Proces eksperymentowania i analizy danych dla nanotwardości miękkiej materii

Summary

Protokół przedstawia kompletny przebieg eksperymentów z nanoindentacją miękkiego materiału, w tym hydrożeli i komórek. Po pierwsze, szczegółowo opisano etapy eksperymentalne mające na celu pozyskanie danych ze spektroskopii sił; następnie analiza takich danych jest szczegółowo opisana za pomocą nowo opracowanego oprogramowania Python o otwartym kodzie źródłowym, które można pobrać bezpłatnie z GitHub.

Abstract

Nanoindentation odnosi się do klasy technik eksperymentalnych, w których mikrometryczna sonda siły jest używana do ilościowego określania lokalnych właściwości mechanicznych miękkich biomateriałów i komórek. Podejście to zyskało centralną rolę w dziedzinie mechanobiologii, projektowania biomateriałów i inżynierii tkankowej, w celu uzyskania właściwej charakterystyki mechanicznej materiałów miękkich z rozdzielczością porównywalną do wielkości pojedynczych komórek (μm). Najpopularniejszą strategią pozyskiwania takich danych eksperymentalnych jest użycie mikroskopu sił atomowych (AFM); Chociaż instrument ten oferuje bezprecedensową rozdzielczość w mocy (do pN) i przestrzeni (sub-nm), jego użyteczność jest często ograniczona przez jego złożoność, która uniemożliwia rutynowe pomiary całkowych wskaźników właściwości mechanicznych, takich jak moduł Younga (E). Nowa generacja nanoindenterów, takich jak te oparte na technologii wykrywania światłowodów, zyskała ostatnio popularność ze względu na łatwość integracji, a jednocześnie umożliwia przyłożenie sił sub-nN z rozdzielczością przestrzenną μm, dzięki czemu nadaje się do badania lokalnych właściwości mechanicznych hydrożeli i komórek.

W tym protokole przedstawiono przewodnik krok po kroku szczegółowo opisujący procedurę eksperymentalną pozyskiwania danych o nanowgłębieniach na hydrożelach i komórkach za pomocą dostępnego na rynku nanoindentera światłowodowego wykrywającego światłowód. Podczas gdy niektóre kroki są specyficzne dla instrumentu użytego w niniejszym dokumencie, proponowany protokół może być traktowany jako przewodnik dla innych urządzeń do nanotwardości, pod warunkiem, że niektóre kroki są dostosowane zgodnie z wytycznymi producenta. Ponadto zaprezentowano nowe oprogramowanie Python o otwartym kodzie źródłowym, wyposażone w przyjazny dla użytkownika graficzny interfejs użytkownika do analizy danych dotyczących nanotwardości, które pozwala na przesiewanie nieprawidłowo uzyskanych krzywych, filtrowanie danych, obliczanie punktu kontaktowego za pomocą różnych procedur numerycznych, konwencjonalne obliczanie E, a także bardziej zaawansowaną analizę, szczególnie odpowiednią dla danych dotyczących nanotwardości pojedynczych komórek.

Introduction

Fundamentalna rola mechaniki w biologii jest obecnie ustalona^1,2. Od całych tkanek po pojedyncze komórki, właściwości mechaniczne mogą informować o stanie patofizjologicznym badanego biomateriału^3,4. Na przykład tkanka piersi dotknięta rakiem jest sztywniejsza niż zdrowa tkanka, co jest podstawą popularnego testu palpacyjnego⁵. Warto zauważyć, że niedawno wykazano, że choroba koronawirusowa 2019 (COVID-19) wywoływana przez koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) jest podkreślona zmianami we właściwościach mechanicznych komórek krwi, w tym zmniejszoną odkształcalnością erytrocytów oraz zmniejszoną sztywnością limfocytów i neutrofili w porównaniu z komórkami krwi osób niezakażonych wcześniej SARS-CoV-2⁶.

Ogólnie rzecz biorąc, mechanika komórek i tkanek jest ze sobą nierozerwalnie związana: każda tkanka ma specyficzne właściwości mechaniczne, które jednocześnie wpływają i zależą od właściwości komórek składowych i macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)⁵. Z tego powodu strategie badania mechaniki w biologii często obejmują inżynierię substratów z fizjologicznie istotnymi bodźcami mechanicznymi, aby wyjaśnić zachowanie komórki w odpowiedzi na te bodźce. Na przykład przełomowa praca Englera i współpracowników wykazała, że zaangażowanie mezenchymalnych komórek macierzystych w linię jest kontrolowane przez elastyczność matrycy, jak badano na miękkich i sztywnych dwuwymiarowych hydrożelach poliakrylamidowych (PAAm)⁷.

Istnieje wiele strategii mechanicznego charakteryzowania badanego biomateriału, różniących się skalą przestrzenną (tj. od lokalnej do masowej) i sposobem deformacji (np. osiowe vs ścinające), w konsekwencji dając różne informacje, które wymagają starannej interpretacji^3,8,9,10. Mechanika miękkich biomateriałów jest powszechnie wyrażana w kategoriach sztywności. Jednak sztywność zależy zarówno od właściwości materiału, jak i geometrii, podczas gdy moduły sprężystości są podstawowymi właściwościami materiału i są niezależne od geometrii materiału¹¹. W związku z tym różne moduły sprężystości są związane ze sztywnością danej próbki, a każdy moduł sprężystości obejmuje odporność materiału na określony tryb odkształcenia (np. osiowy lub ścinający) w różnych warunkach brzegowych (np. swobodne rozszerzanie a uwięzienie)^11,12. Eksperymenty z nanowgłębieniami pozwalają na ilościowe określenie właściwości mechanicznych za pomocą E, co jest związane z jednoosiowym odkształceniem (wgłębieniem), gdy biomateriał nie jest ograniczony bocznie^10,11,12.

Najpopularniejszą metodą ilościowego oznaczania E systemów biologicznych w mikroskali jest AFM^13,14,15,16. AFM jest niezwykle potężnym narzędziem o rozdzielczości siły do poziomu pN i rozdzielczości przestrzennej do skali sub-nm. Co więcej, AFM oferuje ekstremalną elastyczność w zakresie sprzężenia z uzupełniającymi się narzędziami optycznymi i mechanicznymi, rozszerzając swoje możliwości w zakresie wydobywania bogactwa informacji z badanego biomateriału¹³. Te atrakcyjne cechy wiążą się jednak z barierą wejścia, jaką stanowi złożoność konfiguracji eksperymentalnej. AFM wymaga intensywnego szkolenia, zanim użytkownicy będą mogli uzyskać solidne dane, a jego wykorzystanie do codziennej mechanicznej charakterystyki materiałów biologicznych jest często nieuzasadnione, zwłaszcza gdy nie jest wymagana jego unikalna siła i rozdzielczość przestrzenna.

Z tego powodu, nowa klasa nanoindenterów zyskała ostatnio popularność ze względu na ich łatwość użycia, jednocześnie oferując dane porównywalne z AFM z rozdzielczością siły sub-nN i rozdzielczością przestrzenną μm, odzwierciedlając siły wywierane i odbierane przez komórki w odpowiednich skalach długości². W szczególności urządzenia do nanowgłębień typu ferrule-top oparte na technologii wykrywania światłowodów^17,18 zyskały popularność wśród badaczy działających w dziedzinie mechanobiologii i nie tylko; oraz opublikowano wiele prac opisujących właściwości mechaniczne biomateriałów przy użyciu tych urządzeń, w tym Cells^19,20, hydrogels^8,21 oraz tissues^22,23. Pomimo możliwości tych systemów do badania lokalnych dynamicznych właściwości mechanicznych (tj. modułu przechowywania i strat), eksperymenty quasi-statyczne dające E pozostają najpopularniejszym wyborem^8,19,20,21. Krótko mówiąc, quasi-statyczne eksperymenty z nanowgłębieniem polegają na wcięciu próbki ze stałą prędkością do wartości zadanej określonej przez maksymalne przemieszczenie, siłę lub głębokość wgłębienia oraz rejestrowaniu zarówno siły, jak i pozycji pionowej wspornika w tak zwanych krzywych siła-odległość (F-z). Krzywe F-z są następnie przekształcane w krzywe siła-wcięcie (F-δ) poprzez identyfikację punktu kontaktowego (CP) i wyposażane w odpowiedni model mechaniki kontaktu (zwykle model Hertza¹³) w celu obliczenia E.

Chociaż działanie nanoindenterów z czuwką przypomina pomiary AFM, istnieją pewne szczegóły warte rozważenia. W niniejszej pracy przedstawiono przewodnik krok po kroku, jak solidnie uzyskiwać krzywe F-z z komórek i hydrożeli naśladujących tkanki za pomocą dostępnego na rynku nanoindenta z wierzchołkiem ferruli, w celu zachęcenia do standaryzacji procedur eksperymentalnych między grupami badawczymi korzystającymi z tego i innych podobnych urządzeń. Ponadto podano porady, jak najlepiej przygotować próbki i komórki hydrożelowe do przeprowadzenia eksperymentów z nanotwardością, wraz ze wskazówkami dotyczącymi rozwiązywania problemów na całej ścieżce eksperymentalnej.

Ponadto, duża część zmienności wyników nanowcięć (np. E i jego rozkładu) zależy od konkretnej procedury używanej do analizy danych, co jest nietrywialne. Aby rozwiązać ten problem, podano instrukcje dotyczące korzystania z nowo opracowanego oprogramowania typu open source zaprogramowanego w języku Python i wyposażonego w przyjazny dla użytkownika graficzny interfejs użytkownika (GUI) do analizy wsadowej krzywych F-z. Oprogramowanie pozwala na szybkie przesiewanie danych, filtrowanie danych, obliczanie CP za pomocą różnych procedur numerycznych, konwencjonalne obliczanie E, a także bardziej zaawansowaną analizę o nazwie flexity spectra²⁴, co pozwala oszacować masowy moduł Younga komórki, moduł Younga kory aktynowej i grubość kory aktyny. Oprogramowanie można swobodnie pobrać z GitHub i można je łatwo dostosować do analizy danych pochodzących z innych systemów poprzez dodanie odpowiedniego parsera danych. Podkreśla się, że protokół ten może być stosowany w przypadku innych urządzeń do nanotwardości typu ferrule-top i ogólnie innych urządzeń do nanotwardości, pod warunkiem, że niektóre kroki są dostosowane zgodnie z wytycznymi konkretnego instrumentu. Protokół jest schematycznie podsumowany w Rysunek 1.

Protocol

1. Przygotowanie substratów/komórek do pomiarów nanotwardości

1. Postępuj zgodnie z krokami podanymi w Protokole Uzupełniającym w celu przygotowania hydrożeli/komórek PAAm do eksperymentów z nanowgłębieniami. Procedura jest podsumowana w Rysunek 2.
   UWAGA: Hydrożele PAAm zostały wybrane, ponieważ są to najczęściej stosowane hydrożele w dziedzinie mechanobiologii. Protokół ten ma jednak zastosowanie w równym stopniu do każdego typu hydrożelu²⁵ (patrz Dyskusja, modyfikacje metody).

2. Uruchamianie urządzenia, wybór sondy i kalibracja sondy

1. Postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi w protokole dodatkowym, aby uruchomić urządzenie. Szczegółowe informacje techniczne na temat działania nanoindenterów światłowodowych można znaleźć w następujących odnośnikach^17,18.
2. Wybierz sondę nanotwardości zgodnie z poniższym opisem.
   UWAGA: Wszystkie dostępne na rynku sondy, takie jak te używane w tym protokole, są wyposażone w sferyczną końcówkę (Rysunek 3A). W związku z tym wybór zawęża się do dwóch zmiennych: sztywności wspornika i promienia końcówki (Rysunek 3B).
   1. Wybierz sztywność wspornika (k w N/m), która odpowiada oczekiwanej sztywności próbki, aby uzyskać najlepsze wyniki¹⁵ (patrz Rysunek 3C i Dyskusja, krytyczne kroki w protokole). W przypadku ogniw należy wybrać sondę o k w zakresie 0,01-0,09 N/m. W przypadku hydrożeli należy wybrać sondę o k w zakresie 0,1-0,9 N/m, która daje optymalne wyniki dla żeli o oczekiwanym E między kilkoma kPa a 100 kPa (patrz Wyniki reprezentatywne).
   2. Wybierz promień końcówki (R w μm) zgodnie z żądaną rozdzielczością przestrzenną procesu wgłębiania. W przypadku małych komórek, takich jak ludzkie embrionalne komórki nerkowe 293T (HEK293T) (średnia średnica ~10-15 μm²⁶) wybierz kulę o R = 3 μm. W przypadku hydrożeli wybierz kulę o R = 10-250 μm, aby zbadać właściwości mechaniczne biomateriału na dużej powierzchni kontaktu i uniknąć lokalnych niejednorodności.
   3. Zapoznaj się z Rysunek 3C i wszelkimi dodatkowymi wytycznymi producenta, aby wybrać odpowiednią sondę.
3. Po wybraniu sondy postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole dodatkowym, aby zamontować ją na nanoindenterze.

3. Kalibracja sondy

UWAGA: Poniższe kroki są specyficzne dla urządzeń do nanoindentacji typu ferrule-top, opartych na technologii wykrywania światłowodów, i są szczegółowo opisane dla wersji oprogramowania 3.4.1. W przypadku innych urządzeń do nanotwardości postępuj zgodnie z instrukcjami zalecanymi przez producenta urządzenia.

1. W głównym oknie oprogramowania kliknij Inicjuj. Pojawi się menu kalibracji. Wprowadź szczegóły sondy (można je znaleźć z boku pudełka sondy; k w N/m, R w μm i współczynnik kalibracji w powietrzu) w skrzynkach wejściowych.
2. Przygotuj naczynie kalibracyjne: grubą szklaną szalkę Petriego z płaskim dnem (patrz Dyskusja, kluczowe kroki w protokole). Napełnij naczynie tym samym medium, co naczynie na próbkę (może to być również powietrze). Dopasować temperaturę pożywki do temperatury próbki.
3. Umieść naczynie kalibracyjne pod sondą. W razie potrzeby wysuń sondę z uchwytu ramienia nanoinddenta i przytrzymaj ją jedną ręką, aby zrobić miejsce na umieszczenie czaszy kalibracyjnej. Wsuń sondę z powrotem na miejsce.
4. Wykonaj kolejne dwa kroki, aby skalibrować w cieczy. W przypadku pomiaru w powietrzu użyj dostarczonego podłoża z politetrafluoroetylenu do kalibracji i przejdź do kroku 5.
   1. Wstępnie zwilż sondę kroplą 70% etanolu za pomocą pipety Pasteura tak, aby koniec pipety miał lekki kontakt ze szklaną skuwką, aby kropla przesunęła się po wsporniku i kulistej końcówce²⁷ (patrz Dyskusja, krytyczne kroki w protokole).
   2. Ręcznie przesuń ramię nanoindentera w dół, aż sonda zostanie całkowicie zanurzona, ale nadal daleko od dna szalki Petriego. W razie potrzeby dodaj więcej pożywki do naczynia kalibracyjnego. Odczekaj 5 minut, aby w cieczy zostały osiągnięte warunki równowagi.
5. W menu Inicjalizuj oprogramowania kliknij Scan Wavelength (Długość fali skanowania). Na ekranie interferometru pojawi się pasek postępu, a w oknie Live Signal w oprogramowaniu komputera zostanie wyświetlony wzór pokazany na rysunku S1A po lewej stronie. Aby sprawdzić, czy skanowanie optyczne zakończyło się pomyślnie, przejdź do panelu Skanowanie długości fali w polu interferometru. Jeśli się powiedzie, powinna być widoczna fala sinusoidalna (rysunek 1A, po prawej). Zobacz Dyskusja (rozwiązywanie problemów z metodą), jeśli pojawi się błąd.
6. W menu Inicjalizacja kliknij przycisk Znajdź powierzchnię, który będzie stopniowo obniżał sondę, aż do osiągnięcia ustawionego progu w zgięciu wspornika. Sonda przestaje się poruszać po zetknięciu się ze szklaną szalką Petriego.
7. Sprawdź, czy sonda styka się z powierzchnią. Przesuń sondę w dół o 1 μm za pomocą przycisku strzałki y w dół w głównym oknie oprogramowania. Obserwuj zielony sygnał (ugięcie wspornika) w oknie na żywo oprogramowania dla zmian linii bazowej przy każdym kroku, gdy wspornik styka się z podłożem (rysunek S1B). Jeśli nie ma zmiany, wspornik nie styka się (patrz następny krok).
8. Zwiększ wartość progową w menu Opcje na karcie Znajdź powierzchnię z wartości domyślnej 0,01 o krok 0,01 na raz i powtarzaj krok Znajdź powierzchnię, aż dojdzie do kontaktu. Alternatywnie, przyprowadzaj sondę w dół, aby zetknęła się małymi krokami co 1 μm, aż zielona linia bazowa zacznie się przesuwać przy każdym kroku w dół.
   UWAGA: W przypadku najmiększych wsporników (k = 0,025 ^Nm-1) zwiększ wartość Próg w menu Opcje na karcie Znajdź powierzchnię a priori wykonania kroku 6. Zacznij od wartości progowej 0,06 lub 0,07 i w razie potrzeby zwiększ ją do 0,1. Dzieje się tak, ponieważ hałas otoczenia prawdopodobnie spowoduje, że wspornik wygina się powyżej progu przed kontaktem. W przypadku miękkich sond zmniejszenie prędkości podejścia (μm/s) w tym samym menu również usprawnia procedurę.
9. W menu Inicjalizacja kliknij Kalibruj.
10. Sprawdź okno Live Signal w oprogramowaniu i upewnij się, że zarówno sygnały przemieszczenia piezo, jak i odchylenia wspornika przesuwają się w górę w tym samym czasie (Rysunek S1C).
    1. Jeśli w czasie wystąpi niedopasowanie, sonda nie styka się w pełni ze szkłem. Przesuwać sondę w dół w krokach co 1 μm, aż zmieni się linia podstawowa sygnału wspornika (patrz krok 7) i powtórzyć krok 9.
    2. Jeśli sygnał wspornika w ogóle się nie zmieni podczas kroku kalibracji, oznacza to, że sonda znajduje się daleko od powierzchni. Zwiększaj próg kontaktu iteracyjnie (patrz krok 8), aż powierzchnia zostanie prawidłowo znaleziona i powtórz kalibrację od początku, zaczynając od skanowania długości fali.
11. Po zakończeniu kalibracji sprawdź stary i nowy współczynnik kalibracji w wyświetlonym wyskakującym okienku. Jeśli nowy współczynnik kalibracji znajduje się w prawidłowym zakresie, kliknij Użyj nowego współczynnika. Jeśli kalibracja nie powiedzie się, a nowy współczynnik to NaN lub nie mieści się w oczekiwanym zakresie, zobacz Dyskusja (rozwiązywanie problemów z metodą), aby uzyskać rozwiązanie.
    UWAGA: Nowy współczynnik powinien być ~n razy niższy niż podany na opakowaniu sondy, jeśli kalibracja została przeprowadzona w ciekłym ośrodku o współczynniku załamania światła n (n = 1,33 dla wody). Jeśli kalibracja została przeprowadzona w powietrzu, to nowy i stary współczynnik kalibracji powinny być w przybliżeniu równe.
12. Sprawdź, czy koło demodulacji zostało prawidłowo skalibrowane w następujący sposób. Przejdź do zakładki Demodulacja na pulpicie interferometru. Delikatnie postukaj w stół optyczny lub nanoindenter, aby wywołać wystarczający hałas. Biały okrąg składający się z dyskretnych punktów danych powinien w przybliżeniu pokrywać się z czerwonym okręgiem (rysunek S1D).
13. Jeśli białe kółko nie nakłada się na czerwone kółko lub na wyświetlaczu interferometru pojawi się ostrzeżenie, okrąg demodulacji wymaga ponownej kalibracji. Można to zrobić na dwa sposoby, jak opisano poniżej.
    1. Ciągle stukaj w korpus nanoindentera, aby wywołać jeden pełny krąg hałasu i naciśnij przycisk Kalibruj na interferometrze.
    2. Wejdź w kontakt ze szklanym podłożem i naciśnij Kalibruj z menu Inicjalizacja w głównym oknie oprogramowania. Nie zapisuj współczynnika kalibracji. W tym momencie sprawdź ponownie i upewnij się, że białe kółko nakłada się na czerwone kółko.
       UWAGA: Jeśli sygnał nie jest tylko nieznacznie przesunięty od okręgu demodulacji, ale raczej stał się bardzo mały lub w ogóle nie jest widoczny, oznacza to, że wspornik jest przyklejony do światłowodu. Postępuj zgodnie z poradami dotyczącymi rozwiązywania tego problemu (patrz Dyskusja, rozwiązywanie problemów z metodą) i powtórz kroki 13.1 lub 13.2. Gdy wspornik powróci do pozycji poziomej (Rysunek 3A), sygnał powróci do okręgu demodulacji.
14. Sprawdź kalibrację, wykonując wgłębienie na szklanym podłożu bezpośrednio po kalibracji, jak opisano poniżej.
    1. Załaduj lub utwórz plik eksperymentu, klikając Konfiguruj eksperyment i dodaj krok Znajdź powierzchnię i krok Wcięcie. Na etapie wcięcia użyj domyślnych ustawień trybu przemieszczenia i zmień maksymalne przemieszczenie na odległość kalibracji (3,000 nm), aby przemieścić sondę względem sztywnego podłoża.
    2. Kliknij Uruchom eksperyment i sprawdź okrąg demodulacji w oknie interferometru. Sprawdź biały sygnał i upewnij się, że znajduje się na górze czerwonego kółka podczas wcięcia.
    3. Sprawdź wyniki w głównym oknie oprogramowania na wykresie danych czasowych i upewnij się, że przemieszczenie piezo (niebieska linia) jest równe ugięciu wspornika (zielona linia), gdy wgłębienie zaczyna się w kontakcie i nie oczekuje się deformacji materiału. Jeśli sygnały nie są równoległe, zobacz Dyskusja (rozwiązywanie problemów z metodą).
15. Zmień ścieżkę lokalną w menu kalibracji, ustawiając ścieżkę zapisu kalibracji na odpowiedni katalog.
16. Po pomyślnej kalibracji sondy przesuń piezo w górę o 500 μm.

4. Pomiar modułu Younga w miękkich materiałach

1. Nanoindentacja hydrożeli
   1. Załadować szalkę Petriego zawierającą próbkę (próbki) na stolik mikroskopu i ręcznie przesunąć sondę nanoindentera do żądanej pozycji x-y nad próbką.
   2. Ręcznie wsuń sondę w roztwór, uważając, aby na tym etapie pozostawić 1-2 mm między sondą a powierzchnią próbki. Odczekaj 5 minut, aż sonda zrównoważy się w medium.
   3. Ustaw ostrość płaszczyznę z mikroskopu optycznego tak, aby sonda była wyraźnie widoczna.
   4. Wykonaj pojedyncze wcięcie, aby dostroić parametry eksperymentalne zgodnie z poniższym opisem.
      1. Skonfiguruj nowy eksperyment w oknie głównym oprogramowania. Kliknij Konfiguruj eksperyment, co otworzy nowe okno. Dodaj krok Znajdź powierzchnię. W razie potrzeby wszystkie parametry kroku Znajdź powierzchnię można zmienić w menu Opcje oprogramowania.
         UWAGA: Funkcja Znajdź powierzchnię obniży sondę, aż zostanie znaleziona powierzchnia, a następnie cofnie sondę na odległość określoną przez Z nad powierzchnią (μm), nad powierzchnią próbki. Jeśli wybrany wspornik jest zbyt sztywny dla próbki lub próbka jest lepka, po kroku sonda prawdopodobnie nadal będzie w kontakcie z próbką, co spowoduje powstanie krzywej bez linii bazowej (Rysunek 4C). Aby rozwiązać ten problem, zwiększ wartość Z nad powierzchnią (μm).
      2. Dodaj krok Wcięcie. Wybierz zakładkę Profil i kliknij Kontrola przemieszczenia. Pozostaw domyślny profil wcięć.
      3. Kliknij Uruchom eksperyment w głównym oknie oprogramowania. Spowoduje to znalezienie powierzchni i wykonanie pojedynczego wcięcia. Jeśli pojedyncze wcięcie nie wygląda zgodnie z oczekiwaniami, dostosuj parametry eksperymentalne zgodnie z opisem w Rysunek 4 i Dyskusja (rozwiązywanie problemów z metodą).
   5. Gdy wcięcie wygląda zgodnie z oczekiwaniami, skonfiguruj skanowanie matrycy tak, aby wciąć wystarczający obszar próbki. Kliknij Konfiguruj eksperyment, dodaj krok Znajdź powierzchnię z wcześniej określonymi parametrami eksperymentalnymi i dodaj krok Skanowanie matrycy.
   6. W przypadku płaskich hydrożeli należy skonfigurować skan matrycowy zawierający 50-100 punktów (tj. 5 x 10 lub 10 x 10 cali x i y) rozmieszczonych w odstępach 10-100 μm (tj. dx = dy = 10-100 μm). Kliknij Użyj pozycji stołu montażowego, aby rozpocząć skanowanie matrycy od bieżącej pozycji etapu. Upewnij się, że pole Automatyczne wyszukiwanie powierzchni jest zaznaczone, aby znaleźć powierzchnię przy każdym wcięciu przy użyciu ustawionych parametrów eksperymentalnych.
      1. Aby uniknąć nadmiernego próbkowania, ustaw rozmiar kroku na co najmniej dwukrotność promienia kontaktu (, gdzie δ oznacza głębokość wcięcia).
      2. Skonfiguruj profil skanowania matrycy w kontroli przemieszczenia. Upewnij się, że profil nie narusza założeń modelu Hertz (patrz Dyskusja, krytyczne kroki w protokole).
      3. Pozostaw liczbę segmentów na 5, co jest wartością domyślną, i użyj domyślnego profilu przemieszczenia. W razie potrzeby należy zmienić profil przemieszczenia pod względem maksymalnego przemieszczenia i czasu dla każdego nachylonego segmentu, co wpłynie odpowiednio na maksymalną głębokość wcięcia i szybkość odkształcania. Nie należy przekraczać prędkości odkształcania > 10 μm/s (patrz Dyskusja, ograniczenia metody).
      4. Wprowadź wartość prędkości zbliżania, która określa, jak szybko sonda jest przemieszczana w kierunku próbki przed kontaktem. Dopasuj prędkość chowania do prędkości zbliżania (patrz uwaga poniżej).
         UWAGA: W przypadku miękkich wsporników i hałaśliwego otoczenia zalecana jest prędkość zbliżania 1,000-2,000 nm/s. W przypadku sztywniejszych wsporników i kontrolowanych środowisk można to zwiększyć.
      5. Zapisz skonfigurowany eksperyment w żądanej ścieżce eksperymentu i wybierz katalog, w którym dane zostaną zapisane w ścieżce zapisu, na karcie Ogólne w oknie Konfiguruj eksperyment. Kliknij Uruchom eksperyment.
   7. Po zakończeniu skanowania matrycy podnieś sondę o 200-500 μm i przesuń sondę w inne miejsce próbki, wystarczająco daleko od pierwszego obszaru.
   8. Powtórz eksperyment co najmniej dwa razy, aby uzyskać wystarczającą ilość danych na każdej próbce (tj. co najmniej dwa skany matrycy na próbkę, z których każda zawiera 50-100 krzywych).
2. Nanowgłębienie komórek
   1. Załaduj próbkę do mikroskopu zgodnie z powyższym opisem.
   2. W przypadku wcięcia pojedynczej komórki ustaw ostrość płaszczyznę z tak, aby zarówno komórki, jak i sonda były widoczne w powiększeniu 20x lub 40x, w zależności od rozmiaru komórki i rozprzestrzeniania się.
   3. Przesuń sondę nad komórkę, która ma zostać wcięta.
   4. Skonfiguruj nowy eksperyment w oknie głównym oprogramowania. Kliknij Konfiguruj eksperyment, co otworzy nowe okno. Dodaj krok Znajdź powierzchnię i wcięcie z domyślnymi parametrami w trybie przemieszczenia.
   5. Kliknij Uruchom eksperyment, który znajdzie powierzchnię i wykona pojedyncze wcięcie. Sprawdź, czy wcięcie się powiodło. Jeśli krzywa nie wygląda zgodnie z oczekiwaniami, dostosuj parametry eksperymentalne (patrz Rysunek 4 i Dyskusja, rozwiązywanie problemów z metodą).
   6. Jeśli wcięcie się powiodło, dodaj skan matrycy do eksperymentu. Postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi dla eksperymentów z nanotwardością hydrożeli; skonfigurować skanowanie matrycy tak, aby rozmiar kroku pozwalał na wcięcie niewielkiego obszaru komórki; 25 punktów rozmieszczonych w odstępach 0,5-5 μm dla HEK293T komórek.
      1. W zależności od rozmiaru komórki dostosuj skanowanie matrycy, aby upewnić się, że końcówka nie wykracza poza limit komórki, tj. wykonując inną geometrię mapy lub sondując mniej punktów.
   7. Kliknij Uruchom eksperyment i poczekaj na jego zakończenie.
   8. Po zakończeniu skanowania matrycy podnieś sondę z dala od kontaktu (50 μm w płaszczyźnie z).
   9. Przesuń sondę nad nową komórkę i powtórz proces (patrz Dyskusja, krytyczne kroki w protokole).
3. Czyszczenie sondy i wyłączanie przyrządu
   1. Postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi w protokole dodatkowym, aby wyczyścić sondę i wyłączyć urządzenie do nanotwardości.

5. Analiza danych

1. Pobieranie i instalowanie oprogramowania
   1. Postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi w Protokole dodatkowym, aby pobrać i zainstalować oprogramowanie do analizy danych^28,29.
2. Badanie przesiewowe krzywych F-z i tworzenie oczyszczonego zestawu danych w formacie JSON
   1. Uruchom prepare.py z wiersza polecenia na komputerze laboratoryjnym zgodnie z opisem w krokach od 2 do 3.
   2. Jeśli używasz komputera z systemem Windows, przytrzymaj Shift podczas klikania prawym przyciskiem myszy folderu NanoPrepare i kliknij Otwórz okno PowerShell tutaj. Wpisz polecenie python prepare.py i naciśnij Enter. Na ekranie pojawi się graficzny interfejs użytkownika (rysunek S2).
   3. Jeśli używasz komputera z systemem MacOS, kliknij prawym przyciskiem myszy folder NanoPrepare i kliknij Nowy terminal w folderze. Wpisz polecenie python3 prepare.py i naciśnij Enter, co spowoduje uruchomienie graficznego interfejsu użytkownika (Rysunek S2).
   4. Wybierz format danych O11NEW z listy rozwijanej. Jeśli dane nie zostały załadowane poprawnie, uruchom ponownie graficzny interfejs użytkownika i wybierz O11OLD.
      UWAGA: Format O11NEW działa dla danych uzyskanych za pomocą urządzeń do wykrywania nanotwardości światłowodów z ferrulą z oprogramowaniem w wersji 3.4.1. Format ten sprawdzi się również w przypadku poprzednich wersji oprogramowania, przynajmniej tych należących do nanoindenterów zainstalowanych w latach 2019-2020.
   5. Kliknij Załaduj folder. Wybierz folder zawierający dane, które mają być analizowane — pojedyncze skanowanie macierzy lub wiele skanów matrycowych. Górny wykres (krzywe nieprzetworzone) zostanie wypełniony przesłanym zestawem danych. Aby wyświetlić wizualizację określonej krzywej, kliknij na nią. Spowoduje to podświetlenie go na zielono i pokazanie go na dolnym wykresie (Current Curve).
   6. Wyczyść zestaw danych za pomocą zakładek znajdujących się w prawej części graficznego interfejsu użytkownika, jak opisano poniżej.
      1. Użyj przycisku Segment, aby wybrać właściwy segment do analizy, który jest segmentem do przodu krzywych F-z. Konkretna liczba zależy od liczby segmentów wybranych w oprogramowaniu do nanotwardości podczas wykonywania eksperymentów.
      2. Użyj przycisku Przytnij 50 nm, aby przyciąć krzywe o 50 nm po lewej stronie (jeśli zaznaczone jest L), po prawej (jeśli zaznaczone jest R) lub po obu stronach (jeśli zaznaczone są zarówno R, jak i L). Kliknij ten przycisk kilka razy, aby przyciąć tyle, ile jest wymagane. Użyj tego, aby usunąć artefakty obecne na początku/końcu krzywych F-z.
      3. Sprawdź zakładkę Cantilever pod kątem stałej sprężystości, geometrii końcówki i promienia końcówki. Sprawdź kartę, aby upewnić się, że metadane zostały poprawnie odczytane.
      4. Zakładka Klasyfikacja służy do ustawiania progu siły, który odrzuci wszystkie krzywe, które nie osiągnęły danej siły. Odrzucone krzywe zostaną podświetlone na czerwono.
      5. Użyj przycisku Przełącz ręcznie , aby ręcznie usunąć krzywe, które nie zostały poprawnie pobrane. Usuń wszystkie krzywe, klikając określoną krzywą i wybierając OUT, co spowoduje podświetlenie krzywej na czerwono.
   7. Kliknij Zapisz JSON. Wprowadź odpowiednią nazwę oczyszczonego zestawu danych, który jest pojedynczym plikiem JSON. Wyślij plik JSON do komputera, na którym zainstalowano oprogramowanie NanoAnalysis.

6. Formalna analiza danych

1. Uruchom plik nano.py z wiersza poleceń, przechodząc do folderu NanoAnalysis i uruchamiając terminal, jak wyjaśniono wcześniej. Wpisz polecenie python nano.py lub python3 nano.py (w zależności od systemu operacyjnego) i naciśnij Enter. Na ekranie pojawi się graficzny interfejs użytkownika (Rysunek S3).
2. W lewym górnym rogu graficznego interfejsu użytkownika kliknij Załaduj eksperyment i wybierz plik JSON. Spowoduje to wypełnienie listy plików i wykresu Raw Curves przedstawiającego zestaw danych pod względem krzywych F-z. Zarówno osie F, jak i z są wyświetlane względem współrzędnych CP, które są obliczane w tle podczas ładowania zestawu danych (patrz następna uwaga). W polu Statystyki sprawdź wartości trzech parametrów: N_aktywowany, N _nieudane i N_wykluczone.
   UWAGA:_{N aktywowane} reprezentuje liczbę krzywych, które zostaną przeanalizowane w kolejnej analizie widm hertz/sprężystości i są wyświetlane w kolorze czarnym na wykresie krzywych surowych. N_failed reprezentuje liczbę krzywych, na których nie można było znaleźć wiarygodnego CP i są wyświetlane na niebiesko na wykresie. Krzywe te zostaną automatycznie odrzucone w kolejnej analizie. Po otwarciu oprogramowania niektóre krzywe mogą zostać automatycznie przeniesione do uszkodzonego zestawu. Dzieje się tak, ponieważ CP jest obliczany po otwarciu oprogramowania z domyślnym algorytmem progowym (patrz poniżej). N_wykluczone reprezentuje krzywe, które zostały ręcznie wybrane do wykluczenia z analizy i będą wyświetlane na czerwono na wykresie (patrz poniżej).
3. Sprawdź, czy liczba krzywych zakończonych niepowodzeniem, wykluczonych i aktywowanych jest rozsądna. Sprawdź wykres Raw Curves (Krzywe surowe), aby je zwizualizować.
4. Aby bardziej szczegółowo zobrazować określoną krzywą, kliknij na nią. Spowoduje to podświetlenie go na zielono i pokazanie go na wykresie bieżącej krzywej. Po wybraniu pojedynczej krzywej parametry R i k (które muszą być takie same dla wszystkich krzywych) zostaną wypełnione w polu Statystyki w graficznym interfejsie użytkownika.
5. Zmień stan danej krzywej za pomocą pola Przełącz. Kliknij konkretną krzywą, której stan chcesz zmienić, a następnie kliknij opcję Aktywowana, Nieudana lub Wykluczona. Liczba w polu Statystyki jest aktualizowana automatycznie.
   UWAGA: Aby zmienić widok zestawu danych na wykresie Raw Curves (Krzywe podstawowe), należy użyć pola Widok. Kliknij Wszystkie, aby wyświetlić wszystkie krzywe (tj. aktywowane, uszkodzone i wykluczone w odpowiednich kolorach). Kliknij Nie powiodło się, aby wyświetlić aktywowane i nieudane krzywe, a następnie kliknij Aktywowane, aby wyświetlić tylko aktywowane krzywe. Aby zresetować stan wszystkich krzywych między aktywowanymi a wykluczonymi, kliknij Aktywowane lub Wykluczone w polu Resetuj.
6. Po dalszym oczyszczeniu zestawu danych postępuj zgodnie z potokiem analizy danych opisanym poniżej.
   1. Filtruj wszelkie szumy obecne w krzywych za pomocą filtrów zaimplementowanych w GUI (Filtering Box), a mianowicie niestandardowego filtra o nazwie Prominency filter, Savitzky Golay^30,31 (SAVGOL) oraz filtru wygładzającego opartego na obliczeniu mediany danych w danym oknie (filtr mediany). Zobacz Dyskusja (krytyczne kroki w protokole), aby uzyskać szczegółowe informacje na temat filtrów.
   2. Sprawdź przefiltrowane krzywe na wykresie Bieżąca krzywa. Krzywa z filtrem jest pokazana w kolorze czarnym, podczas gdy niefiltrowana wersja krzywej jest pokazana w kolorze zielonym.
      UWAGA: Zaleca się jak najmniejsze filtrowanie danych, aby zachować cechy oryginalnego sygnału. Nadmierne filtrowanie może wygładzić wszelkie różnice występujące w danych. Praca z aktywowanym filtrem protuberancji jest wystarczająca do analizy Hertz danych nanotwardości. Jeśli dane są szczególnie zaszumione, można dodatkowo zastosować filtry SAVGOL lub medianę.
   3. Wybierz algorytm, aby znaleźć punkt kontrolny. W polu Punkt kontaktowy wybierz jedną z serii procedur numerycznych, które zostały zaimplementowane w oprogramowaniu, a mianowicie: Goodness of Fit (GoF)³², Ratio of Variances (RoV)³², Second derivative³³, lub Threshold³³. Zobacz Dyskusja, krytyczne kroki w protokole, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat algorytmów.
      UWAGA: CP to punkt, w którym sonda styka się z materiałem i musi zostać zidentyfikowana w celu przekształcenia danych F-z na dane F-δ (w przypadku materiałów miękkich δ jest skończona i należy ją obliczyć). Wybrany algorytm zostanie zastosowany do wszystkich aktywnych krzywych zestawu danych, a krzywe, w przypadku których algorytm nie jest w stanie solidnie zlokalizować CP, zostaną przeniesione do zestawu, który uległ awarii.
   4. Dostosuj parametry algorytmu do swojego zestawu danych, tak aby CP był zlokalizowany poprawnie, jak opisano w Dyskusji, krytycznych krokach w protokole. Aby zobaczyć, gdzie na pojedynczej krzywej znaleziono CP, wybierz krzywą, klikając na nią i kliknij Sprawdź. Sprawdź wyskakujące okienko, które się pojawi, aby określić, gdzie znajduje się punkt kontrolny.
   5. Sprawdź, czy czerwona linia, która się pojawia, czyli parametr obliczony przez algorytm w wybranym obszarze zainteresowania, ma maksymalną lub minimalną wartość, która odpowiada lokalizacji CP (np. dla GoF parametrem jest R²). W razie potrzeby powtórz ten proces dla wszystkich krzywych.
      UWAGA: Osie okna podręcznego są we współrzędnych bezwzględnych, dzięki czemu można pokazać położenie punktu kontrolnego. I odwrotnie, osie wykresu krzywych surowych i krzywej prądu są pokazane względem CP, tj. położenie CP wynosi (0,0).
   6. Kliknij Analiza Hertz. Spowoduje to wygenerowanie trzech wykresów opisanych poniżej.
      1. Sprawdź poszczególne krzywe F-δ w zestawie danych wraz ze średnim dopasowaniem Hertz (czerwona linia przerywana). Dostosuj wcięcie w nm, do którego dopasowany jest model Hertz w polu Wyniki w obszarze Maksymalne wcięcie (nm). Ustaw go na maksymalnie ~10% R, aby model Hertz był prawidłowy (patrz Dyskusja, krytyczne kroki w protokole).
      2. Sprawdź średnią krzywą F-δ z pasmem błędu pokazującym jedno odchylenie standardowe (SD) wraz ze średnim dopasowaniem Hertza (czerwona przerywana linia). Wizualizuj średnie dopasowanie herców na wykresie krzywych surowych w celach informacyjnych oraz dopasowanie herców dla każdej krzywej bieżącej.
      3. Sprawdź wykres punktowy E wynikający z dopasowania modelu Hertz do każdej pojedynczej krzywej.
   7. Kliknij nazwę pliku, krzywą F-z, krzywą F-δ lub punkt na wykresie punktowym, aby podświetlić krzywą na każdym wykresie. Jeśli punkt danych na diagramie punktowym wydaje się leżeć poza rozkładem danych, kliknij go i sprawdź krzywą, do której należy. Sprawdź, czy punkt kontrolny został zlokalizowany poprawnie, klikając przycisk Sprawdź. W razie potrzeby należy wykluczyć krzywą z analizy.
   8. Sprawdź pole Wyniki dla obliczonej średniej E i jej SD (E_γ ± σ) i upewnij się, że są one rozsądne dla danego eksperymentu.
   9. W polu Zapisz kliknij Hertz. W wyskakującym okienku wprowadź nazwę pliku i katalog. Po zakończeniu kliknij Zapisz. Zostanie utworzony plik tsv. Otwórz plik .tsv w dowolnym dodatkowym preferowanym oprogramowaniu i użyj wartości do analizy statystycznej i dalszego kreślenia.
      UWAGA: Plik zawiera E uzyskane z każdej krzywej oraz średnią E i jej SD. Dodatkowo plik zawiera metadane związane z analizą, w tym liczbę analizowanych krzywych, R, k oraz maksymalne wcięcie używane dla modelu Hertz.
   10. Ten krok jest opcjonalny. Kliknij Średnia F-Ind, aby wyeksportować średnią siłę i średnie wcięcie wraz z jednym SD w sile.
   11. Aby uzyskać dane dotyczące nanotwardości komórek, kliknij Analiza widm sprężystości (patrz Reprezentatywne wyniki i dyskusja). Sprawdzić dwa utworzone wykresy, a mianowicie E w funkcji głębokości wcięcia (E(δ)) dla każdej krzywej oraz średnią E(δ) z pasmem błędu pokazującym jedno SD (ciągła czerwona linia i zacieniony obszar) dopasowany przez model (linia przerywana), który pozwala oszacować moduł Younga kory aktynowej komórki, masowy moduł Younga komórki i grubość kory aktyny. Dodatkowo sprawdź średnią E(δ) na górnym wykresie w kolorze czerwonym.
   12. Upewnij się, że pole Interpoluj jest zaznaczone, co gwarantuje, że pochodna potrzebna do przeprowadzenia analizy widm sprężystości jest obliczana na interpolowanym sygnale (patrz Reprezentatywne wyniki).
   13. Sprawdź pole Wyniki, podając moduł Younga kory mózgowej (E₀ ± σ), moduł Younga (E_b ± σ) i grubość kory (d₀ ± σ).
       UWAGA: Średnie widma sprężystości mogą początkowo wydawać się hałaśliwe, z wyraźnymi oscylacjami sinusoidalnymi. W rezultacie równanie (3) może nie być prawidłowo dopasowane. W takim przypadku iteracyjne zwiększanie długości okna wygładzającego filtra SAVGOL³⁴ rozwiązuje ten problem.
   14. Po zakończeniu analizy kliknij ES w polu Zapisz. Spowoduje to wyeksportowanie pliku .tsv w określonym katalogu, zawierającego średnią elastyczność w funkcji średniej głębokości wcięcia i promienia kontaktu, metadanych związanych z eksperymentem (patrz powyżej) oraz szacowanych parametrów modelu wyjaśnionych powyżej. Na koniec podano również średnią elastyczność bez uwzględnienia zależności od δ i jego SD.
   15. Zamknij oprogramowanie i wprowadź zapisane wyniki do dowolnego innego preferowanego oprogramowania, aby dalej wykreślić dane i przeprowadzić analizę statystyczną.
   16. Ten krok jest opcjonalny: Eksportuj wykresy z graficznego interfejsu użytkownika, klikając wykres prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję Eksportuj. Eksportuj wykres w .svg, aby parametry takie jak czcionka, rozmiar czcionki, styl linii itp. mogły być edytowane w innym wybranym oprogramowaniu.
       UWAGA:Niestandardowe algorytmy i filtry CP można programować i dodawać do już istniejących. Szczegółowe informacje można znaleźć w uwadze uzupełniającej 1.

Results

Zgodnie z protokołem, otrzymuje się zestaw krzywych F-z. Zestaw danych najprawdopodobniej będzie zawierał dobre krzywe oraz krzywe, które należy odrzucić przed kontynuowaniem analizy. Ogólnie rzecz biorąc, krzywe powinny być odrzucane, jeśli ich kształt różni się od pokazanego na Rysunek 4A. Rysunek 5AI pokazuje zestaw danych ~100 krzywych uzyskanych na miękkim hydrożelu PAAm o oczekiwanym E 0,8 KPa³⁵ przesłany do GUI NanoPrepare....

Discussion

Protokół ten pokazuje, jak niezawodnie pozyskiwać dane ze spektroskopii sił za pomocą dostępnego na rynku nanoindentera z wierzchołkiem ferruli, zarówno na hydrożelach, jak i pojedynczych komórkach. Ponadto zamieszczono instrukcje dotyczące korzystania z oprogramowania typu open source zaprogramowanego w języku Python, obejmującego precyzyjny przepływ pracy do analizy danych nanotwardości.

Krytyczne kroki w protokole
Następujące kroki zostały uznane za szczególnie ważne p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szkiełka nakrywkowe 12 mm	VWR	631-1577P
35 mm naczynia hodowlane poddane działaniu komórek	Greiner CELLSTAR	627160
Akrylamid	Sigma-Aldrich	A4058
Akrylsilan	Alfa Aesar	L16400
Nadsiarczan amonu	Merk	7727-54-0
Bisakryloamid	Merk	110-26-9
Chiaro nanoindenter	Optyka 11 Życie		brak numeru katologicznego
Etanol			ogólny
Surowica płodowa bydlęca	Gibco	16140071
Wysoka glukoza DMEM	Gibco	11995065
Isopropanol			ogólny
Kimwipe	Kimberly Clark	21905-026
Szkiełka mikroskopowe	VWR	631-1550P
System MilliQ	Merk Millipore	ZR0Q008WW
OP1550 Interferometr	Optyka11 Życiorys		nr katalogowy
Optyka 11 Życiowa sonda (k = 0,02-0,005 N/m, R = 3-3,5 um)	Układ optyczny 11 Żywotność		brak liczby katatologicznej
Optyka 11 Sonda żywotności (k = 0,46-0,5 N/m, R = 50-55 um)	Optyka 11 Życie		brak liczby katologicznej
Penicylina/Streptomycyna	Gibco	15140122
Odstraszacz deszczu RainX		RainX 26012
Standardowe szalki Petriego (90 mm)	Thermo Scientific	101RTIRR
Tetrametyloetylenodiamina	Sigma-Aldrich	110-18-9
Eksykator próżniowy	Thermo Scientific	531-0250
strong>Software
Oprogramowanie do akwizycji danych (wersja 3.4.1)	Optyka 11 Life
GitHub Desktop (opcjonalnie)	Microsoft
Python 3	Python Software Foundation
Visual Studio Code (opcjonalnie)	Microsoft