Artykuł metodologiczny

Oznaczanie rozkładu długości łańcucha glukanowego glikogenu metodą elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE)

DOI:

10.3791/63392

⸱

31 marca 2022

 ,  , 
1CNRS, UMR8576-UGSF-Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, University of Lille, 2CNRS, USR3290-MSAP-Miniaturisation pour la Synthèse, l’Analyse et la Protéomique, University of Lille

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W obecnym protokole, technika elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE) jest używana do określenia rozkładu długości łańcucha (CLD) i średniej długości łańcucha (ACL) glikogenu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cząsteczki glikogenu to rozgałęzione polisacharydy złożone z liniowych łańcuchów jednostek glukozylowych połączonych wiązaniami glukozydowymi α-1,4. Te ostatnie są połączone ze sobą wiązaniami glukozydowymi α-1,6, zwanymi punktami rozgałęzień. Wśród różnych form magazynowania węgla (tj. skrobia, β-glukan), glikogen jest prawdopodobnie jednym z najstarszych i najbardziej udanych polisacharydów magazynujących znalezionych w żywym świecie. Łańcuchy glukanu są zorganizowane w taki sposób, że w razie potrzeby duża ilość glukozy może być szybko przechowywana lub zasilana w komórce. W ciągu ostatnich dziesięcioleci opracowano wiele uzupełniających się technik w celu rozwiązania drobnej struktury cząstek glikogenu. W tym artykule opisano elektroforezę węglowodanową wspomaganą fluoroforem (FACE). Metoda ta określa ilościowo populację łańcuchów glukanu, które składają się na cząstkę glikogenu. Parametr ten, znany również jako rozkład długości łańcucha (CLD), odzwierciedla wielkość cząstek i procent rozgałęzień. Jest to również niezbędny wymóg do matematycznego modelowania biosyntezy glikogenu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glikogen, używany jako magazyn węgla i energii, jest homopolimerem glukozy składającym się z liniowych łańcuchów jednostek glukozylowych połączonych wiązaniami (1 → 4)-α i połączonych wiązaniami glikozydowymi lub punktami rozgałęzień (1 → 6)-α. Pojawiają się jako cząstki β i α w cytozolu wielu organizmów. Cząstki β to maleńkie cząsteczki rozpuszczalne w wodzie, obserwowane głównie u prokariontów. Ich średnica waha się od 20 do 40 nm, prawdopodobnie podyktowana enzymami metabolizującymi glikogen i przeszkodą steryczną1,2.

Po raz pierwszy opisane w komórkach zwierzęcych, większe cząstki α mają średnicę do 300 nm i kształt przypominający kalafior. Ta szczególna organizacja może powstać w wyniku agregacji kilku β-cząstek lub może powstać w wyniku pączkowania z pojedynczej cząstki β3. Co ciekawe, niedawne badanie wykazało obecność cząsteczek α w Escherichia coli4. Jednak w przeciwieństwie do α-cząstek z komórek zwierzęcych, te ostatnie szybko rozpadają się podczas procesu ekstrakcji, co może tłumaczyć brak danych w literaturze4. Pojawienie się α-cząstek u eukariontów i prokariontów wiąże się z filogenetycznie niepowiązanymi enzymami metabolizującymi glikogen5. Rodzi to pytania dotyczące funkcji takich cząstek i natury potencjalnych czynników sieciujących między cząstkami β5.

Chociaż zaproponowano dwa przeciwstawne modele matematyczne do tworzenia cząsteczek glikogenu6,7,8,9, ogólnie przyjmuje się, że cząstki β wyewoluowały w odpowiedzi na ich funkcję metaboliczną jako wysoce efektywna rezerwa paliwa do szybkiego uwalniania dużych ilości glukozy. Wiele dowodów wskazuje, że właściwości glikogenu, takie jak strawność i rozpuszczalność w wodzie, są skorelowane ze średnią długością łańcucha (ACL), która z kolei będzie dyktować procent punktów rozgałęzień i wielkość cząstek2,6,7,8,10,11. ACL definiuje się jako stosunek całkowitej liczby reszt glukozy do liczby punktów rozgałęzienia. Zazwyczaj wartości ACL wahają się od 11-14 i 7-23 reszt glukozy odpowiednio u eukariontów i prokariontów10. U ludzi kilka chorób związanych z zaburzeniami glikogenu jest spowodowanych nieprawidłową akumulacją glikogenu. Na przykład choroba Andersena jest związana z niedostateczną aktywnością enzymu rozgałęziającego glikogen, co skutkuje akumulacją nieprawidłowego glikogenu11. U prokariontów badania skumulowane sugerują, że ACL jest krytycznym czynnikiem wpływającym na szybkość degradacji glikogenu i zdolność przetrwania bakterii12,13. Doniesiono, że bakterie syntetyzujące cząstki β o niskiej wartości ACL degradują się wolniej, a zatem dłużej wytrzymują warunki głodu. W związku z tym wiedza na temat architektury cząstek β jest niezbędna do zrozumienia powstawania nieprawidłowych cząstek glikogenu w chorobach spichrzeniowych glikogenu u ludzi i przetrwania prokariontów w środowisku ubogim w składniki odżywcze

.

Od czasu pierwszej izolacji glikogenu z wątroby psa przez francuskiego fizjologa Claude'a Bernarda pod koniec XIX wieku14, opracowano wiele technik do szczegółowego charakteryzowania cząsteczek glikogenu. Na przykład transmisyjna mikroskopia elektronowa do morfologii glikogenu (α- lub β-cząstki)15, spektrometria proton-NMR do określania procentu wiązań α-1,616, chromatografia wykluczania wielkości z wieloma detektorami do wnioskowania o masie cząsteczkowej, elektroforeza węglowodanowa wspomagana fluoroforem (FACE)17 lub wysokosprawna chromatografia anionowymienna z pulsacyjną detekcją amperometryczną (HPAEC-PAD) zarówno dla rozkładu długości łańcucha (CLD), jak i oznaczania ACL18.

Ta praca skupia się na metodzie elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem, która opiera się na redukcyjnej aminacji grupy półacetalowej przez pierwszorzędową funkcję aminy. Historycznie rzecz biorąc, kwas 8-amino-1,3,6-naftalenotrisulfonowy (ANTS) został po raz pierwszy użyty do etykietowania. Później został zastąpiony przez bardziej czuły fluorofor, 8-amino-1,3,6 pirenotrisulfonowy kwas (APTS)19.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Redukcyjna reakcja aminacji z 8-aminokwasowym kwasem 1,3,6 pirenotrisulfonowym (APTS). Redukcyjna reakcja aminacji grupy półacetalowej przez pierwszorzędową funkcję aminową kwasu 8-amino-1,3,6 pirenotrisulfonowego (APTS) w warunkach redukcyjnych Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Jak pokazano w Rysunek 1, funkcja półacetalu redukującego końca łańcucha glukanu oddziałuje z pierwszorzędową aminą APTS w warunkach redukcyjnych. Grupy sulfonowe APTS przenoszą ładunki ujemne, które umożliwiają rozdzielenie łańcuchów glukanu w zależności od ich stopnia polimeryzacji (DP). Redukcyjna reakcja aminowa jest wysoce powtarzalna i wydajna. Średnie oznaczenie wydajności 80% uzyskuje się dla DP3 do DP135 oraz odpowiednio do 88% i 97% dla maltozy (DP2) i glukozy17,20. Ponieważ jedna cząsteczka APTS reaguje z redukującym końcem każdego łańcucha glukanu, poszczególne łańcuchy można określić ilościowo i porównać ze sobą na podstawie molowej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Inkubacja z enzymami rozgałęziającymi

  1. Zmieszać 200 μl oczyszczonego glikogenu o stężeniu 0,5-2 mg/ml z 200 μl 100 mM buforu octanowego (pH 4,8). Dodać 2 μl izoamylazy (180 j./mg białka) i 1,5 μl pullulanazy (30 j./mg białka) (patrz tabela materiałów), delikatnie wymieszać pipetując w górę i w dół i inkubować w temperaturze 42 °C przez 16 godzin w probówce o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Podczas procesu oczyszczania glikogenu może dojść do degradacji lub zanieczyszczenia amylazą. Aby ocenić obecność wolnych maltooligosacharydów, próbki można inkubować równolegle bez koktajlu enzymów rozgałęziających. Do analizy włącza się wzorzec (np. maltoheptaozę) w celu określenia zależności między czasem elucji a stopniem polimeryzacji.
  2. Przerwać reakcje przez inkubację w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
  3. Wirować przy 16 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia i usunięcia wszelkich nierozpuszczalnych materiałów.
  4. Usunąć supernatanty za pomocą pipety i przenieść je do nowych probówek z adnotacjami. Supernatanty odsolić, dodając ekwiwalent 100 μl kulek żywicy anionowymiennej (AG-501-X8, patrz tabela materiałów) i wymieszać.
    1. Regularnie mieszaj kulki przez 5 minut. Pobrać próbki za pomocą pipetowania i umieścić je w nowych probówkach z adnotacjami.
  5. Suszyć próbki przez liofilizację lub użyć wyparki próżniowej (patrz tabela materiałów) w temperaturze 30 °C.
  6. Wysuszone próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej lub w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Próbki można przechowywać przez 1 miesiąc.

2. Aminacja redukcyjna

  1. Wysuszone próbki zmieszać z 2 μl 1 M cyjanoborowodorku sodu w tetrahydrofuranie (THF) i 2 μl APTS (5 mg APTS zawieszonych w 48 μl 15% kwasu octowego) (patrz tabela materiałów).
  2. Inkubować w temperaturze 42 °C przez 16 godzin w ciemności.
    UWAGA: Z cyjanoborowodorkiem sodu obchodzi się przy użyciu dostosowanych środków ochrony osobistej i pod maską chemiczną. Wdychanie i kontakt ze skórą są wysoce toksyczne i mogą być śmiertelne, powodując poważne oparzenia skóry i uszkodzenie oczu. Podczas mieszania cyjanoborowodorku sodu z kwasem octowym mogą powstawać wysoce toksyczne gazy. W kontakcie z wodą cyjanoborowodorek sodu uwalnia łatwopalne gazy, które mogą ulec samozapłonowi. Począwszy od tego etapu, skoncentrowane próbki są przetwarzane pod kapturem chemicznym i przy użyciu dostosowanych środków ochrony indywidualnej.

3. Analiza TWARZY

  1. Do każdej próbki dodać 46 μl ultraczystej wody.
  2. Rozcieńczyć próbki bezpośrednio do 1/50 w mikrofiolkach o pojemności 100 μl, dodając 1 μl próbki do 49 μl wody ultraczystej. Trzymaj próbki w ciemności podczas ustawiania TWARZY (5-10 min).
  3. Wykonać elektroforezę z odwrotną polaryzacją za pomocą przyrządu do elektroforezy kapilarnej z detektorem fluorescencji indukowanej laserem (LIF) (patrz tabela materiałów). Ustaw polaryzację na "tryb odwrotny" dla separacji, ustaw LIF na długość fali emisji 488 nm, a detektor na 512 nm.
  4. Ustaw czas wtrysku na 10 s, a ciśnienie wtrysku na 0,5 psi.
  5. Przeprowadzić separację glukanów znakowanych APTS przy napięciu 30 kV w kapilarze z topionej krzemionki o długości 60,2 cm i średnicy wewnętrznej 50 μm (średnica zewnętrzna 375 μm) w buforze do separacji węglowodanów sprzężonych z azotem rozcieńczonym do 1/3 w wodzie ultraczystej (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Bufor separacji węglowodanów sprzężony z N jest wymieniany co 20 przebiegów.

4. Przetwarzanie danych

  1. Eksportuj plik ". ASC "oraz ". CDF" zawierające odpowiednio profil elektroferogramu i dane całkowania.
  2. Otwórz plik . ASC i narysuj względną jednostkę fluorescencji zgodnie z wykresem czasowym.
  3. Otwórz plik . CDF, przejdź do pierwszej automatycznej integracji i dostosuj następujące parametry: szerokość; integracja między dolinami; minimalna powierzchnia.
  4. Ręcznie sprawdź i skoryguj wszelkie nieprawidłowe zdarzenia integracyjne.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Określenie średniej długości łańcucha glikogenu
Rysunek 2 przedstawia proces wymagany do wywnioskowania rozkładu długości łańcucha i średniej długości łańcucha (ACL) glikogenu.

figure-results-1
Rysunek 2: Procedura określania rozkładu długości łańcucha (CLD) i średniej długości łańcucha. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3 przedstawia elektroferogramy komercyjnej maltoheksaozy i rozgałęzionego glikogenu w wątrobie bydlęcej. Sygnały fluorescencyjne obserwowane między 4,13-4,67 min we wszystkich eksperymentach pochodziły z nieprzereagowanych APTS. Czas elucji znakowanej maltoheksaozy (DP6) oszacowano na 8,49 minuty (Ryc. 3A). Glukany glikogenu bydlęcego znakowane APTS zidentyfikowano na podstawie czasu elucji DP6 (Rysunek 3B). W próbce kontrolnej (glikogen nieinkubowany z enzymami rozgałęziającymi) nie wykryto śladu wolnego maltooligosacharydu (glikogen nieinkubowany z enzymami rozgałęziającymi) (Rysunek 3C).

figure-results-2
Rysunek 3: Elektroferogramy wzorca i glikogenu wątroby bydlęcej. (A) Czas elucji (8,49 min) wzorca glukanu, maltoheksaozy (DP6), został wykorzystany jako odniesienie do określenia stopnia polimeryzacji (DP) znakowanych APTS glukanów uwalnianych z glikogenu wątroby bydlęcej po działaniu enzymu rozgałęziającego (B). Panel wstawkowy pokazuje separację łańcuchów glukanu do 44 DP. Równolegle nieleczony glikogen bydlęcy znakowano APTS w celu wykrycia ewentualnych śladów wolnych maltooligosacharydów w próbce (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Można wywnioskować, że uwolnienie glukanu znakowanego APTS jest spowodowane rozszczepieniem punktów rozgałęzienia przez aktywność zarówno izoamylazy, jak i pullulanazy. Należy zauważyć, że profil elektroforezy kapilarnej można przerysować w bardziej odpowiednim formacie, aby stworzyć figurę mozaikową zawierającą kilka profili. W tym celu generowane są pliki DATA zawierające wartości fluorescencji z rozszerzeniem "asc" i otwierane w programie arkusza kalkulacyjnego poprzez wybór formatu CSV (wartość oddzielona przecinkami). Niestety, wyeksportowane wartości fluorescencji nie są powiązane z odpowiednim czasem elucji. W związku z tym należy je dodawać ręcznie zgodnie z ustawieniem częstotliwości akwizycji w aparacie FACE (4 Hz oznacza jedną akwizycję wartości co 0,25 s).

Obszary pików zostały następnie wywnioskowane za pomocą natywnej aplikacji instrumentu FACE lub wyeksportowane jako plik DATA z rozszerzeniem "cdf" do użycia innej aplikacji. Wartości powierzchni są eksportowane w programie arkusza kalkulacyjnego i normalizowane przez wyrażenie DP jako procentu całkowitej powierzchni (Rysunek 4).

figure-results-3
Rysunek 4: Normalizacja danych, rozkład długości łańcucha i średnia wartość długości łańcucha. Obszary pików fluorescencji zostały zaimportowane i znormalizowane w arkuszu kalkulacyjnym. Rozkład długości łańcucha jest pokazany jako procent DP dla każdego DP. Średnią długość łańcucha (ACL) oblicza się, sumując każdy łańcuch procentowy razy odpowiedni stopień polimeryzacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Na koniec, średnia długość łańcucha (ACL) jest wnioskowana poprzez obliczenie sumy każdego procentu łańcucha razy odpowiedni stopień polimeryzacji. Podobne eksperymenty przeprowadzono w trzech egzemplarzach na glikogenie z wątroby królika (Rycina 5A), na glikogenie z wątroby bydlęcej (Rycina 5B) i glikogenu ostrygowego (Rycina 5C).

figure-results-4
Rysunek 5: Rozkład długości łańcucha komercyjnego glikogenu. Wątrobę królika (A), wątrobę bydlęcą (B) i glikogen ostrygowy (C) inkubowano w obecności enzymów rozgałęziających (izoamylazy i pullulanazy). Glukany znakowane APTS zostały następnie oddzielone zgodnie z ich stopniem polimeryzacji (DP) za pomocą analizy FACE. Maltoza (DP2), maltoheksaoza (DP6) i maltoheptaoza (DP7) reprezentują najobficiej występujące glukany odpowiednio w wątrobie królika, ostrygach i glikogenie w wątrobie bydlęcej. Standardowy błąd średniej (SEM) został wywnioskowany z trzech niezależnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozkład długości łańcucha glikogenu z wątroby królika wyraźnie wykazał wyższą zawartość krótkiego maltooligosacharydu (DP2) niż glikogenu w wątrobie bydlęcej (DP 7) czy glikogenu ostrygowego (DP6). W rezultacie glikogen w wątrobie królika ma najniższą średnią długość łańcucha (ACL = 9,8) w porównaniu z glikogenem w wątrobie bydlęcej (ACL = 11,9) i glikogenem ostrygowym (ACL = 12,6). Należy zauważyć, że te komercyjne glikogeny są zwykle używane do oznaczania aktywności fosforylazy glikogenu lub syntazy glikogenu. Sugeruje to, że określenie parametrów kinetycznych (V, max iKm) aktywności enzymów metabolizujących glikogen będzie się różnić w zależności od źródła glikogenu.

Analizy subtraktywne
Analiza subtraktywna to prosta metoda porównywania rozkładu łańcuchów glukanu w dwóch próbkach. Na przykład określono CLD glikogenu wytwarzanego przez szczep Synechocystis PCC6803 typu dzikiego (WT) oraz pojedyncze izogeniczne zmutowane szczepy glgA1 i glgA2 (Figura 6A).

figure-results-5
Rysunek 6: Porównanie rozkładów długości łańcuchów za pomocą analizy subtraktywnej. (A) Rozkłady długości łańcuchów glikogenu oczyszczonego ze szczepów sinic: dziki (WT) Synechocystis PCC6803 oraz pojedyncze izogeniczne zmutowane szczepy glgA1 i glgA2 zostały określone za pomocą analizy FACE. Standardowy błąd średniej (SEM) został wywnioskowany z trzech niezależnych eksperymentów. (B) Analizy subtraktywne przeprowadzono poprzez odjęcie % każdego DP WT do % każdego DP ΔglgA1 i odjęcie % każdego DP WT do % każdego DP DP ΔglgA2. Ta prosta matematyczna manipulacja pokazuje zmianę łańcuchów glukanu w zmutowanych szczepach (czarne linie). (C) Średnie rozkłady długości łańcuchów glikogenu z typu dzikiego i mutantów Synechocystis znormalizowano zgodnie z maksymalnym pikiem obserwowanym dla każdego CLD (DP6 dla wszystkich próbek). Dwa składniki są udowodnione przez wykreślenie znormalizowanego CLD na skali logarytmicznej (Nde (DP)). Każdy komponent wskazuje na inny mechanizm zatrzymania wzrostu (aby uzyskać więcej informacji, zobacz Reference2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dla przypomnienia, większość szczepów sinic posiada dwa geny kodujące aktywność syntazy glikogenu: GlgA1 i GlgA221. Oba enzymy przenoszą resztę glukozy ADP-glukozy na nieredukujące końce liniowych łańcuchów glukanu. Jak pokazano w Rysunek 6A, trudno jest porównywać próbki, patrząc tylko na profile rozkładu długości łańcucha. Analiza subtraktywna polega na odjęciu procentu każdego DP między próbkami (Rysunek 6B). Analiza subtraktywna %DP WT minus % DP Δ mutanta glgA1 ujawnia nadmiar DP3, 4 i 5 (wartości ujemne) oraz zmniejszoną zawartość DP 10-20. Natomiast analiza subtraktywna między %DP WT a % DP Δ mutanta glgA2 wskazuje na odwrotny efekt. Ponieważ profile analizy subtraktywnej różnią się między GlgA1 i GlgA2, sugeruje to specyficzną funkcję każdej izoformy syntazy glikogenu w biosyntezie glikogenu21.

Ważne jest, aby pamiętać, że analiza subtraktywna ma zastosowanie tylko do eksperymentów, które obejmują próbkę referencyjną wykonywaną równolegle z próbkami. W przeciwnym razie analiza subtraktywna może być empiryczna, ponieważ leży na znormalizowanym CLD odniesienia. W 2015 roku Deng i współpracownicy, którzy badali mechanizmy zatrzymywania wzrostu glikogenu u myszy i ludzi, zaproponowali alternatywne wykreślenie i interpretację glikogenu CLD, aby rozwiązać ten problem. Na tym wykresie użyto maksymalnego obszaru piku do normalizacji każdego CLD. Dane są następnie wykreślane na skali logarytmicznej z wyróżnieniem dwóch składników. Te ostatnie ilustrują dwa różne mechanizmy zatrzymywania wydłużania łańcucha2. Rysując linie pasujące do składowej o wyższej DP, parametry bezwzględne (tj. nachylenia i punkty przecięcia linii) mogą być używane do porównania CLD bez normalizacji do profilu odniesienia. CLD szczepu Synechocystis PCC6803 typu dzikiego (WT) oraz pojedynczych izogenicznych mutantów glgA1 i glgA2 wykreślono na skali logarytmicznej, a dla każdego profilu określono linie dopasowania (Figura 6C). Pierwszy składnik był bardzo podobny między próbkami, osiągając maksimum przy DP 6. To pokazuje, że enzym rozgałęziający się wyraźnie wytwarza maksimum takich łańcuchów. Drugi składnik pojawił się jako szerokie ramię, które zostało już opisane dla myszy i ludzkich glikogenów2. Nachylenie drugiego składnika powstało przy wyższym DP w ΔglgA1, a nachylenie odpowiedniej linii dopasowania (czerwona linia) było mniejsze niż w przypadku profilu typu dzikiego. Tak więc brak GlgA1 spowalnia zatrzymanie wydłużania łańcucha podczas biosyntezy, które zaproponowano jako przeszkoda steryczna dla myszy i ludzkiego glikogenu2. Dane te sugerują, że pozostały enzym wydłużający (tj. GlgA2) wytwarza dłuższe łańcuchy przed stłoczeniem łańcucha. W ΔglgA2 zaobserwowano odwrotny efekt przy bardziej dramatycznym spadku linii dopasowania, co potwierdza, że łańcuchy wytwarzane przez pozostały GlgA1 są ogólnie krótsze niż te syntetyzowane przez sam GlgA2 przed przeszkodą steryczną. Analiza ta sugeruje, że obie izoformy mają odmienną kinetykę i/lub że ich odpowiednia harmonia z rozgałęziającą się aktywnością enzymów różni się.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Właściwości fizykochemiczne cząstek glikogenu (np. wielkość, morfologia, rozpuszczalność) są bezpośrednio związane z długością glukanów wchodzących w skład cząstek. Wszelka nierównowaga między enzymami biosyntetycznymi i katabolicznymi powoduje zmianę rozkładu długości łańcucha, a co za tym idzie, akumulację nieprawidłowego glikogenu, który może być niebezpieczny dla komórki11. Analiza FACE jest metodą z wyboru do określenia rozkładu długości łańcucha glikogenu (CLD). Jak pokazano na rysunku 2, wyznaczenie CLD pozwala na wywnioskowanie średniej wartości długości łańcucha glikogenu (ACL), która odzwierciedla strukturę cząstek glikogenu. Glikogeny zwierzęce o wysokich wartościach ACL są związane z pojawieniem się nieprawidłowych cząstek. Analiza subtraktywna jest pomocną metodą porównywania dwóch próbek glikogenu z różnych środowisk genetycznych (typ zmutowany i dziki). Z drugiej strony, wykreślając na skali logarytmicznej CLD znormalizowane do maksymalnego piku, ma tę zaletę, że porównuje CLD niezależnie od odniesienia i dało nam informacje na temat mechanizmu wzrostu glikogenu.

Ponadto analiza FACE jest potężną techniką charakteryzowania właściwości katalitycznych enzymów metabolizujących glikogen. Na przykład wszystkie enzymy rozgałęziające glikogen rozszczepiają wiązania (1 → 4)-α i przenoszą grupy oligomaltozylowe na pozycję (1 → 6)-α lub punkty rozgałęzienia. Enzymy rozgałęziające można wyróżnić ze względu na ich powinowactwo do polisacharydów (np. amylopektyny, glikogenu) i długości przenoszonych glukanów pomimo podobnego mechanizmu katalitycznego22. W ten sposób różne źródła enzymów rozgałęziających (ludzkie, roślinne, bakteryjne) można scharakteryzować i sklasyfikować poprzez serię eksperymentów inkubacyjnych i porównań CLD przy użyciu analizy FACE23.

Jak wspomniano we wprowadzeniu, HPAEC-PAD jest również alternatywną metodą określania rozkładu długości łańcucha18. Obie techniki wymagają całkowitej hydrolizy (1 → 6)-α wiązań lub punktów rozgałęzień za pomocą enzymów rozgałęziających typu izoamylazy przed oddzieleniem puli liniowych glukanów zgodnie z ich stopniem polimeryzacji (DP). Jednak metoda HPAEC-PAD ma dwie wady w porównaniu z FACE: (1) amperometryczna odpowiedź impulsowa zmniejsza się wraz ze wzrostem łańcuchów glukanu, co nie dostarcza informacji ilościowych. Ten problem odchylenia masy można obejść za pomocą HPAEC-ENZ-PAD, który obejmuje pokolumnowy reaktor enzymatyczny między kolumną wymiany anionów a PAD24. Reaktor enzymatyczny kolumny hydrolizuje maltooligosacharydy do reszt glukozy, umożliwiając stałą impulsową odpowiedź amperometryczną. (2) HPAEC-PAD umożliwia separację łańcuchów glukanu o stopniu polimeryzacji do 70. Chociaż rozdzielczość jest wystarczająca do określenia CLD próbek glikogenu, FACE rozdziela łańcuchy o DP do 150, odpowiednie dla próbek skrobi17. Należy pamiętać, że zarówno analiza HPAEC-PAD, jak i FACE mają swoje wady i zalety. Na przykład reakcja aminacji wymaga, aby wolna grupa półacetalowa reagowała z pierwszorzędową funkcją aminową APTS. Oznacza to, że znakowanie APTS nie może być stosowane w przypadku łańcuchów glukanu pozbawionych końcówek redukcyjnych (np. inuliny). Metoda HPAEC-PAD nie wymaga obecności końcówek redukcyjnych. Drugim interesującym aspektem metody HPAEC-PAD jest to, że kolumnę wymiany anionowej można obciążyć kilkoma miligramami liniowych glukanów, co pozwala na oczyszczenie maltooligosacharydu za pomocą specyficznego DP lub 14C-znakowanych radioaktywnie maltooligosacharydów do testu enzymatycznego 18,25. Wreszcie, chociaż spektrometria mas (np. MALDI-TOF) jest szybką i czułą techniką określania rozkładu długości łańcucha, technika ta wydaje się być mniej powtarzalna. To zawyża ilość długich łańcuchów glukanu26. Niemniej jednak ten ostatni może być wykorzystany do konkretnego zastosowania, takiego jak obrazowanie MALDI w celu zmapowania obecności glikogenu w tkance komórkowej27.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konfliktu interesów związanego z tą pracą.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez CNRS, Université de Lille CNRS, a ANR przyznaje "MathTest" (ANR-18-CE13-0027).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AG-501-X8 ŻywicaBioRad#1436424Przechowywanie Temperatura pokojowa
100 mM bufor octanu sodu, pH 4,8Rozpuścić 0,82 g octanu sodu w 80 ml wody. Dostosuj pH do 4,8 za pomocą kwasu octowego i uzupełnij objętość do 100 ml wodą— przechowywanie w temperaturze pokojowej.
Roztwór podstawowy APTSMerck09341-5MGRozpuścić 5 mg APT w 48 ml kwasu octowego 0,2 M. Przechowywanie w temperaturze -20 °C.
Kapilarneseparacje Sciex, Les Ulis, Francja
Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623Thermofisherwybierz :Plik>import/przywróć>ANDI/chromatografia w otwartym oknie: wybierz "Dodaj" wybierz plik CDF  > importuj > następny
Wybierz folder, do którego zostanie pobrany plik w oprogramowaniu Chromeleon> kliknij QNT-Editor> parametr "Minimalna powierzchnia" wybierz "Zakres" 0,05 [Sygnał]*min.
ExcelMicrosoftOtwórz program Excel> Nowy plik> zapisz plik > menu Plik kliknij Importuj > W otwartym oknie wybierz "csv." jako typ pliku > wybierz plik ASC, > pojawi się nowe okno Krok 1: wybierz Macintosh lub  Okno, a następnie użył ustawienia domyślnego dla kroków 2 i 3. > Wartości Y są wyświetlane w kolumnie A> Ręcznie dodaj kolumnę Czas, zwiększając ją o 0,25 sekundy do każdej komórki odpowiadającej częstotliwości (4 Hz) dla danych akwizycji. Następnie narysuj wykres.
Aparat Free-DryChristalpha 2-4 LO plusprzed procesem zamrażania-suszenia próbki są przechowywane w temperaturze -80 & deg; C przez 1 godzinę.
IzoamylazaMegazymeE-ISAMY180 U/mg białka
MaltoheptaozaMerckM7753
N-sprzężony bufor do separacji węglowodanówSciex Separations, Les Ulis, Francja477623Przechowywanie w temperaturze 4 ° C
PullulanazaMegazymeE-PULKP30 U/mg białka
Sicyjanoborowodorek soduSigma-Aldrich296813-100ML1 M cyjanoborowodorek sodu w THF
Parownik próżniowyEppendorfConcentrator 5301Ustawić temperaturę na 30 stopni C. Wirować do momentu wysuszenia próbek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Konkolewicz, D., Thorn-Seshold, O., Gray-Weale, A. Models for randomly hyperbranched polymers: Theory and simulation. The Journal of Chemical Physics. 129 (5), 054901(2008).
  2. Deng, B., Sullivan, M. A., Wu, A. C., Li, J., Chen, C., Gilbert, R. G. The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen. Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).
  3. Besford, Q. A., Sullivan, M. A., Zheng, L., Gilbert, R. G., Stapleton, D., Gray-Weale, A. The structure of cardiac glycogen in healthy mice. International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).
  4. Wang, L., et al. Molecular structure of glycogen in escherichia coli. BioMacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).
  5. Ball, S., Colleoni, C., Cenci, U., Raj, J. N., Tirtiaux, C. The evolution of glycogen and starch metabolism in eukaryotes gives molecular clues to understand the establishment of plastid endosymbiosis. Journal of Experimental Botany. 62 (6), 1775-1801 (2011).
  6. Zhang, P., Nada, S. S., Tan, X., Deng, B., Sullivan, M. A., Gilbert, R. G. Exploring glycogen biosynthesis through Monte Carlo simulation. International Journal of Biological Macromolecules. 116, 264-271 (2018).
  7. Melendez-Hevia, E., Waddell, T. G., Shelton, E. D. Optimization of molecular design in the evolution of metabolism: The glycogen molecule. Biochemical Journal. 295 (2), 477-483 (1993).
  8. Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Cascante, M. How did glycogen structure evolve to satisfy the requirement for rapid mobilization of glucose? A problem of physical constraints in structure building. Journal of Molecular Evolution. 45 (4), 446-455 (1997).
  9. Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Canela, E. I. The fractal structure of glycogen: A clever solution to optimize cell metabolism. Biophysical Journal. 77 (3), 1327-1332 (1999).
  10. Wang, L., Wise, M. J. Glycogen with short average chain length enhances bacterial durability. Naturwissenschaften. 98 (9), 719-729 (2011).
  11. Kanungo, S., Wells, K., Tribett, T., El-Gharbawy, A. Glycogen metabolism and glycogen storage disorders. Annals of Translational Medicine. 6 (24), 474(2018).
  12. Wang, L., et al. Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14(2020).
  13. Wang, L., et al. Influence of in situ progressive N-terminal is still controversial truncation of glycogen branching enzyme in Escherichia coli DH5α on glycogen structure, accumulation, and bacterial viability. BMC Microbiology. 15 (1), 1-14 (2015).
  14. Bernard, C. On the physiological mechanism of sugar formation in the liver. Proceedings of the Academy of Sciences. 44 (12), 578-586 (1857).
  15. Liu, Q. -H., Tang, J. -W., Wen, P. -B., Wang, M. -M., Zhang, X., Wang, L. From prokaryotes to eukaryotes: Insights into the molecular structure of glycogen particles. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 673315(2021).
  16. Zang, L. H., Rothman, D. L., Shulman, R. G. 1 H NMR visibility of mammalian glycogen in solution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (5), 1678(1990).
  17. O'Shea, M. G., Samuel, M. S., Konik, C. M., Morell, M. K. Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) of oligosaccharides: Efficiency of labelling and high-resolution separation. Carbohydrate Research. 307 (1-2), 1-12 (1998).
  18. Koizumi, K., Fukuda, M., Hizukuri, S. Estimation of the distributions of chain length of amylopectins by high-performance liquid chromatography with pulsed amperometric detection. Journal of Chromatography A. 585 (2), 233-238 (1991).
  19. Morell, M. K., Samuel, M. S., Shea, M. G. O. Analysis of starch structure. Electrophoresis. 19, 2603-2611 (1998).
  20. Guttman, A., Chen, F. -T. A., Evangelista, R. A., Cooke, N. High-resolution capillary gel electrophoresis of reducing oligosaccharides labeled with 1-Aminopyrene-3,6,8-trisulfonate. Analytical Biochemistry. 233 (2), 234-242 (1996).
  21. Kadouche, D., et al. Characterization of function of the GlgA2 glycogen/starch synthase in cyanobacterium sp. clg1 highlights convergent evolution of glycogen metabolism into starch granule aggregation. Plant Physiology. 171 (3), 1879-1892 (2016).
  22. Hayashi, M., Suzuki, R., Colleoni, C., Ball, S. G., Fujita, N., Suzuki, E. Bound substrate in the structure of cyanobacterial branching enzyme supports a new mechanistic model. The Journal of biological chemistry. 292 (13), 5465-5475 (2017).
  23. Sawada, T., et al. Diversity of reaction characteristics of glucan branching enzymes and the fine structure of α-glucan from various sources. Archives of Biochemistry and Biophysics. 562, 9-21 (2014).
  24. Wong, K. S., Jane, J. Quantitative analysis of debranched amylopectin by HPAEC-PAD with a post-column enzyme reactor. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 20 (2), 297-310 (1997).
  25. Colleoni, C., et al. Biochemical Characterization of the chlamydomonas reinhardtii a-1,4 glucanotransferase supports a direct function in amylopectin biosynthesis. Plant Physiology. 120, 9(1999).
  26. Broberg, S., Koch, K., Andersson, R., Kenne, L. A comparison between MALDI-TOF mass spectrometry and HPAEC-PAD analysis of debranched starch. Carbohydrate Polymers. 43 (3), 285-289 (2000).
  27. Sun, R. C., et al. Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation. Cell Metabolism. 33 (7), 1404-1417 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Struktura glikogenuelektroforeza wspomagana fluoroforemmetabolizm glikogenustopie polimeryzacjienzymy odga ziaj ceznakowanie APTSelektroforeza kapilarna

Powiązane artykuły