Method Article

Protokół modelowania rozwoju i implantacji blastocyst u ludzi

DOI:

10.3791/63388

⸱

August 10th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA), Vienna Biocenter (VBC), 2Institute of Molecular Pathology (IMP), Vienna Biocenter (VBC), 3Vienna BioCenter PhD Program, Doctoral School of the University of Vienna and Medical University of Vienna

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisujący tworzenie ludzkich blastoidów, które efektywnie, w odpowiednim czasie i sekwencyjnie generują komórki podobne do blastocyst.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model ludzkiej blastocysty utworzonej z komórek macierzystych (blastoid) wspierałby postęp naukowy i medyczny. Jednak jego moc predykcyjna będzie zależała od jego zdolności do skutecznego, terminowego i wiernego odtworzenia sekwencji rozwoju blastocyst (morfogeneza, specyfikacja, wzorzec) oraz do tworzenia komórek odzwierciedlających stadium blastocysty. Tutaj pokazujemy, że naiwne ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste hodowane w warunkach PXGL, a następnie trzykrotnie hamowane dla szlaków kinazy regulowanej przez hipopotam, transformujący czynnik wzrostu i β sygnałem zewnątrzkomórkowym skutecznie ulegają morfogenezie, tworząc blastoidy (>70%). Dopasowując się do czasu rozwoju (~ 4 dni), blastoidy rozwijają sekwencję specyfikacji blastocysty poprzez wytwarzanie analogów trofoblastu i epiblastu, a następnie tworzenie analogów pierwotnej endodermy i polarnych trofoblastów. Powoduje to powstawanie komórek transkrypcyjnie podobnych do blastocysty (>96%) i mniejszości analogów poimplantacyjnych. Blastoidy efektywnie kształtują się, tworząc oś embrionalno-abembrionalną zaznaczoną dojrzewaniem regionu polarnego (NR2F2+), który nabywa specyficzny potencjał do kierunkowego przyłączania się do stymulowanych hormonalnie komórek endometrium, jak w macicy. Taki ludzki blastoid jest skalowalnym, wszechstronnym i etycznym modelem do badania rozwoju człowieka i implantacji in vitro.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brak modeli eksperymentalnych ograniczył zrozumienie wczesnej ludzkiej embriogenezy. Obecna wiedza na temat specyficznych dla człowieka aspektów rozwoju embrionalnego pochodzi z nadwyżek zarodków pochodzących z zapłodnienia in vitro (IVF) przekazanych do badań. Jednak ograniczona dostępność, trudności w eksperymentalnych manipulacjach i zmienna jakość zarodków utrudniają badania naukowe. Wręcz przeciwnie, wierny model ludzkich embrionów in vitro pozwoliłby na złożone manipulacje eksperymentalne, zapewniając w ten sposób etyczną możliwość uzupełnienia badań nad ludzkimi embrionami1,2,3,4. Wcześniej opracowany model blastocyst myszy łączył embrionalne komórki macierzyste myszy i komórki macierzyste trofoblastu5. W tym szczegółowym protokole opisano metodę generowania modelu ludzkiej blastocysty z naiwnych pluripotencjalnych komórek macierzystych, który jest wierny kryteriom blastocysty pierwiastkowej6.

Cztery kryteria dla ludzkich blastoidów. Tutaj, próbując ustalić ustandaryzowaną definicję ludzkich blastoidów, proponujemy cztery minimalne kryteria. Chociaż kryteria te nie są wyczerpujące, mogą służyć jako podstawa do oceny parametrów, które pozwalają na powstawanie ludzkich blastoidów (Rysunek 1A). (1) Blastoidy powinny formować się sprawnie pod względem morfologii i generacji analogów trzech linii, a mianowicie epiblastu (Epi), trofektodermy (TE) i pierwotnej endodermy (PrE). Nieskuteczność może wskazywać na nieodpowiedni początkowy stan komórki i/lub warunki hodowli (np. pożywka blastoidalna). (2) Blastoidy powinny generować analogi trzech linii zgodnie z sekwencją rozwojową (najpierw Epi/TE, najpierw PrE/polarTE ostatni)7,8 i czas (indukcja ~ 3 dni; dni embrionalne 5-7)7,9. (3) Blastoidy powinny tworzyć analogi stadium blastocysty, ale nie stadium poimplantacyjnego (np. komórki poimplantacyjne epiblastu, trofoblastu lub owodni). (4) Wreszcie, blastoidy powinny być zdolne do rekapitulacji funkcjonalnych cech implantacji i rozwoju blastocysty. Korzystając z tego protokołu, ludzkie blastoidy tworzą się wydajnie przy użyciu wielu linii komórkowych (>70%), są w stanie generować analogi komórkowe blastocysty sekwencyjnie w ciągu 4 dni, a analogi są transkrypcyjnie podobne do stadium blastocysty (>96% na podstawie kilku analiz)6,10,11. Wreszcie, blastoidy silnie generują oś embrionalno-abembrionalną, co pozwala im wchodzić w interakcje z hormonalnie stymulowanymi komórkami endometrium przez obszar polarny i solidnie rozszerzać linie po rozszerzonej hodowli (odpowiednik czasu: 13 dzień embrionalny).

Znaczenie początkowego stanu komórki. Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mogą być stabilizowane w różnych stanach, które próbują uchwycić precyzyjne etapy rozwoju. Stany te są podtrzymywane przez warunki hodowli, które, choć nadal nieoptymalne, ograniczają komórki w fazie epiblastu przed implantacją (~ dni embrionalne 5-7) lub po implantacji (~ dni embrionalne 8-14) w stadium epiblastu12. Analiza transkryptomiczna wykazała, że hPSC hodowane w PD0325901, XAV939, Gö6983 i czynniku hamującym białaczkę (LIF; określane jako hPSC nieleczone wcześniej PXGL)13,14 są bardziej podobne do epiblastu blastocysty w porównaniu z hPSC hodowanymi w czynniku wzrostu fibroblastów (FGF) 2 i activin15 (określane jako primed hPSCs12) oraz do ludzkich rozszerzonych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hEPSC)16(Zobacz analizę w References17,18,19). W związku z tym transkryptom zagruntowanych hPSC najlepiej pasuje do poimplantacyjnego/pregastrulacyjnego małpiego cynomolgus epiblast20. Dodatkowe kryteria molekularne, takie jak ekspresja transpozonu, metylacja DNA i stan chromosomu X, potwierdziły, że wariacje stanu naiwnego bardziej przypominają epiblast blastocysty w porównaniu ze stanem primed17,21. Wreszcie, linie naiwnych hPSC udało się wyprowadzić bezpośrednio z blastocyst przy użyciu warunków hodowli PXGL22.

Ludzkie wczesne komórki blastocysty nie są jeszcze zaangażowane. Specyfikacja linii mysiej występuje od stadium moruli, które poprzedza stadium blastocysty23. Wręcz przeciwnie, eksperymenty z dysocjacją i ponowną agregacją wykazały, że ludzkie komórki trofektodermy wczesnych blastocyst nie są jeszcze zaangażowane24. W związku z tym analiza komórek ludzkich blastocyst za pomocą sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNAseq) wykazała, że pierwsza specyfikacja linii (trofoblast/epiblast) występuje po utworzeniu jamy blastocysty7. Ta odroczona specyfikacja człowieka koreluje z obserwacjami, że hPSC są zdolne do tworzenia trofoblastów25,26,27, gdy mysie PSC są w dużej mierze zaangażowane w linię epiblastów. Te połączone obserwacje doprowadziły do możliwości, że naiwne hPSC odzwierciedlają stadium blastocysty i zachowują potencjał do tworzenia trzech linii blastocyst. Ostatnio zaproponowano, że siła działania hPSC w określaniu analogów pozaembrionalnych zmienia się z trofektodermy na owodnię podczas progresji ze stanu pierwotnego do stanu pierwotnego27. W związku z tym naiwne hPSC są bardziej podobne do etapu sprzed implantacji17,18,21 i mają zwiększoną zdolność do tworzenia trofoblastów w porównaniu z zagruntowanymi hPSCs27, hEPSCs16, lub pośrednie stany przeprogramowane28, które są podatne na tworzenie analogów po implantacji10 ( Rysunek 1B). Początkowy stan komórki ma zatem kluczowe znaczenie dla powstania odpowiednich analogów pozaembrionalnych. Chociaż dokładna analiza równoległa przekształconych analogów trofektodermy pozostaje do przeprowadzenia, stan naiwny PXGL odzwierciedlający wczesną blastocystę wydaje się ważny dla tworzenia blastoidów o wysokiej wierności.

Pobudzanie specyfikacji i morfogenezy poprzez hamowanie szlaków sygnałowych. Hamowanie szlaku sygnałowego hipopotama jest konserwatywnym mechanizmem napędzającym specyfikację trofoblastu u myszy, krów i ludzi9,29,30. Ponadto od 2013 roku wiadomo, że hamowanie NODAL (A83-01) i kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK; PD0325901 lub równoważny) oraz aktywacja szlaków sygnałowych białka morfogenetycznego kości (BMP) wyzwala przygotowane hPSC do aktywacji sieci transkrypcyjnej związanej z linią trofoblastu25,31,32,33,34. Co więcej, ostatnio kilka doniesień potwierdziło również, że hamowanie zarówno szlaku NODAL, jak i ERK oraz aktywacja BMP ułatwiają różnicowanie trofoblastów od naiwnych hPSC25,31,32,33,34. Wreszcie, jeśli specyfikacja trofoblastu zostanie wyzwolona ze stanu naiwnego, komórki podsumowują aspekty postępu rozwojowego trofektodermy26. Jednak samoodnawiające się linie odzwierciedlające trofektodermę blastocysty nie zostały ustabilizowane in vitro. Zgodnie ze specyfikacją trofoblastu, indukcja szlaków sygnałowych naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i Wnt wraz z hamowaniem HDAC może ułatwić progresję rozwoju trofoblastu34,35 i stabilizować komórki w linie ludzkich komórek macierzystych trofoblastu (hTSC) odzwierciedlające cytotroblasty po implantacji18,35. Takie linie można wyprowadzić zarówno z blastocyst, jak i tkanek łożyska35.

Druga linia pozaembrionalna, określana jako PrE, jest określona po trofoblastach i pochodzi od epiblast7,9. W przeciwieństwie do mysiego PrE36, uważa się, że ludzki odpowiednik jest niezależny od sygnalizacji FGF37,38. Linie odzwierciedlające endodermę pozazarodkową (określaną jako nEnd) zostały ustanowione z naiwnych hPSC poprzez indukcję szlaków sygnałowych przy użyciu aktywiny A, Wnt i LIF39. Niezgodnie z eksperymentami z hamowaniem zarodków, wykazano, że hamowanie ERK zapobiega tworzeniu się takich komórek nEND in vitro39. Do tej pory takie linie nie pochodziły bezpośrednio od blastocyst.

Ostatnio, modele wczesnego zarodka zostały utworzone poprzez połączenie wariantów pożywek wcześniej opracowanych dla hTSCs35 i komórek nEND39, wykorzystując w ten sposób aktywatory szlaków sygnałowych transformującego czynnika wzrostu - β (TGF-β), EGF i Wnt28,40. Te modele zarodków tworzą się z niską wydajnością (10%-20%) i tworzą komórki przypominające raczej etap po implantacji niż przedimplantacyjny10, w tym analogi epiblastu po implantacji, trofoblastu, owodni, gastruli, tkanek mezodermalnych (~ 14 dzień embrionalny) i cytotrofoblastów10. Wręcz przeciwnie, potrójne hamowanie szlaków Hippo, ERK i TGF-β skutecznie kieruje powstawaniem blastoidów składających się z komórek podobnych do blastocysty41. Wraz z początkowym stanem komórki proponujemy, że hamowanie potrójnych szlaków (Hippo, ERK, TGF-β) jest drugim niezbędnym parametrem do tworzenia blastoidów o wysokiej wierności (Figura 1B).

Ocena stanu komórki i etapu odbicia za pomocą scRNAseq. Stany komórek tworzących blastoidy można ocenić za pomocą analizy scRNAseq. Ich podobieństwo transkrypcyjne do określonych stadiów embrionalnych można zmierzyć za pomocą samych komórek blastoidalnych i przez porównanie z zaszczepionymi hPSC lub hTSC, które odzwierciedlają etapy poimplantacyjne20,35. Przeprowadzanie analiz skupień przy użyciu różnych poziomów definicji ujawnia, w jaki sposób subpopulacje stopniowo łączą się, gdy definicja maleje, ujawniając w ten sposób podobieństwa klastrów. Chociaż optymalność liczby klastrów może być mierzona42, grupowanie w wysokiej rozdzielczości informuje również o ewentualnej obecności małych nieprawidłowych subpopulacji, na przykład odzwierciedlając etapy po implantacji10. Geny o zróżnicowanej ekspresji między klastrami mogą dostarczyć informacji na temat ich analogów w procesie rozwoju, oceniając poziomy ekspresji zestawów genów referencyjnych, które definiują linie specyficzne dla danego etapu. Pozwala to na pomiar wzbogacenia subpopulacji blastoidów za pomocą nienadzorowanych map odległości (np. przy użyciu genów wzbogaconych o najwyższe poziomy) lub za pomocą analizy wzbogacenia zestawu genów (GSEA)43. Korzystając z tego protokołu blastoidowego, tworzą się tylko trzy główne klastry, które transkrypcyjnie odzwierciedlają trzy linie blastocyst. Jedna grupa obejmuje zarówno początkowe naiwne hPSC, jak i analog epiblastu blastoidów. Analiza komórek w różnych punktach czasowych wykazała sekwencyjny charakter specyfikacji linii (trofoblasty zaczynają określać się w ciągu 24 godzin, a pierwotne komórki endodermy w ciągu 60 godzin). Grupowanie w wysokiej rozdzielczości pozwoliło uchwycić subpopulację komórek (3,2%) wykazujących ekspresję genów specyficznych dla zarodków w stadium gastrulacji (prawdopodobnie mezodermy lub owodni). Warto zauważyć, że początkowe naiwne hPSC zawierały również 5% komórek podobnych do implantacji, jak opisano wcześniej44. W drugiej analizie komórki blastoidalne mogą być łączone in silico z komórkami referencyjnymi wyizolowanymi z concepti na różnych etapach45,46,47 w celu wywnioskowania równoważności etapu. W tym przypadku jako punkty odniesienia wykorzystano komórki wyizolowane z koncepcji preimplantacjii45,46, jako punkty odniesienia wykorzystano blastocysty hodowane in vitro45 oraz zarodki w stadium gastrulacji47. Korzystając z tego protokołu, określono ilościowo, że niedopasowane komórki blastoidowe ujawnione przez grupowanie w wysokiej rozdzielczości rzeczywiście grupują się z mezodermą i owodnią po implantacji. W przyszłych krokach analiza porównawcza transkryptomu powinna zostać uzupełniona o analizę ekspresji transpozonów, metylacji DNA i statusu chromosomu X, które również dostarczają punktów orientacyjnych etapów rozwojowych21.

Ocena tworzenia osi i innych funkcji ludzkich blastoidów. Dojrzała blastocysta charakteryzuje się tworzeniem osi embrionalno-abembrionalnej tworzącej trofoblasty do implantacji. Korzystając z tego protokołu blastoidowego, silnie tworzy się oś, której przykładem jest dojrzewanie proksymalnych trofoblastów (np. NR2F2+/CDX2-), które nabywają zdolność przyłączania się do komórek organoidów endometrium tylko wtedy, gdy są stymulowane hormonalnie48,49. Porównanie z trofosferami, które nie tworzą epiblastu, pokazuje, że te wewnętrzne komórki indukują przylegające trofoblasty do dojrzewania, aby pośredniczyć w początkowym przyczepieniu do endometrium. Podczas hodowli w rozszerzonej pożywce przeznaczonej dla blastocyst małp cynomolgus50, wszystkie trzy linie z blastoidu konsekwentnie rozszerzają się przez sześć dodatkowych dni (odpowiednik dnia 13), chociaż ich organizacja nie odzwierciedla tego etapu rozwoju.

Implikacja wysokowydajnych i wiernych ludzkich blastoidów. Zachowanie zasad rozwoju, które zostały odkryte w organizmach modelowych, jest z natury trudne do zbadania na ludzkim zarodku ze względu na ograniczony dostęp i trudności techniczne w genetycznym i fizycznym manipulowaniu nim. Wysokowydajny i wierny model blastoidu pozwoliłby na wysokoprzepustowe badania genetyczne i przesiewowe leków, które są podstawą odkryć naukowych i biomedycznych. Ponadto włączenie złożonych modyfikacji genetycznych w celu zmiany i rejestrowania procesów biologicznych uzupełniłoby takie badania. Ogólnie rzecz biorąc, sugerujemy, że potrójne hamowanie (Hippo, TGF-β, ERK) naiwnych hPSC PXGL jest przewodzące dla skutecznego tworzenia ludzkich blastoidów o wysokiej wierności, spełniających cztery minimalne kryteria. Skalowalny i wszechstronny charakter tego protokołu sprawia, że nadaje się on do generowania ukierunkowanych hipotez, które można następnie zweryfikować przy użyciu ludzkich blastocyst. W związku z tym ludzkie blastoidy nie zastąpią wykorzystania ludzkiego conceptusa do badań in vitro, ale mogą działać jako potężny sposób kierowania badań za pomocą wcześniej niedostępnych podejść eksperymentalnych w sercu procesu odkryć naukowych i biomedycznych. Protokół pokazuje, jak tworzyć ludzkie blastoidy, a także jak analizować komórki zawarte w blastoidzie.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wytyczne Międzynarodowego Towarzystwa Badań nad Komórkami Macierzystymi i Tłumaczenia Klinicznego (ISSCR) zalecają, aby badania nad ludzkimi blastoidami były dozwolone tylko po przeglądzie i zatwierdzeniu przez specjalistyczny proces przeglądu naukowego i etycznego3,4. Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach Instytutu Biotechnologii Molekularnej Austriackiej Akademii Nauk (IMBA) pod zatwierdzeniem Rivron_Stellungnahme_2020-04-22. Przestrzeganie tych wytycznych jest niezbędne do publikowania wyników badań w czasopismach naukowych.

1. Hodowla ludzkiej naiwnej embrionalnej komórki macierzystej w stanie PXGL

UWAGA: Naiwne hPSC można uzyskać w odpowiednich laboratoriach. Użyte tu linie zostały pozyskane z laboratoriów Yasuhiro Takashimy (obecnie w CiRA, Kioto, Japonia) oraz Austina Smitha (obecnie w Living Systems Institute, Exeter, Wielka Brytania). Alternatywnie, naiwne hPSC mogą być resetowane w domu z linii zagruntowanych hPSC, jak opisano wcześniej13,14. Naiwne hPSC wydają się stabilne przez wiele pasaży (> 15), ale jakość kultury może się zmieniać w czasie. Jeśli jakość naiwnych hPSC spadnie, należy rozmrozić nową fiolkę z komórkami lub wygenerować de novo naiwne hPSC z zaszczepionych PSC. W odniesieniu do wszystkich kompozycji podłoży znajduje się w tabeli uzupełniającej 1.

  1. Przygotowanie napromieniowanej warstwy embrionalnej karmnika dla myszy (MEF)
    1. Dzień przed pasażowaniem wcześniej niedoświadczonych hPSC należy przygotować 6-dołkową płytkę do hodowli komórkowej z napromieniowanymi warstwami MEF, postępując zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
    2. Pokryj 6-dołkową płytkę do hodowli komórkowej 1 ml 0,1% żelatyny w PBS na studzienkę. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Usuń roztwór żelatyny.
    3. Przygotować pożywkę MEF w temperaturze 37 °C.
    4. Rozmrażać MEF-y w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, aż pozostanie tylko niewielka grudka lodu. Rozpuścić objętość fiolki w 1 ml przygotowanej pożywki MEF za pomocą pipety P1000.
    5. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml. Obracać zawieszenie przy 200 x g przez 4 minuty. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad MEF, dodając świeżą pożywkę MEF (wystarczającą na 1,5 ml na studzienkę).
    6. Policz komórki za pomocą szkiełek do liczenia komórek i dodaj 300 000 komórek do dołka i przenieś płytkę do inkubatora normoksy w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Jeśli MEF-y odczepią się z czasem, nowe MEF-y mogą zostać dodane do nośnika PXGL podczas rutynowej wymiany nośnika.
  2. Pasażowanie ludzkich naiwnych pluripotencjalnych komórek macierzystych
    1. Przed pasażowaniem hPSC należy sprawdzić ich morfologię pod mikroskopem. Kolonie zazwyczaj mają morfologię w kształcie kopuły z jasnymi, wyraźnymi granicami. Jeśli poszczególne kolonie wykazują bardziej płaską morfologię lub jeśli zaczynają pojawiać się zróżnicowane kolonie, postępuj zgodnie z instrukcjami kroku 1.2.8.
    2. Odessać pożywkę i raz przemyć komórki PBS. Dodać 500 μl roztworu do oddzielania komórek na dołek płytki 6-dołkowej.
    3. Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Użyć pipety P1000 i kilkakrotnie odpipetować komórki, aby rozdzielić kolonie na pojedyncze komórki.
    4. Zebrać komórki i przenieść je do 15 ml probówki zawierającej bufor do przemywania (1 ml na zagłębienie na płytkę 6-dołkową). Wiruj komórki w temperaturze 200 x g przez 4 minuty.
    5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w świeżym podłożu PXGL (wystarcza na 1,5 ml na studzienkę). Rozważ współczynnik rozłupywania 1:3-1:6 dla rutynowego pasażu.
      UWAGA: Po każdych 3-4 pasażach lub jeśli jakość hodowli komórkowej spada w zależności od morfologii komórki (np. pojawienie się płaskich kolonii w populacji), dodaj 10 μM Y-27632 i ekstrakt z błony podstawnej czynnika wzrostu (5 μL / studzienkę) do pożywki w ciągu pierwszych 24 godzin po pasażowaniu.
    6. Przed ponownym posiewem hPSC należy przygotować płytki ze świeżymi MEF-ami, zasysając pożywkę MEF i jednokrotnie przemłukując komórki PBS. Następnie za pomocą pipety P1000 przenieś 1,5 ml zawiesiny komórek hPSC na dołek 6-dołkowej płytki zawierającej MEFs.
      UWAGA: Upewnij się, że pipetowanie prowadzi do jednorodnego wysiewu komórek w obszarze studzienki. Zapewni to wzrost kolonii o jednorodnych rozmiarach i względnej synchronizacji komórek.
    7. Hodowla hPSC w warunkach niedotlenienia w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku. Po 24 godzinach należy dołączyć hPSC. Duża liczba nieprzylegających (lub pływających) komórek odzwierciedla problem z żywotnością lub przyczepieniem się po pasażowaniu.
    8. Zmienić podłoże na 1,5 ml pożywki PXGL na dołek dziennie. Przenikaj hPSC co 3-4 dni lub używaj ich do eksperymentów z tworzeniem blastoidów.
      UWAGA: Po rozmrożeniu hPSC, należy je przepuścić przez co najmniej trzy przejścia przed rozpoczęciem eksperymentu z blastoidem.

2. Powstawanie blastoidów

  1. Powstawanie naiwnych agregatów PSC
    1. Przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj i wstępnie podgrzej pożywkę PXGL, pożywkę podstawową N2B27, bufor myjący, PBS i pożywkę agregacyjną. Wyklucz MEF z zawiesiny hPSC do tworzenia blastoidów, wykonując czynności opisane poniżej.
    2. W celu wykluczenia MEF należy przygotować płytkę pokrytą żelatyną, dodając 1 ml 0,1% żelatyny do dołka płytki 6-dołkowej i inkubując w temperaturze 37 °C przez 30-90 minut.
    3. Aby zebrać komórki, odessać pożywkę i przemyć komórki 1 ml PBS.
    4. Dodać 500 μl roztworu do oddzielania komórek (na dołek płytki 6-dołkowej) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    5. Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby śledzić dysocjację kolonii na pojedyncze komórki (kilka wielokomórkowych grudek można później zdysocjować przez delikatne pipetowanie).
    6. Rozcieńczyć roztwór oddzielający komórki 1 ml buforu do przemywania wody. Zebrać komórki z płytki, delikatnie pipetując od 5 do 10 razy. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml. Wiruj komórki w temperaturze 200 x g przez 4 minuty.
    7. Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki w 1,5 ml pożywki PXGL (na dołek płytki 6-dołkowej) i wysiać komórki na płytkach pokrytych żelatyną w celu wykluczenia MEF i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60-90 minut.
    8. Po wysianiu naiwnych komórek w celu wykluczenia MEF, należy usunąć PBS z mikrostudzienek i zrównoważyć studzienki z 200 μl podstawowej pożywki N2B27 (na 1 chip mikrodołka) i inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C.
    9. Zebrać supernatant zawierający nieprzyłączone komórki naiwne, przenieść go do probówki o pojemności 15 ml i wirować w dół komórek o masie 200 x g przez 4 minuty.
    10. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 1 ml podłoża podstawowego N2B27. Policz komórki za pomocą slajdów do liczenia komórek. Wiruj komórki w temperaturze 200 x g przez 4 minuty.
    11. Odessać pożywkę i dodać odpowiednią ilość 10 μM Y-27632 zawartego w pożywce N2B27, aby uzyskać gęstość komórek 30 000 komórek na 50 μL.
      UWAGA: Optymalna początkowa liczba komórek wysiewu może się różnić w zależności od różnych linii komórkowych. Na przykład, aby zasiać 50-60 komórek / mikrostudzienkę, 30 000 komórek (w tym nadwyżka, biorąc pod uwagę, że niektóre komórki wypadają poza mikrostudzienkę) wysiewa się w 1 dołku z 96 dołków, który zawiera 430 mikrodołków. Niewłaściwa początkowa liczba komórek może spowodować powstanie małego agregatu bez ubytku lub powstanie struktury kawitacyjnej sięgającej ponad 250 μm.
    12. Odessać pożywkę ze zrównoważonych układów mikrostudzienek i dodać 25 μl pożywki N2B27 z 10 μM Y-27632. Dodać 50 μl zawiesiny komórkowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut (do momentu, gdy komórki wpadną na dno mikrostudzienki). Następnie dodać 125 μl pożywki N2B27 uzupełnionej 10 μM Y-27632.
  2. Rozwój blastoidów
    1. W ciągu 24 godzin można zaobserwować agregaty naiwnych hPSC (dzień 0) na chipie mikrostudzienki. Aby zainicjować powstawanie blastoidów, przygotuj pożywkę PALLY i postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
    2. Wstępnie podgrzane podłoże PALLY w temperaturze 37 °C przez 30 min.
      UWAGA: Kwas 1-oleoilo-lizofosfatydowy (LPA) i 10 μM Y-27632 należy dodać tuż przed użyciem. Optymalne stężenie LPA waha się w granicach 0,5-5 μM. Musi to być miareczkowane dla poszczególnych linii hPSC stosowanych w blastoidach.
    3. Zassać pożywkę agregacyjną. Dodać 200 μl wstępnie podgrzanej pożywki PALLY do mikrostudzienek. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej z powrotem w inkubatorze do hipoksyi w temperaturze 37 °C. Powtórzyć zmianę pożywki w dniu 1.
    4. W dniu 2 usunąć pożywkę PALLY i dodać 200 μl pożywki N2B27 uzupełnionej LPA i 10 μM Y-27632.
      UWAGA: W dniu 2 większość agregatów nadal rośnie. Jednak niektóre agregaty tworzą małe wgłębienia. Ciągłą hodowlę blastoidów w PALLY do 4. dnia lub w pożywce do hodowli in vitro (IVC1) od 2. dnia. Jednak następująca po tej zmianie podłoża zwiększa tworzenie się PrE w dojrzałych blastoidach.
    5. Powtórz zmianę nośnika w dniu 3. Całkowite powstanie blastoidu następuje w ciągu 4,
      UWAGA: Uważa się, że blastoidy są w pełni rozwinięte, gdy przeszły pełną morfogenezę w oparciu o morfometrię ludzkich blastocyst dnia 7 (np. zakres średnic od 150 -250 μm; jedno wewnętrzne skupisko otoczone nabłonkiem komórek podobnych do trofektodermy) i utworzyły polarne komórki podobne do trofektodermy (NR2F2+/CDX2-) i komórki podobne do PrE (GATA4+). Można to ocenić za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego lub sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).

3. Powstawanie blastoidów w 96-dołkowych mikropłytkach o bardzo niskim przyczepie

  1. Przygotować zawiesinę komórek hPSC do tworzenia blastoidów, wykonując czynności opisane powyżej od 2.1.1 - 2.1.11.
  2. Odessać pożywkę i dodać odpowiednią ilość pożywki N2B27 zawierającej 10 μM Y-27632, aby uzyskać gęstość komórek 70 komórek na 100 μl pożywki.
    UWAGA: Optymalna początkowa liczba komórek wysiewu może się różnić w zależności od różnych linii komórkowych. Na przykład 70 komórek/studzienkę może być optymalną liczbą komórek dla większości linii komórkowych.
  3. Odwirować płytkę o sile 200 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w celu grupowania komórek na dnie studzienek.
  4. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C w warunkach hodowli niedotlenionej. W ciągu 24 godzin na odwiertach można zaobserwować agregaty naiwnych hPSC (dzień 0).
  5. Przygotuj 2x PALLY podłoże. Dodać 100 μl podgrzanej pożywki 2x PALLY do studzienek.
  6. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej z powrotem w inkubatorze do hipoksyi w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach odessać połowę pożywki (100 μl) i zastąpić ją 100 μl podgrzanego podłoża PALLY. Powtarzaj ten krok do 4 dnia. Upewnij się, że nie zasysasz agregatów.
    UWAGA: W dniu 2 większość agregatów nadal rośnie. Jednak niektóre agregaty mają małe wgłębienia wypełnione cieczą. W 4 dniu większość kawitatowanych struktur ulega pełnej morfogenezie, tworząc struktury podobne do blastocyst.

4. Powstawanie trofosfer

  1. W celu utworzenia trofosfery postępuj zgodnie z protokołem tworzenia blastoidów od kroku 2.1.1 (wykluczenie MEF) do kroku 2.1.12 (ostatni krok protokołu wysiewu).
  2. Gdy po 24 godzinach utworzą się agregaty naiwnych hPSC, należy wymienić pożywkę agregacyjną na PALY (bez LIF) uzupełnioną 3 μM SC-144 w celu utworzenia trofosfer reprezentujących wczesną trofektodermę i PALLY uzupełnioną 2 μM XMU-MP-1 w celu wytworzenia trofosfer reprezentujących dojrzałą trofektodermę.
  3. Odświeżaj podłoże codziennie. Całkowite uformowanie trofosfery następuje do 4 dnia.

5. Analiza stanu komórek blastoidalnych i ich odbitego etapu za pomocą scRNAseq

  1. Aby wychwycić blastoidy i przeprowadzić dysocjację, rozgrzej inkubator z wytrząsaniem do 37 °C i ustaw go na 100 obr./min.
  2. Zebrać blastoidy z początkowej 96-dołkowej płytki i przenieść je do wielu dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U za pomocą pipety ustnej wyposażonej w szklaną kapilarę.
    UWAGA: Blastoidy (> 70%) powinny być wybierane na podstawie kryteriów morfometrycznych (rozmiar = 150-250 μm z unikalnym skupiskiem wewnętrznym), aby uniknąć zanieczyszczenia strukturami nieblastoidalnymi (< 30%).
  3. Przemyć raz 200 μl PBS za pomocą P200, oglądając pod mikroskopem stereoskopowym. Przenieść do studzienki zawierającej 50 μl kolagenazy i inkubować przez 30 minut w inkubatorze do wytrząsania.
  4. Przenieś blastoidy do studzienki ze 100 μl 10x trypsyny-EDTA i dobrze wymieszaj. Inkubować przez 20 minut w inkubatorze z wytrząsaniem.
  5. Oddziel blastoidy na pojedynczą komórkę za pomocą pipety P200. Przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml z buforem FACS (1% FBS w PBS).
  6. Aby uchwycić określone proporcje analogów trzech linii, należy wybarwić analogi TE i PrE odpowiednio przeciwciałami TROP2 i PDGFRa.
    UWAGA: Liczba komórek PrE w ludzkich blastocystach jest mniejsza w porównaniu z blastocystami myszy, co może odzwierciedlać wady rozwojowe blastocyst powstałych w wyniku zapłodnienia in vitro (IVF) lub różnicę gatunkową. W blastoidach analogi PrE są mniej obfite niż analogi TE i EPI i reprezentują 7,4% komórek po zliczeniu komórek GATA4 + za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego. Ponadto proces dysocjacji może indukować odchylenia w proporcjach różnych typów komórek jako analogów PrE, które reprezentują 1%-2% komórek po dysocjacji blastoidów, znakowaniu PDGFRa i analizie FACS.
  7. FACS sortuje komórki ze wszystkich trzech analogów linii na 384 płytki zawierające bufor do lizy do analizy smart-seq2. Wyklucz martwe komórki oznaczone barwieniem DAPI (wykonane zgodnie z instrukcjami producenta).
  8. Aby ocenić stany komórek (typ komórki i stadium rozwoju), porównaj dane transkryptomiczne z blastoidu z odpowiednimi kontrolami.

6. Rozszerzona hodowla do oceny postępu rozwoju blastoidów

  1. Hodowla ludzkich blastoidów na płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej (szklane dno).
    1. Pokryj płytkę matrycą błony podstawnej.
    2. Obejrzyj wzrokowo blastoidy, aby ocenić i zarejestrować morfologię.
      UWAGA: Tylko blastoidy, które wykazują klasyczną morfologię blastocysty z pustą kulą ze zwartym ICM, mają potencjał do dalszego wzrostu i rozwoju.
    3. Dodać 100 μl pożywki CMRL-1 na jedno zagłębienie 96-dołkowej płytki i umieścić płytkę w inkubatorze co najmniej 2 godziny przed przeniesieniem blastoidów w celu zrównoważenia.
    4. Za pomocą stereomikroskopu wizualnie zidentyfikuj blastoidy o dobrej morfologii, przenieś wybrane blastoidy do dołka 96-dołkowej płytki zawierającej 100 μl pożywki CMRL-1, aby usunąć ślady pożywki blastoidowej.
    5. Przenieś blastoidy do studzienki zawierającej wstępnie zrównoważoną pożywkę CMRL-1. Umieścić płytkę w inkubatorze i inkubować w temperaturze 37°C przez noc.
      UWAGA: W jednym dołku z 96-dołkowymi płytkami można hodować do 5 blastoidów. Posiadanie zbyt wielu blastoidów w jednej studzience może prowadzić do powstawania skupisk wielu blastoidów.
    6. Następnego dnia obejrzyj wizualnie blastoidy pod mikroskopem. Jeśli blastoidy są przyłączone, dodaj 100 μl wstępnie zbalansowanego podłoża CMRL-1 uzupełnionego 5% matrycą błony podstawnej. Umieścić płytkę w inkubatorze i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
    7. Następnego dnia monitoruj blastoidy pod mikroskopem. Usunąć połowę pożywki (100 μl) i zastąpić ją 100 μl wstępnie zbalansowanego podłoża CMRL-2 uzupełnionego 5% matrycą membrany podstawnej.
    8. W kolejnych dniach zastąp połowę pożywki (100 μl) wstępnie zrównoważonym podłożem CMRL-3 uzupełnionym 5% matrycą membrany podstawnej. Umieścić płytkę w inkubatorze i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Powtarzaj codziennie przez maksymalnie 4-6 dni hodowli in vitro.
      UWAGA: Posiadamy blastoidy hodowane przez okres do 6 dni w rozszerzonych warunkach hodowli, co odpowiada czasowi odpowiadającemu 13. dniu w przypadku ludzkich zarodków hodowanych in vitro.

7. Blastoidy barwiące immunologicznie

  1. Zassać pożywkę. Umyj próbki 3x PBS przez 5 min.
  2. Dodać 200 μl zimnego 4% paraformaldehydu (PFA) do PBS i utrwalać próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór PFA i przemyć próbki 3x PBS przez 10 min.
    UWAGA: Jeśli blastoidy były hodowane na chipach mikrodołkowych, przenieś blastoidy z chipa do 96-dołkowych płytek dolnych w kształcie litery U, aby wykonać następujące czynności.
  3. Przepuszczalność i zablokowanie blastoidów w 100 μl roztworu blokującego na studzienkę (PBS zawierający 0,3% Triton-X 100 i 10% normalnej surowicy osła) przez 60 min.
    UWAGA: W zależności od gatunku gospodarza przeciwciał, należy odpowiednio dostosować surowicę.
  4. Usuń roztwór blokujący. Dodać 100 μl przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w świeżym roztworze blokującym i inkubować próbki przez noc w temperaturze 4°C.
    UWAGA: Stężenia przeciwciał pierwszorzędowych należy określić na podstawie instrukcji producenta.
  5. Przemyć próbki 3x 0,1% Triton-X 100 w PBS (roztwór myjący) przez 10 min. Dodać 100 μl przeciwciał drugorzędowych w roztworze blokującym razem z 20 μg/ml barwnika jądrowego Hoechst i inkubować próbki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Chroń próbki przed światłem.
    UWAGA: Stężenia przeciwciał drugorzędowych należy określić na podstawie instrukcji producenta.
  6. Próbki przemywać 3x roztworem myjącym przez 10 min. W celu obrazowania przenieś próbki na szklane dno μ szkiełko w PBS.
    UWAGA: Medium montażowe należy dobrać w zależności od obiektywu użytego do obrazowania. Na przykład 80% glicerol w PBS można użyć do mocowania próbek podczas korzystania z obiektywów olejowych.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zazwyczaj, naiwne hPSC hodowane w PXGL (Rysunek 2A) to zagregowane i kawitowane struktury, które pojawiają się między 48 a 72 godzinami po indukcji PALLY i osiągają średnicę 150-250 μm w ciągu 96 godzin (Rysunek 2B). Przy zastosowaniu optymalnej (1) liczby komórek wysiewu, (2) czasu agregacji przed hodowlą z N2B27 (od 0 do 24 godzin), (3) stężenia poszczególnych składników chemicznych (zwłaszcza LPA) oraz (4) czasu trwania zabiegu PALLY, wydajność indukcji osiąga 70%-80% zgodnie z parametrami morfometrycznymi (całkowita wielkość 150-250 μm, pojedyncza regularna jama, pojedynczy wewnętrzny klaster komórek; Rysunek 2C,D) i obecność trzech linii. Nieoptymalny początkowy stan komórki i/lub warunki indukcji spowodują mniej wydajne tworzenie blastoidów lub ich brak. Aby zapewnić maksymalną skuteczność i tworzyć wyłącznie analogi preimplantacyjne, konieczne jest użycie wysokiej jakości hodowli naiwnych komórek hPSC PXGL. Można to ocenić, mierząc za pomocą FACS odsetek komórek dodatnich dla markerów powierzchniowych SUSD2 (stan naiwny) i CD24 (stan podstawiony). Dodatkowe markery powierzchniowe specyficzne dla linii pozaembrionalnych poza celem (np. owodni, mezoderma pozaembrionalna) również byłyby przydatne, ale zgodnie z naszą najlepszą wiedzą nie są obecnie dostępne. Jeśli uzyskana wydajność tworzenia jest niższa niż podane wyniki, ważne jest, aby dokładnie sprawdzić wszystkie składniki pożywki blastoidowej, zwłaszcza LPA, który jest odtwarzany w PBS i który, jako ligand GPCR, może być bardziej niestabilny w porównaniu z cząsteczkami syntetycznymi odtworzonymi w DMSO. W większości przypadków, nawet jeśli wydajność nie jest maksymalna, kawitowane struktury nadal składają się z trzech linii blastocyst. Pojawienie się trzech linii blastocyst i powstanie osi embrionalno-abembrionalnej można potwierdzić poprzez barwienie immunofluorescencyjne markerów (EPI: NANOG, OCT4, TE: GATA3, Polar-TE NR2F2, Mural-TE: CDX2, PrE: GATA4; Rysunek 2E,G). Trofosfery, które składają się tylko z TE, pomagają dokładniej przeanalizować rolę komunikacji międzykomórkowej. Trofosfery mogą formować się z wydajnością 50%-60% w ciągu 96 godzin od indukcji (Rysunek 2H,I). Powstawanie blastoidów można przeprowadzić nie tylko w domowych układach mikrostudzienek, ale także w dostępnych na rynku płytkach 96-dołkowych o ultra niskim przyłączeniu z optymalizacją warunków indukcji (patrz Protokół i Rysunek 2J). Blastoidy mają również zdolność do dalszego rozwoju przez dodatkowe 6 dni, co jest odpowiednikiem czasu zarodka w 13 dniu, z protokołem różnicowania in vitro (Ryc. 2K).

Aby dokładniej scharakteryzować stan komórek blastoidowych, należy użyć technologii sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. UMAP jest powszechnie stosowany do wizualizacji rozkładu stanów komórek i przeprowadza się na nim nienadzorowaną analizę grupowania w celu oceny bliskości poszczególnych stanów komórek. Różne parametry w analizie danych jednokomórkowych mogą wpływać na sposób wyświetlania komórek w UMAP, prowadząc w ten sposób do tworzenia klastrów o różnych pozycjach przestrzennych i względnych oraz kształtach (Rysunek 3A). Jednak w tej analizie komórki wykazują wyraźnie powtarzalne profile grupowania, niezależnie od parametrów użytych do przeprowadzenia grupowania i wizualizacji danych, co pozwala na rozróżnienie z dużą pewnością trzech linii blastocyst. Jako punkt odniesienia posłużyliśmy się komórkami z zarodków pobranych na różnych etapach rozwoju. Połączenie tych zestawów danych pokazuje, że większość analogu trofektodermy z blastoidu grupowała się z trofektodermą sprzed implantacji, ale nie z trofoblastami po implantacji (Rysunek 3B). Wyniki te zostały również potwierdzone przez niezależne konsorcjum10.

Gdy na mapie referencyjnej zostaną wprowadzone zarodki gastrulatujące Carnegie stage 7 (CS7), mała populacja komórek blastoidów (3%) skupiona jest w liniach mezodermy i owodni tych zarodków (Rysunek 3C). Kiedy komórki podobne do owodni są wprowadzane na mapę referencyjną, niewielka populacja komórek blastoidalnych (< 2%) skupia się z takimi komórkami podobnymi do owodni

.

Ogólnie rzecz biorąc, tylko struktury składające się z pojedynczej regularnej jamy, pojedynczego wewnętrznego skupiska komórek, ogólnego rozmiaru w zakresie 150-250 μm, zawierające transkryptomiczne analogi trzech linii blastocyst i w dużej mierze pozbawione innych linii (np. owodni, mezoderma, mezoderma pozaembrionalna) są uważane za ludzkie blastoidy.

figure-results-1
Rysunek 1: Cztery cechy i dwa podejścia do generowania blastoidów o wysokiej wierności. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Blastoidy i trofosfery pochodzące z agregatów naiwnego hPSC. (A) Obrazy z kontrastem fazowym przedstawiające naiwne hPSC hodowane w pożywce PXGL współhodowlanej z napromieniowanym MEF. Podziałka skali: 50 μm. (B) Obrazy kontrastu fazowego przedstawiające zmianę morfologiczną naiwnych agregatów hPSC hodowanych na nieprzylegającym hydrożelowym układzie mikrostudzienkowym z 500 nM LPA (podłoże PALLY). Podziałka skali: 200 μm. (C) Ludzkie blastoidy powstały na matrycy mikrostudzienkowej po 96 godzinach. Podziałka skali: 400 μm. (D) Oznaczanie ilościowe procentu mikrostudzienek zawierających ludzki blastoid wywołany przez warunki hodowli PALLY ze zoptymalizowanym stężeniem LPA z różnych naiwnych linii hPSC (n = 3 matryce mikrostudzienek). (E) Barwienie immunofluorescencyjne ludzkich blastoidów markerami epiblastów (EPI) (żółtymi) NANOG i OCT4; markery TE (cyjan) CDX2 i GATA3; oraz prymitywny marker endodermy (magenta) SOX17 i GATA4. Podziałka skali: 100 μm. (H-I) Kwantyfikacja liczby komórek (po lewej) i procentu komórek (po prawej) należących do każdej linii w blastoidzie (96 h) na podstawie barwienia immunofluorescencyjnego OCT4, GATA3 i GATA4. (G) Barwienie immunofluorescencyjne ludzkich blastoidów pod kątem CDX2 (cyjan) i NR2F2 (magenta). (F) Obrazy kontrastu fazowego trofosfer wczesnego i późnego stadium na matrycy mikrostudzienek wywołane przez dodanie odpowiednio 3 μM SC144 (H) lub 2 μM XMU-MP-1 (I). (J) Obrazy z kontrastem fazowym przedstawiające zmianę morfologiczną naiwnych agregatów hPSC hodowanych na 96-dołkowej płytce o ultra niskim przyłączeniu z 500 nM LPA (podłoże PALLY). (K) Obraz z kontrastem fazowym (po lewej) i barwienie immunofluorescencyjne (po prawej) dla OCT4 (żółty), GATA3 (cyjan) i GATA4 (magenta) u blastoidu hodowanego w warunkach hodowli poimplantacyjnej przez 6 dni. Podziałka: 100 μm. Ten rysunek jest zaadaptowany z6,10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Charakterystyka składu blastoidów za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek. (A) Nienadzorowana analiza skupień z różnymi parametrami UMAP transkryptomu pojedynczych komórek pochodzących z różnych punktów czasowych blastoidu (24 h, 60 h, 96 h), naiwnych hPSC, primed hPSC i hTSC (reprezentują cytotrofoblast po implantacji). (B) UMAP transkryptomu komórek pochodzących z blastoidów (96 h), naiwnych hPSC i primeed hPSC zintegrowanych z opublikowanymi zestawami danych z ludzkich zarodków w stadium preimplantacji, okołoimplantacyjnym (blastocysty hodowane in vitro) i gastrulacji (stadium Carnegie 7, tj. między E16-19). Poszczególne komórki są kolorowane na podstawie ich pochodzenia w ludzkich embrionach (po lewej), komórek pochodzących z blastoidów lub komórek macierzystych (w środku) oraz wyniku nienadzorowanej analizy grupowania (po prawej). (C) UMAP transkryptomu komórek pochodzących z blastoidów, naiwnych hPSC, zaszczepionych hPSC i zintegrowanych z opublikowanym zestawem danych z zarodka gastrulacji (stadium 7 Carnegie, tj. między E16-19). Poszczególne komórki są kolorowane na podstawie ich pochodzenia w ludzkich embrionach (po lewej), komórek pochodzących z blastoidów lub komórek macierzystych (w środku) oraz wyniku nienadzorowanej analizy grupowania (po prawej). Ten rysunek jest zaadaptowany z6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Wszystkie kompozycje mediów użyte w tym badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym badaniu pokazujemy krok po kroku, jak ustalić ludzkie blastoidy z wysoką skutecznością przy użyciu prostego i solidnego protokołu. Po agregacji naiwnych hPSC PXGL i ich potrójnym hamowaniu, blastoidy tworzą się wydajnie (> 70%) i sekwencyjnie generują 3 analogi blastocyst w ciągu 4 dni. Ograniczenia w wydajności i jakości blastoidów (np. obecność komórek poza celem) mogą wystąpić, jeśli stan początkowy jest nieoptymalny. Warto zauważyć, że zmierzyliśmy, że hPSC PXGL zawiera około 5% komórek odzwierciedlających etapy poimplantacyjne. Komórki te mogą ograniczać powstawanie wysokiej jakości blastoidów. Poza początkowym naiwnym stanem PXGL, który odzwierciedla epiblast blastocysty, innym kluczowym czynnikiem jest pożywka używana do tworzenia blastoidów. Aby szybko tworzyć komórki podobne do blastocyst i zapobiegać tworzeniu się komórek podobnych do implantacji poza celem, sugerujemy, że niezbędne jest hamowanie potrójnych szlaków (Hippo, ERK, TGF-β). Podczas gdy różne linie komórkowe dają różną wydajność blastoidu po zahamowaniu ERK/TGF-β (zwykle około 10%-20%), narażenie na LPA powoduje powstanie równie wysokiej wydajności blastoidu we wszystkich liniach komórkowych, przy zastosowaniu ścisłych kryteriów morfometrycznych i specyfikacji linii. LPA prawdopodobnie działa na hamowanie szlaku hipopotama, który odgrywa kluczową rolę w pierwszej linii segregacji między liniami epiblastów i trofektodermy u myszy i ludzi 8,51. Znacząca poprawa skuteczności blastoidu przez LPA sugeruje, że mechanizmy specyfikacji komórek wewnętrznych-zewnętrznych, w których pośredniczy szlak Hippo, odgrywające rolę w blastocyście, są dokooptowane podczas tworzenia blastoidu. Obecne ograniczenie polega na tym, że ze względu na nieoptymalną skuteczność protokołów stosowanych do hodowli ludzkich blastocyst lub blastoidów w równoważnym czasie dnia 7-13 (po wytworzeniu blastocysty/blastoidu) nie jesteśmy w stanie ocenić, w jakim stopniu możemy prawidłowo modelować rozwój poimplantacyjny.

Analiza stanu transkryptomicznego komórek blastoidalnych może być łatwo osiągnięta za pomocą scRNAseq, odpowiednich map referencyjnych i metod bioinformatycznych. Wcześniej analiza transkryptomiczna wykazała, że hPSC hodowane w PXGL są bardziej podobne do epiblastu blastocysty w porównaniu ze stanem zapoczątkowanym. Ograniczenia w analizie danych mogą wystąpić, jeśli mapa referencyjna obejmuje tylko komórki w stadium blastocysty. Mapa referencyjna powinna obejmować komórki pochodzące z zarodków po implantacji w celu oceny obecności potencjalnych komórek niedocelowych. W przyszłości, w celu przeprowadzenia testów porównawczych komórek blastoidowych, niezwykle cenna byłaby mapa referencyjna obejmująca wszystkie tkanki ludzkiego zarodka przed i po implantacji. Ponadto pomocne byłyby multiomiczne mapy referencyjne pojedynczych komórek, na przykład obejmujące transkryptom, dostępność chromatyny i metylację DNA. Wreszcie, standaryzowane metody bioinformatyczne do ilościowej oceny podobieństw między komórkami z modeli embrionalnych i koncepcji referencyjnych oraz do pozytywnej identyfikacji komórek poza celem dodatkowo pomogłyby w bezstronnej analizie i porównywaniu wyników.

Ogólnie rzecz biorąc, blastoidy powstałe w wyniku potrójnego hamowania szlaków Hippo, TGF-β i ERK posiadają cztery cechy: 1) wysoce wydajną morfogenezę, 2) prawidłową sekwencję specyfikacji linii, 3) wysoką czystość komórek podobnych do blastocysty na poziomie transkryptomu, 4) zdolność do modelowania rozwoju okołoimplantacyjnego. Te cechy blastoidów ułatwią budowanie hipotez dotyczących rozwoju i zagnieżdżania się blastocyst, jednak nie podsumowują wcześniejszych etapów rozwoju embrionalnego. W przeciwieństwie do ograniczonej dostępności i wszechstronności ludzkich blastocyst, blastoidy są podatne na genetyczne i lekowe badania przesiewowe w celu funkcjonalnych badań rozwoju i implantacji blastocysty. W przyszłości taka podstawowa wiedza może przyczynić się do ulepszenia formułowania pożywek do zapłodnienia in vitro, opracowania środków antykoncepcyjnych po zapłodnieniu i lepszego zarządzania wczesną ciążą.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Instytut Biotechnologii Molekularnej Austriackiej Akademii Nauk złożył wniosek patentowy EP21151455.9 opisujący protokoły powstawania blastoidów u ludzi oraz test interakcji blastoid-endometrium. HK, AJ, HHK i NR są wynalazcami tego patentu. Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt otrzymał dofinansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji (umowa o grant ERC-Co nr 101002317 'BLASTOID: platforma odkrywcza dla wczesnej embriogenezy człowieka'). H.H.K. jest wspierany przez Austriacki Fundusz Naukowy (FWF), Lise Meitner Programme M3131-B. Dziękujemy Yasuhiro Takashimie za udostępnienie linii komórkowych H9 i H9-GFP oraz Austinowi Smithowi, Peterowi Andrewsowi i Ge Guo za udostępnienie linii komórkowych HNES1, Shef6, niPSC 16.2b i cR-NCRM2. Dziękujemy Hosseinowi Baharvandowi za udostępnienie organoidów endometrialnych. Dziękujemy Joshua M. Brickman za udostępnienie RNA wyizolowanego z komórek zróżnicowanych PrE i komórek nEND. Dziękujemy Shankarowi Srinivasowi za udostępnienie danych z sekwencjonowania jednokomórkowego RNA zarodka peri-gastrulacyjnego. Dziękujemy Aleksandrowi Bykovowi i Luisie Cochelli za pomoc techniczną w przygotowaniu biblioteki SMARTSeq2. Dziękujemy placówce NGS, Biooptic and Stem Cell w IMBA za krytyczną pomoc.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Pożywki neuropodstawowew domu
DMEM/F12w domu
100X N2 suplementGibco17502048
50X B27Gibco17504044
100X GlutamaxGibco35050038
100 mM Pirogronian soduGibco11360039
MEM-Aminokwasy endogenneGibco11140050
1 M Hepesw domu
50 mM 2-merkaptoetanolThermofisher31350010
100X Penicylina-StreptomycynaSigma-AldrichP0781
Surowica bydlęca Roztwór albuminySigma-AldrichA7979
PD0325901Medchem expressHY-10254
XAV-939Medchem expressHY-15147
Gö 6983Medchem expressHY-13689
Ludzki rekombinowany czynnik hamujący białaczkęw domu
A83-01Medchem expressHY-10432
Kwas 1-oleoilo-lizofosfatydowy (LPA)Peprotech2256236
Y-27632Medchem expressHY-10583
CMRL mediumGibco21530027
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-AldrichF7524
Wymiana surowicy nokautującej (KSR)Thermofisher10-828-028
AccutaseBiozymB423201roztwór do odrywania komórek
GeltrexThermofisherA1413302czynnik wzrostu ekstrakt z błony podstawnej
przeciwciało TROP2R& Systemy DMAB650
PDGFRα przeciwciałaR& Systemy DAF307
SC-144Axon2324
XMU-MP-1Med Chem ExpressHY-100526
Matryca membrany podstawnejMatrigel
Szkiełka komory do liczenia komórek CountessSzkiełka do liczenia komórekThermo fisher
Roztwór do barwienia DAPIMiltenyi Biotec130-111-570

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rivron, N., et al. Debate ethics of embryo models from stem cells. Nature. 564 (7735), 183-185 (2018).
  2. Hyun, I., Munsie, M., Pera, M. F., Rivron, N. C., Rossant, J. Toward Guidelines for Research on Human Embryo Models Formed from Stem Cells. Stem Cell Reports. 14 (2), 169-174 (2020).
  3. Clark, A. T., et al. Human embryo research, stem cell-derived embryo models and in vitro gametogenesis: Considerations leading to the revised ISSCR guidelines. Stem Cell Reports. 16 (6), 1416-1424 (2021).
  4. Lovell-Badge, R., et al. ISSCR Guidelines for Stem Cell Research and Clinical Translation: The 2021 update. Stem Cell Reports. 16 (6), 1398-1408 (2021).
  5. Rivron, N. C., et al. Blastocyst-like structures generated solely from stem cells. Nature. 557 (7703), 106-111 (2018).
  6. Kagawa, H., et al. Human blastoids model blastocyst development and implantation. Nature. , 04267-04268 (2021).
  7. Meistermann, D., et al. Integrated pseudotime analysis of human pre-implantation embryo single-cell transcriptomes reveals the dynamics of lineage specification. Cell Stem Cell. 28 (9), 1625-1640 (2021).
  8. Gerri, C., et al. Initiation of a conserved trophectoderm program in human, cow and mouse embryos. Nature. 587 (7834), 443-447 (2020).
  9. Gerri, C., Menchero, S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. A., Niakan, K. K. Human Embryogenesis: A Comparative Perspective. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 411-440 (2020).
  10. Zhao, C., et al. Reprogrammed iBlastoids contain amnion-like cells but not trophectoderm. bioRxiv. , 2021.05.07.442980(2021).
  11. Zijlmans, D. W. Integrated multi-omics reveal polycomb repressive complex 2 restricts human trophoblast induction. Nat. Cell Biol. 24, 858-871 (2022).
  12. Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).
  13. Guo, G., et al. Epigenetic resetting of human pluripotency. Development. 144 (15), Cambridge, England. 2748-2763 (2017).
  14. Takashima, Y., et al. Resetting transcription factor control circuitry toward ground-state pluripotency in human. Cell. 158 (6), 1254-1269 (2014).
  15. Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), New York, N.Y. 1145-1147 (1998).
  16. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
  17. Stirparo, G. G., et al. Integrated analysis of single-cell embryo data yields a unified transcriptome signature for the human pre-implantation epiblast. Development. 145 (3), Cambridge, England. 158501(2018).
  18. Castel, G., et al. Induction of Human Trophoblast Stem Cells from Somatic Cells and Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 33 (8), 108419(2020).
  19. Posfai, E., et al. Evaluating totipotency using criteria of increasing stringency. Nature Cell Biology. 23 (1), 49-60 (2021).
  20. Nakamura, T., et al. A developmental coordinate of pluripotency among mice, monkeys and humans. Nature. 537 (7618), 57-62 (2016).
  21. Theunissen, T. W., et al. Molecular Criteria for Defining the Naive Human Pluripotent State. Cell Stem Cell. 19 (4), 502-515 (2016).
  22. Guo, G., et al. Naive Pluripotent Stem Cells Derived Directly from Isolated Cells of the Human Inner Cell Mass. Stem Cell Reports. 6 (4), 437-446 (2016).
  23. Rossant, J. Genetic Control of Early Cell Lineages in the Mammalian Embryo. Annual Review of Genetics. 52, 185-201 (2018).
  24. De Paepe, C., et al. Human trophectoderm cells are not yet committed. Human reproduction. 28 (3), 740-749 (2013).
  25. Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 1212-1221 (2013).
  26. Io, S., et al. Capturing human trophoblast development with naive pluripotent stem cells in vitro. Cell Stem Cell. 28 (6), 1023-1039 (2021).
  27. Guo, G., et al. Human naive epiblast cells possess unrestricted lineage potential. Cell Stem Cell. 28 (6), 1040-1056 (2021).
  28. Liu, X., et al. Modelling human blastocysts by reprogramming fibroblasts into iBlastoids. Nature. 591 (7851), 627-632 (2021).
  29. Hirate, Y., et al. Polarity-dependent distribution of angiomotin localizes Hippo signaling in preimplantation embryos. Current biology: CB. 23 (13), 1181-1194 (2013).
  30. Cockburn, K., Biechele, S., Garner, J., Rossant, J. The Hippo pathway member Nf2 is required for inner cell mass specification. Current Biology: CB. 23 (13), 1195-1201 (2013).
  31. Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature Biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
  32. Krendl, C., et al. GATA2/3-TFAP2A/C transcription factor network couples human pluripotent stem cell differentiation to trophectoderm with repression of pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9579-9588 (2017).
  33. Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
  34. Horii, M., Bui, T., Touma, O., Cho, H. Y., Parast, M. M. An Improved Two-Step Protocol for Trophoblast Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 96(2019).
  35. Okae, H., et al. Derivation of Human Trophoblast Stem Cells. Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63 (2018).
  36. Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
  37. Kuijk, E. W., et al. The roles of FGF and MAP kinase signaling in the segregation of the epiblast and hypoblast cell lineages in bovine and human embryos. Development. 139 (5), Cambridge, England. 871-882 (2012).
  38. Roode, M., et al. Human hypoblast formation is not dependent on FGF signalling. Developmental Biology. 361 (2), 358-363 (2012).
  39. Linneberg-Agerholm, M., et al. Naïve human pluripotent stem cells respond to Wnt, Nodal and LIF signalling to produce expandable naïve extra-embryonic endoderm. Development. 146 (24), Cambridge, England. (2019).
  40. Yu, L., et al. Blastocyst-like structures generated from human pluripotent stem cells. Nature. 591 (7851), 620-626 (2021).
  41. Yanagida, A., et al. Naive stem cell blastocyst model captures human embryo lineage segregation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1016-1022 (2021).
  42. Zappia, L., Oshlack, A. Clustering trees: a visualization for evaluating clusterings at multiple resolutions. GigaScience. 7 (7), (2018).
  43. Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
  44. Messmer, T., et al. Transcriptional Heterogeneity in Naive and Primed Human Pluripotent Stem Cells at Single-Cell Resolution. Cell Reports. 26 (4), 815-824 (2019).
  45. Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
  46. Petropoulos, S., et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Lineage and X Chromosome Dynamics in Human Preimplantation Embryos. Cell. 167 (1), 285(2016).
  47. Tyser, R. C. V., et al. A spatially resolved single cell atlas of human gastrulation. bioRxiv. , (2020).
  48. Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  49. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), Cambridge, England. 1775-1786 (2017).
  50. Ma, H., et al. In vitro culture of cynomolgus monkey embryos beyond early gastrulation. Science. 366 (6467), New York, N.Y. (2019).
  51. Nishioka, N., et al. The Hippo signaling pathway components Lats and Yap pattern Tead4 activity to distinguish mouse trophectoderm from inner cell mass. Developmental Cell. 16 (3), 398-410 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human BlastoidsBlastocyst DevelopmentStem Cell ModelNaive Pluripotent Stem CellsPXGL CultureLineage SpecificationTrophoblast AnalogPrimitive EndodermSingle Cell SequencingIn Vitro Implantation

Related Articles