Method Article

Skuteczna ilościowa strategia diagnostyki śliny metodą PCR z odwrotną transkryptazą SARS-CoV-2 z wykorzystaniem robotów do pipetowania typu open source

DOI:

10.3791/63395

⸱

February 11th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Innovative Medical Devices and Sensors (REDDI Lab), Clemson University, 2Department of Bioengineering, Clemson University, 3Swann Medicine, 4Student Health Services, Clemson University, 5Department of Chemical & Biomolecular Engineering, Clemson University, 6Department of Chemical & Biomolecular Engineering, University of Delaware

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje metodę diagnostyczną SARS-CoV-2, która wykorzystuje automatyzację open-source do przeprowadzania testów molekularnych RT-qPCR próbek śliny. To skalowalne podejście może być stosowane w klinicznym nadzorze nad zdrowiem publicznym, a także w celu zwiększenia wydajności mniejszych laboratoriów uniwersyteckich.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojawienie się niedawnego globalnego kryzysu zdrowotnego związanego z SARS-CoV-2 wprowadziło kluczowe wyzwania dla badań epidemiologicznych i testów klinicznych. Charakteryzująca się wysokim wskaźnikiem transmisji i niską śmiertelnością pandemia COVID-19 wymusiła dokładne i skuteczne testy diagnostyczne, szczególnie w populacjach zamkniętych, takich jak uniwersytety z internatem. Początkowa dostępność testów kwasów nukleinowych, takich jak wymazy z nosogardzieli, była ograniczona ze względu na presję w łańcuchu dostaw, która również opóźniała raportowanie wyników testów. Wykazano, że ilościowe badanie reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-qPCR) na podstawie śliny jest porównywalne pod względem czułości i swoistości z innymi metodami testowania, a pobieranie śliny jest mniej inwazyjne fizycznie dla uczestników. W związku z tym opracowaliśmy multipleksowy test diagnostyczny RT-qPCR do nadzoru populacji Uniwersytetu Clemson i otaczającej społeczności. W teście wykorzystano roboty do obsługi cieczy i termocyklery typu open source zamiast złożonych systemów automatyzacji klinicznej, aby zoptymalizować przepływ pracy i elastyczność systemu. Automatyzacja RT-qPCR na podstawie śliny umożliwia szybkie i dokładne wykrywanie szerokiego zakresu stężeń wirusowego RNA zarówno w przypadku testów na dużą, jak i małą skalę. Średni czas realizacji zautomatyzowanego systemu wynosił < 9 godzin dla 95% próbek i < 24 godziny dla 99% próbek. Koszt pojedynczego testu wynosił 2,80 USD, gdy wszystkie odczynniki zostały zakupione w ilościach hurtowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koronawirus związany z zespołem ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej-2 (SARS-CoV-2), nowy koronawirus, pojawił się pod koniec 2019 roku i szybko rozprzestrzenił się w populacjach na całym świecie1. Zakażenie SARS-CoV-2 powoduje chorobę koronawirusową 2019 (COVID-19), wysoce zaraźliwą chorobę z potencjalnie ciężkimi objawami ze strony układu oddechowego i zapalnego. Wysoka zdolność przenoszenia się w połączeniu z niską śmiertelnością wskazywała, że wirus szybko rozprzestrzeni się w populacjach i będzie wymagał zwiększonej liczby testów diagnostycznych2,3. Zalecenia dotyczące zdrowia publicznego zachęcały do szeroko zakrojonych badań przesiewowych populacji w celu odizolowania przypadków, a następnie zmniejszenia szybkości transmisji4,5,6. Co więcej, modele nadzoru populacji wykazały, że zwiększenie częstotliwości testów i skrócenie czasu raportowania miało większy wpływ na zmniejszenie transmisji niż zwiększenie czułości testu7. Jest to prawdopodobne dlatego, że zakażone osoby mogą zostać poddane kwarantannie wcześniej, przerywając w ten sposób łańcuchy infekcji.

Pierwotnym standardem testowania amplifikacji kwasów nukleinowych (NAAT) były wymazy z nosogardzieli (NP) przetworzone przez RT-qPCR8. Jednak w przypadku tej formy testowania dla bardzo dużych populacji pojawiają się komplikacje, takie jak zwiększony koszt względny i zwiększona presja w łańcuchu dostaw9,10. Co więcej, zarówno pobieranie próbek, jak i przetwarzanie popularnych metod NAAT (w tym wymazów NP, wymazów z jamy ustnej i gardła, wymazów ze środkowej małżowiny usznej i wymazów z nosa) zależy od specjalistycznego sprzętu, odczynników i personelu medycznego9,10.

Odpowiednim substytutem testu RT-qPCR z wymazu NP jest badanie na podstawie śliny, które jest dokładnym narzędziem diagnostycznym do wykrywania SARS-CoV-211,12,13,14. Bezpośrednie wykonanie RT-qPCR na próbkach śliny daje podobną czułość i swoistość jak wymazy NPs15. Jedną z głównych zalet badania śliny w porównaniu z testami wymazów NP jest to, że pozwala na samodzielne pobieranie próbek16. Minimalizuje to potrzebę zatrudniania personelu medycznego i maksymalizuje łatwość pobierania próbek dla pacjentów, ponieważ jest mniej inwazyjne niż wymazy NP. Dodatkowo, ponieważ próbki śliny nie wymagają do usunięcia próbki z wymazówki (jak w przypadku próbek NP), testy oparte na ślinie mogą bezpośrednio wykorzystywać ekstrakcję kwasem rybonukleinowym (RNA) na bazie ciepła, co zmniejsza koszty testowania, eliminując potrzebę stosowania dodatkowych, pożywek transportowych i/lub odczynników do ekstrakcji RNA14,17.

Laboratorium Badań i Edukacji w Diagnostyce i Interwencji Chorób (REDDI) Uniwersytetu Clemson zostało założone w celu zaspokojenia potrzeb uniwersytetu w zakresie testów i nadzoru nad COVID-19. W zamkniętych populacjach, w tym na uniwersytetach, częste testy kontrolne w połączeniu z dystansem społecznym przyniosły najkorzystniejsze wyniki w epidemiologicznych modelach występowania choroby18. Dostosowano skonsolidowane protokoły CDC 2019-nCOV RT-qPCR19 i SalivaDirect14, a w klinicznym przepływie pracy wykorzystano automatyzację, aby obniżyć koszty i skrócić czas realizacji. Poprzednie grupy używały robotów do obsługi płynów o otwartym kodzie źródłowym do etapów ekstrakcji RNA SARS-CoV-220,21, ale zmaksymalizowaliśmy wykorzystanie robotów do przygotowania płytek testowych i obciążenia próbek22. Tutaj pokazujemy, że dostosowany protokół i wykorzystanie systemów obsługi płynów o otwartym kodzie źródłowym ( Rysunek 1) pozwala na szybki i dokładny RT-qPCR oparty na ślinie i jest skuteczną strategią nadzoru zdrowia publicznego na dużą skalę.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania zostały przeprowadzone zgodnie z Clemson University i Prisma Health Institutional Review Boards (Prisma Health IRB # Pro00099491, July 1, 2020).

1. Konfiguracja robota do obsługi płynów o otwartym kodzie źródłowym

  1. Zainstaluj wysokowydajne moduły filtrów cząstek stałych (HEPA) (patrz tabela materiałów) na górze każdego robota do obsługi cieczy zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Podłącz 8-kanałową pipetę P20 do lewego mocowania robota(ów) przygotowującego płytkę do mieszania zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Podłącz pipetę P20 do prawego uchwytu robota (robotów) ładującego próbkę zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Pobierz niestandardowe skrypty języka Python (plik uzupełniający 1 i plik uzupełniający 2) na odpowiednich komputerach.
  5. Otwórz TigerSaliva Full 384 Loading.py w aplikacji komputerowej na przykładowych komputerach robotów. Kliknij przycisk Kalibruj i skonfiguruj zarówno pipetę, jak i program zgodnie ze wskazówkami oprogramowania.
  6. Otwórz 12 Full Plates.py w aplikacji komputerowej na komputerze robota master mix. Kliknij przycisk Kalibruj i skonfiguruj zarówno pipetę, jak i program zgodnie ze wskazówkami oprogramowania.
  7. Drukuj niestandardowe stojaki na próbki za pomocą trójwymiarowej drukarki (3D) do modelowania osadzania topionego przy użyciu pliku projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) (https://www.myminifactory.com/object/3d-print-141363). Drukuj 16 stojaków na jednego robota ładującego próbki, dla dwóch zestawów po osiem stojaków.

2. Przygotowanie 20-krotnego multipleksu N1+P1 sonda/starter mix

  1. Przygotuj partię 20-krotnej mieszaniny sondy N1 + P1 z multipleksem N1 / starterem (całkowita objętość 20 ml, tabela 1) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w sterylnym środowisku z dala od syntetycznego RNA SARS-CoV-2 lub próbek pacjentów.
  2. Porcję 1,6 ml mieszaniny za pomocą pipety serologicznej umieścić w sterylnych probówkach wirówkowych o pojemności 2,0 ml i odpowiednio oznaczyć.
  3. Porcje należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C do momentu użycia.

3. Przygotowanie mieszanki kontroli pozytywnej

UWAGA: Mieszanka kontroli pozytywnej nie powinna być przygotowywana w tym samym sterylnym środowisku, co mieszanina sonda/starter lub inne składniki mieszanki wzorcowej. Należy użyć oddzielnego pojemnika z wodą wolną od nukleaz.

  1. Rozcieńczyć syntetyczny RNA (N1) SARS-CoV-2 od 1 000 000 kopii genów/μl (cpμ) do 10 000 cpμ, dodając 10 μl roztworu podstawowego do 990 μl wody wolnej od nukleaz. Podać 25 μl 10 000 cpμ do sterylnych probówek o pojemności 0,2 ml i odpowiednio oznaczyć. Niewykorzystane porcje należy przechowywać w temperaturze -80°C.
    UWAGA: Syntetyczne RNA musi być przechowywane w temperaturze -80°C, aby zapobiec degradacji.
  2. Rozcieńczyć Hs_RPP30 syntetycznym DNA (P1) od 200 000 cpμ do 10 000 cpμ, dodając 50 μl roztworu podstawowego do 950 μl wody wolnej od nukleaz. Podać 25 μl 10 000 cpμ do sterylnych probówek o pojemności 0,2 ml i odpowiednio oznaczyć. Niewykorzystane podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze -80°C.
  3. Rozcieńczyć każdy składnik do końcowego stężenia 200 cpμ, dodając 20 μl zarówno SARS-CoV-2, jak i Hs_RPP30 10 000 cpμ do 960 μl wody wolnej od nukleaz, co daje w sumie 1000 μl. Podwielokrotność 20 μl zmieszanej kontroli pozytywnej 200 cpμ do probówek o pojemności 0,2 ml i odpowiednio oznaczyć. Przechowywać porcje w temperaturze -80°C do momentu przygotowania do użycia.

4. Przygotowanie płytek z mieszanką główną

UWAGA: Przygotuj mieszankę wzorcową w sterylnym środowisku, z dala od syntetycznego RNA SARS-CoV-2 lub próbek pacjentów. Wszystkie składniki muszą być całkowicie rozmrożone przed dodaniem do mieszanki; Bez odpowiedniego rozmrożenia stężenia mogą być nieprawidłowe. Na nieodpowiednie rozmrażanie wskazuje obecność lodu lub nierównomierny kolor odczynników. Przechowywać na bloku zamrażarki podczas przygotowywania mieszanki.

  1. Przygotować partię multipleksowej mieszanki wzorcowej (całkowita objętość 48 ml, tabela 2) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  2. Homogenizować mieszaninę, obracając probówkę 3 razy. Nie mieszać przez pipetowanie w górę i w dół ani wirowanie, ponieważ może to spowodować uszkodzenie enzymu.
  3. Napełnij kolumny 1-4 sterylnego 96-dołkowego zbiornika głębinowego, przenosząc 1,48 ml mieszanki głównej do każdej studzienki. Jeden stożkowy o pojemności 50 ml wypełnia cztery kolumny, co wystarcza na 12 płytek.
  4. Przykryj zbiornik studni głębinowej uszczelką foliową i umieść go w dedykowanym robocie do obsługi cieczy master mix. Umieść napełniony zbiornik głębinowy na pokładzie 10, umieść sześć pustych płytek 384-dołkowych na pokładach 1-6, a skrzynkę na końcówki P20 na pokładzie 11. Odsłoń płytkę głębinową i pudełka na końcówki, a następnie zamknij robota.
  5. Zainicjuj niestandardowy protokół operacyjny języka Python, klikając przycisk Start Run (Uruchom uruchom) w aplikacji komputerowej robota.
  6. Po 40 minutach bieg zostanie wstrzymany. Przykryj napełnione płytki 384-dołkowe uszczelkami foliowymi, gdy pozostają w robocie i dociśnij rolką, aby zapewnić przyczepność. Oznacz krawędź każdej tabliczki identyfikatorem partii.
  7. Umieść sześć nowych pustych płytek 384-dołkowych na pokładach 1-6 i wznów protokół operacyjny, klikając przycisk Wznów bieg. Po zakończeniu cyklu przykryj ostatni zestaw 384 płytek dołkowych uszczelkami foliowymi.
  8. Odpipetować 2 μl pozostałej mieszanki wzorcowej do kolumn 1-3 i 22-24 pustej płytki 384-dołkowej w celu kontroli jakości partii. Uszczelnić optycznie przezroczystą uszczelką i uruchomić na termocyklerze (rozdział 10.1-10.2). Jeśli którakolwiek ze studni ma wartości progowe cyklu N1 (Ct) lub jeśli więcej niż 10 studzienek ma wartości P1 Ct, partia jest zanieczyszczona i nie może być użyta.
  9. Przygotowane płytki wzorcowe należy przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 7 dni od przygotowania.

5. Pobieranie próbek, pobieranie i obróbka cieplna

  1. Poinstruuj uczestników, aby unikali jedzenia, picia, palenia tytoniu lub dbania o higienę jamy ustnej na 30 minut przed pobraniem śliny. Poinstruuj uczestników, aby zebrali co najmniej 1 ml śliny, która naturalnie gromadzi się w jamie ustnej i umieścili ją w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml bez konserwantów, a następnie zakryli probówkę (plik uzupełniający 3).
  2. Odkaż zewnętrzną stronę probówek do pobierania śliny za pomocą 70% etanolu lub chusteczek dezynfekujących i przenieś je do laboratorium w celu przetestowania.
  3. Rejestruj przybycie próbki, skanując każdy kod kreskowy próbki do arkusza kalkulacyjnego dziennego spożycia (plik uzupełniający 4).
  4. Zeskanowane próbki poddawać obróbce cieplnej przez 30 minut w piecu o temperaturze 95 °C. Próbki należy usuwać w rękawicach żaroodpornych.
    UWAGA: Próbki niepoddane działaniu substancji są stabilne w temperaturze pokojowej (23 °C) przez okres do 72 godzin. Po poddaniu ich obróbce cieplnej próbki muszą być przechowywane w temperaturze 4 °C, jeżeli nie są natychmiast przetwarzane.

6. Przykładowe zadanie

  1. Otwórz arkusze kalkulacyjne codziennego ładowania próbek dla każdego robota ładującego próbki (plik uzupełniający 5) na komputerze w stacji przypisywania próbek.
  2. Przypisz 188 próbek do każdej płytki 384-dołkowej w następujący sposób: Próbki 1-48 są uważane za kwartał 1, próbki 49-96 są uważane za kwartał 2, próbki 97-144 są uważane za kwartał 3, a próbki 145-188 są uważane za kwartał 4. Próbki są analizowane w dwóch egzemplarzach.
  3. Tace na etykiety z nazwą tabliczki, datą i numerem kwartału. Zeskanuj próbki w kolejności do arkusza kalkulacyjnego ładowania próbek.
    UWAGA: Próbki z wcześniejszych płytek mogą wymagać ręcznego uruchomienia, zgodnie z definicją w Rysunek 3. Patrz sekcje 8.1-8.3, aby zapoznać się z instrukcjami ręcznego przypisywania i ładowania próbek.

7. Obsługa robotów ładujących próbki

  1. Na stacji ładowania próbek ustaw dwa pełne zestawy ośmiu wydrukowanych w 3D stojaków odpowiadających umieszczeniu pokładu w robocie.
  2. Odkręć ćwiartkę 1 probówki i umieść w stojakach wydrukowanych w 3D, zaczynając od pozycji A1 w stojaku 1. Wypełnij każdy kosz od lewej do prawej i od góry do dołu. Kontynuuj ten schemat ładowania w stojaku 2, a następnie przejdź do stojaków 4 i 5 (patrz Rysunek 2C).
    UWAGA: Regały nie są numerowane kolejno ze względu na parametry programu robota.
  3. Umieść załadowane stojaki na próbki ćwiartki 1 na pokładach 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11. Umieść końcówki P20 na pokładach 3 i 9. Aby uprościć proces konfiguracji, załaduj materiały od tyłu do przodu do robota.
  4. Wziąć gotową płytkę wzorcową z temperatury 4 °C, oznaczyć ją nazwą płytki i ostrym ostrzem przeciąć linię w folii wokół studzienek kontrolnych (N23/24, O23/24 i P23/24).
  5. Umieścić płytkę mieszającą na pokładzie 6 i zdjąć foliową pokrywę, pozostawiając mały prostokąt zakrywający studzienki kontrolne. Otwórz pudełka z końcówkami i zamknij robota.
  6. Zainicjuj niestandardowy protokół operacyjny języka Python, klikając przycisk Uruchom uruchom za pomocą aplikacji komputerowej robota. Każda ćwiartka ładuje się na talerz w 24,5 minuty; Ustaw minutnik jako przypomnienie.
  7. Podczas pracy robota odkręć i załaduj ćwierć 2 probówek z próbkami do drugiego zestawu stojaków wydrukowanych w 3D, jak opisano w sekcji 7.2.
  8. Gdy robot zatrzyma się, wyjmij stojaki ćwiartka 1 i zastąp je stojakami ćwiartka 2. Kliknij przycisk Wznów uruchamianie w aplikacji komputerowej.
  9. Uzupełnij probówki z ćwiartką 1 i przechowuj je w lodówce o temperaturze 4 °C w oczekiwaniu na wyniki.
    Powtórz ten proces ładowania dla ćwiartek 3 i 4.
  10. Przenieś załadowaną płytkę do komory bezpieczeństwa biologicznego. Aby zminimalizować zanieczyszczenie, podczas przenoszenia należy przykryć płytę.

8. Ręczne ładowanie próbki

UWAGA: Wykonaj pojedynczy ręczny przebieg na powtarzających się próbkach (N1 Rerun lub Rerun, zobacz Rysunek 3) w przypadku nieodpowiedniego obciążenia robota.

  1. Zebrać wszystkie powtarzające się próbki i przypisać je jako ostatnie próbki w kwartale 4 (patrz sekcja 6.2). Ponumeruj próbki, zeskanuj kody kreskowe i wprowadź oryginalną lokalizację próbki oraz wynik do arkusza kalkulacyjnego ładowania próbki.
  2. Przenieść powtórzone próbki do komory bezpieczeństwa biologicznego. Nie ładuj probówek z powtarzającymi się próbkami do stojaków załadowczych robota.
  3. Odpipetować 2 μl każdej powtórzonej próbki do odpowiednich studzienek, postępując zgodnie ze schematem układu płytek (plik uzupełniający 6). Do dodawania próbek pacjenta należy używać przeznaczonej do tego pipety. Studzienki kontrolne należy przykryć folią podczas dodawania próbek, aby zminimalizować zanieczyszczenie.

9. Dodanie kontrolek do płytek testowych

  1. Zdejmij foliową osłonę ze studzienek kontrolnych za pomocą kleszczy.
  2. Odpipetować 2 μl wody wolnej od nukleaz (bez kontroli matrycy) do studzienek N23-N24 i 2 μl mieszanej kontroli dodatniej o stężeniu 200 cpμ (patrz sekcja 3) do studzienek O23-O24. Odpipetować 2 μl potwierdzonej dodatniej próbki pacjenta do studzienek M23-M24 jako dodatkową kontrolę. Pozostaw studzienki P23-P24 puste, aby monitorować jakość partii mieszanki głównej.
  3. Przykryj płytkę optycznie przezroczystą uszczelką i użyj wałka aplikatora, aby przykleić uszczelkę do wszystkich studzienek. Wiruj płytkę z prędkością 2500 obr./min przez 30 sekund, aby dokładnie wymieszać. Odwirować płytkę o masie 500 g przez 1 minutę.

10. Wykonywanie RT-qPCR

  1. Utwórz program protokołu w oprogramowaniu termocyklera zgodnie z opisanymi warunkami (Tabela 3). Zachowaj protokół na przyszłe tablice. Umieść zapieczętowaną płytkę w termocyklerze i uruchom protokół.
  2. Wyeksportuj wartości Ct jako plik .xslx i skopiuj je do przykładowego arkusza kalkulacyjnego ładowania (plik uzupełniający 5).
    UWAGA: Te arkusze zostały zaprojektowane specjalnie dla plików wyjściowych Ct z oprogramowania producenta i mogą wymagać modyfikacji w celu zaakceptowania innych formatów.

11. Określanie ważności tabliczki

  1. Należy zatwierdzić zarówno kontrolę dodatnią i/lub znane próbki dodatnie, jak i kontrolę ujemną, aby uznać wyniki płytki za ważne. Oceń studzienki kontrolne według następujących kryteriów.
    1. W przypadku kontroli dodatniej należy sprawdzić, czy co najmniej jedna studzienka kontroli dodatniej (O23/O24) wytwarza wartości Ct między 22-28 zarówno dla sond P1, jak i N1. Alternatywnie, znane dołki z dodatnimi próbkami (M23/M24) wytwarzają wartości Ct P1 i N1 <33 na sondach P1 i N1.
    2. W przypadku kontroli ujemnej należy sprawdzić, czy w żadnym z dwóch dołków kontroli ujemnej (N23/N24) nie ma wartości Ct N1 lub P1. Upewnij się, że wartości Ct mają prawidłowe krzywe amplifikacji przed unieważnieniem płytki.

12. Interpretacja przykładowych wyników

  1. Określ wynik pacjenta zgodnie z diagramem (Rysunek 3) i zgłoś rozdzielone próbki.
    1. Oceń wynik P1 jako WAŻNY lub NIEWAŻNY. Jeśli P1 daje wynik Ct <33, należy uznać studnię za PRAWIDŁOWĄ i przejść do wyniku z N1. Jeśli P1 daje wynik Ct >=33 lub brak wartości Ct, należy uznać studnię za NIEPRAWIDŁOWĄ.
      1. Oceń wynik N1 jako TAK, NIE lub NIE*. Jeśli N1 daje wynik Ct <33, dołek ma wartość TAK. Jeśli N1 nie daje wartości Ct, studzienka ma wartość NO. Jeśli N1 wytwarza Ct >=33, studzienka ma wartość NO*. Upewnij się, że wszystkie wartości N1 Ct są powiązane z rzeczywistą krzywą wzmocnienia. Jeśli wartość Ct dla N1 nie ma krzywej wzmocnienia, studzienka ma wartość NO.
      2. Zidentyfikuj powtarzające się próbki (N1 Rerun lub Rerun), oznacz je wewnętrznym numerem próbki i typem próbki, a następnie zwróć je do procesu ładowania (sekcja 8.1-8.3).

13. Sprzątanie laboratorium

  1. Roboty do transportu cieczy
    1. Oczyść wszystkie strony środkiem dezynfekującym pośredniego poziomu. Nie używaj etanolu, ponieważ spowoduje to degradację plastiku.
    2. Delikatnie przetrzyj końcówkę pipety i kosz na śmieci chusteczką nasączoną alkoholem (70% etanolu lub 100% izopropanolu). Wytrzyj klawiaturę i mysz.
  2. Szafa bezpieczeństwa biologicznego
    1. Oczyść wszystkie powierzchnie środkiem dezynfekującym średniego poziomu. Włącz światło UV na 15 minut.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Określiliśmy zakres wykrywania sond RT-qPCR i starterów dla zawartości syntetycznych kwasów nukleinowych zarówno dla SARS-CoV-2 (N1), jak i Hs_RPP30 (P1). Wykonano 10-krotne seryjne rozcieńczenie znanych stężeń połączonego syntetycznego RNA SARS-CoV-2 i syntetycznego Hs_RPP30 DNA w wodzie. Do przeliczenia masy cząsteczkowej na liczbę kopii genu użyto następującego wzoru

Liczba kopii genu = (ng * 6.0221 x 1023)/((długość w parach zasad*660 g/mol) *1 x 109 ng/g)

i RT-qPCR zostało wykonane. Po przeprowadzeniu RT-qPCR, krzywe liniowe do wykrywania N1 (Rysunek 4A) i detekcji P1 (Rysunek 4B) wykazały dobre współczynniki korelacji w szerokim zakresie stężeń kopii genów (odpowiednio R2 = 0,9975 i R2 = 0,9884). Wynik ten wskazuje, że połączenie zestawów starterów i sond nie jest hamujące i może dokładnie wykryć RNA SARS-CoV-2 w jednej kopii genu / μL (Cq = 33). Jedna kopia genu jest w przybliżeniu równoważna jednej kopii wirusa; jednak nie określiliśmy ilościowej liczby kopii wirusa w ślinie ze względu na półilościowy charakter RT-qPCR. Próbowaliśmy symulować dodatnie próbki śliny, wprowadzając syntetyczne RNA SARS-CoV-2 o znanych stężeniach do śliny wolnej od wirusa (zarówno poddanej obróbce cieplnej, jak i niepoddanej obróbce cieplnej), ale nie byliśmy w stanie wytworzyć amplifikacji N1 przy niskich stężeniach RNA (dane nie pokazane). Może to być spowodowane degradacją RNazy lub innymi czynnikami zakłócającymi.

Oceniono również zmienność między testami i wewnątrz testów między automatycznymi i ręcznymi metodami ładowania próbek. Aby ocenić zmienność między testami, 20 unikalnych próbek dodatnich załadowano przy użyciu metod ręcznych (opisanych w sekcji 8.1-8.3) i automatycznych (opisanych w sekcji 7.1-7.11). Wartości N1 Ct porównano w celu określenia, czy roboty do obsługi cieczy i ręczne ładowanie próbek dały równoważne wyniki (Rysunek 5A). Liniowa zależność między metodami ręcznymi i automatycznymi pozwoliła uzyskać wysoki współczynnik korelacji (R2 = 0,9088), co wskazuje, że obie metody są funkcjonalnie równoważne. Wraz ze wzrostem wartości N1 Ct zwiększała się również zmienność wartości Ct. Tendencja ta jest prawdopodobnie spowodowana niejednorodnym rozmieszczeniem cząstek wirusa w ślinie, który jest bardziej wyraźny, gdy obecnych jest mniej cząstek. Aby ocenić zmienność wewnątrz testu, porównano wartości N1 Ct z powtórzonych studzienek unikalnych próbek śliny przy użyciu obu metod ładowania próbki (Rysunek 5B). Liniowa zależność między powtórzeniami automatycznego ładowania próbki (R2 = 0,9622) dała nieco wyższy współczynnik korelacji niż w przypadku ręcznego ładowania (R2 = 0,9589), co wskazuje na wysoką odtwarzalność wykrywania SARS-CoV-2 dla obu metod ładowania.

Na koniec, dokonano oceny redukcji lepkości śliny w odniesieniu do metod obróbki cieplnej (Rysunek 6). Ślinę uzyskano z jednego źródła, aby wyeliminować zmienność próbki. Większa zmienność wartości P1 Ct w ramach jednej metody obróbki cieplnej może wskazywać na wyższą lepkość próbki, ponieważ lepka ślina nie może być precyzyjnie zasysana i dozowana. Zarówno metody obróbki cieplnej trwającej 30 minut, jak i 60 minut spowodowały znacznie zmniejszoną zmienność próbki w porównaniu z brakiem kontroli (odpowiednio p = 0,0006 i p = 0,0429). Nie stwierdzono istotnej różnicy między 30-minutowym a 60-minutowym leczeniem (p = 0,2245); W związku z tym wdrożono metodę 30-minutowej obróbki cieplnej w celu skrócenia czasu obróbki.

figure-results-1
Rysunek 1: Przebieg pracy laboratorium z wykorzystaniem systemu diagnostycznego RT-qPCR opartego na ślinie. (A) Próbki są pobierane i poddawane obróbce cieplnej w temperaturze 95 °C przez 30 minut. Poddane działaniu substancji próbki są sortowane i śledzone wraz z informacjami o pacjencie za pomocą wewnętrznego systemu arkuszy kalkulacyjnych. Robot do obsługi cieczy ładuje próbki do zduplikowanych dołków przygotowanych płytek wzorcowych. Technik ręcznie ładuje elementy sterujące, uszczelnia płytkę i umieszcza ją w termocyklerze w celu przetworzenia. Wyniki są analizowane przez zautomatyzowany system komputerowy i weryfikowane przez technika. (B) Technik przygotowuje odczynniki do mieszanki wzorcowej, które są dodawane do zbiornika głębinowego w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego. Napełnione zbiorniki głębinowe są ładowane do dedykowanego robota do obsługi cieczy. Gotowe tabliczki są zaklejane folią, etykietowane i przechowywane w temperaturze 4 °C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Układy używane w robocie do obsługi cieczy. (A) Układ pokładu dla robota(ów) przygotowującego płytę do mieszanki. Dzięki pipecie ośmiokanałowej robot jest zaprogramowany do pobierania końcówek pipet, zasysania mieszanki wzorcowej z 96-dołkowego zbiornika głębinowego, dozowania mieszanki wzorcowej do pustych płytek 384-dołkowych i wyrzucania końcówek pipet do kosza na śmieci. Powtarza się to dla sześciu płyt na cykl. (B) Konfiguracja pokładu dla robota(-ów) ładującego(-ych) próbki. W przypadku pipety jednokanałowej robot jest zaprogramowany tak, aby pobierał końcówkę pipety, odsysał próbkę śliny, dozował próbkę śliny do zduplikowanych studzienek 384-dołkowej płytki mieszającej i wyrzucał końcówkę pipety do kosza na śmieci. Czynność tę powtarza się dla 48 próbek na serię. (C) Kolejność ładowania probówek na próbki dla stojaków drukowanych w 3D. Czerwone strzałki wskazują kolejność załadunku w obrębie regału, a białe cyfry w polach wskazują kolejność załadunku całego zestawu regałów. Cała konfiguracja załaduje 188 próbek w dwóch egzemplarzach do 384-dołkowej płytki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Przykładowy wynikowy schemat blokowy. Próbki z ważnym P1 i dodatnim N1 uznano za próbki ludzkiej śliny dodatnie na obecność SARS-CoV-2. Ważne i pozytywne/ujemne wyniki próby uznano za rozstrzygające. Próbki, które nie dały rozstrzygających wyników w pierwszym przebiegu, zostały sklasyfikowane jako Rerun (oznaczone RR) lub N1 Rerun (oznaczone N1 RR). Próbki powtórzone nie miały prawidłowej amplifikacji P1, a próbki N1 Rerun miały dodatnią amplifikację N1 w pojedynczej powtórzeniu. Jeśli nie można było wytworzyć ważnej amplifikacji P1 przez późniejszą serię ręczną lub obie kontrpróby miały wartości N1 Ct powyżej progu dodatniego (Ct >33), wyniki próbki uznano za niejednoznaczne. Do celów klinicznych próbki pacjentów, które nie dotarły do laboratorium, miały niewystarczającą ilość śliny do pipetowania lub były uszkodzone, były uważane za nieważne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wykrywanie syntetycznego RNA N 1 (SARS-CoV-2) za pomocą RT-qPCR i syntetycznego DNA P 1 (Hs_RPP30). Krzywe standardowe zostały wykreślone z odchyleniami standardowymi w celu określenia zakresu dokładnej detekcji przy użyciu tej kombinacji sondy/startera. (A) Średnie wartości Ct (n = 4) uzyskane w odpowiednich rozcieńczeniach zestawiono z szacowaną ilością syntetycznego RNA (1x100 do 1x104 kopii RNA w 10 μL reakcji RT-qPCR). (B) Średnie wartości Ct (n = 3) uzyskane w odpowiednich rozcieńczeniach zestawiono z szacowaną ilością syntetycznego DNA (1 x 100 do 1 x 104 kopii genów w 10 μL reakcji RT-qPCR). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Porównanie wartości Ct SARS-CoV-2 (N1) do ręcznego i automatycznego transferu śliny. Znane próbki śliny z dodatnim wynikiem testu na obecność SARS-CoV-2 (n = 20) załadowano w dwóch egzemplarzach do głównej płytki mieszającej RT-qPCR za pomocą robota do obsługi cieczy. Próbki mają wartość Ct w zakresie 18-32 dla N1. Te same próbki zostały następnie ręcznie załadowane do zduplikowanych studzienek w innym miejscu płyty. (A) Wartości N1 Ct uzyskane z unikalnych próbek przy użyciu zarówno robota, jak i ręcznego ładowania próbki przetransponowano w celu określenia zmienności między testami między obciążeniami ręcznymi i robotami. (B) Zmienność wewnątrz testu określono również przy użyciu transponowanej repliki wartości N1 Ct uzyskanych zarówno z robota, jak i ręcznego ładowania próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Ocena metod obróbki cieplnej w celu zmniejszenia lepkości śliny. Ślinę ujemną dla SARS-CoV-2 pobrano z jednego źródła, a podwielokrotności poddano obróbce cieplnej przez 0 minut, 30 minut lub 60 minut w temperaturze 95 °C. Wartości P1 Ct z kontrprób technicznych (n = 12) każdego stanu wykreślono w celu określenia zmienności między metodami leczenia. Porównania parami między grupami oceniano za pomocą niesparowanego testu t (*** oznacza p <0,001, * oznacza p <0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Porównanie N1 Ct w próbkach śliny o niskim poziomie P1.Wybrano próbki dodatnie o niskim Ct P1 i porównano je z N1 Ct (n = 106). Wartości N1 Ct wahały się od 14 do 33, co wskazuje, że test ma zakres dynamiki w próbkach śliny, który jest porównywalny z krzywą standardową. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

KomponentSekwencja (5'→3')Koncentracja zapasówgłośność
2019-nCoV-N1 Sonda/5FAM/ACCCCGCAT/ZEN/TACGTTTGGTGGACC/3IABkFQ50 μM500 μL
2019-nCoV-N1-DlaGACCCCAAAATCAGCGAAAT100 μM2000 μL
2019-nCoV-N1-RevTCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG100 μM2000 μL
Sonda Hs RPP30 Cy5/5Cy5/ttctgacct/zen/gaaggctctgcgcg/3IABkFQ50 μM500 μL
Hs-RPP30-DlaAGATTTGGACCTGCGAGCG100 μM2000 μL
Hs-RPP30-RevGAGCGGCTGTCTCCACAAGT100 μM2000 μL
Woda--11000 μL

Tabela 1: Składniki mieszanki sondy i startera N 1+P1.

KomponentKoncentracja zapasówObjętość na reakcjęStężenie końcoweObjętość partii
Luna WarmStart RT Mieszanka enzymów20X0,5 μL1X3 ml
Mieszanka reakcyjna bufora Luna2X5,0 μl1X30 ml
N1+P1 Mieszanka podkładów/sondnCoV N1 F: 10 μM0,5 μL500 nM3 ml
nCoV N1 R: 10 μM500 nM
Sonda nCoV N1: 2,5 μM125 nM
RPP_30 P1 F: 10 μM500 nM
RPP_30 P1 R: 10 μM500 nM
Sonda RPP_30 P1: 2,5 μM125 nM
Woda wolna od nukleaz---2 μl---12 ml
Suma częściowa---8 μL---48 ml
Szablon2 μl

Tabela 2: Składniki multipleksowej mieszanki głównej SARS-CoV-2.

Rozdział Rozdział
scenaTemperatura (°C)czas trwaniaLiczba cykli
Odwrotna transkrypcja55Czas trwania: 10 min1
Początkowa denaturacja95 Rozdział 951 min1
Przyziemienia95 Rozdział 9510 sekund3
72 Rozdział 7230 sekund
95 Rozdział 9510 sekund3
Rozdział 6930 sekund
95 Rozdział 9510 sekund3
Rozdział 6630 sekund
Główne wzmocnienie95 Rozdział 9510 sekundRozdział 40
6530 sekund

Tabela 3: Protokół RT-qPCR przyziemienia. Warunki termocyklingu dla jednoetapowego testu diagnostycznego RT-qPCR SARS-CoV-2.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.
Krok przyłożeniaBrak kroku przyłożenia
Średnia N1 CtŚrednia P1 CtŚrednia N1 CtŚrednia P1 Ct
Próbka 1godz. 19.6522,7Pytanie 27,8Z dnia 28,3
Próbka 2Godzina 22,2424,9Godzina 28,7730,5
Próbka 3godz. 18.85Pytanie 19,2Godzina 24,6525,9
Próbka 4Godzina 25,5622,831,93Pytanie 29,2
Próbka 5O godz. 22.34Pytanie 24,8Rejon 38,4840.0 (Wykrycie nie powiodło się)

Tabela 4: Porównanie wartości Ct dla pięciu próbek dodatnich z wartościami Ct bez przyziemienia.

pkt. pkt.
PróbkaŚlina tygrysaKomercyjnie dostępny test SARS-CoV-2 na bazie śliny
N1 CtP1 CtWartość Covid-19Wartość RNaseP
Zobacz materiał D11Rozdział 16,4Rozdział 18,1Godzina 20,86Pytanie 23,4
E11Norma 18,9Rozdział 19,1Pytanie 25,6Rozdział 21,2
F1119,5Rozdział 18,422,8Rozdział 22,2
Zobacz materiał G11Rozdział 22,2Rozdział 19,1Dnia 23,7Norma 22,9
H11Pytanie 26,4Rejon 21,3Nr 32,2Z dnia 26,7
Ciąg A12Rozdział 14,8Rozdział 16,5O godz. 29.15Rozdział 19
Zobacz materiał B1224Rozdział 19,6Godzina 31.05Godzina 21.35
Zobacz materiał C12Norma 14,917,5Godzina 20,84Norma 18,9

Tabela 5: Porównanie wyników testu Ct na bazie śliny tygrysiej z dostępnymi na rynku wynikami testów SARS-CoV-2 na bazie śliny. Oba testy przeprowadzono na tych samych próbkach śliny (n = 8).

Plik uzupełniający 1: Niestandardowy skrypt do tworzenia płyty miksowania głównego robota. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Niestandardowy skrypt do przetwarzania śliny na robotach ładujących próbki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Instrukcje dotyczące samodzielnego pobierania wysokiej jakości próbek śliny od uczestników. Więcej szczegółów można znaleźć w krótkim opisie wideo procesu testowania dostępnym na stronie https://www.clemson.edu/centers-institutes/reddilab/index.html. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Arkusz kalkulacyjny pobierania próbki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Przykładowy arkusz kalkulacyjny. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Przykładowy schemat układu płytki 384-dołkowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test opisany w protokole został oceniony w niezależnym badaniu walidacyjnym. Stwierdzono, że test miał 98,9% swoistości (1,1% fałszywie dodatniej) i 90,0% czułości (10,0% fałszywie ujemnej) w porównaniu z parami wymazów z nosogardzieli pobranych w tym samym czasie (n = 837; 817 ujemnych, 20 dodatnich). Co ważne, trzech uczestników, którzy uzyskali pozytywny wynik testu TigerSaliva i ujemny wynik wymazu z nosogardzieli, zostało ponownie przebadanych wymazami 48 godzin później i uzyskało wyniki dodatnie, co wskazuje, że TigerSaliva może być w stanie wykryć infekcje SARS-CoV-2 wcześniej w przebiegu choroby.

Symulowaliśmy dodatnie próbki śliny, zwiększając ślinę wolną od wirusa (zarówno poddaną obróbce cieplnej, jak i niepoddanej obróbce cieplnej) znanymi stężeniami syntetycznego RNA SARS-CoV-2 i przeprowadziliśmy 10-krotne rozcieńczenie w celu określenia limitu Ct w ślinie. Gen N1 nie był wykrywalny poniżej 10 000 kopii genu (w przybliżeniu Ct = 28) w symulowanych próbkach dodatnich. Podejrzewamy, że jest to spowodowane degradacją RNazy lub innymi czynnikami zakłócającymi. Jednak interakcja RNaz śliny z nagim syntetycznym RNA prawdopodobnie różni się od interakcji z cząsteczkami wirusa, nawet po ich denaturacji przez ciepło. Dodatnie próbki śliny zostały zidentyfikowane za pomocą Ct >30, a zewnętrzne laboratoria uzyskały dane sekwencji genetycznej SARS-CoV-2 z tych próbek. Spekulujemy, że białka wirusowe zapewniają ochronę przed degradacją RNA w próbkach śliny pacjentów.

Najważniejszym krokiem w protokole jest wdrożenie automatyzacji przygotowania mieszanki wzorcowej i przetwarzania próbek śliny (odpowiednio sekcje 4 i 7). Pozwala to na nakładanie się procesów zadań, co drastycznie skraca czas realizacji. Kolejnym krytycznym etapem jest interpretacja wyników klinicznych (punkty 11 i 12). Ustalenie pośrednich kategorii wyników (Rerun i N1 Rerun) również zminimalizowało występowanie niejednoznacznych wyników testów.

Wykazaliśmy, że różnica między ręcznymi i automatycznymi metodami ładowania próbek śliny jest znikoma (Figura 5A) i że automatyzacja może poprawić odtwarzalność wykrywania SARS-CoV-2 (Figura 5B). Automatyzacja powinna być preferowana, aby ułatwić testowanie podczas projektowania i rozbudowy laboratoriów klinicznych25. Usprawnienie pracy w laboratorium następuje dzięki wdrożeniu zadań zautomatyzowanychprzez roboty 26. Możliwości open source robotów do obsługi cieczy pozwalają na implementację niestandardowych skryptów do projektowania protokołów. To sprawia, że roboty do obsługi cieczy są niedrogim i wysoce modyfikowalnym systemem w porównaniu z tradycyjnymi metodami automatyzacji klinicznej. Jest to również idealna strategia do wykonywania wysoce powtarzalnych zadań laboratoryjnych. Wysoki poziom możliwości dostosowania systemu przekłada się na swobodę zmiany sprzętu laboratoryjnego (np. probówek, końcówek do pipet lub płytek 384-dołkowych) w przypadku niedoborów. W związku z tym automatyzacja za pomocą robotów do obsługi cieczy jest opłacalna zarówno w przypadku nadzoru i badań na dużą, jak i małą skalę.

Główną zaletą tej strategii testowania jest znacznie krótszy czas realizacji w porównaniu z innymi laboratoriami klinicznymi. Wykorzystanie zautomatyzowanych robotów do obsługi cieczy odgrywa kluczową rolę w skracaniu czasu realizacji, ale jednoczesne wykorzystanie robotów i termocyklerów ma również zasadnicze znaczenie dla maksymalizacji wydajności testów. Jeden robot i termocykler powinny być obsługiwane jako para, przy czym obie maszyny są używane w tandemie do nieprzerwanego ładowania próbki i analizy wyników próbek. Po ustaleniu stałego przepływu przypisanych próbek, wszystkie pary maszyn mogą być obsługiwane jednocześnie. Stałe jednoczesne korzystanie z robotów i termocyklerów drastycznie zwiększa zdolność i wydajność testowania, co ma kluczowe znaczenie dla dostosowania się do dużej liczby testów.

W przeciwieństwie do innych uznanych protokołów SARS-CoV-2 RT-qPCR, w protokole termocyklera uwzględniliśmy krok przyziemienia, aby poprawić wyżarzanie zestawów sondy i starterów do docelowych genów27, zmniejszając ryzyko nieudanej amplifikacji. Wyniki wykazały, że przyziemienie poprawiło wykrywanie próbek dodatnich bez ryzyka utraty specyficznego wiązania starterów (Tabela 4). Ustaliliśmy, że szeroki zakres zarówno kopii RNA SARS-CoV-2 (Figura 4A), jak i Hs_RPP30 kopii DNA (Figura 4B) można jednocześnie wykryć za pomocą testu RT-qPCR.

Jednym z ograniczeń robotów do obsługi cieczy jest możliwość zanieczyszczenia krzyżowego z dodatnich próbek podczas przenoszenia śliny. Ślina jest płynem lepkosprężystym28 i po dozowaniu z końcówki pipety może przechodzić przez sąsiednie studzienki. Ponadto niejednorodność śliny29 może powodować nierównomierne rozmieszczenie cząstek wirusa w całej próbce. Zwiększa to prawdopodobieństwo wystąpienia zarówno wyników fałszywie dodatnich, jak i ujemnych, co wymaga wyznaczenia próbek N1 Rerun i Rerun. Jednak 14,1% próbek początkowo oznaczonych jako N1 Rerun zostało rozpoznanych jako pozytywne dla SARS-CoV-2 i było ponad 30 razy bardziej prawdopodobne, że po ponownym przetestowaniu ustąpi jako pozytywne niż próbki Rerun. W związku z tym odróżnienie Rerun od N1 Rerun (ryc. 3) pozwoliło na dokładniejsze oddzielenie potencjalnie dodatnich próbek, zwiększając czułość i swoistość naszego testu diagnostycznego. Inne parametry wynikowe do diagnostycznego badania śliny nie dokonały tego rozróżnienia 12,14,24,30,31.

Próbki śliny mogą być trudne do pipetowania ze względu na niejednorodność i lepkość32. Obróbka cieplna odpowiednio denaturuje białka w biomatrycy śliny, zmniejszając lepkość i eliminując potrzebę stosowania odczynników do ekstrakcji RNA9, których brakowało we wczesnych stadiach pandemii10. Przedłużona obróbka cieplna dezaktywuje również obecne wirusy33, co pozwala na przetwarzanie laboratoryjne przy niższych poziomach bezpieczeństwa biologicznego. W związku z tym zastosowano ekstrakcję RNA na bazie ciepła (opisaną w sekcji 5.4) w celu zmniejszenia lepkości poprzez denaturację białek (ryc. 6). Na podstawie uzyskanych wyników postulujemy, że obróbka cieplna może również homogenizować próbki śliny, a także denaturować biomatrycę białkową. Inne grupy łączyły obróbkę cieplną i obróbkę proteinazą K w celu zwiększenia jednorodności 9,14,34. Zdecydowaliśmy się nie wdrażać tego kroku, ponieważ może to spowodować denaturację białek wirionowych w tempie, które pozostawia wirusowe RNA narażone na degradację cieplną35. Ponadto rozcieńczenie próbki proteinazą K może zamaskować próbki dodatnie zawierające mniej cząstek wirusa, zmniejszając w ten sposób czułość. Ponadto wyniki testu porównano z dostępnym na rynku testem SARS-CoV-2 na bazie śliny (Logix Smart COVID-19), który wykorzystuje ekstrakcję RNA z kulkami magnetycznymi (Tabela 5). Stwierdzono, że obecny test lepiej nadaje się do wykrywania słabych próbek dodatnich w porównaniu z testem dostępnym na rynku.

Trudno jest określić ilościowo liczbę kopii wirusa w ślinie przy użyciu tylko RT-qPCR, ponieważ qPCR jest półilościowy. Istnieje nieodłączna zmienność między wartościami Ct, która wynika z ograniczeń technicznych. Liczba kopii genu może być określona na podstawie wartości Ct (ryc. 4) i jest w przybliżeniu równoważna liczbie kopii wirusa. Jednym z możliwych rozwiązań pozwalających określić liczbę kopii wirusa w próbkach śliny jest ddPCR, który zapewnia twardą kwantyfikację kopii genów w reakcji. Uważamy jednak, że jest to wystarczające, aby zapewnić klinicystom wyniki jakościowe, a względną zawartość wirusa można porównać w próbkach przetworzonych naszymi metodami.

Pomimo pewnych ograniczeń, które pojawiają się podczas stosowania śliny, test SARS-CoV-2 metodą RT-qPCR na bazie śliny okazuje się skuteczną metodą szybkiego i niezawodnego wykrywania wirusowego RNA w dowolnej skali testów. Jest to szczególnie ważne w połączeniu z wykorzystaniem systemów obsługi cieczy typu open source. To podejście testowe można zmodyfikować w celu wykrycia innych sekwencji kwasów nukleinowych istotnych dla diagnostyki, takich jak czynniki chorób zakaźnych, markery choroby lub inne wirusy. To sprawia, że test ma zastosowanie zarówno w klinicznych, jak i badawczych wysiłkach diagnostycznych.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Test opisany w protokole podlega procedurze SalivaDirect EUA złożonej przez Yale School of Public Health.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują administracji Clemson, personelowi medycznemu i pracownikom laboratorium klinicznego w laboratorium REDDI, którzy pomogli wdrożyć i zarządzać testami SARS-CoV-2. Dziękujemy dr Phillipowi Buckhaultsowi i dr Carolyn Bannister z Uniwersytetu Południowej Karoliny za wstępne doradztwo projektowe i kontakty branżowe w zakresie zaopatrzenia w sprzęt. Dziękujemy wielu studentom, profesorom i pracownikom za pomoc w pobraniu próbek. Dziękujemy studentom Creative Inquiry za zbieranie danych dotyczących krzywych standardowych. Fundusze na to badanie zostały otrzymane z P20GM121342 grantowego National Institutes of Health (przyznanego DD i LGP), Clemson Athletic Department, wiceprezydenta ds. badań Uniwersytetu Clemson oraz Gubernatora Karoliny Południowej i Wspólnego Komitetu ds. Przeglądu Obligacji.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100% EtOHFisher scientific22-032-601
20 uL filtrowane końcówki do pipet KońcówkiOpentrons20uL 2mL
Probówki do mikrowirówekFisher Scientific14-666-313Można użyć alternatywnego produktu
Armadillo PCR Plate, 384-dołkowa, przezroczysta, biała studzienkaThermo ScientificAB3384Można użyć alternatywnego produktu
Celltreat 2 ml 96 płytek głębinowychFisher Scientific50-828-743Do przygotowania mastermixu
Przezroczyste arkusze uszczelniające PCRThermo ScientificAB0558Można użyć alternatywnego produktu
DPEC Uzdatniona wodaAmbion (Thermo Scientific)AM9916
Flip Cap 50 ml Rurki stożkoweVWR75845-210Do pobierania próbek
Foliowe arkuszeuszczelniające PCRThermo ScientificAB0626Do przechowywania płytek mastermix można użyć alternatywnego produktu
HS_RPP30 Synthetic DNAIntegrated DNA Technologies299788131P1 kontrola pozytywna
Luna Buffer Probe Jednoetapowa reakcjaNew England BiolabsM3006B
Luna WarmStart RT Enzyme MixNew England BiolabsM3002B
nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmolZintegrowane technologie DNA10006830
nCOV_N1 Sonda Aliquot, 50 nmolZintegrowane technologie DNA10006832Sonda może być syntetyzowana przez innych dostawców z fluoforami SYBR lub FAM
nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmolZintegrowane technologie DNA10006831
Moduł filtra HEPAOpentronN/ANie jest wymagany, ale przydatny do redukcji zanieczyszczenie
Przystawka wielokanałowa Opentron, P20Opentrons999-00005Do przygotowania mastermixu
Robot do obsługi cieczy Opentron OT-2OT-2
P20Opentrons999-0000215Do ładowania próbek
PiekarnikMemmertUF450 PLUS 208V-3PH
Probówki PCR (bez rnazy, dnazy)Fisher Scientific14-230-225Do porcji kontroli dodatnich i ujemnych
Aluminiowy blok chłodzący PolarSafe, 15-dołkowy (probówki 1,5/2,0 mL)VWR10808-952
Aluminiowy blok chłodzący PolarSaf, 24-dołkowe (probówki 0,5 ml)VWR10808-956
Sonda RNAzy P (ATTO 647), 50 nmolZintegrowane technologie DNA 10007062Sonda może być syntetyzowana przez innych dostawców za pomocą Cy5 Starter do
przodu fluoroforowego RNAzy, zintegrowane technologie DNA 100 nmol10006836
Odwrócony starter RNAzy P, 100 nmolZintegrowane technologie DNA10006837
Kontrola syntetycznego RNA Sars-CoV-2 2Twist Biosciences102024 / 103907 / 103909N1 Skanery kontroli pozytywnej
KodCR1500Wymagane tylko podczas skalowania w górę
Mały kaptur z filtrem HEPAErlabCaptair Bio 321Do przygotowania mastermixu
Termocykler CFX384 TouchBioradCFX384 TouchMożna stosować alternatywne modele, np. CFX384 Opus
X-acto Knife SetStaplesN/ADo cięcia folii do przykrywania studzienek kontrolnych
Przystawka do pipet Opentron ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. New England Journal Medicine. 382 (8), 727-733 (2020).">Zhu, N., et al. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. New England Journal Medicine. 382 (8), 727-733 (2020).
  2. Pathogenicity and transmissibility of 2019-nCoV-A quick overview and comparison with other emerging viruses. Microbes and Infection. 22 (2), 69-71 (2020).">Chen, J. Pathogenicity and transmissibility of 2019-nCoV-A quick overview and comparison with other emerging viruses. Microbes and Infection. 22 (2), 69-71 (2020).
  3. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. The Lancet. Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).">Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. The Lancet. Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  4. Summary of Guidance for Public Health Strategies to Address High Levels of Community Transmission of SARS-CoV-2 and Related Deaths, December 2020. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (49), 1860-1867 (2020).">Honein, M. A., et al. Summary of Guidance for Public Health Strategies to Address High Levels of Community Transmission of SARS-CoV-2 and Related Deaths, December 2020. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (49), 1860-1867 (2020).
  5. https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051 (2020).">World Health Organization. Surveillance strategies for COVID-19 human infection: interim guidance. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051 (2020).
  6. https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance (2020).">Screening testing for early detection of SARS-CoV-2 infection. Division of viral diseases. Centers for Disease Control. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance (2020).
  7. Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 screening. Science Advances. 7 (1), 5393(2021).">Larremore, D. B., et al. Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 screening. Science Advances. 7 (1), 5393(2021).
  8. Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2. JAMA. 323 (22), 2249-2251 (2020).">Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2. JAMA. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  9. Evaluation of simple nucleic acid extraction methods for the detection of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal and saliva specimens during global shortage of extraction kits. Journal of clinical virology: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104519(2020).">Chu, A. W., et al. Evaluation of simple nucleic acid extraction methods for the detection of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal and saliva specimens during global shortage of extraction kits. Journal of clinical virology: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104519(2020).
  10. Global supply-chain effects of COVID-19 control measures. Nature Human Behaviour. 4 (6), 577-587 (2020).">Guan, D., et al. Global supply-chain effects of COVID-19 control measures. Nature Human Behaviour. 4 (6), 577-587 (2020).
  11. The Sensitivity and Costs of Testing for SARS-CoV-2 Infection With Saliva Versus Nasopharyngeal Swabs: A Systematic Review and Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 174 (4), 501-510 (2021).">Bastos, M. L., Perlman-Arrow, S., Menzies, D., Campbell, J. R. The Sensitivity and Costs of Testing for SARS-CoV-2 Infection With Saliva Versus Nasopharyngeal Swabs: A Systematic Review and Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 174 (4), 501-510 (2021).
  12. Saliva sample as a non-invasive specimen for the diagnosis of coronavirus disease 2019: a cross-sectional study. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 27 (2), (2021).">Pasomsub, E., et al. Saliva sample as a non-invasive specimen for the diagnosis of coronavirus disease 2019: a cross-sectional study. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 27 (2), (2021).
  13. Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of The Infectious Diseases Society of America. 71 (15), 841-843 (2020).">To, K. K., et al. Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of The Infectious Diseases Society of America. 71 (15), 841-843 (2020).
  14. Med (New York, N.Y.). 2 (3), 263-280 (2021).">Vogels, C. B., et al. SalivaDirect: A simplified and flexible platform to enhance SARS-CoV-2 testing capacity. Med (New York, N.Y.). 2 (3), 263-280 (2021).
  15. Evaluation of Specimen Types and Saliva Stabilization Solutions for SARS-CoV-2 Testing. Journal of Clinical Microbiology. 59 (5), 1418-1420 (2021).">Griesemer, S. B., et al. Evaluation of Specimen Types and Saliva Stabilization Solutions for SARS-CoV-2 Testing. Journal of Clinical Microbiology. 59 (5), 1418-1420 (2021).
  16. Self-collection: An appropriate alternative during the SARS-CoV-2 pandemic. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 128, 104417(2020).">Wehrhahn, M. C., et al. Self-collection: An appropriate alternative during the SARS-CoV-2 pandemic. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 128, 104417(2020).
  17. Use of a simplified sample processing step without RNA extraction for direct SARS-CoV-2 RT-PCR detection. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 132, 104587(2020).">Barza, R., Patel, P., Sabatini, L., Singh, K. Use of a simplified sample processing step without RNA extraction for direct SARS-CoV-2 RT-PCR detection. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 132, 104587(2020).
  18. Assessment of SARS-CoV-2 Screening Strategies to Permit the Safe Reopening of College Campuses in the United States. JAMA Network Open. 3 (7), 2016818(2020).">Paltiel, A. D., Zheng, A., Walensky, R. P. Assessment of SARS-CoV-2 Screening Strategies to Permit the Safe Reopening of College Campuses in the United States. JAMA Network Open. 3 (7), 2016818(2020).
  19. https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html (2020).">Centers for Disease Control. 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Primers and Probes. U.S. Department of Health and Human Services. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html (2020).
  20. Can Robots Improve Testing Capacity for SARS-CoV-2. Journal of Medical Internet Research. 22 (8), 20169(2020).">Cresswell, K., Ramalingam, S., Sheikh, A. Can Robots Improve Testing Capacity for SARS-CoV-2. Journal of Medical Internet Research. 22 (8), 20169(2020).
  21. Implementation of an open-source robotic platform for SARS-CoV-2 testing by real-time RT-PCR. PLoS One. 16 (7), 0252509(2021).">Villanueva-Cañas, J. L., et al. Implementation of an open-source robotic platform for SARS-CoV-2 testing by real-time RT-PCR. PLoS One. 16 (7), 0252509(2021).
  22. https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php (2020).">Robot Boosts COVID-19 Testing Efficiency. University of South Carolina College of Pharmacy. , Available from: https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php (2020).
  23. Practical challenges to the clinical implementation of saliva for SARS-CoV-2 detection. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology. 40 (2), 447-450 (2021).">Matic, N., et al. Practical challenges to the clinical implementation of saliva for SARS-CoV-2 detection. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology. 40 (2), 447-450 (2021).
  24. SalivaSTAT: Direct-PCR and Pooling of Saliva Samples Collected in Healthcare and Community Setting for SARS-CoV-2 Mass Surveillance. Diagnostics. 11 (5), Basel, Switzerland. 904(2021).">Sahajpal, N. S., et al. SalivaSTAT: Direct-PCR and Pooling of Saliva Samples Collected in Healthcare and Community Setting for SARS-CoV-2 Mass Surveillance. Diagnostics. 11 (5), Basel, Switzerland. 904(2021).
  25. Challenges and Opportunities in Implementing Total Laboratory Automation. Clinical Chemistry. 64 (2), 259-264 (2018).">Genzen, J. R., et al. Challenges and Opportunities in Implementing Total Laboratory Automation. Clinical Chemistry. 64 (2), 259-264 (2018).
  26. Clinical Laboratory Automation: A Case Study. Journal of Public Health Research. 6 (1), 881(2017).">Archetti, C., Montanelli, A., Finazzi, D., Caimi, L., Garrafa, E. Clinical Laboratory Automation: A Case Study. Journal of Public Health Research. 6 (1), 881(2017).
  27. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20 (3), 478-485 (1996).">Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20 (3), 478-485 (1996).
  28. Formation of beads-on-a-string structures during break-up of viscoelastic filaments. Nature Physics. 6, 625-631 (2010).">Bhat, P. P., et al. Formation of beads-on-a-string structures during break-up of viscoelastic filaments. Nature Physics. 6, 625-631 (2010).
  29. Current developments in salivary diagnostics. Biomarkers in Medicine. 4 (1), 171-189 (2010).">Miller, C. S., et al. Current developments in salivary diagnostics. Biomarkers in Medicine. 4 (1), 171-189 (2010).
  30. Saliva Sampling and Its Direct Lysis, an Excellent Option To Increase the Number of SARS-CoV-2 Diagnostic Tests in Settings with Supply Shortages. Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 01659(2020).">Moreno-Contreras, J., et al. Saliva Sampling and Its Direct Lysis, an Excellent Option To Increase the Number of SARS-CoV-2 Diagnostic Tests in Settings with Supply Shortages. Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 01659(2020).
  31. Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens. JAMA. 323 (18), 1843-1844 (2020).">Wang, W., et al. Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens. JAMA. 323 (18), 1843-1844 (2020).
  32. Challenges in use of saliva for detection of SARS CoV-2 RNA in symptomatic outpatients. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 130, 104567(2020).">Landry, M. L., Criscuolo, J., Peaper, D. R. Challenges in use of saliva for detection of SARS CoV-2 RNA in symptomatic outpatients. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 130, 104567(2020).
  33. Resilient SARS-CoV-2 diagnostics workflows including viral heat inactivation. PLoS One. 16 (9), 0256813(2021).">Lista, M. J., et al. Resilient SARS-CoV-2 diagnostics workflows including viral heat inactivation. PLoS One. 16 (9), 0256813(2021).
  34. Validation and implementation of a direct RT-qPCR method for rapid screening of SARS-CoV-2 infection by using non-invasive saliva samples. International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of The International Society for Infectious Diseases. 110, 363-370 (2021).">Brotons, P., et al. Validation and implementation of a direct RT-qPCR method for rapid screening of SARS-CoV-2 infection by using non-invasive saliva samples. International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of The International Society for Infectious Diseases. 110, 363-370 (2021).
  35. Heat inactivation of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2. Journal of Biosafety and Biosecurity. 3 (1), 1-3 (2021).">Batéjat, C., Grassin, Q., Manuguerra, J. C., Leclercr, I. Heat inactivation of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2. Journal of Biosafety and Biosecurity. 3 (1), 1-3 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

SARS CoV 2 RT qPCRSaliva DiagnosticsOpen Source Pipetting RobotsLiquid Handling AutomationHeat Treatment SalivaMultiplex RT qPCRCommunity Surveillance TestingThermocycler WorkflowViral RNA DetectionSample Barcode Tracking

Related Articles