Method Article

Solidny przebieg przetwarzania w mikroskopii krioelektronowej jednocząsteczkowej (cryo-EM) z cryoSPARC, RELION, i Scipion

DOI:

10.3791/63387

⸱

January 31st, 2022

 , 
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje, jak efektywnie wykorzystać trzy platformy przetwarzania cryo-EM, tj. cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3, aby stworzyć pojedynczy i solidny przepływ pracy mający zastosowanie do różnych zestawów danych o pojedynczych cząstkach do określania struktury w wysokiej rozdzielczości.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie postępy zarówno w oprzyrządowaniu, jak i oprogramowaniu do przetwarzania obrazów sprawiły, że mikroskopia krioelektronowa jednocząsteczkowa (cryo-EM) stała się preferowaną metodą dla biologów strukturalnych do określania struktur o wysokiej rozdzielczości dla szerokiej gamy makrocząsteczek. Dla nowych i doświadczonych użytkowników dostępnych jest wiele pakietów oprogramowania do przetwarzania obrazów i obliczania struktury, które usprawniają ten sam podstawowy przepływ pracy: filmy zarejestrowane przez detektory mikroskopowe są poddawane korekcji w celu oszacowania ruchu wywołanego wiązką i funkcji transferu kontrastu (CTF). Następnie obrazy cząstek są wybierane i wyodrębniane z uśrednionych klatek filmu w celu iteracyjnej klasyfikacji 2D i 3D, a następnie rekonstrukcji, udoskonalania i walidacji 3D. Ponieważ różne pakiety oprogramowania wykorzystują różne algorytmy i wymagają różnych poziomów wiedzy specjalistycznej do działania, generowane przez nie mapy 3D często różnią się jakością i rozdzielczością. W ten sposób użytkownicy regularnie przesyłają dane między różnymi programami w celu uzyskania optymalnych wyników. Niniejszy dokument zawiera przewodnik dla użytkowników, który pomaga poruszać się po przepływie pracy w popularnych pakietach oprogramowania: cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3 w celu uzyskania struktury rozdzielczości zbliżonej do atomowej wirusa związanego z adenowirusem (AAV). Najpierw szczegółowo opisujemy proces przetwarzania obrazu za pomocą cryoSPARC v3, ponieważ jego wydajne algorytmy i łatwy w użyciu graficzny interfejs użytkownika pozwalają użytkownikom szybko dotrzeć do mapy 3D. W kolejnym kroku wykorzystujemy PyEM i autorskie skrypty do konwersji i transferu współrzędnych cząstek z najlepszej jakości rekonstrukcji 3D uzyskanej w cryoSPARC v3 do RELION-3 i Scipion 3 oraz przeliczamy mapy 3D. Na koniec nakreślamy kroki w celu dalszego udoskonalenia i walidacji powstałych struktur poprzez integrację algorytmów z RELION-3 i Scipion 3. W tym artykule opisujemy, jak efektywnie wykorzystać trzy platformy przetwarzania w celu stworzenia jednego i niezawodnego przepływu pracy mającego zastosowanie do różnych zestawów danych w celu określenia struktury w wysokiej rozdzielczości.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) i analiza pojedynczych cząstek (SPA) umożliwiają określanie struktury szerokiej gamy zespołów biomolekularnych w stanie uwodnionym, pomagając wyjaśnić rolę tych makrocząsteczek w szczegółach atomowych. Udoskonalenia w optyce mikroskopowej, sprzęcie komputerowym i oprogramowaniu do przetwarzania obrazów umożliwiły określenie struktur biomolekuł w rozdzielczości wykraczającej poza 2 Å1,2,3. W 2020 r. w Banku Danych o Białkach (PDB) zdeponowano ponad 2 300 struktur krio-EM, w porównaniu do 192 struktur w 2014 r. 4, co wskazuje, że krio-EM stał się metodą z wyboru dla wielu biologów strukturalnych. W tym miejscu opisujemy przepływ pracy łączący trzy różne programy SPA do określania struktury w wysokiej rozdzielczości (Rysunek 1).

Celem SPA jest rekonstrukcja objętości 3D próbki docelowej z zaszumionych obrazów 2D zarejestrowanych przez detektor mikroskopowy. Detektory zbierają obrazy w postaci filmów z pojedynczymi klatkami o tym samym polu widzenia. W celu zachowania próbki, ramki są zbierane z niską dawką elektronów, a tym samym mają słaby stosunek sygnału do szumu (SNR). Dodatkowo, ekspozycja elektronów może indukować ruch w zeszklonych siatkach krio-EM, powodując rozmycie obrazu. Aby przezwyciężyć te problemy, klatki są wyrównywane w celu skorygowania ruchu wywołanego wiązką i uśredniane, aby uzyskać mikrofotografię o zwiększonym SNR. Mikrofotografie te są następnie poddawane estymacji funkcji transferu kontrastu (CTF) w celu uwzględnienia skutków rozmycia i aberracji narzuconych przez mikroskop. Z mikrofotografii skorygowanych przez CTF poszczególne cząstki są wybierane, ekstrahowane i sortowane w średnie klasy 2D reprezentujące różne orientacje przyjęte przez próbkę w lodzie szklistym. Powstały w ten sposób jednorodny zestaw cząstek jest wykorzystywany jako dane wejściowe do rekonstrukcji 3D ab initio w celu wygenerowania zgrubnego modelu lub modeli, które są następnie iteracyjnie udoskonalane w celu wytworzenia jednej lub więcej struktur o wysokiej rozdzielczości. Po rekonstrukcji przeprowadzane są udoskonalenia strukturalne w celu dalszej poprawy jakości i rozdzielczości mapy cryo-EM. Wreszcie, albo model atomowy jest bezpośrednio wyprowadzany z mapy, albo mapa jest wyposażona w współrzędne atomowe uzyskane gdzie indziej.

Dostępne są różne pakiety oprogramowania do realizacji zadań opisanych powyżej, w tym Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13i inne. Chociaż programy te wykonują podobne etapy przetwarzania, wykorzystują różne algorytmy, na przykład do wybierania cząstek, generowania początkowych modeli i udoskonalania rekonstrukcji. Ponadto programy te wymagają różnego poziomu wiedzy i interwencji użytkownika do działania, ponieważ niektóre zależą od dostrojenia parametrów, które mogą stanowić przeszkodę dla nowych użytkowników. Te rozbieżności często skutkują niespójną jakością i rozdzielczością map na różnych platformach14, co skłania wielu badaczy do korzystania z wielu pakietów oprogramowania w celu udoskonalenia i walidacji wyników. W tym artykule zwracamy uwagę na wykorzystanie cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3 do uzyskania rekonstrukcji 3D AAV w wysokiej rozdzielczości, powszechnie stosowanego wektora terapii genowej15. Wyżej wymienione pakiety oprogramowania są bezpłatne dla użytkowników akademickich; cryoSPARC v3 i Scipion 3 wymagają licencji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tworzenie nowego projektu cryoSPARC v3 i importowanie danych

UWAGA: Dane zostały pozyskane na Oregon Health and Science University (OHSU) w Portland przy użyciu mikroskopu elektronowego Titan Krios o napięciu 300 kV, wyposażonego w bezpośredni detektor elektronów Falcon 3. Obrazy zebrano w trybie zliczania z całkowitą dawką 28,38 e−/Å2 podzieloną na 129 klatek i zakresem rozmycia od -0,5 μm do -2,5 μm, przy rozmiarze piksela 1,045 A przy użyciu EPU. Próbka AAV-DJ została dostarczona przez personel OHSU.

  1. Otwórz cryoSPARC v3 w przeglądarce internetowej i kliknij nagłówek Projekty. Wybierz pozycję + Dodaj , aby utworzyć nowy projekt. Nazwij projekt odpowiednio i podaj ścieżkę do istniejącego katalogu, w którym będą zapisywane zadania i dane.
  2. Utwórz obszar roboczy dla projektu, otwierając projekt, klikając pozycję + Dodaj i wybierając pozycję Nowy obszar roboczy. Nazwij obszar roboczy i kliknij Utwórz.
  3. Przejdź do nowego obszaru roboczego i otwórz Konstruktora zadań w prawym panelu. Ta zakładka wyświetla wszystkie funkcje dostępne w cryoSPARC v3. Kliknij Importuj filmy i podaj ścieżkę filmów, ścieżkę do pliku referencyjnego i ustaw parametry akwizycji w następujący sposób: Rozmiar surowego piksela 1,045 A, Napięcie przyspieszające 300 kV, Aberracja sferyczna 2,7 mm, Całkowita dawka ekspozycji 28,38 e-/Å^2.
  4. Kliknij pozycję Kolejka, wybierz tor, aby uruchomić zadanie i obszar roboczy, a następnie kliknij pozycję Create.
    UWAGA: Parametry akwizycji są zależne od próbki i mikroskopu.

2. CryoSPARC v3 - wyrównanie filmu i estymacja CTF

  1. Otwórz opcję Patch Motion Correction (Multi). To zadanie wymaga filmów zaimportowanych w kroku 1.3 jako danych wejściowych. Otwórz kartę zadania importowania filmów w obszarze roboczym i przeciągnij Imported_movies dane wyjściowe do symbolu zastępczego filmów w nowym zadaniu. Kolejkowanie zadania.
    UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat metod cryoSPARC opisanych w tym artykule, zobacz tutorial cryoSPARC 16.
  2. Aby przeprowadzić szacowanie CTF, otwórz Patch CTF Estimation (Multi). Wprowadź mikrofotografie wygenerowane w kroku 2.1 i umieść zadanie w kolejce.
  3. Aby sprawdzić uśrednione i skorygowane przez CTF mikrofotografie i wybrać podzbiór do dalszego przetwarzania, otwórz Curate Exposures i wprowadź ekspozycje uzyskane w kroku 2.2. Kolejkowanie zadania.
  4. Po przejściu zadania w tryb oczekiwania kliknij zakładkę Interakcja na karcie zadania, dostosuj progi parametrów i zaakceptuj lub odrzuć poszczególne mikrofotografie do dalszego przetwarzania. Zaakceptuj mikrofotografie z dobrze dopasowanymi szacunkowymi i eksperymentalnymi CTF (Rysunek 2) i odrzuć te z wysokim astygmatyzmem, słabym dopasowaniem CTF i grubym lodem.
  5. Podczas przetwarzania bieżących danych ustaw górny próg astygmatyzmu na 400 A, rozdzielczość dopasowania CTF na 5 A, a względną grubość lodu na 2. Kliknij Gotowe, aby wybrać mikrofotografie do dalszego przetwarzania.

3. CryoSPARC v3 - ręczne i szablonowe pobieranie cząstek

  1. Otwórz selektor ręczny, wprowadź zaakceptowane ekspozycje z kroków 2.4–2.5 i umieść zadanie w kolejce. Kliknij kartę Interaktywny, ustaw Rozmiar pola (px) na 300 i kliknij kilkaset cząstek na wielu mikrofotografiach i unikaj wybierania nakładających się na siebie cząstek. Tutaj wybrano 340 cząstek z 29 mikrofotografii. Po zakończeniu kliknij Zakończono zbieranie! Cząstki ekstraktu.
    UWAGA: Ten protokół wykorzystuje ręczne wybieranie cząstek do generowania szablonów do automatycznego wyboru. Dostępne są jednak również inne metody17.
  2. Aby wygenerować szablony do automatycznego wybierania cząstek, kliknij Klasyfikacja 2D i wprowadź pobrane cząstki wygenerowane w kroku 3.1. Zmień liczbę klas 2D na 10 i umieść zadanie w kolejce.
  3. Otwórz Wybierz klasy 2D. Wprowadź cząstki i średnie klasowe uzyskane w kroku 3.2 i kliknij kartę Interaktywny. Wybierz reprezentatywne klasy 2D z dobrym SNR i kliknij Gotowe.
    UWAGA: Średnie klas odzwierciedlają różne widoki cząstek. Wybierz średnie klas, które odzwierciedlają każdy widok. Celem jest stworzenie dobrze zdefiniowanych szablonów reprezentujących różne widoki próbki do automatycznego pobierania.
  4. Otwórz Selektor szablonów i wprowadź klasy 2D wybrane w kroku 3.3 oraz mikrofotografie z kroków 2.4-2.5. Ustaw średnicę cząstek (Å) na 220 A i ustaw zadanie w kolejce.
  5. Aby sprawdzić automatyczne pobrania, otwórz okno Wybierz pobieranie cząstek, wprowadź cząstki i mikrofotografie wygenerowane w kroku 3.4, a następnie umieść zadanie w kolejce.
  6. Na karcie zadania Select Particle Picks (Wybierz pobieranie cząstek) kliknij kartę Interactive (Interaktywny) i ustaw Box size (px) (Rozmiar pudełka) na 300. Kliknij indywidualny mikrograf, dostosuj filtr dolnoprzepustowy, aż cząstki będą wyraźnie widoczne, a następnie ustaw próg znormalizowanej korelacji krzyżowej (NCC) na 0,41 i próg mocy w zakresie od 54000 do 227300 .
  7. Sprawdź kilka mikrofotografii i, jeśli to konieczne, dostosuj progi tak, aby większość cząstek została wybrana bez uwzględniania wyników fałszywie dodatnich. Po zakończeniu kliknij przycisk Zakończono pobieranie! Cząstki ekstraktu.
    UWAGA: Cząstki rzeczywiste zazwyczaj mają wysoki NCC i wynik mocy, co wskazuje, że są podobne do matrycy i mają odpowiednio wysoki SNR.
  8. Otwórz Wyciąg z mikrofotografii i wprowadź mikrografie i cząstki z kroku 3.7. Ustaw rozmiar wyodrębnionego pola (px) na 300 i umieść zadanie w kolejce.

4. CryoSPARC v3 - klasyfikacja 2D

  1. Kliknij Klasyfikacja 2D i wprowadź wyekstrahowane cząstki z kroku 3.8. Ustaw liczbę klas 2D na 50 i umieść zadanie w kolejce.
  2. Aby wybrać najlepsze klasy 2D do dalszego przetwarzania, otwórz okno Wybierz klasy 2D. Wprowadzić cząstki stałe i średnie klasowe uzyskane w kroku 4.1. Kliknij zakładkę Interaktywna i wybierz klasy 2D na podstawie rozdzielczości i liczby cząstek w klasie (Rysunek 3). Nie wybieraj klas zawierających artefakty. Po wybraniu kliknij Gotowe.
    UWAGA: Zazwyczaj wymagane są wielokrotne rundy klasyfikacji 2D, aby usunąć cząstki, które nie zbiegają się w odrębne, dobrze zdefiniowane klasy. Przeprowadź tyle rund klasyfikacji 2D, ile potrzeba, aby usunąć takie cząstki ze zbioru danych (Rysunek 3).

5. CryoSPARC v3 - rekonstrukcja ab-initio i jednorodne udoskonalanie

  1. Aby wygenerować początkową objętość 3D, otwórz Rekonstrukcję Ab-initio i wprowadź cząstki uzyskane w kroku 4.2 lub z końcowej klasyfikacji 2D. Dostosuj symetrię do ikosahedrycznej. Kolejkowanie zadania.
    UWAGA: Symetria jest zależna od próbki i powinna zostać odpowiednio zmieniona. Jeśli nie jest znana, użyj symetrii C1.
  2. Otwarte jednorodne zagęszczenie. Wprowadź objętość z kroku 5.1 i cząstki z kroku 4.2 lub końcową klasyfikację 2D. Zmień symetrię i umieść zadanie w kolejce. Po zakończeniu zadania sprawdź krzywą korelacji powłoki Fouriera (FSC) i pobierz wolumin do zbadania w UCSF Chimera18.

6. Eksport współrzędnych cząstek z cryoSPARC v3 i import ich do RELION-3 za pomocą PyEM

UWAGA: Współrzędne cząstek zawierają informacje o położeniu poszczególnych cząstek na każdym mikrozdjęciu. Przeniesienie współrzędnych zamiast stosów cząstek do RELION-3 pozwala na przeprowadzenie etapów doprecyzowania, które w innym przypadku nie byłyby dostępne. Na przykład polerowanie cząstek wymaga dostępu do początkowych klatek filmu. W związku z tym, przed eksportem współrzędnych cząstek z cryoSPARC v3 do RELION-3, należy zaimportować filmy i przeprowadzić korekcję ruchu oraz estymację CTF w RELION-3. Szczegółowe informacje można znaleźć w samouczku RELION-319.

  1. Przejdź do katalogu projektu RELION-3 i uruchom RELION-3.
  2. Otwórz okno Importuj z przeglądarki typu zadania i określ ścieżkę do filmów oraz parametrów pozyskiwania, jak w kroku 1.3.
  3. Aby wykonać korekcję ruchu, użyj UCSF MotionCor220 przez GUI RELION-3, otwórz Motion Correction i ustaw domyślne parametry, jak w UCSF MotionCor2 manual21. Wprowadź ścieżkę do filmów zaimportowanych w kroku 6.2. Na karcie Ruch określ ścieżkę do pliku wykonywalnego motioncor2.
    UWAGA: MotionCor2 może być uruchamiany równolegle przy użyciu wielu procesorów graficznych.
  4. Wykonaj estymację CTF za pomocą CTFFIND-4.122 za pośrednictwem graficznego interfejsu użytkownika RELION-3. Otwórz CTF Estimation i wprowadź micrographs.star wygenerowany w kroku 6.3. Na karcie CTFFIND-4.1 określ ścieżkę do pliku wykonywalnego CTFFIND-4.1 i ustaw parametry jak w RELION-3.1 tutorial19.
  5. Aby zaimportować stosy cząstek z cryoSPARC v3 do RELION-3, należy je najpierw wyeksportować z cryoSPARC v3. W cryoSPARC v3 otwórz kartę zadania Wybierz klasę 2D z kroku 4.2 lub końcowej klasyfikacji 2D. Na karcie Szczegóły kliknij pozycję Eksportuj zadanie. Zadanie eksportu powoduje wyświetlenie pliku particles_exported.cs.
  6. Przed zaimportowaniem współrzędnych cząstek z cryoSPARC v3 do RELION-3 plik particles_exported.cs z kroku 6.5 musi zostać przekonwertowany do formatu .star. Korzystając z PyEM23, przekonwertuj plik particles_exported.cs na format .star, wykonując następujące polecenie: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. W RELION-3 kliknij zakładkę Manual Picking (Kompletacja ręczna), a następnie na kartę I/O wprowadź mikrofotografie z udoskonalenia CTF opisanego w kroku 6.4. Na karcie Wyświetlacz wprowadź następujące parametry: Średnica cząstek (A): 220, Filtr dolnoprzepustowy (A): -1 , Skala dla obrazu CTF: 0.5. Uruchom zadanie. Katalog o nazwie ManualPick jest generowany w folderze domowym RELION-3.
    UWAGA: Ten krok jest wykonywany w celu utworzenia struktury folderów pobrania ręcznego w RELION-3. Podczas wykonywania ręcznej selekcji, dla każdego uśrednionego mikrografu używanego do pobierania w graficznym interfejsie RELION-3 tworzony jest pojedynczy plik .star zawierający współrzędne pobranych cząstek.
  8. Przejdź do folderu zawierającego plik particles_exported.star z kroku 6.6 i uruchom samodzielnie napisany skrypt, tworząc pojedynczy plik manualpick.star dla każdego uśrednionego mikrografu używanego do wybierania cząstek cryo-SPARC v3, który przyczynił się do ostatecznej klasyfikacji 2D wyeksportowanej w kroku 6.5. Wynikowe pliki współrzędnych są zapisywane w folderze ManualPick/Movies.
  9. Wróć do RELION-3 i ponownie otwórz zadanie pobierania ręcznego. Kliknij Kontynuuj. Spowoduje to wyświetlenie cząstek wcześniej wybranych w cryoSPARC v3 w graficznym interfejsie użytkownika RELION-3. Sprawdź kilka mikrofotografii, aby sprawdzić, czy transfer współrzędnych cząstek został dokonany i czy cząstki są prawidłowo dobrane.

7. RELION-3 - Ekstrakcja cząstek i klasyfikacja 2D

  1. Kliknij Ekstrakcja cząstek. Na karcie I/O wprowadź mikrografie z korektą CTF z kroku 6.4 i współrzędne z kroku 6.9. Kliknij kartę Extract (Wyodrębnij) i zmień rozmiar pudełka cząstek (pix) na 300. Uruchom zadanie.
  2. Wykonaj klasyfikację 2D, aby dodatkowo oczyścić zestaw cząstek wygenerowany w cryoSPARC v3 w celu uzyskania rekonstrukcji o wyższej rozdzielczości. Kliknij Klasyfikacja 2D i na karcie I/O wprowadź plik particles.star wygenerowany w kroku 7.1. Na karcie Optymalizacja ustaw liczbę klas na 50 i Średnicę maski (A) na 280. Uruchom zadanie.
    UWAGA: Maska powinna obejmować całą cząsteczkę.
  3. Aby wybrać najlepsze klasy 2D, kliknij metodę Wybór podzbioru, wprowadź plik _model.star z kroku 7.2 i uruchom zadanie. Wybierz klasy zgodnie z opisem w kroku 4.2.
  4. Powtórz kroki 7.2 i 7.3, aby usunąć cząstki niezbieżne.

8. RELION-3 - Udoskonalanie 3D, tworzenie masek i przetwarzanie końcowe

  1. Użyj mapy wygenerowanej w cryoSPARC v3 (krok 5.2) jako początkowego modelu do udoskonalenia 3D w RELION-3. Wybierz metodę importu i ustaw następujące parametry na karcie I/O: Import Raw Movies/Micrographs: No, Raw Input Files: Movies/*.mrc.
  2. Podaj plik MTF i wprowadź parametry akwizycji filmu zgodnie z opisem w kroku 1.3. Na karcie Inne wybierz mapę cryoSPARC v3 jako plik wejściowy, zmień Typ węzła na Odwołanie 3D (.mrc) i uruchom zadanie.
  3. Wybierz opcję 3D Auto-Fine (Automatyczne poprawianie 3D) i na karcie I/O (I/O) ustaw Input Images (Obrazy wejściowe) jako plik particles.star z kroku 7.3 lub ostatniego zadania wyboru. Podaj rekonstrukcję cryoSPARC v3 jako mapę referencyjną. Kliknij zakładkę Odniesienie i zmień Początkowy filtr dolnoprzepustowy (Å) na 50 i Symetria na ikozaedryczny. Na karcie Optymalizacja zmień Średnicę maski (Å) na 280 i uruchom zadanie.
  4. Po zakończeniu przebiegu otwórz run_class001.mrc w UCSF Chimera.
  5. W UCSF Chimera kliknij Narzędzia i w obszarze Dane woluminu wybierz Przeglądarka woluminów. Spowoduje to otwarcie nowego okna, w którym można dostosować ustawienia głośności. Zmień Krok na 1 i dostosuj suwak, aż osiągniesz wartość poziomu, w której na mapie nie ma szumów. Zapisz tę wartość, ponieważ będzie ona używana do tworzenia maski w następnym kroku.
  6. Mapa utworzona w wyniku automatycznego uszlachetniania nie odzwierciedla prawdziwego FSC, ponieważ szum z otaczającego rozpuszczalnika obniża rozdzielczość. Przed obróbką końcową utwórz maskę, aby odróżnić próbkę od obszaru rozpuszczalnika.
    1. Kliknij Tworzenie maski i wprowadź run_class001.mrc z kroku 8.3.
    2. Kliknij zakładkę Maska i dostosuj parametry w następujący sposób: Mapa filtru dolnoprzepustowego (Å): 10, Rozmiar piksela (Å): 1,045, Początkowy próg binaryzacji: wartość poziomu uzyskana w kroku 8.5, Rozszerz mapę binarną o tyle pikseli: 3 i Dodaj miękką krawędź o tej liczbie pikseli: 3. Uruchom zadanie.
  7. Zbadaj maskę w UCSF Chimera. Jeśli maska jest zbyt ciasna, zwiększ Rozszerz mapę binarną o tyle pikseli i/lub Dodaj miękką krawędź o tej liczbie pikseli. Ważne jest, aby stworzyć maskę o miękkich krawędziach, ponieważ ostra maska może prowadzić do nadmiernego dopasowania.
  8. Kliknij na Post-Processing i na karcie I/O wprowadź półmapy utworzone w kroku 8.3 i maskę z 8.6. Ustaw skalibrowany rozmiar piksela na 1,045 A. Na karcie Wyostrzanie wprowadź następujące informacje: Oszacuj współczynnik B automatycznie?: Tak, Najniższa rozdzielczość dla automatycznego dopasowania B (A): 10, Użyj własnego współczynnika B?: Nie. Na karcie Filtr ustaw opcję Pomiń ważenie Fsc? na Nie. Uruchom zadanie.

9. RELION-3 - Szkolenie z polerowania i polerowania cząstek

  1. Przed skorygowaniem o ruch wywołany wiązką cząstek, najpierw użyj trybu uczenia, aby zidentyfikować optymalne ścieżki ruchu dla zestawu danych. Otwórz Polerowanie bayesowskie i na karcie I/O wprowadź mikrofotografie z korekcją ruchu z kroku 6.3, cząstki z kroku 8.3 i plik .star z kroku 8.8. Kliknij kartę Trening i ustaw następujące parametry: Trenuj optymalne parametry: Tak, Ułamek pikseli Fouriera do testowania: 0,5, Użyj tej liczby cząstek: 5000. Uruchom zadanie.
    UWAGA: Ten skrypt wytworzy opt_params_all_groups.txt plik w polskim folderze RELION-3 zawierający zoptymalizowane parametry polerowania wymagane do wykonania następnego kroku.
  2. Po zakończeniu zadania szkoleniowego kliknij pozycję Polerowanie bayesowskie. Kliknij zakładkę Trening i ustaw opcję Trenuj optymalne parametry? na Nie. Wybierz zakładkę Polski i w polu Zoptymalizowany plik parametrów określ ścieżkę do pliku opt_params_all_groups.txt z kroku 9.1. Kliknij Uruchom.
  3. Powtórz udoskonalanie 3D (krok 8.3) i obróbkę końcową (krok 8.8) z zestawem wypolerowanych cząstek.

10. RELION-3 - CTF i udoskonalenia dla każdej cząsteczki

  1. Aby oszacować aberracje wyższego rzędu, otwórz CTF Refinement i na karcie I/O w obszarze Cząstki wybierz ścieżkę do pliku .star zawierającego polerowane cząstki z ostatniego zadania Refine 3D (run_data.star).
    1. W obszarze Plik gwiazdki Postprocess ustaw ścieżkę do danych wyjściowych z najnowszego zadania przetwarzania końcowego (krok 9.3).
    2. Wybierz zakładkę Dopasuj i ustaw następujące parametry: Oszacowanie (powiększenie anizotropowe): Nie, wykonać dopasowanie parametrów CTF? Nie, oszacuj nachylenie wiązki: Tak, oszacuj również koniczynę? Tak, oszacuj aberracje 4. rzędu? Tak. Uruchom zadanie.
  2. Powtórz krok 10.1, używając jako danych wejściowych cząstek (z Refine3D) wygenerowanych w poprzednim zadaniu (particles_ctf_refine.star). Na karcie Dopasowanie zmień wartość Estimate (powiększenie anizotropowe) na Tak i Uruchom zadanie.
  3. Powtórz krok 10.2, używając jako danych wejściowych cząstek (z Refine3D) utworzonych w poprzednim zadaniu (particles_ctf_refine.star). Na karcie Dopasowanie ustaw następujące parametry: Oszacowanie (powiększenie anizotropowe): Nie, wykonać dopasowanie parametrów CTF?: Tak, dopasowanie rozmycia?: Na cząstkę, dopasowanie astygmatyzmu? Na mikrofotografii, dopasowany współczynnik B?: Nie, dopasowany przesunięcie fazowe: Nie, Oszacuj nachylenie wiązki?: Nie, Oszacuj aberracje 4. rzędu?: Nie. Uruchom it.
    UWAGA: Biorąc pod uwagę, że cząstka ma wystarczający kontrast, zakładka Dopasuj astygmatyzm? może być ustawiona na Na cząstkę. W przypadku tego zestawu danych udoskonalenie astygmatyzmu na cząstkę nie poprawiło jakości i rozdzielczości mapy.
  4. Powtórz udoskonalanie 3D z cząstkami z kroku 10.3 i na karcie I/O ustaw opcję Use Solvent-Flattened FSCs? na yes (Tak). Po zakończeniu działania wykonaj zadanie przetwarzania końcowego (krok 8.8) i sprawdź mapę w UCSF Chimera (krok 5.2).

11. Przesyłanie współrzędnych cząstek RELION-3 i mapy 3D do Scipion 3

  1. Aby jeszcze bardziej udoskonalić i zweryfikować mapę RELION-3, najpierw zaimportuj objętość i cząstki z ostatniego zadania przetwarzania końcowego (krok 10.4) do Scipion 3. Uruchom Scipion 3 i utwórz nowy projekt.
  2. W lewym panelu Protokoły wybierz menu rozwijane Importy i kliknij Importuj cząstki. Zmień następujące parametry: Importuj z: RELION-3, Plik gwiazdy: postprocess.star i określ parametry akwizycji jak w kroku 1.3. Kliknij Wykonaj.
  3. Kliknij menu rozwijane Importy i wybierz opcję Importuj woluminy. W polu Import From (Importuj z) należy wskazać ścieżkę do mapy RELION-3. Zmień rozmiar piksela (częstotliwość próbkowania) å/px na 1,045 i wykonaj.

12. Scipion 3 - Udoskonalenie w wysokiej rozdzielczości

  1. Najpierw wykonaj wyrównanie globalne. Wybierz menu rozwijane Uściślij w panelu Protokoły i kliknij Xmipp3 - highres24. Wprowadź zaimportowane cząstki i objętości z kroków 11.2 i 11.3 odpowiednio jako obrazy pełnowymiarowe i objętości początkowe, a następnie ustaw grupę symetrii na ikozaedryczną. Na karcie Wyrównanie obrazu w obszarze Przypisanie kątowe wybierz pozycję Globalne i ustaw maksymalną rozdzielczość docelową na 3 A, a następnie uruchom zadanie.
  2. Po zakończeniu zadania kliknij pozycję Analizuj wyniki. W nowym oknie kliknij ikonę UCSF Chimera, aby sprawdzić udoskonalony wolumin. Dodatkowo kliknij Wyświetl wykresy rozdzielczości (FSC), aby zobaczyć, jak zmienił się FSC po udoskonaleniu, a także Histogram wykresu ze zmianami kątowymi, aby sprawdzić, czy przypisania kąta Eulera uległy zmianie.
    UWAGA: W zależności od rozdzielczości wejściowej struktury RELION-3, krok ten może być powtórzony kilka razy z różnymi wartościami ustawionymi dla Max Target Resolution w zakładce Angular Assignment. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz Scipion tutorial25.
  3. Powtórz krok 12.1 z wyrównaniem lokalnym. Skopiuj poprzednie zadanie i zmień pozycję Wybierz poprzedni przebieg na Xmipp3 — highres Global. Na karcie Przypisanie kątowe zmień ustawienie Wyrównanie obrazu na Lokalne. Ustaw maksymalną rozdzielczość docelową na 2,1 A.
  4. Zapoznaj się z udoskonaloną mapą w UCSF Chimera i przeanalizuj zmianę w przypisaniach FSC i kątowych (krok 12.2). Powtarzaj lokalne uściślanie, aż rozdzielczość nie ulegnie poprawie, a przypisania kątowe nie zbieżne się, dostosowując w razie potrzeby maksymalną rozdzielczość docelową.
  5. Mapa wyjściowa ze Scipion 3 może być dodatkowo modyfikowana i wyostrzana pod względem gęstości w Phenix26.

13. Scipion 3 - Walidacja mapy

  1. Sprawdź lokalną rozdzielczość końcowej mapy wygenerowanej w Xmipp3 - highres. Otwórz Xmipp - local MonoRes27 i wprowadź końcowy wolumin z poprzedniego zadania i maski wygenerowanej w kroku 8.6. Ustaw zakres rozdzielczości od 1 do 6 A z interwałem 0,1 A i wykonaj zadanie.
  2. Po zakończeniu działania kliknij Analizuj wyniki i sprawdź histogram rozdzielczości i wycinki objętości pokolorowane według rozdzielczości.
  3. Aby sprawdzić, czy cząstki są dobrze wyrównane, otwórz Multireference Alignability28 i wprowadź cząstki oraz objętość z kroku 12.3. Kliknij pozycję Analizuj wyniki, aby wyświetlić wykres walidacji. Idealnie byłoby, gdyby wszystkie punkty były skupione wokół (1.0,1.0).
  4. Otwórz Xmipp3 — zweryfikuj nadmierne dopasowanie. Wprowadź cząstki i objętości z kroku 12.3. Po zakończeniu pracy przeanalizuj wyniki i sprawdź wykres nadmiernego dopasowania. Przecięcie wyrównanych krzywych szumu gaussowskiego i wyrównanych cząstek wskazuje na nadmierne dopasowanie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiliśmy kompleksowy pipeline SPA, aby uzyskać strukturę o wysokiej rozdzielczości przy użyciu trzech różnych platform przetwarzania: cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3. Rysunek 1 i Rysunek 4 podsumowuje ogólny proces przetwarzania, a Tabela 1 szczegółowo opisuje protokoły udoskonalania. Protokoły te zostały wykorzystane podczas udoskonalania struktury 2,3 A AAV, osiągając rozdzielczość bliską Nyquist.

Filmy zo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiamy solidny przepływ pracy SPA do przetwarzania danych krio-EM na różnych platformach oprogramowania w celu uzyskania rekonstrukcji 3D w wysokiej rozdzielczości (ilustracja 1). Ten przepływ pracy ma zastosowanie do szerokiej gamy makrocząsteczek biologicznych. Kolejne etapy protokołu przedstawiono na rysunku 4, w tym wstępne przetwarzanie filmu, wybieranie i klasyfikację cząstek oraz wiele metod udoskonalania struktury (tabela

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Carlosowi Oscarowi Sorzano za pomoc przy instalacji Scipion3 oraz Kilianowi Schnelle i Arne Moellerowi za pomoc w przenoszeniu danych między różnymi platformami przetwarzania. Część tych badań była wspierana przez U24GM129547 grantowe NIH i przeprowadzona w PNCC w OHSU i dostępna za pośrednictwem EMSL (grid.436923.9), DOE Office of Science User Facility sponsorowanego przez Office of Biological and Environmental Research. Badanie to zostało wsparte grantem start-upowym z Rutgers University dla Arka Kulczyka.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CryoSPARCStructura Biotechnology Inc.https://cryosparc.com/
CTFFIND 4Instytut Medyczny Howarda Hughesa, Szkoła Medyczna UMass Chanhttps://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
Grupa Struktury MakromolekularnejMotionCorr2https://msg.ucsf.edu/software
Narzędzia obliczeniowe Phenix do makromolekularnej krystalografii neutronów (MNC)http://www.phenix-online.org/
Uniwersytet PyEMw Kalifornii, San Franciscohttps://github.com/asarnow/pyem
RELIONMRC Laboratorium Biologii Strukturalnejhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion(I2PC), SciLifeLabhttp://scipion.i2pc.es/
UCSF ChimeraUCSF Zasób do bioinformatyki, Wizualizacja iinformatyka https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
UCSF Centrum Przetwarzania Obrazów

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
  2. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  3. Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
  4. PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB. , Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021).
  5. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  6. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383(2018).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  9. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  10. Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  11. de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  12. Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  13. Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
  14. Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
  15. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  16. Dawood, S., Punjani, S., Arulthasan, S. Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at. , Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020).
  17. Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
  18. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  19. Scheres, S. Single-particle processing in RELION-3.1. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019).
  20. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  21. Zheng, S. MotionCor2 User Manual. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018).
  22. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  23. Asarnow, D., Palovacak, E., Cheng, Y. UCSF PyEM v0.5. , Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019).
  24. Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
  25. Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261(2021).
  26. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
  27. Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
  28. Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
  29. Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
  30. Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194(2020).
  31. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166(2018).
  32. Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Particle Cryo EMCryoSPARC WorkflowRELION ProcessingScipion Integration3D ReconstructionMotion CorrectionCTF EstimationParticle Picking2D ClassificationAdeno Associated Virus

Related Articles