Proces eksperymentowania i analizy danych dla nanotwardości miękkiej materii

Summary

Protokół przedstawia kompletny przebieg eksperymentów z nanoindentacją miękkiego materiału, w tym hydrożeli i komórek. Po pierwsze, szczegółowo opisano etapy eksperymentalne mające na celu pozyskanie danych ze spektroskopii sił; następnie analiza takich danych jest szczegółowo opisana za pomocą nowo opracowanego oprogramowania Python o otwartym kodzie źródłowym, które można pobrać bezpłatnie z GitHub.

Abstract

Nanoindentation odnosi się do klasy technik eksperymentalnych, w których mikrometryczna sonda siły jest używana do ilościowego określania lokalnych właściwości mechanicznych miękkich biomateriałów i komórek. Podejście to zyskało centralną rolę w dziedzinie mechanobiologii, projektowania biomateriałów i inżynierii tkankowej, w celu uzyskania właściwej charakterystyki mechanicznej materiałów miękkich z rozdzielczością porównywalną do wielkości pojedynczych komórek (μm). Najpopularniejszą strategią pozyskiwania takich danych eksperymentalnych jest użycie mikroskopu sił atomowych (AFM); Chociaż instrument ten oferuje bezprecedensową rozdzielczość w mocy (do pN) i przestrzeni (sub-nm), jego użyteczność jest często ograniczona przez jego złożoność, która uniemożliwia rutynowe pomiary całkowych wskaźników właściwości mechanicznych, takich jak moduł Younga (E). Nowa generacja nanoindenterów, takich jak te oparte na technologii wykrywania światłowodów, zyskała ostatnio popularność ze względu na łatwość integracji, a jednocześnie umożliwia przyłożenie sił sub-nN z rozdzielczością przestrzenną μm, dzięki czemu nadaje się do badania lokalnych właściwości mechanicznych hydrożeli i komórek.

W tym protokole przedstawiono przewodnik krok po kroku szczegółowo opisujący procedurę eksperymentalną pozyskiwania danych o nanowgłębieniach na hydrożelach i komórkach za pomocą dostępnego na rynku nanoindentera światłowodowego wykrywającego światłowód. Podczas gdy niektóre kroki są specyficzne dla instrumentu użytego w niniejszym dokumencie, proponowany protokół może być traktowany jako przewodnik dla innych urządzeń do nanotwardości, pod warunkiem, że niektóre kroki są dostosowane zgodnie z wytycznymi producenta. Ponadto zaprezentowano nowe oprogramowanie Python o otwartym kodzie źródłowym, wyposażone w przyjazny dla użytkownika graficzny interfejs użytkownika do analizy danych dotyczących nanotwardości, które pozwala na przesiewanie nieprawidłowo uzyskanych krzywych, filtrowanie danych, obliczanie punktu kontaktowego za pomocą różnych procedur numerycznych, konwencjonalne obliczanie E, a także bardziej zaawansowaną analizę, szczególnie odpowiednią dla danych dotyczących nanotwardości pojedynczych komórek.

Introduction

Fundamentalna rola mechaniki w biologii jest obecnie ustalona^1,2. Od całych tkanek po pojedyncze komórki, właściwości mechaniczne mogą informować o stanie patofizjologicznym badanego biomateriału^3,4. Na przykład tkanka piersi dotknięta rakiem jest sztywniejsza niż zdrowa tkanka, co jest podstawą popularnego testu palpacyjnego⁵. Warto zauważyć, że niedawno wykazano, że choroba koronawirusowa 2019 (COVID-19) wywoływana przez koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) jest podkreślona zmianami we w....

Protocol

1. Przygotowanie substratów/komórek do pomiarów nanotwardości

1. Postępuj zgodnie z krokami podanymi w Protokole Uzupełniającym w celu przygotowania hydrożeli/komórek PAAm do eksperymentów z nanowgłębieniami. Procedura jest podsumowana w Rysunek 2.
   UWAGA: Hydrożele PAAm zostały wybrane, ponieważ są to najczęściej stosowane hydrożele w dziedzinie mechanobiologii. Protokół ten ma jednak zastosowanie w równym stopniu do każdego typu hydrożelu²⁵ (patrz Dyskusja, modyfikacje metody).

2. Uruchamianie urządzenia, wybó....

Results

Zgodnie z protokołem, otrzymuje się zestaw krzywych F-z. Zestaw danych najprawdopodobniej będzie zawierał dobre krzywe oraz krzywe, które należy odrzucić przed kontynuowaniem analizy. Ogólnie rzecz biorąc, krzywe powinny być odrzucane, jeśli ich kształt różni się od pokazanego na Rysunek 4A. Rysunek 5AI pokazuje zestaw danych ~100 krzywych uzyskanych na miękkim hydrożelu PAAm o oczekiwanym E 0,8 KPa³⁵ przesłany do GUI NanoPrepare........

Discussion

Protokół ten pokazuje, jak niezawodnie pozyskiwać dane ze spektroskopii sił za pomocą dostępnego na rynku nanoindentera z wierzchołkiem ferruli, zarówno na hydrożelach, jak i pojedynczych komórkach. Ponadto zamieszczono instrukcje dotyczące korzystania z oprogramowania typu open source zaprogramowanego w języku Python, obejmującego precyzyjny przepływ pracy do analizy danych nanotwardości.

Krytyczne kroki w protokole
Następujące kroki zostały uznane za szczególnie ważne p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szkiełka nakrywkowe 12 mm	VWR	631-1577P
35 mm naczynia hodowlane poddane działaniu komórek	Greiner CELLSTAR	627160
Akrylamid	Sigma-Aldrich	A4058
Akrylsilan	Alfa Aesar	L16400
Nadsiarczan amonu	Merk	7727-54-0
Bisakryloamid	Merk	110-26-9
Chiaro nanoindenter	Optyka 11 Życie		brak numeru katologicznego
Etanol			ogólny
Surowica płodowa bydlęca	Gibco	16140071
Wysoka glukoza DMEM	Gibco	11995065
Isopropanol			ogólny
Kimwipe	Kimberly Clark	21905-026
Szkiełka mikroskopowe	VWR	631-1550P
System MilliQ	Merk Millipore	ZR0Q008WW
OP1550 Interferometr	Optyka11 Życiorys		nr katalogowy
Optyka 11 Życiowa sonda (k = 0,02-0,005 N/m, R = 3-3,5 um)	Układ optyczny 11 Żywotność		brak liczby katatologicznej
Optyka 11 Sonda żywotności (k = 0,46-0,5 N/m, R = 50-55 um)	Optyka 11 Życie		brak liczby katologicznej
Penicylina/Streptomycyna	Gibco	15140122
Odstraszacz deszczu RainX		RainX 26012
Standardowe szalki Petriego (90 mm)	Thermo Scientific	101RTIRR
Tetrametyloetylenodiamina	Sigma-Aldrich	110-18-9
Eksykator próżniowy	Thermo Scientific	531-0250
strong>Software
Oprogramowanie do akwizycji danych (wersja 3.4.1)	Optyka 11 Life
GitHub Desktop (opcjonalnie)	Microsoft
Python 3	Python Software Foundation
Visual Studio Code (opcjonalnie)	Microsoft