Artykuł metodologiczny

Izolacja i multipleksowanie jądra o niskim poziomie wejściowym z przeciwciałami kodowymi zwojów współczulnych myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

DOI:

10.3791/63397

⸱

23 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy & Embryology, Leiden University Medical Center, 2Department of Cardiology, Leiden University Medical Center, 3Department of Medical Statistics and Bioinformatics, Leiden University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje szczegółowe, niskonakładowe przygotowanie próbki do sekwencjonowania pojedynczego jądra, w tym sekcję górnych zwojów szyjnych i gwiaździstych myszy, dysocjację komórek, krioprezerwację, izolację jądra i kodowanie kreskowe hashtagów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autonomiczny układ nerwowy serca jest kluczowy w kontrolowaniu funkcji serca, takich jak tętno i kurczliwość serca, i dzieli się na gałęzie współczulne i przywspółczulne. Zwykle istnieje równowaga między tymi dwiema gałęziami, aby utrzymać homeostazę. Jednak stany chorobowe serca, takie jak zawał mięśnia sercowego, niewydolność serca i nadciśnienie, mogą indukować przebudowę komórek zaangażowanych w unerwienie serca, co wiąże się z niekorzystnym wynikiem klinicznym.

Chociaż istnieje ogromna ilość danych na temat struktury histologicznej i funkcji autonomicznego układu nerwowego serca, jego molekularna architektura biologiczna w zdrowiu i chorobie jest nadal enigmatyczna w wielu aspektach. Nowatorskie technologie, takie jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq), dają nadzieję na genetyczną charakterystykę tkanek w rozdzielczości pojedynczej komórki. Jednak stosunkowo duży rozmiar neuronów może utrudniać standardowe stosowanie tych technik. W tym przypadku protokół ten wykorzystuje sekwencjonowanie jednojądrowego RNA oparte na kropelkach (snRNA-seq), metodę charakteryzowania biologicznej architektury neuronów współczulnych serca w zdrowiu i chorobie. Wykazano podejście krokowe w celu wykonania sekwencji snRNA obustronnych górnych zwojów szyjnych (SCG) i gwiaździstych (StG) wypreparowanych od dorosłych myszy.

Ta metoda umożliwia długoterminową konserwację próbek, utrzymując odpowiednią jakość RNA, gdy próbki od wielu osób/eksperymentów nie mogą być zebrane wszystkie naraz w krótkim okresie czasu. Kodowanie kreskowe jąder za pomocą oligonukleotydów hasztagowych (HTO) umożliwia demultipleksację i śledzenie wstecz odrębnych próbek zwojowych po sekwencjonowaniu. Późniejsze analizy wykazały udane wychwytywanie jąder komórek neuronalnych, gleju satelitarnego i śródbłonka zwojów współczulnych, co zostało potwierdzone za pomocą snRNA-seq. Podsumowując, protokół ten zapewnia stopniowe podejście do sekwencjonowania snRNA współczulnych zewnętrznych zwojów sercowych, metoda, która ma potencjał do szerszego zastosowania w badaniach unerwienia innych narządów i tkanek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autonomiczny układ nerwowy (ANS) jest kluczową częścią obwodowego układu nerwowego, który utrzymuje homeostazę organizmu, w tym adaptację do warunków środowiskowych i patologii1. Bierze udział w regulacji wielu układów narządowych w całym ciele, takich jak układ sercowo-naczyniowy, oddechowy, pokarmowy i hormonalny. ANS jest podzielony na gałęzie współczulne i przywspółczulne. Gałęzie rdzeniowe współczulnego układu nerwowego synapsa w zwojach łańcucha współczulnego, usytuowane obustronnie w pozycji przykręgowej. Obustronne zwoje szyjne i piersiowe, zwłaszcza StG, są ważnymi elementami uczestniczącymi w unerwieniu współczulnym serca. W stanach chorobowych, takich jak niedokrwienie serca, może dojść do przebudowy neuronów, co skutkuje nadbiegiem współczulnym2. Przebudowa neuronów została wykazana w wielu badaniach histologicznych na ludziach i kilku innych gatunkach zwierząt3,4,5,6. Obecnie brakuje szczegółowej charakterystyki biologicznej przebudowy neuronów wywołanej niedokrwieniem serca w zwojach współczulnych serca, a podstawowe cechy biologiczne wyspecjalizowanych typów lub podtypów komórek nerwowych w sercowym współczulnym układzie nerwowym (SNS) nie są jeszcze w pełni określone w zdrowiu i chorobie7.

Nowatorskie technologie, takie jak scRNA-seq, otworzyły bramy do genetycznej charakterystyki małych tkanek na poziomie pojedynczej komórki8,9. Jednak stosunkowo duży rozmiar neuronów może utrudniać optymalne wykorzystanie tych technik jednokomórkowych u ludzi10. Ponadto sekwencjonowanie pojedynczych komórek wymaga dużej przepustowości komórek w celu odzyskania wystarczającej liczby komórek ze względu na duże straty w procesie sekwencjonowania. Może to okazać się wyzwaniem podczas badania małych tkanek, które są trudne do uchwycenia podczas jednej sesji i wymagają wielu próbek, aby wprowadzić wystarczającą liczbę pojedynczych komórek do sekwencjonowania. Niedawno opracowana technologia sekwencyjna snRNA-seq oparta na kropelkach (tj. platforma 10x Chromium) pozwala na badanie różnic biologicznych między pojedynczymi jądrami11,12. snRNA-seq ma przewagę nad scRNA-seq dla dużych komórek (>30 μm), które mogą nie zostać wychwycone w Gel Bead in Emulsions (GEMs), a także lepszą kompatybilność z rozległą dysocjacją i/lub przedłużoną konserwacją13,14,15.

Heterogeniczność, liczba komórek neuronalnych i innych komórek wzbogaconych w SNS serca są ważnymi aspektami dla charakterystyki ANS w stanach zdrowia i choroby. Ponadto unerwienie specyficzne dla narządu lub regionu przez każdy zwój współczulny przyczynia się do złożoności SNS. Ponadto wykazano, że zwoje szyjne, gwiaździste i piersiowe łańcucha współczulnego unerwiają różne obszary serca16. W związku z tym konieczne jest wykonanie analizy jednojądrowej komórek zwojowych pochodzących z pojedynczych zwojów w celu zbadania ich architektury biologicznej.

Sekwencja snRNA oparta na kropelkach umożliwia profilowanie ekspresji w całym transkryptomie dla puli tysięcy komórek z wielu próbek naraz przy niższych kosztach niż platformy sekwencjonowania na płytkach. Podejście to sprawia, że sekwencjonowanie snRNA oparte na kropelkach jest bardziej odpowiednie do klasyfikacji fenotypów komórkowych i identyfikacji nowej subpopulacji komórek w obrębie SCG i StG. Warto zauważyć, że protokół ten zapewnia zwięzłe, krokowe podejście do identyfikacji, izolacji i sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra współczulnych zewnętrznych zwojów serca, metody, która ma potencjał do szerokiego zastosowania w badaniach nad charakterystyką zwojów unerwiających inne powiązane narządy i tkanki w zdrowie i choroba.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje wszystkie kroki wymagane do sekwencji snRNA mysich zwojów szyjnych i/lub szyjno-piersiowych (gwiaździstych). Wykorzystano samice i samce myszy C57BL/6J (w wieku 15 tygodni, n = 2 dla każdej płci). Jeden dodatkowy Wnt1-Cre; Mysz mT/mG została użyta do wizualizacji zwojów w celu sekcji17,18. Ta dodatkowa mysz została wygenerowana przez krzyżowanie B6. Mysz Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J i mysz B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych opublikowanym przez NIH i zatwierdzonym przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu w Lejdzie (numer licencji AVD1160020185325, Lejda, Holandia). Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, sprzętu, oprogramowania i zwierząt użytych w protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowania

UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w komorze przepływu kultur komórkowych.

  1. Wyczyść kleszcze i nożyczki, zanurzając narzędzia w 70% etanolu na 20 minut.
  2. Przygotuj pożywkę zwojową składającą się z pożywki neurobazalnej uzupełnionej witaminą B-27 plus (1x), L-glutaminą (2 mM) i 1% antybiotykiem-antybiotykiem. Podgrzej pożywkę ganglinową w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotuj roztwór wytrawiający: 0,25% trypsyny-EDTA (1:1) i 1,400 U/ml kolagenazy typu 2 rozpuszczonych w pożywce ganglionowej.
  4. Przygotować świeży, zimny (4 °C) bufor do przemywania komórek (0,4% albuminy surowicy bydlęcej [BSA]) i bufor do lizy (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 i 0,1% detergentu niejonowego, 40 U/ml RNAzy w wodzie wolnej od nukleaz) do izolacji jądra.
  5. Przygotować bufor do przemywania jądra (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami [PBS] z 2,0% BSA i 0,2U/μL inhibitorem RNazy).
  6. Przygotować bufor do barwienia ST (ST-SB) (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 2% BSA, 0,02% Tween-20 w wodzie wolnej od nukleaz).

2. Analiza górnych zwojów szyjnych dorosłej myszy (SCG)

  1. Poddaj myszy eutanazji i trzymaj je na lodzie.
    UWAGA: W obecnym badaniu łącznie 4 myszy C57BL6 / J zostały uśpione przez uduszenie CO2. Alternatywnie można zastosować izofluran, a następnie wykrwawienie, gdy konieczne jest pobranie dużej ilości krwi do innych celów badawczych.
  2. Przymocuj mysz do deski preparacyjnej za pomocą szpilek i oblej ją 70% etanolem, aby zminimalizować rozproszenie futra (golenie nie jest konieczne).
  3. Pod mikroskopem stereoskopowym otwórz skórę okolicy szyi, wykonując nożyczkami cięcie linii środkowej, odsuń gruczoły podżuchwowe na bok i usuń mięsień mostkowo-sutkowy, aby odsłonić i zlokalizować wspólną tętnicę szyjną i jej rozwidlenie (Rysunek 1A, B, patrz strzałka).
  4. Wypreparuj rozwidlenie prawej i lewej tętnicy szyjnej oraz przyczepioną do niej tkankę. Przenieś każdy wypreparowany fragment tkanki na oddzielną szalkę Petriego o średnicy 3,5 cm, zawierającą zimny PBS.
  5. Poszukaj SCG przyczepionego do rozwidlenia tętnicy szyjnej. Oczyść SCG dalej, usuwając tętnicę i inną przyczepioną tkankę na szalce Petriego (Rysunek 1E).

3. Sekcja zwojów gwiaździstych dorosłej myszy (StG)

  1. Aby wypreparować StG, wykonaj nacięcie w linii środkowej brzucha, a następnie otwórz przeponę i brzuszną ścianę klatki piersiowej.
  2. Usuń serce i płuca, aby odsłonić grzbietową klatkę piersiową. Poszukaj lewego i prawego StG przednio-bocznego do mięśnia długiego wzgórka (MCL) na poziomie pierwszego żebra (Rysunek 1C, D, oznaczony liniami przerywanymi).
  3. Rozetnij zarówno lewy, jak i prawy StG za pomocą kleszczy i oddzielnie przenieś je na 3,5 cm szalki Petriego zawierające zimny PBS (Rysunek 1F).

4. Izolacja i kriokonserwacja mysich komórek zwojowych

Kroki 4-6 są podsumowane w Rysunek 2.

  1. Ostrożnie przenieś wszystkie pojedyncze SCG i StG do oddzielnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml za pomocą kleszczy.
    UWAGA: Nie używaj końcówek do pipet do przenoszenia zwojów nerwowych, ponieważ zwoje mają skłonność do przylegania do ścianek plastikowych końcówek pipet.
  2. Dodać 500 μl 0,25% roztworu trypsyny-EDTA do każdej probówki mikrowirówki i inkubować w wytrząsającej łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 40 min.
    UWAGA: Ten etap ma na celu ułatwienie trawienia i uwalniania komórek w roztworze kolagenazy typu 2.
  3. Przygotować probówkę o pojemności 15 ml zawierającą 5 ml pożywki ganglinowej dla każdej próbki. Pozwól, aby zwoje osiadały się na dnie probówek do mikrowirówek. Zebrać supernatant, który zawiera bardzo mało komórek zwojowych, przenieść supernatant do przygotowanych probówek o pojemności 15 ml i oznaczyć każdą probówkę. Alternatywnie, aby zaoszczędzić trochę czasu, odessać supernatant trypsyny-EDTA bez zbierania, ponieważ można w nim wykryć bardzo niewiele zdysocjowanych komórek.
    UWAGA: Niewielką ilość roztworu trypsyny-EDTA (~10-30 μL) można pozostawić w probówce mikrowirówki, aby uniknąć usunięcia zwojów. Na tym etapie należy unikać pipetowania, ponieważ może to spowodować uszkodzenie zwojów nerwowych i doprowadzić do obniżenia wydajności komórek zwojowych.
  4. Dodać 500 μl roztworu kolagenazy typu 2 do każdej probówki mikrowirówki i inkubować w wytrząsającej łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 35-40 minut. Spróbować zawiesić ganglion po 35 minutach; jeśli ganglion jest nadal nienaruszony i nie ulega dysocjacji, należy przedłużyć czas inkubacji lub zwiększyć stężenie roztworu kolagenazy typu 2, jeśli to konieczne.
    UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od wielkości ganglionu.
  5. Ponownie zawiesić zwoje w roztworze kolagenazy, pipetując w górę iw dół ~10 razy lub do momentu, gdy grudki tkanek przestaną być wykrywane.
  6. Przenieść zawiesinę komórek do poprzednio używanej probówki o pojemności 15 ml, która zawiera pożywkę do hodowli zwojów nerwowych i zawiesinę trypsyny-EDTA z tego samego zwoju. Wirować zawiesinę komórek za pomocą wirówki z wirnikiem kubełkowym przez 10 minut, 300 × g w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić supernatant komórki.
    UWAGA: Ponieważ komórki zwojowe są oddzielone od pojedynczego zwoju, osad komórki może być zbyt mały, aby można go było wykryć gołym okiem; Niewielką ilość supernatantu można pozostawić w probówce, aby uniknąć przypadkowego usunięcia osadu komórkowego.
  7. Ponownie zawiesić komórki zwojowe w 270 μl płodowej surowicy bydlęcej (FBS, niska endotoksyna) i przenieść każdą zawiesinę FBS komórki do kriowialu o pojemności 1 ml.
  8. Aby policzyć komórki, zmieszaj 5 μl zawiesiny komórek zwojowych z 5 μl 0,4% barwnika błękitu trypanowego i załaduj mieszaninę do hemocytometru. Policz całkowitą liczbę komórek i liczbę żywych komórek pod mikroskopem.
    UWAGA: Żywotność komórek (liczba żywych komórek/całkowita liczba komórek = żywotność%) wynosi zwykle powyżej 90% w tym protokole dysocjacji. Liczba żywych komórek w pojedynczym ganglionie (SCG lub StG) zwykle mieści się w zakresie 9 000-60 000 komórek, gdy ganglion jest izolowany od myszy w wieku od 12 do 16 tygodni.
  9. Dodać 30 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do każdej zawiesiny FBS w kriowialach, dobrze wymieszać i przenieść kriowiale do pojemnika do zamrażania komórek, który jest przechowywany w temperaturze pokojowej. Pojemnik z ładunkiem kriowialnym należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez noc, a następnego dnia przenieść kriowialne do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania przed sekwencjonowaniem.

5. Izolacja jądra

UWAGA: Lewy i prawy SCG wyizolowany z czterech myszy (w sumie 8 próbek) zostały użyte jako przykład w poniższym przygotowaniu do izolacji jądra i sekwencjonowania. Trzymaj wszystko na lodzie podczas całej procedury. Ze względu na niewidoczność małych osadów jądrowych, zdecydowanie zaleca się wirówkę z wahadłowymi wiadrami, aby ułatwić usuwanie supernatantu podczas całej procedury.

  1. Przygotować probówki o pojemności 15 ml z sitkiem (30 μm) na wierzchu i wstępnie przepłukać sitko 1 ml pożywki ganglionowej.
  2. Wyjąć kriowiale z ciekłego azotu i natychmiast rozmrozić je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Gdy w kriowiale pozostanie niewielka osadka lodu, wyjmij kriowiale z łaźni wodnej.
  3. Odzyskaj komórki zwojowe, wrzucając 1 ml pożywki zwojowej do każdego kriowialu, ostrożnie potrząsając ręką. Opcjonalnie: Aby ocenić regenerację komórek, wymieszaj zawiesinę komórek po odzyskaniu i wyjmij 5 μl zawiesiny komórek w celu zliczenia żywych komórek, jak opisano w kroku 4.8.
  4. Załadować każdą zawiesinę komórek zwojowych na osobne sitko (przygotowane w kroku 5.1) i przepłukać każde sitko 4-5 ml pożywki ganglionowej.
  5. Odwirować odcedzoną zawiesinę komórek przez 5 minut w temperaturze 300 × g, ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 μl buforu do przemywania komórek.
  6. Przenieś zawiesinę komórkową do nisko wiążącej probówki mikrowirówkowej DNA/RNA o pojemności 0,5 ml.
  7. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Usunąć 45 μl supernatantu, nie dotykając dna probówki, aby uniknąć przemieszczenia się osadu komórkowego.
  9. Dodaj 45 μl schłodzonego buforu do lizy i delikatnie pipetuj w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl.
  10. Inkubować komórki przez 8 minut na lodzie.
  11. Do każdej probówki dodać 50 μl zimnego buforu do przemywania jąder. Nie mieszać.
  12. Odwirować zawiesinę jądra w temperaturze 600 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  13. Usunąć 95 μl supernatantu bez naruszania osadu jądrowego.
  14. Dodać 45 μl schłodzonego buforu do przemywania jądra do osadu. Opcjonalnie: Weź 5 μl zawiesiny jądra, wymieszaj z 5 μl 0,4% błękitu trypanowego, aby policzyć i sprawdź jakość jąder pod mikroskopem za pomocą hemocytometru.
  15. Odwirować zawiesinę jądra w temperaturze 600 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  16. Usunąć supernatant bez dotykania dna probówki, aby uniknąć przemieszczenia się osadu jądra.

6. Kodowanie kreskowe jądra z hashtagiem oligos (HTOs) i multipleksowanie

UWAGA: Etapy barwienia HTO zostały zmodyfikowane i zoptymalizowane pod kątem znakowania jądrowego bardzo małych ilości jąder (zwojowych) zgodnie z poprzednim zastosowaniem w tkance korowej przez Gaublomme et al.15.

  1. Dodać 50 μl buforu ST-SB do osadu jądra, delikatnie pipetować 8-10 razy, aż jądra zostaną całkowicie zawieszone.
  2. Dodać 5 μl odczynnika blokującego Fc na 50 μl mieszanki ST-SB/jądra i inkubować przez 10 minut na lodzie.
  3. Dodać 1 μl (0,5 μg) jednojądrowego przeciwciała hashtag na probówkę mieszanki ST-SB/jądra i inkubować przez 30 minut na lodzie.
    UWAGA: Krótszy czas inkubacji prowadzi do mniejszej skuteczności etykietowania hashtagów, jak wykazano w reprezentatywnych wynikach.
  4. Dodać 100 μl ST-SB do każdej probówki. Nie mieszać.
  5. Odwirować zawiesinę jądra przez 5 minut, 600 × g w temperaturze 4 °C.
  6. Usunąć 145 μl supernatantu bez naruszania osadu jądrowego.
  7. Powtórz kroki 6.4 i 6.5. Usunąć supernatant tak bardzo, jak to możliwe, nie dotykając dna probówki, aby uniknąć przemieszczenia się osadu jądra komórkowego.
  8. Zawiesić osad jądra w 50 μl ST-SB i delikatnie wymieszać jądra.
  9. Weź 5 μl zawiesiny jądra i wymieszaj ją z 5 μl 0,4% błękitu trypanowego, aby policzyć jądra pod mikroskopem. Zobacz Rysunek 3A dla reprezentatywnego obrazu jąder zmieszanych z błękitem trypanowym i załadowanych do hemocytometru.
  10. Odwirować zawiesinę jądra przez 5 minut w temperaturze 600 × g w temperaturze 4 °C.
  11. Zawiesić jądra w ST-SB, aby osiągnąć docelowe stężenie jądra 1 000-3 000 jąder / μl dla każdej próbki zgodnie z odpowiednią liczbą jąder.
  12. Zebrać próbki, aby uzyskać żądaną liczbę komórek.
    UWAGA: Na przykład w tym eksperymencie 8 próbek zostało równo połączonych, aby uzyskać łącznie 25 000 jąder, aby natychmiast przejść do 10x Genomics Chromium i snRNA-seq. Liczba jąder zwykle mieści się w zakresie 6 000-40 000 komórek, gdy ganglion jest izolowany od myszy w wieku od 12 do 16 tygodni. Tylko około połowa całkowitych załadowanych jąder może zostać przechwycona przez sekwencję snRNA opartą na kropelkach. Na przykład przygotowano mieszaninę 25 000 jąder, aby zapewnić wychwycenie 10 000 jąder, które są potrzebne do dalszego przygotowania biblioteki i sekwencjonowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza kontroli jakości przygotowania biblioteki jednojądrowego cDNA i sekwencjonowania snRNA
Reprezentatywne wyniki opisują wyniki sekwencjonowania 10 000 przechwyconych jąder w jednej puli z biblioteką ekspresji genów 25 000 odczytów/jądro i biblioteką hashtagów 5 000 odczytów/jądro. Rysunek 3B ilustruje wyniki kontroli jakości 1nici cDNA, biblioteki ekspresji genów (GEX) i biblioteki HTO, które zostały sprawdzone za pomocą Bioanalyzera. Oczekuje się, że cD...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisano szczegółowy protokół, który koncentruje się na i) rozbiorze górnych zwojów współczulnych szyjki macicy i gwiaździstej myszy, ii) izolacji i kriokonserwacji komórek zwojowych, iii) izolacji jądra oraz iv) kodowaniu jądra za pomocą znakowania HTO w celu multipleksowania i sekwencjonowania snRNA.

Dzięki temu protokołowi współczulne komórki zwojowe można łatwo uzyskać poprzez dysocjację poszczególnych zwojów za pomocą powszechnie stosowanej trypsyny i kolagenazy. Długotrwałe ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Susan L. Kloet (Department of Human Genetics, LUMC, Leiden, Holandia) za pomoc w projektowaniu eksperymentów i użyteczne dyskusje. Dziękujemy Emile'owi J. de Meijerowi (Zakład Genetyki Człowieka, LUMC, Lejda, Holandia) za pomoc w izolacji jednojądrowego RNA i przygotowaniu biblioteki do sekwencjonowania. Prace te są wspierane przez Holenderską Organizację Badań Naukowych (NWO) [016.196.346 do M.R.M.J.].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemikalia i odczynniki
0,25% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200056
0,4% barwnik błękit trypanowyBio-Rad1450021
Antybiotyk-Antybiotyk PrzeciwgrzybiczyGibco15240096
B-27GibcoA3582801
Kolagenaza typ 2WorthingtonLS004176użyć 1,400 U/ml
DimetylosulfotlenkuSigma Aldrich67685
≥ 99,5%VWRVWRC83813.360
Płodowa surowica bydlęca (niska endotoksyna)BiowestS1810-500
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030024
Neurobasal MediumGibco21103049
Albumina surowicy bydlęcej 10%Sigma-AldrichA1595-50MLBufor do płukania komórek
DPBS (Ca2+, Mg2+free)Gibco14190-169Bufor do płukania komórek
Roztwór chlorku magnezu, 1 MSigma-AldrichM1028Bufor do lizy jądra
Substytut Nonidet P40 (detergent niejonowy)Sigma-Aldrich74385Bufor do lizy jądra
Woda wolna od nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC)InvitrogenAM9937Bufor
do lizy jądraInhibitor RNazy ochronnej, 40 U/&mikro; LSigma-Aldrich3335399001Bufor do lizy jądra
Roztwór chlorku sodu, 5 MSigma-Aldrich59222CBufor do lizy jądra
Roztwór chlorowodorku Trizma, 1 M, pH 7,4Sigma-AldrichT2194Bufor do lizy jądra
Albumina surowicy bydlęcej 10%Sigma-AldrichA1595-50MLMycie
jądra DPBS (Ca2+, Mg< sup>2+free)Gibco14190-169Nucleus wash
Protector Inhibitor RNazy,40 U/µ LSigma-Aldrich3335399001Nucleus
wash Albumina surowicy bydlęcej 10%Sigma-AldrichA1595-50MLST bufor barwiący (ST-SB)
Roztwór chlorku wapnia, 1 MSigma-Aldrich21115-100MLST bufor barwiący (ST-SB)
Roztwór chlorku magnezu, 1 MSigma-AldrichM1028ST bufor barwiący (ST-SB)
Woda wolna od nukleaz (nie DEPC leczony)InvitrogenAM9937ST bufor barwiący (ST-SB)
Roztwór chlorku sodu, 5MSigma-Aldrich59222CST bufor barwiący ST (ST-SB)
Roztwór chlorowodorku trizma, 1M, pH 7,4Sigma-AldrichT2194ST bufor barwiący (ST-SB)
Tween-20Merck Millipore822184bufor do barwienia ST (ST-SB)
TotalSeq-A0451 przeciwciała antyjądrowe z kompleksem porów Hashtag 1 PrzeciwciałoBiolegend682205Hashtag
TotalSeq-A0452 przeciwciało antyjądrowe białka kompleksu porów Hashtag 2 PrzeciwciałoBiolegend682207Hashtag
TotalSeq-A0453 Białka przeciwjądrowe Hashtag 3 PrzeciwciałoBiolegend682209Przeciwciało Hashtag
TotalSeq-A0461 Przeciwciało antyjądrowe Białka kompleksu porów Hashtag 11 PrzeciwciałoBiolegend682225Hashtag
TotalSeq-A0462 Przeciwciało przeciwjądrowe Białka kompleksu porów Hashtag 12 PrzeciwciałoBiolegend682227Hashtag
TotalSeq-A0463 Białka przeciwjądrowe Białko kompleksu porów Hashtag 13 PrzeciwciałoBiolegend682229Przeciwciało Hashtag
TotalSeq-A0464 Przeciwciało przeciwjądrowe Białka z kompleksem porów Hashtag 14 PrzeciwciałoBiolegend682231Hashtag
TotalSeq-A0465 Przeciwciało przeciwjądrowe Białka z kompleksem porów Hashtag 15 PrzeciwciałoBiolegend682233Hashtag
TruStain FcX (człowiek)Biolegend422302Roztwór blokujący receptor FC
Sprzęt i materiały eksploatacyjne
Jasna linia  HemacytometrMerckZ359629-1EA
Wirówka 5702/R A-4-38Eppendorf 
Pojemnik do zamrażania komórek CoolCell LXCorningCLS432003-1EA
CryovialThermo Scientific479-6840
DNA LoBind 0,5 ml probówka EppendorfEP0030108035-250EA
Probówki Eppendorf Safe-Lock 1,5 mlEppendorf30121872
Falcon 35 mm Bez powłoki TC szalka PetriegoCorning
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 mlFisher scientific10773501
Kleszcze Dumont #5Narzędzia do nauki11252-40
Hartowane drobne nożyczkiNarzędzia do nauki precyzyjnej14091-09
  Patelnia do lodu, prostokątna 4 L PomarańczowyCorningCLS432106-1EA
Leica MS5MikroskopLeica
Nożyczki Moria MC50Narzędzia do nauki precyzyjnej15370-50
Nożyczki sprężynowe NoyesNarzędzia do nauki precyzyjnej15012-12
Olympus CK2 ULWCDMikroskop Olympus
P10GilsonF144802
P1000GilsonF123602
P200GilsonF123601
Filtry do wstępnej separacji (30 &mikro; m)Miltenyi biotecMiltenyi biotec130-041-407
Wytrząsająca łaźnia wodnaGFL1083
Płyta silikonowaRubberBV3530Deska prosektoryjna
Oprogramowanie i pakiety
Cell rangerV4.0.0
Programowanie RV4.1.1
R sudioV1.3.1073
SeuratV4.0
tydiverseV1.3.1
Animals
B6. Mysz Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/JKolba Jackson Laboratory JAX #022501
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Mysz Luo/JKolbaJackson Laboratory JAX #007576
C57BL/6J myszyCharles River
Code do analizy danych
Absolut etanolu EP022629905351008 precyzyjnej https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McCorry, L. K. Physiology of the autonomic nervous system. American Journal of Pharmaceutical Education. 71 (4), 78(2007).
  2. Li, C. -Y., Li, Y. -G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Cardiology Research and Practice. 2015, 698368(2015).
  3. Ajijola, O. A., et al. Extracardiac neural remodeling in humans with cardiomyopathy. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 5 (5), 1010(2012).
  4. Nguyen, B. L., et al. Acute myocardial infarction induces bilateral stellate ganglia neural remodeling in rabbits. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 143-148 (2012).
  5. Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
  6. Han, S., et al. Electroanatomic remodeling of the left stellate ganglion after myocardial infarction. Journals of the American College of Cardiology. 59 (10), 954-961 (2012).
  7. Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
  8. Svensson, V., Vento-Tormo, R., Teichmann, S. A. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade. Nature Protocols. 13 (4), 599-604 (2018).
  9. Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967(2016).
  10. Kokubun, S., et al. Distribution of TRPV1 and TRPV2 in the human stellate ganglion and spinal cord. Neuroscience Letters. 590, 6-11 (2015).
  11. Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communication. 10 (1), 2832(2019).
  12. Petrany, M. J., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers. Nature Communication. 11 (1), 6374(2020).
  13. Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
  14. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648(2018).
  15. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).
  16. Zandstra, T. E., et al. Asymmetry and heterogeneity: part and parcel in cardiac autonomic innervation and function. Frontiers in Physiology. 12, 665298(2021).
  17. Lewis, A. E., Vasudevan, H. N., O'Neill, A. K., Soriano, P., Bush, J. O. The widely used Wnt1-Cre transgene causes developmental phenotypes by ectopic activation of Wnt signaling. Developmental Biology. 379 (2), 229-234 (2013).
  18. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  19. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. bioRxiv. , (2018).
  20. Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891(2020).
  21. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224(2018).
  22. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 11022(2016).
  23. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031(2017).
  24. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Single Nucleus RNA SequencingNucleus IsolationBarcoded AntibodiesMouse Sympathetic GangliaCardiac Autonomic Nervous SystemHashtag OligosMultiplexed SequencingGanglia DissectionNeuronal Cell ClustersSample Preservation

Powiązane artykuły