Method Article

Solidny przebieg przetwarzania w mikroskopii krioelektronowej jednocząsteczkowej (cryo-EM) z cryoSPARC, RELION, i Scipion

DOI:

10.3791/63387

⸱

January 31st, 2022

 , 
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje, jak efektywnie wykorzystać trzy platformy przetwarzania cryo-EM, tj. cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3, aby stworzyć pojedynczy i solidny przepływ pracy mający zastosowanie do różnych zestawów danych o pojedynczych cząstkach do określania struktury w wysokiej rozdzielczości.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie postępy zarówno w oprzyrządowaniu, jak i oprogramowaniu do przetwarzania obrazów sprawiły, że mikroskopia krioelektronowa jednocząsteczkowa (cryo-EM) stała się preferowaną metodą dla biologów strukturalnych do określania struktur o wysokiej rozdzielczości dla szerokiej gamy makrocząsteczek. Dla nowych i doświadczonych użytkowników dostępnych jest wiele pakietów oprogramowania do przetwarzania obrazów i obliczania struktury, które usprawniają ten sam podstawowy przepływ pracy: filmy zarejestrowane przez detektory mikroskopowe są poddawane korekcji w celu oszacowania ruchu wywołanego wiązką i funkcji transferu kontrastu (CTF). Następnie obrazy cząstek są wybierane i wyodrębniane z uśrednionych klatek filmu w celu iteracyjnej klasyfikacji 2D i 3D, a następnie rekonstrukcji, udoskonalania i walidacji 3D. Ponieważ różne pakiety oprogramowania wykorzystują różne algorytmy i wymagają różnych poziomów wiedzy specjalistycznej do działania, generowane przez nie mapy 3D często różnią się jakością i rozdzielczością. W ten sposób użytkownicy regularnie przesyłają dane między różnymi programami w celu uzyskania optymalnych wyników. Niniejszy dokument zawiera przewodnik dla użytkowników, który pomaga poruszać się po przepływie pracy w popularnych pakietach oprogramowania: cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3 w celu uzyskania struktury rozdzielczości zbliżonej do atomowej wirusa związanego z adenowirusem (AAV). Najpierw szczegółowo opisujemy proces przetwarzania obrazu za pomocą cryoSPARC v3, ponieważ jego wydajne algorytmy i łatwy w użyciu graficzny interfejs użytkownika pozwalają użytkownikom szybko dotrzeć do mapy 3D. W kolejnym kroku wykorzystujemy PyEM i autorskie skrypty do konwersji i transferu współrzędnych cząstek z najlepszej jakości rekonstrukcji 3D uzyskanej w cryoSPARC v3 do RELION-3 i Scipion 3 oraz przeliczamy mapy 3D. Na koniec nakreślamy kroki w celu dalszego udoskonalenia i walidacji powstałych struktur poprzez integrację algorytmów z RELION-3 i Scipion 3. W tym artykule opisujemy, jak efektywnie wykorzystać trzy platformy przetwarzania w celu stworzenia jednego i niezawodnego przepływu pracy mającego zastosowanie do różnych zestawów danych w celu określenia struktury w wysokiej rozdzielczości.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) i analiza pojedynczych cząstek (SPA) umożliwiają określanie struktury szerokiej gamy zespołów biomolekularnych w stanie uwodnionym, pomagając wyjaśnić rolę tych makrocząsteczek w szczegółach atomowych. Udoskonalenia w optyce mikroskopowej, sprzęcie komputerowym i oprogramowaniu do przetwarzania obrazów umożliwiły określenie struktur biomolekuł w rozdzielczości wykraczającej poza 2 Å1,2,3. W 2020 r. w Banku Danych o Białkach (PDB) zdeponowano ponad 2 300 struktur krio-EM, w porównaniu do 192 struktur w 2014 r. 4, co....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tworzenie nowego projektu cryoSPARC v3 i importowanie danych

UWAGA: Dane zostały pozyskane na Oregon Health and Science University (OHSU) w Portland przy użyciu mikroskopu elektronowego Titan Krios o napięciu 300 kV, wyposażonego w bezpośredni detektor elektronów Falcon 3. Obrazy zebrano w trybie zliczania z całkowitą dawką 28,38 e−/Å2 podzieloną na 129 klatek i zakresem rozmycia od -0,5 μm do -2,5 μm, przy rozmiarze piksela 1,045 A przy użyciu EPU. Próbka AAV-DJ została dostarczona przez personel OHSU.

  1. Otwórz cryoSPARC v3 w przeglądarce internetowej i kliknij nagłówek Projekty

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiliśmy kompleksowy pipeline SPA, aby uzyskać strukturę o wysokiej rozdzielczości przy użyciu trzech różnych platform przetwarzania: cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3. Rysunek 1 i Rysunek 4 podsumowuje ogólny proces przetwarzania, a Tabela 1 szczegółowo opisuje protokoły udoskonalania. Protokoły te zostały wykorzystane podczas udoskonalania struktury 2,3 A AAV, osiągając rozdzielczość bliską Nyquist.

Filmy zo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiamy solidny przepływ pracy SPA do przetwarzania danych krio-EM na różnych platformach oprogramowania w celu uzyskania rekonstrukcji 3D w wysokiej rozdzielczości (ilustracja 1). Ten przepływ pracy ma zastosowanie do szerokiej gamy makrocząsteczek biologicznych. Kolejne etapy protokołu przedstawiono na rysunku 4, w tym wstępne przetwarzanie filmu, wybieranie i klasyfikację cząstek oraz wiele metod udoskonalania struktury (tabela

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Carlosowi Oscarowi Sorzano za pomoc przy instalacji Scipion3 oraz Kilianowi Schnelle i Arne Moellerowi za pomoc w przenoszeniu danych między różnymi platformami przetwarzania. Część tych badań była wspierana przez U24GM129547 grantowe NIH i przeprowadzona w PNCC w OHSU i dostępna za pośrednictwem EMSL (grid.436923.9), DOE Office of Science User Facility sponsorowanego przez Office of Biological and Environmental Research. Badanie to zostało wsparte grantem start-upowym z Rutgers University dla Arka Kulczyka.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CryoSPARCStructura Biotechnology Inc.https://cryosparc.com/
CTFFIND 4Instytut Medyczny Howarda Hughesa, Szkoła Medyczna UMass Chanhttps://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
Grupa Struktury MakromolekularnejMotionCorr2https://msg.ucsf.edu/software
Narzędzia obliczeniowe Phenix do makromolekularnej krystalografii neutronów (MNC)http://www.phenix-online.org/
Uniwersytet PyEMw Kalifornii, San Franciscohttps://github.com/asarnow/pyem
RELIONMRC Laboratorium Biologii Strukturalnejhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion(I2PC), SciLifeLabhttp://scipion.i2pc.es/
UCSF ChimeraUCSF Zasób do bioinformatyki, Wizualizacja iinformatyka https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
UCSF Centrum Przetwarzania Obrazów

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
  2. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  3. Wardell, M.,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Particle Cryo EMCryoSPARC WorkflowRELION ProcessingScipion Integration3D ReconstructionMotion CorrectionCTF EstimationParticle Picking2D ClassificationAdeno Associated Virus

Related Articles