W obecnym protokole, technika elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE) jest używana do określenia rozkładu długości łańcucha (CLD) i średniej długości łańcucha (ACL) glikogenu.
Artykuł metodologiczny
Oznaczanie rozkładu długości łańcucha glukanowego glikogenu metodą elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Cząsteczki glikogenu to rozgałęzione polisacharydy złożone z liniowych łańcuchów jednostek glukozylowych połączonych wiązaniami glukozydowymi α-1,4. Te ostatnie są połączone ze sobą wiązaniami glukozydowymi α-1,6, zwanymi punktami rozgałęzień. Wśród różnych form magazynowania węgla (tj. skrobia, β-glukan), glikogen jest prawdopodobnie jednym z najstarszych i najbardziej udanych polisacharydów magazynujących znalezionych w żywym świecie. Łańcuchy glukanu są zorganizowane w taki sposób, że w razie potrzeby duża ilość glukozy może być szybko przechowywana lub zasilana w komórce. W ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano wiele uzupełniających się technik w celu rozwiązania drobnej struktury cząstek glikogenu. W tym artykule opisano elektroforezę węglowodanową wspomaganą fluoroforem (FACE). Metoda ta określa ilościowo populację łańcuchów glukanu, które składają się na cząstkę glikogenu. Parametr ten, znany również jako rozkład długości łańcucha (CLD), odzwierciedla wielkość cząstek i procent rozgałęzień. Jest to również niezbędny wymóg do matematycznego modelowania biosyntezy glikogenu.
Wprowadzenie
Glikogen, wykorzystywany jako magazyn węgla i energii, jest homopolimerem glukozy składającym się z liniowych łańcuchów jednostek glukozylu połączonych wiązaniami (1 → 4)-α i przyłączonych poprzez wiązania glikozydowe (1 → 6)-α lub punkty rozgałęzień. Występuje on w postaci cząsteczek β i α w cytozolu wielu organizmów. Cząsteczki β to niewielkie, rozpuszczalne w wodzie cząsteczki obserwowane głównie u prokariontów. Ich średnica mieści się w zakresie 20-40 nm, co jest prawdopodobnie determinowane przez enzymy metabolizujące glikogen oraz zawadę steryczną1,2.
Pierwszy raz opisane w komórkach zwierzęcych, większe cząstki α osiągają średnicę do 300 nm i mają kształt przypominający kalafior. Ta konkretna organizacja może wynikać z agregacji kilku cząstek β lub może powstawać w procesie pączkowania z pojedynczej cząstki β3. Co ciekawe, niedawne badanie zgłosiło obecność cząstek α w Escherichia coli4. Jednak w przeciwieństwie do cząstek α z komórek zwierzęcych, te ostatnie szybko rozpadają się podczas procesu ekstrakcji, co może wyjaśniać brak danych w literaturze4. Pojawienie się cząstek α u eukariotów i prokariotów angażuje filogenetycznie niezwiązane enzymy metabolizujące glikogen5. Budzi to pytania dotyczące funkcji takich cząstek oraz natury potencjalnych czynników sieciujących pomiędzy cząstkami β5.
Choć zaproponowano dwa przeciwstawne modele matematyczne tworzenia cząsteczek glikogenu6,7,8,9, powszechnie przyjmuje się, że cząstki β ewoluowały w odpowiedzi na ich funkcję metaboliczną jako wysoce wydajny rezerwuar paliwa do szybkiego uwalniania dużych ilości glukozy. Liczne dowody wskazują, że właściwości glikogenu, takie jak strawność i rozpuszczalność w wodzie, są skorelowane ze średnią długością łańcucha (ACL), która następnie determinuje procent punktów rozgałęzień oraz wielkość cząstki2,6,7,8,10,11. ACL jest definiowana jako stosunek całkowitej liczby reszt glukozy do liczby punktów rozgałęzień. Typowo wartości ACL wahają się od 11-14 i 7-23 reszt glukozy odpowiednio u eukariotów i prokariotów10. U ludzi kilka chorób zaburzeń metabolizmu glikogenu wynika z nieprawidłowego gromadzenia się glikogenu. Na przykład choroba Andersena wiąże się z niedoborem aktywności enzymu rozgałęziającego glikogen, co prowadzi do kumulacji nieprawidłowego glikogenu11. U prokariotów badania zbiorcze sugerują, że ACL jest krytycznym czynnikiem wpływającym na tempo degradacji glikogenu i zdolność przeżycia bakterii12,13. Donoszono, że bakterie syntetyzujące cząstki β o niskiej wartości ACL degradują je wolniej, a zatem dłużej znoszą warunki głodzenia. Zatem wiedza o architekturze cząstek β jest niezbędna do zrozumienia powstawania nieprawidłowych cząstek glikogenu w ludzkich chorobach spichrzeniowych glikogenu oraz przeżywalności prokariotów w środowisku ubogim w składniki odżywcze.
Od czasu pierwszej izolacji glikogenu z wątroby psa dokonanej przez francuskiego fizjologa Claude'a Bernarda pod koniec XIX wieku14, opracowano wiele technik służących do szczegółowej charakterystyki cząsteczek glikogenu. Przykładowo, zastosowano transmisyjną mikroskopię elektronową do badania morfologii glikogenu (cząsteczki α lub β)15, spektrometrię protonowego NMR do określania procentowej zawartości wiązań α-1,616, chromatografię wykluczania z wielodetekcją w celu określenia masy cząsteczkowej, elektroforezę węglowodanów wspomaganą fluoroforami (FACE)17 lub wysokosprawną anionowymienną chromatografię z pulsacyjną detekcją amperometryczną (HPAEC-PAD) do wyznaczania zarówno rozkładu długości łańcuchów (CLD), jak i ACL18.
Niniejsza praca koncentruje się na metodzie elektroforezy węglowodanów wspomaganej fluoroforami, która opiera się na aminowaniu redukcyjnym grupy hemiacetalowej za pomocą funkcji aminy pierwszorzędowej. Historycznie do znakowania po raz pierwszy wykorzystywano kwas 8-amino-1,3,6-naftaleno-trisulfonowy (ANTS). Później został on zastąpiony przez bardziej czuły fluorofor, kwas 8-amino-1,3,6-pireno-trisulfonowy (APTS)19.
Rycina 1: Reakcja aminowania redukcyjnego z kwasem 8-amino-1,3,6-pyrenotrisulfonowym (APTS). Reakcja aminowania redukcyjnego grupy hemiacetalowej przez funkcję aminy pierwszorzędowej kwasu 8-amino-1,3,6-pyrenotrisulfonowego (APTS) w warunkach redukcyjnych Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Jak przedstawiono na Rysunku 1, funkcja hemiacetalowa redukującego końca łańcucha glukanu oddziałuje z aminą pierwszorzędową APTS w warunkach redukujących. Grupy sulfonowe APTS niosą ładunki ujemne, które umożliwiają rozdzielanie łańcuchów glukanów zgodnie z ich stopniem polimeryzacji (DP). Reakcja aminowa redukcyjna jest wysoce powtarzalna i wydajna. Średnia wydajność znakowania na poziomie 80% jest uzyskiwana dla DP3 do DP135, a do 88% i 97% odpowiednio dla maltozy (DP2) i glukozy17,20. Ponieważ jedna cząsteczka APTS reaguje z redukującym końcem każdego łańcucha glukanu, poszczególne łańcuchy mogą być ilościowo oznaczane i porównywane ze sobą w oparciu o molowość.
Protokół
1. Inkubacja z enzymami rozgałęziającymi
- Zmieszać 200 μl oczyszczonego glikogenu o stężeniu 0,5-2 mg/ml z 200 μl 100 mM buforu octanowego (pH 4,8). Dodać 2 μl izoamylazy (180 j./mg białka) i 1,5 μl pullulanazy (30 j./mg białka) (patrz tabela materiałów), delikatnie wymieszać pipetując w górę i w dół i inkubować w temperaturze 42 °C przez 16 godzin w probówce o pojemności 1,5 ml.
UWAGA: Podczas procesu oczyszczania glikogenu może dojść do degradacji lub zanieczyszczenia amylazą. Aby ocenić obecność wolnych maltooligosacharydów, próbki można inkubować równolegle bez koktajlu enzymów rozgałęziających. Do analizy włącza się wzorzec (np. maltoheptaozę) w celu określenia zależności między czasem elucji a stopniem polimeryzacji. - Przerwać reakcje przez inkubację w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
- Wirować przy 16 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia i usunięcia wszelkich nierozpuszczalnych materiałów.
- Usunąć supernatanty za pomocą pipety i przenieść je do nowych probówek z adnotacjami. Supernatanty odsolić, dodając ekwiwalent 100 μl kulek żywicy anionowymiennej (AG-501-X8, patrz tabela materiałów) i wymieszać.
- Regularnie mieszaj kulki przez 5 minut. Pobrać próbki za pomocą pipetowania i umieścić je w nowych probówkach z adnotacjami.
- Suszyć próbki przez liofilizację lub użyć wyparki próżniowej (patrz tabela materiałów) w temperaturze 30 °C.
- Wysuszone próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej lub w temperaturze -20 °C.
UWAGA: Próbki można przechowywać przez 1 miesiąc.
2. Aminacja redukcyjna
- Wysuszone próbki zmieszać z 2 μl 1 M cyjanoborowodorku sodu w tetrahydrofuranie (THF) i 2 μl APTS (5 mg APTS zawieszonych w 48 μl 15% kwasu octowego) (patrz tabela materiałów).
- Inkubować w temperaturze 42 °C przez 16 godzin w ciemności.
UWAGA: Z cyjanoborowodorkiem sodu obchodzi się przy użyciu dostosowanych środków ochrony osobistej i pod maską chemiczną. Wdychanie i kontakt ze skórą są wysoce toksyczne i mogą być śmiertelne, powodując poważne oparzenia skóry i uszkodzenie oczu. Podczas mieszania cyjanoborowodorku sodu z kwasem octowym mogą powstawać wysoce toksyczne gazy. W kontakcie z wodą cyjanoborowodorek sodu uwalnia łatwopalne gazy, które mogą ulec samozapłonowi. Począwszy od tego etapu, skoncentrowane próbki są przetwarzane pod kapturem chemicznym i przy użyciu dostosowanych środków ochrony indywidualnej.
3. Analiza TWARZY
- Do każdej próbki dodać 46 μl ultraczystej wody.
- Rozcieńczyć próbki bezpośrednio do 1/50 w mikrofiolkach o pojemności 100 μl, dodając 1 μl próbki do 49 μl wody ultraczystej. Trzymaj próbki w ciemności podczas ustawiania TWARZY (5-10 min).
- Wykonać elektroforezę z odwrotną polaryzacją za pomocą przyrządu do elektroforezy kapilarnej z detektorem fluorescencji indukowanej laserem (LIF) (patrz tabela materiałów). Ustaw polaryzację na "tryb odwrotny" dla separacji, ustaw LIF na długość fali emisji 488 nm, a detektor na 512 nm.
- Ustaw czas wtrysku na 10 s, a ciśnienie wtrysku na 0,5 psi.
- Przeprowadzić separację glukanów znakowanych APTS przy napięciu 30 kV w kapilarze z topionej krzemionki o długości 60,2 cm i średnicy wewnętrznej 50 μm (średnica zewnętrzna 375 μm) w buforze do separacji węglowodanów sprzężonych z azotem rozcieńczonym do 1/3 w wodzie ultraczystej (patrz tabela materiałów).
UWAGA: Bufor separacji węglowodanów sprzężony z N jest wymieniany co 20 przebiegów.
4. Przetwarzanie danych
- Eksportuj plik ". ASC "oraz ". CDF" zawierające odpowiednio profil elektroferogramu i dane całkowania.
- Otwórz plik . ASC i narysuj względną jednostkę fluorescencji zgodnie z wykresem czasowym.
- Otwórz plik . CDF, przejdź do pierwszej automatycznej integracji i dostosuj następujące parametry: szerokość; integracja między dolinami; minimalna powierzchnia.
- Ręcznie sprawdź i skoryguj wszelkie nieprawidłowe zdarzenia integracyjne.
Wyniki
Oznaczanie średniej długości łańcucha glikogenu
Rycina 2 przedstawia schemat postępowania niezbędny do wyznaczenia rozkładu długości łańcuchów oraz średniej długości łańcucha (ACL) glikogenu.
Rysunek 2: Schemat postępowania w celu określenia rozkładu długości łańcuchów (CLD) oraz średniej długości łańcucha. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3 przedstawia elektroferogramy komercyjnego maltoheksaozy oraz odgałęzionego glikogenu z wątroby bydlęcej. Sygnały fluorescencji obserwowane w czasie 4,13-4,67 min we wszystkich eksperymentach pochodziły z niezreagowanego APTS. Czas elucji znakowanej maltoheksaozy (DP6) oszacowano na 8,49 min (Rycina 3A). Glukany glikogenu bydlęcego znakowane APTS zidentyfikowano na podstawie czasu elucji DP6 (Rycina 3B). W próbce kontrolnej (glikogen nieinkubowany z enzymami odgałęziającymi) nie wykryto śladów wolnych maltooligosacharydów (Rycina 3C).
Rycina 3: Elektroferogramy standardu oraz glikogenu z wątroby bydlęcej. (A) Czas elucji (8,49 min) standardu glukanu, maltoheksozy (DP6), posłużył jako punkt odniesienia do określenia stopnia polimeryzacji (DP) glukanów znakowanych APTS, uwolnionych z glikogenu z wątroby bydlęcej po działaniu enzymów odgałęziających (B). Panel wstawkowy przedstawia rozdział łańcuchów glukanów do 44 DP. Równolegle niepoddanym obróbce glikogen bydlęcy znakowano APTS w celu wykrycia ewentualnych śladów wolnych malto-oligosacharydów w próbce (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Można wywnioskować, że uwalnianie glukanu znakowanego APTS wynika z rozrywania punktów rozgałęzień przez aktywność izoamylazy i pullulanazy. Należy zauważyć, że profil elektroforezy kapilarnej można przerysować w bardziej odpowiednim formacie, aby stworzyć rycinę mozaikową zawierającą kilka profili. W tym celu generuje się pliki DATA zawierające wartości fluorescencji z rozszerzeniem „asc”, a następnie otwiera je w programie do arkuszy kalkulacyjnych, wybierając format CSV (wartości rozdzielane przecinkami). Niestety wyeksportowane wartości fluorescencji nie są powiązane z odpowiadającym im czasem elucji. W związku z tym muszą one zostać dodane ręcznie, zgodnie z ustawieniami częstotliwości akwizycji w aparacie FACE (4 Hz oznacza akwizycję jednej wartości co 0.25 s).
Następnie wyznaczono pola powierzchni pików przy użyciu natywnej aplikacji instrumentu FACE lub wyeksportowano je do pliku danych z rozszerzeniem „cdf” w celu wykorzystania innej aplikacji. Wartości pól zostały wyeksportowane do programu arkusza kalkulacyjnego i znormalizowane poprzez wyrażenie DP jako procentu całkowitej powierzchni powierzchniowej (Rycina 4).
Rysunek 4: Normalizacja danych, rozkład długości łańcuchów i wartość średniej długości łańcucha. Powierzchnie pików fluorescencji zostały zaimportowane i znormalizowane w arkuszu kalkulacyjnym. Rozkład długości łańcuchów przedstawiono jako procent DP dla każdego DP. Średnią długość łańcucha (ACL) obliczono poprzez zsumowanie każdego procentowego udziału łańcucha pomnożonego przez odpowiadający mu stopień polimeryzacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Na koniec średnia długość łańcucha (ACL) jest wyznaczana poprzez obliczenie sumy każdego procentowego udziału łańcuchów pomnożonej przez odpowiadający mu stopień polimeryzacji. Analogiczne eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach dla glikogenu z wątroby królika (Rysunek 5A), glikogenu z wątroby bydlęcej (Rysunek 5B) oraz glikogenu z ostrygi (Rysunek 5C).
Rycina 5: Rozkład długości łańcuchów komercyjnego glikogenu. Glikogen z wątroby królika (A), wątroby bydła (B) oraz z ostrygi (C) inkubowano w obecności enzymów odgałęziających (izoamylazy i pullulanazy). Oznakowane APTS glukany rozdzielono następnie według ich stopnia polimeryzacji (DP) przy użyciu analizy FACE. Maltoza (DP2), maltoheksoza (DP6) i maltoheptaose (DP7) reprezentują odpowiednio najliczniejsze glukany w glikogenie z wątroby królika, ostrygi i wątroby bydła. Błąd standardowy średniej (SEM) wyznaczono na podstawie trzech niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rozkład długości łańcuchów glikogenu z wątroby królika wyraźnie wykazał wyższą zawartość krótkich malto-oligosacharydów (DP2) niż glikogen z wątroby bydlęcej (DP 7) lub glikogen z ostrygi (DP6). W konsekwencji glikogen z wątroby królika posiada najniższą średnią długość łańcucha (ACL = 9.8) w porównaniu do glikogenu z wątroby bydlęcej (ACL = 11.9) oraz glikogenu z ostrygi (ACL = 12.6). Należy zauważyć, że te komercyjne glikogeny są zazwyczaj stosowane do oznaczania aktywności fosforylazy glikogenu lub syntazy glikogenu. Sugeruje to, że wyznaczanie parametrów kinetycznych (Vmax i Km) aktywności enzymów metabolizujących glikogen będzie zróżnicowane w zależności od źródła glikogenu.
Analizy subtrakcyjne
Analiza subtrakcyjna jest prostą metodą porównywania rozkładu łańcuchów glukanów w dwóch próbkach. Przykładowo, wyznaczono CLD glikogenu produkowanego przez szczep dziki (WT) Synechocystis PCC6803 oraz pojedyncze izogeniczne szczepy mutantów glgA1 i glgA2 (Rysunek 6A).
Rycina 6: Porównanie rozkładów długości łańcuchów z wykorzystaniem analizy subtrakcyjnej. (A) Rozkłady długości łańcuchów glikogenu oczyszczonego z szczepów cyjanobakterii: typu dzikiego (WT) Synechocystis PCC6803 oraz pojedynczych izogenicznych szczepów mutantów glgA1 i glgA2 określono za pomocą analizy FACE. Standardowy błąd średniej (SEM) wyznaczono na podstawie trzech niezależnych eksperymentów. (B) Analizy subtrakcyjne przeprowadzono poprzez odjęcie wartości % każdego DP dla WT od wartości % każdego DP dla ΔglgA1 oraz odjęcie wartości % każdego DP dla WT od wartości % każdego DP dla ΔglgA2. Ta prosta manipulacja matematyczna obrazuje zmiany w łańcuchach glukanów u szczepów mutantów (linie czarne). (C) Średnie rozkłady długości łańcuchów glikogenu z typu dzikiego i mutantów Synechocystis znormalizowano zgodnie z maksymalnym pikiem zaobserwowanym dla każdego CLD (DP6 dla wszystkich próbek). Dwie składowe ujawniono poprzez naniesienie znormalizowanego CLD na skalę logarytmiczną (Nde (DP)). Każda składowa wskazuje na inny mechanizm zatrzymania wzrostu (więcej informacji w Literaturze2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Przypominając, większość szczepów cyjanobakterii posiada dwa geny kodujące aktywności syntazy glikogenu: GlgA1 oraz GlgA221. Oba enzymy przenoszą resztę glukozy z ADP-glukozy na końce nieredukujące liniowych łańcuchów glukanu. Jak pokazano na Ryc. 6A, porównanie próbek wyłącznie na podstawie profili rozkładu długości łańcuchów jest utrudnione. Analiza subtraktywna polega na odjęciu procentowego udziału każdego DP między próbkami (Ryc. 6B). Analiza subtraktywna %DP typu WT minus % DP mutanta ΔglgA1 wykazuje nadmiar DP3, 4 i 5 (wartości ujemne) oraz zmniejszoną zawartość DP 10-20. W przeciwieństwie do tego, analiza subtraktywna między %DP typu WT a % DP mutanta ΔglgA2 wskazuje na efekt przeciwny. Ponieważ profile analizy subtraktywnej różnią się między GlgA1 a GlgA2, sugeruje to specyficzną funkcję każdej izoformy syntazy glikogenu w biosyntezie glikogenu21.
Należy zauważyć, że analiza subtraktywna ma zastosowanie wyłącznie do eksperymentów obejmujących próbkę referencyjną wykonaną równolegle z pozostałymi próbkami. W przeciwnym razie analiza subtraktywna może być empiryczna, ponieważ opiera się na znormalizowanym CLD referencji. W 2015 roku Deng i współpracownicy, badając mechanizmy zatrzymywania wzrostu glikogenu u myszy i ludzi, zaproponowali alternatywny sposób przedstawiania i interpretacji CLD glikogenu, aby rozwiązać ten problem. Wykres ten wykorzystuje maksymalną powierzchnię piku do normalizacji każdego CLD. Dane są następnie przedstawiane w skali logarytmicznej, co uwydatnia dwa komponenty. Te ostatnie ilustrują dwa różne mechanizmy zatrzymywania wydłużania łańcucha2. Poprzez wykreślenie linii dopasowanych do komponentu o wyższym DP, parametry bezwzględne (tj. nachylenia i punkty przecięcia linii) mogą być wykorzystane do porównania CLD bez konieczności normalizacji do profilu referencyjnego. CLD szczepu dzikiego (WT) Synechocystis PCC6803 oraz pojedynczych mutantów izogenicznych glgA1 i glgA2 przedstawiono w skali logarytmicznej i wyznaczono linie dopasowania dla każdego profilu (Ryc. 6C). Pierwszy komponent był bardzo podobny między próbkami, z maksimum przy DP 6. Ilustruje to, że enzym rozgałęziający produkuje konkretną maksymalną liczbę takich łańcuchów. Drugi komponent pojawił się jako szerokie ramię, co zostało już opisane dla glikogenów myszy i ludzi2. Nachylenie drugiego komponentu wystąpiło przy wyższym DP w ΔglgA1, a nachylenie odpowiadającej mu linii dopasowania (linia czerwona) było niższe niż w profilu typu dzikiego. Zatem brak GlgA1 spowalnia zatrzymanie wydłużania łańcucha podczas biosyntezy, które w przypadku glikogenu myszy i ludzi miało wynikać z zawady sterycznej2. Dane te sugerują, że pozostały enzym wydłużający (i.e., GlgA2) produkuje dłuższe łańcuchy przed wystąpieniem zagęszczenia łańcuchów. W ΔglgA2 zaobserwowano efekt przeciwny, z bardziej gwałtownym spadkiem linii dopasowania, co potwierdza, że łańcuchy produkowane przez pozostałe GlgA1 są ogólnie krótsze niż te syntetyzowane przez samo GlgA2 przed wystąpieniem zawady sterycznej. Analiza ta sugeruje, że obie izoformy posiadają odmienną kinetykę i/lub że ich odpowiednie stężenie w stosunku do aktywności enzymu rozgałęziającego różni się od siebie.
Dyskusja
Właściwości fizykochemiczne cząstek glikogenu (np. wielkość, morfologia, rozpuszczalność) są bezpośrednio związane z długością glukanów wchodzących w skład cząstek. Wszelka nierównowaga między enzymami biosyntetycznymi i katabolicznymi powoduje zmianę rozkładu długości łańcucha, a co za tym idzie, akumulację nieprawidłowego glikogenu, który może być niebezpieczny dla komórki11. Analiza FACE jest metodą z wyboru do określenia rozkładu długości łańcucha glikogenu (CLD). Jak pokazano na rysunku 2, wyznaczenie CLD pozwala na wywnioskowanie średniej wartości długości łańcucha glikogenu (ACL), która odzwierciedla strukturę cząstek glikogenu. Glikogeny zwierzęce o wysokich wartościach ACL są związane z pojawieniem się nieprawidłowych cząstek. Analiza subtraktywna jest pomocną metodą porównywania dwóch próbek glikogenu z różnych środowisk genetycznych (typ zmutowany i dziki). Z drugiej strony, wykreślając na skali logarytmicznej CLD znormalizowane do maksymalnego piku, ma tę zaletę, że porównuje CLD niezależnie od odniesienia i dało nam informacje na temat mechanizmu wzrostu glikogenu.
Ponadto analiza FACE jest potężną techniką charakteryzowania właściwości katalitycznych enzymów metabolizujących glikogen. Na przykład wszystkie enzymy rozgałęziające glikogen rozszczepiają wiązania (1 → 4)-α i przenoszą grupy oligomaltozylowe na pozycję (1 → 6)-α lub punkty rozgałęzienia. Enzymy rozgałęziające można wyróżnić ze względu na ich powinowactwo do polisacharydów (np. amylopektyny, glikogenu) i długości przenoszonych glukanów pomimo podobnego mechanizmu katalitycznego22. W ten sposób różne źródła enzymów rozgałęziających (ludzkie, roślinne, bakteryjne) można scharakteryzować i sklasyfikować poprzez serię eksperymentów inkubacyjnych i porównań CLD przy użyciu analizy FACE23.
Jak wspomniano we wprowadzeniu, HPAEC-PAD jest również alternatywną metodą określania rozkładu długości łańcucha18. Obie techniki wymagają całkowitej hydrolizy (1 → 6)-α wiązań lub punktów rozgałęzień za pomocą enzymów rozgałęziających typu izoamylazy przed oddzieleniem puli liniowych glukanów zgodnie z ich stopniem polimeryzacji (DP). Jednak metoda HPAEC-PAD ma dwie wady w porównaniu z FACE: (1) amperometryczna odpowiedź impulsowa zmniejsza się wraz ze wzrostem łańcuchów glukanu, co nie dostarcza informacji ilościowych. Ten problem odchylenia masy można obejść za pomocą HPAEC-ENZ-PAD, który obejmuje pokolumnowy reaktor enzymatyczny między kolumną wymiany anionów a PAD24. Reaktor enzymatyczny kolumny hydrolizuje maltooligosacharydy do reszt glukozy, umożliwiając stałą impulsową odpowiedź amperometryczną. (2) HPAEC-PAD umożliwia separację łańcuchów glukanu o stopniu polimeryzacji do 70. Chociaż rozdzielczość jest wystarczająca do określenia CLD próbek glikogenu, FACE rozdziela łańcuchy o DP do 150, odpowiednie dla próbek skrobi17. Należy pamiętać, że zarówno analiza HPAEC-PAD, jak i FACE mają swoje wady i zalety. Na przykład reakcja aminacji wymaga, aby wolna grupa półacetalowa reagowała z pierwszorzędową funkcją aminową APTS. Oznacza to, że znakowanie APTS nie może być stosowane w przypadku łańcuchów glukanu pozbawionych końcówek redukcyjnych (np. inuliny). Metoda HPAEC-PAD nie wymaga obecności końcówek redukcyjnych. Drugim interesującym aspektem metody HPAEC-PAD jest to, że kolumnę wymiany anionowej można obciążyć kilkoma miligramami liniowych glukanów, co pozwala na oczyszczenie maltooligosacharydu za pomocą specyficznego DP lub 14C-znakowanych radioaktywnie maltooligosacharydów do testu enzymatycznego 18,25. Wreszcie, chociaż spektrometria mas (np. MALDI-TOF) jest szybką i czułą techniką określania rozkładu długości łańcucha, technika ta wydaje się być mniej powtarzalna. To zawyża ilość długich łańcuchów glukanu26. Niemniej jednak ten ostatni może być wykorzystany do konkretnego zastosowania, takiego jak obrazowanie MALDI w celu zmapowania obecności glikogenu w tkance komórkowej27.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konfliktu interesów związanego z tą pracą.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez CNRS, Université de Lille CNRS, a ANR przyznaje "MathTest" (ANR-18-CE13-0027).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| AG-501-X8 Żywica | BioRad | #1436424 | Przechowywanie Temperatura pokojowa |
| 100 mM bufor octanu sodu, pH 4,8 | Rozpuścić 0,82 g octanu sodu w 80 ml wody. Dostosuj pH do 4,8 za pomocą kwasu octowego i uzupełnij objętość do 100 ml wodą— przechowywanie w temperaturze pokojowej. | ||
| Roztwór podstawowy APTS | Merck | 09341-5MG | Rozpuścić 5 mg APT w 48 ml kwasu octowego 0,2 M. Przechowywanie w temperaturze -20 °C. |
| Kapilarne | separacje Sciex, Les Ulis, Francja | ||
| Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623 | Thermofisher | wybierz :Plik>import/przywróć>ANDI/chromatografia w otwartym oknie: wybierz "Dodaj" wybierz plik CDF > importuj > następny Wybierz folder, do którego zostanie pobrany plik w oprogramowaniu Chromeleon> kliknij QNT-Editor> parametr "Minimalna powierzchnia" wybierz "Zakres" 0,05 [Sygnał]*min. | |
| Excel | Microsoft | Otwórz program Excel> Nowy plik> zapisz plik > menu Plik kliknij Importuj > W otwartym oknie wybierz "csv." jako typ pliku > wybierz plik ASC, > pojawi się nowe okno Krok 1: wybierz Macintosh lub Okno, a następnie użył ustawienia domyślnego dla kroków 2 i 3. > Wartości Y są wyświetlane w kolumnie A> Ręcznie dodaj kolumnę Czas, zwiększając ją o 0,25 sekundy do każdej komórki odpowiadającej częstotliwości (4 Hz) dla danych akwizycji. Następnie narysuj wykres. | |
| Aparat Free-Dry | Christ | alpha 2-4 LO plus | przed procesem zamrażania-suszenia próbki są przechowywane w temperaturze -80 & deg; C przez 1 godzinę. |
| Izoamylaza | Megazyme | E-ISAMY | 180 U/mg białka |
| Maltoheptaoza | Merck | M7753 | |
| N-sprzężony bufor do separacji węglowodanów | Sciex Separations, Les Ulis, Francja | 477623 | Przechowywanie w temperaturze 4 ° C |
| Pullulanaza | Megazyme | E-PULKP | 30 U/mg białka |
| Sicyjanoborowodorek sodu | Sigma-Aldrich | 296813-100ML | 1 M cyjanoborowodorek sodu w THF |
| Parownik próżniowy | Eppendorf | Concentrator 5301 | Ustawić temperaturę na 30 stopni C. Wirować do momentu wysuszenia próbek |
Bibliografia
- Konkolewicz, D., Thorn-Seshold, O., Gray-Weale, A. Models for randomly hyperbranched polymers: Theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 129 (5), 054901(2008).
- Deng, B., Sullivan, M. A., Wu, A. C., Li, J., Chen, C., Gilbert, R. G. The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen. Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).
- Besford, Q. A., Sullivan, M. A., Zheng, L., Gilbert, R. G., Stapleton, D., Gray-Weale, A. The structure of cardiac glycogen in healthy mice. International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).
- Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in escherichia coli. BioMacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
- Ball, S., Colleoni, C., Cenci, U., Raj, J. N., Tirtiaux, C. The evolution of glycogen and starch metabolism in eukaryotes gives molecular clues to understand the establishment of plastid endosymbiosis. Journal of Experimental Botany. 62 (6), 1775-1801 (2011).
- Zhang, P., Nada, S. S., Tan, X., Deng, B., Sullivan, M. A., Gilbert, R. G. Exploring glycogen biosynthesis through Monte Carlo simulation. International Journal of Biological Macromolecules. 116, 264-271 (2018).
- Melendez-Hevia, E., Waddell, T. G., Shelton, E. D. Optimization of molecular design in the evolution of metabolism: The glycogen molecule. Biochemical Journal. 295 (2), 477-483 (1993).
- Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Cascante, M. How did glycogen structure evolve to satisfy the requirement for rapid mobilization of glucose? A problem of physical constraints in structure building. Journal of Molecular Evolution. 45 (4), 446-455 (1997).
- Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Canela, E. I. The fractal structure of glycogen: A clever solution to optimize cell metabolism. Biophysical Journal. 77 (3), 1327-1332 (1999).
- Wang, L., Wise, M. J. Glycogen with short average chain length enhances bacterial durability. Naturwissenschaften. 98 (9), 719-729 (2011).
- Kanungo, S., Wells, K., Tribett, T., El-Gharbawy, A. Glycogen metabolism and glycogen storage disorders. Annals of Translational Medicine. 6 (24), 474(2018).
- Wang, L., et al. Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14(2020).
- Wang, L., et al. Influence of in situ progressive N-terminal is still controversial truncation of glycogen branching enzyme in Escherichia coli DH5α on glycogen structure, accumulation, and bacterial viability. BMC Microbiology. 15 (1), 1-14 (2015).
- Bernard, C. On the physiological mechanism of sugar formation in the liver. Proceedings of the Academy of Sciences. 44 (12), 578-586 (1857).
- Liu, Q. -H., Tang, J. -W., Wen, P. -B., Wang, M. -M., Zhang, X., Wang, L. From prokaryotes to eukaryotes: Insights into the molecular structure of glycogen particles. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 673315(2021).
- Zang, L. H., Rothman, D. L., Shulman, R. G. 1 H NMR visibility of mammalian glycogen in solution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (5), 1678(1990).
- O'Shea, M. G., Samuel, M. S., Konik, C. M., Morell, M. K. Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) of oligosaccharides: Efficiency of labelling and high-resolution separation. Carbohydrate Research. 307 (1-2), 1-12 (1998).
- Koizumi, K., Fukuda, M., Hizukuri, S. Estimation of the distributions of chain length of amylopectins by high-performance liquid chromatography with pulsed amperometric detection. Journal of Chromatography A. 585 (2), 233-238 (1991).
- Morell, M. K., Samuel, M. S., Shea, M. G. O. Analysis of starch structure. Electrophoresis. 19, 2603-2611 (1998).
- Guttman, A., Chen, F. -T. A., Evangelista, R. A., Cooke, N. High-resolution capillary gel electrophoresis of reducing oligosaccharides labeled with 1-Aminopyrene-3,6,8-trisulfonate. Analytical Biochemistry. 233 (2), 234-242 (1996).
- Kadouche, D., et al. Characterization of function of the GlgA2 glycogen/starch synthase in cyanobacterium sp. clg1 highlights convergent evolution of glycogen metabolism into starch granule aggregation. Plant Physiology. 171 (3), 1879-1892 (2016).
- Hayashi, M., Suzuki, R., Colleoni, C., Ball, S. G., Fujita, N., Suzuki, E. Bound substrate in the structure of cyanobacterial branching enzyme supports a new mechanistic model. The Journal of biological chemistry. 292 (13), 5465-5475 (2017).
- Sawada, T., et al. Diversity of reaction characteristics of glucan branching enzymes and the fine structure of α-glucan from various sources. Archives of Biochemistry and Biophysics. 562, 9-21 (2014).
- Wong, K. S., Jane, J. Quantitative analysis of debranched amylopectin by HPAEC-PAD with a post-column enzyme reactor. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 20 (2), 297-310 (1997).
- Colleoni, C., et al. Biochemical Characterization of the chlamydomonas reinhardtii a-1,4 glucanotransferase supports a direct function in amylopectin biosynthesis. Plant Physiology. 120, 9(1999).
- Broberg, S., Koch, K., Andersson, R., Kenne, L. A comparison between MALDI-TOF mass spectrometry and HPAEC-PAD analysis of debranched starch. Carbohydrate Polymers. 43 (3), 285-289 (2000).
- Sun, R. C., et al. Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation. Cell Metabolism. 33 (7), 1404-1417 (2021).
Przedruki i uprawnienia
