analizy qRT-PCR |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | Do syntezy dsRNA, który zawiera roztwór Rnazy A (4 μ g/μ L), Octan sodu, 3,0 M (pH 5,2), Mieszanka enzymów, T7 Express, Woda bez nukleaz, Express T7 2x Bufor , RQ1 Wolne od RNaz Termocyklery DNazy |
| Bio-Rad | S1000 | do amplifikacji DNA |
Bibliografia
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431(2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
- Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207(2015).
- Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1(2020).
- Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
- Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008(2018).
- Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
- Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163(2011).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
- Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
- Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
- Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
- Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
- Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778(2020).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
- Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
