Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową

Irina A. Okkelman; Chris Vercruysse; Alina V. Kondrashina; Sergey M. Borisov; Ruslan I. Dmitriev

doi:10.3791/63403

Artykuł metodologiczny

Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową

DOI:

10.3791/63403

⸱

6 kwietnia 2022

Irina A. Okkelman^*¹ , Chris Vercruysse^*¹ , Alina V. Kondrashina² , Sergey M. Borisov³ , Ruslan I. Dmitriev¹

¹Tissue Engineering and Biomaterials Group, Department of Human Structure and Repair, Faculty of Medical and Health Sciences, Ghent University, ²Health and Happiness (H&H) Group, National Food Innovation Hub, ³Institute of Analytical Chemistry and Food Chemistry, Graz University of Technology

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje wysokoprzepustowe generowanie sferoidów do biodruku przy użyciu wieloparametrycznej analizy ich natlenienia i śmierci komórki pod standardowym mikroskopem fluorescencyjnym. Podejście to można zastosować do kontrolowania żywotności sferoid i przeprowadzania standaryzacji, co jest ważne w modelowaniu tkanki 3D, mikrośrodowiska guza i udanej biofabrykacji (mikro)tkanek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sferoidy wielokomórkowe są ważnymi narzędziami do badania fizjologii tkanek i nowotworów w 3D i są często używane w inżynierii tkankowej jako jednostki do składania tkanek do biofabrykacji. Podczas gdy główna moc modelu sferoidalnego polega na naśladowaniu gradientów fizyczno-chemicznych w mikroskali tkankowej, rzeczywiste środowisko fizjologiczne (w tym dynamika aktywności metabolicznej, natlenienie, śmierć komórki i proliferacja) wewnątrz sferoid jest na ogół ignorowane. Jednocześnie wpływ składu pożywki wzrostowej i metody tworzenia na uzyskany fenotyp sferoidy jest dobrze udokumentowany. W związku z tym charakterystyka i standaryzacja fenotypu sferoidalnego są niezbędne do zapewnienia odtwarzalności i przejrzystości wyników badań. Analiza średniego natlenienia sferoidowego i wartości gradientów_O2 w trzech wymiarach (3D) może być prostym i uniwersalnym sposobem charakterystyki fenotypu sferoidalnego, wskazującym na ich aktywność metaboliczną, ogólną żywotność i potencjał do rekapitulacji mikrośrodowiska tkanek in vivo. Wizualizację natlenienia 3D można łatwo połączyć z wieloparametryczną analizą dodatkowych parametrów fizjologicznych (takich jak śmierć komórki, proliferacja i skład komórki) i zastosować do ciągłego monitorowania natlenienia i/lub pomiarów punktu końcowego. Ładowanie sondy_O2 odbywa się na etapie tworzenia sferoid i jest zgodne z różnymi protokołami generowania sferoidów. Protokół zawiera wysokoprzepustową metodę generowania sferoidów z wprowadzonymi ratiometrycznymi nanoczujnikami fluorescencyjnymi O₂ emitującymi światło czerwone i bliskiej podczerwieni oraz opis wieloparametrowej oceny natlenienia sferoidów i śmierci komórek przed i po bioprintingu. Przykłady eksperymentalne pokazują porównawczą analizę gradientów_O2 w sferoidach homo- i heterokomórkowych, a także w biodrukowanych konstruktach opartych na sferoidach. Protokół jest kompatybilny z konwencjonalnym mikroskopem fluorescencyjnym posiadającym wiele filtrów fluorescencyjnych i diodę elektroluminescencyjną jako źródło światła.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tlen cząsteczkowy (O₂) jest jednym z kluczowych metabolitów regulujących żywotność, funkcjonowanie i śmierć komórek i tkanek. W warunkach fizjologicznych miejscowe utlenowanie tkanek jest dynamicznie regulowane przez unaczynienie tkanek, przepływ krwi i metabolizm komórkowy, co w niektórych przypadkach prowadzi do powstawania gradientów_O2, niedotlenienia mikrośrodowiska i/lub stresu oksydacyjnego¹^,². Komórki wyczuwają gradienty O₂ poprzez bezpośrednie zaangażowanie molekularnego O₂ w funkcję sygnalizacyjną (poprzez sygnalizację za pośrednictwem czynnika indukowanego hipoksją (HIF), demetylazy lizyny histonowej KDM i w inny sposób), zmiany w komórkowym potencjale redoks (reaktywne gatunki O₂wykrywają za pomocą sygnalizacji Nrf2 / Keap1 lub białek regulatorowych żelaza), a następnie mogą dostosować swój metabolizm, Proliferacja, siła działania i zróżnicowanie3. Tak więc niejednorodność utlenowania komórek i tkanek, jej gradienty i związane z tym zjawiska są ważnymi graczami w rozwoju tkanek i homeostazie. Różne tkanki i typy komórek często wymagają różnych "normalnych" fizjologicznych poziomów_O2, które definiują specjalną architekturę tkanek z komórkami ustawionymi zgodnie z mikrogradientami tkanki_{O 2} ⁴. Niektóre typy komórek są wrażliwe na spadek_O2(np. neurony, hepatocyty, komórki wysp trzustkowych lub komórki mięśniowe)⁵^,⁶, podczas gdy inne mogą wytrzymać ekstremalne niedotlenienie i tworzyć strome gradienty O₂ (np. w nabłonku jelita grubego)⁷. Wraz z postępem w bioinżynierii tkankowej i biowytwarzaniu istotna staje się konieczność kwantyfikacji_O2 w mikroagregatach i sferoidalnych konstruktach tkanek 3D. Jednym z problemów jest standaryzacja parametrów fizjologicznych wielokomórkowego modelu sferoidowego, które zależą od metody generowania sferoidów i warunków hodowli⁸. Ponadto niekontrolowane stosowanie biomateriałów uwalniających_O2 lub perfuzji_O2 w mikrotkankach pozbawionych funkcjonalnego unaczynienia może być toksyczne dla komórek, prowadzić do przeprogramowania ich metabolizmu i zmniejszenia przeżycia w okresie po przeszczepie⁹^,¹⁰. Wiarygodność podejścia do pomiaru_O2 i optymalizacji środowiska natleniania w celu osiągnięcia wydajnej hodowli fizjologicznie istotnych mikroagregatów została niedawno udowodniona przez modelowanie matematyczne sferoidów wątroby pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych użyte jako przykład¹¹. Inną dziedziną, w której uznaje się wiedzę o poziomach O₂ w tkankach, jest terapia nowotworów¹²^,¹³. Heterogeniczne niedotlenienie guza może osłabić skuteczną terapię przeciwnowotworową. Mierzenie i kontrolowanie dokładnych poziomów natlenienia podczas leczenia pacjenta lub modelowania niedotlenienia guza pozwoliłoby na ulepszenie indywidualnych i spersonalizowanych strategii terapeutycznych¹⁴. W związku z tym ilościowe monitorowanie dynamicznego natleniania w biofabrykowanych konstruktach i modelach 3D guzów jest znaczącym narzędziem do fizjologicznej analizy ich aktywności oddechowej, metabolizmu i optymalizacji hodowli tkankowej, warunków produkcji lub podstawowych badań odpowiedzi terapeutycznej za pośrednictwem hipoksji.

Szereg metod umożliwia multipleksowaną (lub wieloparametrową) analizę natlenienia komórek w sferoidalnych i mikrozagregowanych konstrukcjach tkankowych. Pionierskie w dziedzinie neurosfer i sferoidów nowotworowych ¹⁵^,¹⁶^,¹⁷, podejście oparte na mikroskopii obrazowania czasu życia fosforescencji (PLIM) umożliwia bezpośrednie ilościowe określenie natlenienia komórek w żywych mikrotkankach i ustalenie jego korelacji z żywotnością komórek, proliferacją lub dystrybucją funkcjonalnych typów komórek. Pomimo siły tego podejścia, aktualizacja mikroskopii PLIM nadal nie jest powszechnie dostępna nawet wśród popularnych dostawców mikroskopów¹⁸^,¹⁹. Na szczęście duża liczba penetrujących komórki sond nanocząstek O₂ może być również używana do pomiaru ratiometrycznego opartego na intensywności fluorescencji¹⁵^,¹⁷^,²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴. Zazwyczaj sonda wyświetla dwie długości fal emisyjnych, tj. O₂ czułą i niewrażliwą (referencyjną), które można zmierzyć za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, obrazika przesiewowego o wysokiej zawartości lub czytnika mikropłytek. Takie nanocząstki wykrywające_O2 mogą być wytwarzane techniką wytrącania z biokompatybilnymi polimerami, czujnikiem_O2 i barwnikami referencyjnymi obejmującymi widma widzialne i bliskiej podczerwieni, lub można je kupić komercyjnie²^,²⁵. Ponieważ analiza grubych mikrotkanek 3D skorzystałaby na zastosowaniu barwników fluorescencyjnych z przesunięciem ku czerwieni, skonstruowano ratiometryczną sondę nanocząstek O₂ multimodalną podczerwień numer 1 (MMIR1), składającą się z O_2-sensing PtTPTBPF²⁶ i reference aza-BODIPY^{27 barwników} impregnowanych dodatnio naładowanym kopolimerem na bazie polimetakrylanu²⁸. W tej konstrukcji sygnał czuły na_O2 (bliska podczerwień, wzbudzenie (exc.) = 635 nm, emisja (em.) = 760 nm; I_sens) zależy od stężenia [O₂] w procesie hartowania fosforescencyjnego, podczas gdy intensywność czerwonego barwnika referencyjnego (exc. = 580 nm, em. = 650 nm; I_ref) pozostaje nienaruszony (Rysunek 1A). W ten sposób stosunek I_ref / I_sens (R) w barwionych komórkach może umożliwić kalibrację O₂²².

Tutaj opisujemy półilościowe podejście do monitorowania natlenienia żywych komórek w sferoidach i biodrukowanych konstruktach, pomagając oszacować gradienty O₂ w punktach końcowych i pomiarach kinetycznych. Takie obrazowanie_O2 można wykonać za pomocą innych typów ratiometrycznych sond O₂ (Rysunek 1B) i, w zależności od liczby dostępnych źródeł światła i filtrów fluorescencyjnych, można je stosować z innymi barwnikami w celu uzyskania informacji o żywych/martwych komórkach, funkcji mitochondriów i śledzeniu innych typów komórek. Można również korzystać z zaawansowanych trybów pomiaru, takich jak mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM)¹⁹. Największym wyzwaniem związanym z zastosowaniem barwników barwiących komórki i wrażliwych na O₂ nanocząstek jest optymalizacja protokołu barwienia. W przypadku sondy MMIR1 i powiązanych nanocząstek, komórki są albo wstępnie wybarwione, albo współinkubowane podczas procesu tworzenia sferoid. W opisanym protokole sferoidy barwione sondą O₂ zostały wygenerowane na mało przylegającej powierzchni agarozy²⁹^,³⁰^,³¹^,³² (Rysunek 1C), co umożliwia późniejsze biodrukowanie w oparciu o sferoidy i wieloparametrową analizę O₂ i śmierć komórki. Aby zilustrować możliwość zastosowania tego podejścia, porównano poziomy natlenienia w sferoidach z ludzkich komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSC) przed i po biodruku, przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generacja sferoid o wysokiej przepustowości z wbudowaną sondą czułą na O₂

Przygotowanie płytki do hodowli tkankowej pokrytej agarozą pokrytej mikrowzorzystą
UWAGA: Płytki do hodowli tkankowych pokrytych agarozą z mikrowzorzyskiem są używane do jednoczesnego generowania dużej liczby sferoidów (1585 na stempel PDMS, patrz Tabela materiałów) do biodruku i innych zastosowań, w których potrzebne są wielokrotne powtórzenia eksperymentalne lub duża liczba sferoidów.
1. Przygotuj wszystkie sterylne materiały i narzędzia (szpatułki i pęsety) przez autoklawowanie, jeśli to możliwe, lub przez sterylizację filtra. Wyczyść nadające się do recyklingu znaczki PDMS³³ z agarozy i przechowuj je aseptycznie w 70% etanolu. Zrób to co najmniej 1 dzień przed generacją sferoidów.
2. Przenieść stemple PDMS z mikrowzorzyskiem z fiolki do przechowywania na sterylną szalkę Petriego i wysuszyć na powietrzu gładką powierzchnią do góry w sterylnych warunkach laminarnego przepływu powietrza przez 10 minut.
3. Umieść każdy stempel z powierzchnią z mikrowzorem do góry (i gładką powierzchnią do dołu) w środku dołka 12-dołkowej sterylnej płytki do hodowli tkankowej. Suszyć na powietrzu przez 1-2 minuty z otwartą pokrywą.
  UWAGA: Bardzo ważne jest odparowanie nadmiaru płynu, ponieważ tylko suche stemple idealnie przylegają do plastikowej powierzchni i pozostają przymocowane podczas zabiegu.
4. Odważyć 1,5 g agarozy do czystej szklanej butelki o pojemności 200 ml, dodać 50 ml sterylnej wody destylowanej, przykryć pokrywką i rozpuść w kuchence mikrofalowej, aby uzyskać 50 ml 3% jednorodnego roztworu agarozy.
  UWAGA: Roztwór agarozy jest bardzo gorący i należy obchodzić się z nim ostrożnie. Wstrząśnięty natychmiast po procedurze topienia gorący roztwór agarozy może zacząć bulgotać i wydostać się z naczynia. Aby uniknąć sporadycznych urazów, należy używać wystarczająco dużych naczyń wypełnionych roztworem agarozy maksymalnie w 50% objętości.
5. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej natychmiast dodaj ~ 2 ml gorącego roztworu agarozy do każdej studzienki z 12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych, aby całkowicie pokryć włożony stempel PDMS. Pozostawić agarozę do zestalenia się na 20 minut, inkubując pod sterylnym strumieniem powietrza z otwartą pokrywką płytki.
  UWAGA: Warstwa agarozy powinna być co najmniej dwa razy grubsza niż stempel PDMS, aby zapewnić integralność mikrostudzienek agarozy po usunięciu stempla PDMS (Rysunek 1C).
6. Za pomocą sterylnej małej szpatułki dokładnie obróć agarozę z osadzonym stemplem PDMS do góry nogami w każdym dołku, aby uzyskać gładką powierzchnię stempla do góry. Dodaj ~200 μL sterylnej wody na gładką górną stronę stempla, delikatnie oderwij go od agarozy szpatułką i wyjmij z dołka. Unikaj uszkadzania mikrostudzienek.
7. Dodać 1 ml odpowiedniej sterylnej pożywki do hodowli komórkowych do stempli agarozy do bezpośredniego użycia. Przykryć płytkę pokrywką i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Do długotrwałego przechowywania (do 2 tygodni) należy użyć roztworu PBS (zamiast podłoża). Nie pozwól, aby agaroza wyschła. Przed użyciem ogrzewać płytki z mikrowzorem agarozy przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z stężeniem_CO2.
  UWAGA: Inkubacja jest potrzebna do zrównoważenia i usunięcia pęcherzyków powietrza z mikrostudzienek agarozowych. Przejdź do kroku 1.2 protokołu.
Przygotowanie sferoid z sondą O₂
1. Stosować α minimalną pożywkę egzogenną (MEM) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) oraz pożywką do wzrostu komórek śródbłonka uzupełnioną czynnikami wzrostu 2 do hodowli odpowiednio linii komórkowych hDPSC i HUVEC. Przygotuj heterokomórkową sferoidalną pożywkę wzrostową hDPSC / HUVEC, dodając pożywki wzrostowe HUVEC i hDPSC w stosunku 1:1.
2. Przygotuj 70%-90% zlewającą się hodowlę komórkową (~3-4 dni przygotowania). Do generowania sferoid heterokomórkowych należy przygotować odpowiednio kultury hDPSC i HUVEC.
  UWAGA: Liczba przejść HUVEC i hDPSC nie może przekraczać 8. Aby zapewnić szybki wzrost kultur komórkowych, należy je zawsze dzielić na 1/3 całkowitej hodowli komórkowej (przy 70%-80% konfluencji) za pomocą nowej kolby co 3 do 4 dni.
3. Przepłukać 70%-90% zlewającą się hodowlę komórkową wstępnie podgrzanym (37 °C) PBS (10 ml na 75 cm² kolbę). Dodać dysocjujący roztwór enzymu (0,05% trypsyny i 1 mM EDTA; 1 ml na 75 cm² kolby) i inkubować przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO₂, wilgotności 95% do oderwania komórek i sprawdzić oderwanie komórek pod mikroskopem. Po zakończeniu zneutralizuj trypsynę kompletną pożywką do hodowli komórkowych zawierającą 10% FBS (5 ml pożywki na 1 ml roztworu dysocjacyjnego).
  UWAGA: Zapobiegaj nadmiernej ekspozycji komórek na dysocjujący roztwór enzymu, ponieważ może to wpłynąć na ich żywotność.
4. W przypadku HUVEC hodowanego w pożywce o niskiej zawartości FBS należy przeprowadzić neutralizację trypsyny, dodając 0,5 ml 100% FBS do hodowli komórkowej traktowanej trypsyną, a następnie odwirować w celu przeniesienia komórek na pożywkę wzrostową.
  UWAGA: Otrzymana zawiesina komórkowa powinna zawierać ~1 milion komórek na 1 ml. W razie potrzeby do protokołu można dodać dodatkowy etap wirowania w celu zagęszczenia zawiesiny komórek.
5. Dysocjację agregatów komórkowych należy przeprowadzić poprzez pipetowanie za pomocą końcówki pipety o pojemności 1000 μl umieszczonej na górze pipety serologicznej o pojemności 10 ml w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Użyj komory zliczającej (hemocytometr typu Neubauera lub alternatywa), aby policzyć liczbę komórek na 1 ml zawiesiny komórkowej³⁴. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do 500 000 komórek na ml. W przypadku heterokomórkowego hDPSC / HUVEC w stosunku sferoidalnym 1:1 dodaj równe objętości odpowiednich zawiesin komórkowych, aby uzyskać końcowe stężenie komórek 500 000 komórek na ml.
  UWAGA: Zmiana stężenia komórek w zawiesinie dodanej do stempla agarozowego z mikrowzorem pozwala na zmianę średniej wielkości wytwarzanych sferoid, która zależy od liczby komórek na mikrodołek stempla agarozowego. W opisanym układzie sferoidy ~300 komórek są generowane z 1 ml zawierającego 500 000 komórek na stemplu agarozowym z 1585 mikrodołkami.
6. Dodać skoncentrowany roztwór sondy_O2 (nanocząstki, 1 mg/ml podstawowy) do przygotowanej zawiesiny komórek do końcowego stężenia 5 μg/ml.
  UWAGA: Tworzenie się sferoid w obecności nanocząstek wykrywających O₂ zapewnia wydajne barwienie, które jest utrzymywane przez co najmniej 5 dni (Rysunek 1D). Z kolei barwienie wstępnie uformowanych sferoid wielokomórkowych nanocząstkami będzie mniej wydajne¹⁵.
7. Wymienić 1 ml starych pożywek w mikrowzorzystej studzience z 12-dołkowymi płytkami do hodowli komórkowych pokrytych agarozą (patrz krok 1.1.7) na 1 ml przygotowanej zawiesiny komórkowej (500 000 komórek na 1 ml, z sondą 5 μg/ml_O2). Hodować sferoidy w inkubatorze CO₂ przez 2-5 dni w ciągłej obecności sondy_O2, aby zapewnić jej obciążenie podczas tworzenia i zagęszczania sferoidów.
  UWAGA: Unikaj nadmiernego parowania pożywki w kulturze sferoidalnej. W razie potrzeby ostrożnie (nie naruszać sferoid w mikrostudzienkach) dodać 0,2-0,5 ml pożywki hodowlanej z dodatkowym rozcieńczeniem sondy_O2.
8. Po utworzeniu sferoidy wymień pożywkę wzrostową na nową bez sondy. Barwienie sondy zostanie zachowane w wygenerowanych sferoidach przez 7-14 dni lub dłużej, co pozwoli na długoterminowe monitorowanie jej sygnałów w sferoidach.

2. Drukowanie biologiczne sferoidów

UWAGA: Sferoidy są biodrukowane w biotuszu na bazie żelatyny modyfikowanej metakrylamidem (GelMA). Poniżej znajduje się opis składników biotuszu, procedury przygotowania biotuszu i biodruku.

Przygotowanie biotuszu
1. Przygotować 10% (w/v) roztwór GelMA (2 ml) w pożywce pod laminarnym przepływem powietrza³⁵ w następujący sposób: odważyć 0,2 g sterylnego GelMA o stopniu podstawienia 78 w probówce o pojemności 15 ml, dodać 1,9 ml α-MEM i pozostawić do rozpuszczenia, mieszając na wytrząsarce obrotowej w temperaturze 37 °C (~2 h).
  UWAGA: Nie dodawaj pełnej ilości pożywki, ponieważ inne związki, takie jak sferoidy i fotoinicjator Li-TPO-L, zostaną dodane później.
2. Ponownie zawiesić sferoidy w studzienkach z mikrowzorami przez pipetowanie i zebrać je do probówki o pojemności 15 ml. Wykonaj dodatkowe płukanie PBS, aby upewnić się, że wszystkie sferoidy zostały zebrane z mikrostudzienek agarozowych. Unikaj dotykania/uszkadzania mikrostudzienek agarozy, ponieważ płatki agarozy mogą blokować igłę podczas bioprintingu.
3. Zebrać sferoidy przez odwirowanie w probówce o pojemności 15 ml o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Odessać supernatant za pomocą pipety, dodać 50 μl pożywki do sferoid i zawiesić je ponownie przez delikatne pipetowanie.
4. Dodać mieszaninę sferoidów do ciepłego roztworu GelMA i wymieszać delikatnie pipetując. Utrzymuj stężenie sferoidów na poziomie 6340-12860 sferoidów (z 4-8 mikrowzorów) na ml biotuszu do biodruku. Unikaj wyższych stężeń sferoid, ponieważ łatwo powoduje to zablokowanie igły drukującej.
5. Dodać wysterylizowany filtrem roztwór podstawowy Li-TPO-L (32 mg/ml) o końcowym stężeniu 2% molowym w stosunku do liczby wiązań podwójnych i wymieszać delikatnie pipetując³⁶^,³⁷.
  UWAGA: Ilość Li-TPO-L można obliczyć zgodnie z równaniem:
  Objętość fotoinicjatora (PI) = (0,000385 mol_{NH 2}- grupy / g GelMA x 294,10 g Li-TPO-L / mol x 0,78 x 0,02) / 0,032 g Li-TPO-L / ml x 0,2 g GelMA = 0,0107 ml zapasu Li-TPO-L
Procedura biodruku
1. Zapoznaj się z krokami w Protokole Uzupełniającym 1, aby zapoznać się z projektowaniem rusztowania w CAD. Aby wydrukować bioprint projektu, wykonaj poniższe czynności.
2. Zamknij koniec sterylnego wkładu o pojemności 3 ml nakrętką z końcówką (luer lock) i napełnij biotuszem przez pipetowanie. Włóż tłok do wkładu. Przytrzymaj wkład do góry nogami i zdejmij nasadkę końcówki, popchnij tłok w kierunku biotuszu, aż całe powietrze z wkładu zostanie usunięte.
  UWAGA: Należy unikać kontaktu biotuszu GelMA z bokami wkładu, ponieważ może to hamować ruch tłoka z powodu żelowania biotuszu.
3. Pozwól biotuszowi ostygnąć w płaszczu grzewczym biodrukarki w temperaturze 23 °C (20-30 min). Wkręć adapter ciśnieniowy na górze wkładu. Zamknij zacisk na rurce wlotowej, aby zapobiec wyciekaniu biotuszu, zamontuj stożkową igłę PE 22 G na kartridżu. Dostosuj rozmiar i średnicę igły do konstrukcji rusztowania oraz średnicy i stężenia sferoidy.
  UWAGA: Noś maskę na usta i spryskane rękawice, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
4. Spryskaj biodrukarkę 70% etanolem i wytrzyj ją do sucha papierem absorpcyjnym. Zainstaluj wkład w płaszczu grzewczym na głowicy drukującej opartej na wytłaczaniu. Podłącz wlot ciśnienia i otwórz zacisk na wlocie. Załaduj plik G-code swojego projektu do oprogramowania do drukowania.
5. Rozpocznij pomiar długości igły. Reguluj ciśnienie drukowania, dozując trochę biotuszu na sterylnej szalce Petriego. Ciśnienie druku 0,025-0,045 MPa jest typowe dla druku biotuszów na bazie GelMA³⁸.
6. Zainstaluj płytkę 6-dołkową, otwórz płytkę dołka, zamknij pokrywę i rozpocznij drukowanie. Po wydrukowaniu pozostaw rusztowania do fizycznego usieciowania przez 10 minut w temperaturze 5 °C i naświetlaj wydrukowane rusztowania przez 60 s lampą UV LED (365 nm; 500 mW wg producenta).
  UWAGA: Czas sieciowania UV zależy od właściwości światła UV, typu i stężenia fotoinicjatora, pożądanego stopnia usieciowania rusztowania, pęcznienia i modułu sprężystości.
7. Natychmiast dodać odpowiednią pożywkę wzrostową zawierającą 100 j./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (P/S) do wszystkich studzienek z biodrukowanymi siatkami (2 ml na studzienkę 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej).
8. Hodowlę w inkubatorze CO₂ o temperaturze 37 °C do momentu rozpoczęcia mikroskopii. W przypadku mikroskopii konstrukcji biodrukowanych przenieś wydrukowaną siatkę waflową do naczynia mikroskopowego, przykryj nośnikiem obrazowym i wykonaj kroki 3.2 i 3.3.
  UWAGA: W przypadku pływających konstruktów z biodruku, muszą one być utrwalone w naczyniu mikroskopowym bez wpływu na żywotność komórek, np. za pomocą kleju cytokompatybilnego. W przypadku transferu za pomocą mikroskopu odwróconego, bioprint należy umieścić w naczyniu mikroskopowym ze szklanym dnem i przykryć nośnikiem obrazowym (~200-500 μL, patrz uwaga do kroku 3.1 dotycząca składu nośnika do obrazowania), aby uniknąć niepożądanego unoszenia się próbki. Barwienie za pomocą dodatkowych sond fluorescencyjnych można przeprowadzić w naczyniu do hodowli komórkowej przed przeniesieniem biodrukowanych konstruktów do naczyń mikroskopowych (patrz krok 3.1.6).

3. Ratiometryczna fluorescencyjna mikroskopia na żywo natlenienia sferoidalnego w biofabrykowanej tkance

UWAGA: Aby przeliczyć ratiometryczną odpowiedź intensywności (R) sondy O₂ na rzeczywiste poziomy niedotlenienia, odpowiedź sondy musi być skalibrowana przy użyciu procedur opisanych w²⁴. Ponieważ jednak kalibracja ratiometryczna jest specyficzna dla danego urządzenia i wymaga zainstalowania inkubatora sterowanego T/O₂/CO₂ (nie zawsze dostępnego), preferowaną opcją jest zastosowanie półilościowego wykrywania proporcji.

Przygotowanie sferoid do analizy obrazowania na żywo
1. W celu przyłączenia sferoidów na tym etapie, wstępnie pokryj sterylne naczynia mikroskopowe kolagenem IV i/lub poli-D-lizyną lub użyj dostępnych na rynku³⁹. Sprawdź kompatybilność naczyń mikroskopowych z odległością roboczą i innymi cechami obiektywu mikroskopu.
  UWAGA: W przypadku obrazowania wieloparametrowego wszystkie dodatkowe procedury barwienia muszą być wykonywane w szalkach na płytkach hodowlanych z wystarczającą ilością pożywki chroniącej komórki przed parowaniem, szokiem osmotycznym lub innym stresem. Przed użyciem przygotować i podgrzać pożywkę do obrazowania: DMEM uzupełniony wodorowęglanem sodu (1,2 g/L), HEPES-Na, pH 7,2 (10 mM), pirogronianem sodu (1 mM), L-glutaminą (2 mM) i glukozą (5 mM), bez czerwieni fenolowej.
2. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml delikatnie wypłukać wstępnie wybarwione sferoidy z sondy_O2 z mikrostudzienek agarozy. Podczas gdy sferoidy nadal unoszą się w pożywce, przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
3. Aby zapewnić zebranie wszystkich sferoid ze studzienki z mikrowzorami, należy przepłukać studzienkę 1 do 3 razy dodatkowym 1 ml pożywki hodowlanej, łącząc wszystkie zawiesiny sferoidalne w jednej fiolce. Pozostawić fiolkę w pozycji pionowej na maksymalnie 10 minut, aby sferoidy osiadły na dnie fiolki, tworząc widoczną osadówkę.
4. Ostrożnie wyjmij pożywkę z rurki, pozostawiając sferoidy w spokoju. Delikatnie zawiesić je ponownie w ilości świeżej pożywki hodowlanej, która będzie wystarczająca na co najmniej 20 sferoid na naczynie na próbkę mikroskopową. Zminimalizuje to zużycie pożywek hodowlanych i uprości lokalizowanie sferoid podczas obrazowania.
  UWAGA: Użyj autoklawowalnej silikonowej części μ-komorowej płytki 12-dołkowej (patrz Tabela materiałów) przymocowanej do szkła nakrywkowego jako naczynia na próbki mikroskopowe (24 x 60 mm, grubość #1) o maksymalnej objętości pożywki 300 μl na studzienkę. Silikonowa część tej komory hodowlanej może być sterylizowana i ponownie używana z dowolnymi innymi powierzchniami plastikowymi i szklanymi po przyklejeniu do naczynia.
5. Natychmiast dodać równą objętość zawiesiny sferoidalnej do każdej płytki mikroskopowej/studzienki. Pozostawić sferoidy na 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO₂ w celu przymocowania do powierzchni naczynia mikroskopowego. W przypadku analizy natleniania w połączeniu z użyciem innych barwników należy postępować zgodnie z krokiem 3.1.6. W celu prostej analizy natlenienia należy postępować zgodnie z krokiem 3.1.7.
  UWAGA: Niewystarczający czas inkubacji (<1 h) może prowadzić do sporadycznego usuwania sferoidów i utraty podczas wymiany pożywki, co przerywa eksperyment. Jednocześnie nadmierna inkubacja (>3 h) może prowadzić do częściowej lub całkowitej utraty ich organizacji 3D z powodu migracji komórek ze sferoid na powierzchnię czaszy mikroskopowej i wpływając na ich natlenienie w czasie rzeczywistym.
6. (opcjonalnie) Ostrożnie wymienić pożywkę na pożywkę zawierającą sondę fluorescencyjną (sondy) fluorescencyjną rozcieńczoną do stężenia barwiącego i kontynuować inkubację przez dodatkowy 1 godzinę, aby osiągnąć optymalną intensywność. Aby uniknąć usunięcia sferoid podczas wymiany pożywki, należy ostrożnie odessać pożywkę pipetą o pojemności 200 μl od krawędzi naczyń mikroskopowych i przeprowadzić dodawanie pożywki z boku w naczyniu mikroskopowym. Przejdź do kroku 3.1.7.
  UWAGA: Aby uzyskać skuteczne barwienie sondami o słabej dyfuzji w agregatach wielokomórkowych, należy wydłużyć stężenie obciążenia i/lub czas. Przed użyciem określ opcjonalne parametry obciążenia sondy we wstępnych eksperymentach.
7. Wyjmij pożywkę z naczynia mikroskopowego i spłucz raz pożywką do obrazowania. Dodać dokładną ilość pożywki do obrazowania do próbki (np. 300 μl na mikrodołek w komorze μ 12-dołkowej płytki hodowlanej). Przejdź do kroku 3.2.
Akwizycja obrazu
1. Włącz mikroskop i podłączone urządzenia (tj. źródło światła wzbudzającego, kamerę, komputer, inkubator i inne działające bloki elektroniczne) 30 minut przed obrazowaniem, aby się rozgrzały i zrównoważyły warunki pomiaru (temperatura, różne wartości_O2, 5% CO₂, wilgotność, jeśli jest to wymagane). Uruchom oprogramowanie operacyjne mikroskopu dostarczone z dokładną konfiguracją mikroskopu.
  UWAGA: Opisany protokół jest dostosowany do oprogramowania CellSens Dimension v.3.
2. Dobierz odpowiednie filtry wzbudzenia (źródła, mocy) i emisji oraz czas naświetlania dla wybranych sond fluorescencyjnych (lub fosforyzujących). W przypadku analiz wieloparametrowych, 3D i mikroskopii poklatkowej należy zapisać protokoły automatycznych sekwencji pomiarowych w oprogramowaniu mikroskopu operacyjnego.
3. Empirycznie określ optymalne ustawienia obrazowania dla każdej sondy, modelu eksperymentalnego i linii komórkowej we wstępnych eksperymentach. Upewnij się, że ustawienia mają minimalne fotowybielanie w kanałach referencyjnych (I_ref) i O₂ detekcji (I_sens) oraz minimalny wpływ na współczynnik intensywności (R = I_ref / I_sens), szczególnie w eksperymentach z pomiarami 3D i poklatkowymi.
4. Ustaw naczynie mikroskopowe z barwionymi sferoidami na stoliku mikroskopowym. Korzystając z obiektywu o małym powiększeniu, wyświetl podgląd próbki w świetle transmisyjnym, wykonaj wstępne ustawienie ostrości na sferoidach i umieść je w środku obrazu.
  UWAGA: Do wstępnego ustawiania ostrości wystarczą standardowe obiektywy powietrzne o powiększeniu od 4x do 10x, natomiast do rzeczywistego pomiaru zalecamy obiektywy o aperturze numerycznej (NA) od 20x do 40x z obiektywami o aperturze numerycznej (NA) 0,6 lub większej (zanurzenie w powietrzu lub wodzie) o wystarczającej odległości roboczej dla sferoid przymocowanych do czaszy.
5. Ustawić obiektyw z wymaganym dużym powiększeniem w pozycji roboczej. Skoncentruj się na trybie światła transmisyjnego w środkowym (równikowym) przekroju sferoidy. Natlenienie w obiektach 3D zależy bezpośrednio od głębokości przekroju obrazowania. Aby to zapewnić, przeanalizuj podobne przekroje w grupach i między nimi, np. środkowe i górne/dolne przekroje sferoid.
  UWAGA: W celu szczegółowej i precyzyjnej analizy i rekonstrukcji gradientów_O2 zalecamy skanowanie i tworzenie stosów Z za pomocą mikroskopów konfokalnych, arkuszy świetlnych lub mikroskopów dwufotonowych (najlepsza opcja). W przypadku konwencjonalnej mikroskopii szerokokątnej, w której sygnał ze wszystkich przekrojów będzie zbierany jednocześnie, można przeprowadzić średnie oszacowanie na podstawie środkowego przekroju poprzecznego, a nie dokładną analizę gradientów_O2. W tym przypadku środkowy przekrój poprzeczny jest definiowany jako przekrój ogniskowy, w którym sferoidy mają maksymalną średnicę z ostrym ogniskiem na ich granicach.
6. Dostosuj ustawienia zbierania sygnałów fluorescencji/fosforescencji referencyjnych i czułych kanałów spektralnych sondy_O2 i innych sond fluorescencyjnych stosowanych do obrazowania wieloparametrycznego.
7. W celu ilościowego porównania opartego na intensywności zastosuj te same wybrane ustawienia obrazowania dotyczące czasu ekspozycji, mocy wzbudzenia źródła światła, rozdzielczości, prędkości skanowania i rozmiaru otworu dla wszystkich mierzonych obiektów w grupach.
  UWAGA: Wiele wersji oprogramowania do mikroskopii dostarczonych przez dostawców umożliwia automatyczne obliczanie współczynnika natężenia. Zastosuj scalanie funkcji do pomiarów intensywności kanałów odniesienia i czułych kanałów sondy_O2, podczas pisania programu akwizycji obrazowania w menedżerze eksperymentów w używanym tutaj oprogramowaniu do obrazowania.
8. Zbierz obrazy z tej samej sekcji optycznej dla referencyjnych i czułych kanałów widmowych sondy_O2 oraz, w razie potrzeby, dodatkowych kanałów fluorescencyjnych. Dla tego protokołu należy użyć sondy MMIR1 z czerwonym widmem odniesienia (exc. = 580 nm, em. = 650 nm) i czułym na bliską podczerwień O₂ (exc. =635 nm, em. = 760 nm).
9. Powtórzyć kroki 3.2.5–3.2.8, aby zebrać wystarczającą liczbę punktów danych do analizy statystycznej. Do dynamicznej analizy szybko zmieniających się odpowiedzi komórkowych po leczeniu różnymi lekami, mitochondrialnymi rozprzęgaczaczami lub inhibitorami łańcucha transportu elektronów i innymi szybko działającymi związkami należy użyć trybu pomiaru poklatkowego (krok 3.2.10).
10. Pomiary należy wykonywać w pożywkach obrazowych, w temperaturze 37 °C z okresowym oświetleniem próbki i zbierać sygnały z interesujących fluoroforów (np. sondy_O2 kanałów odniesienia i czujników), np. co 10 s przez ponad 2 minuty.
11. Po wykonaniu pomiarów okresowych wykonaj kontrolę ostrości dla każdej sferoidy, aby upewnić się, że podczas obrazowania nie wystąpił dryft ostrości. W razie potrzeby czynność powtórzyć. Przejdź do kroku 3.3 w celu analizy danych.
  UWAGA: Bez stymulacji komórek i dodawania leku można wykonać pomiar poklatkowy w celu oceny fotostabilności w porównaniu z barwnikiem referencyjnym, np. fluoresceiną, zielenią kalceinową AM lub estrem metylowym tetrametylorodaminy.
Prezentacja obrazu
UWAGA: Tutaj opisujemy, jak automatycznie obliczyć współczynnik intensywności sondy O₂ (R) w sferoidach za pomocą funkcji analizy proporcji w oprogramowaniu do obrazowania i zastosować obliczenia R piksel po pikselu w celu wygenerowania obrazów rozkładu R w sztucznych kolorach sekcji mikroskopii sferoidalnej. R można również obliczyć ręcznie na podstawie danych intensywności referencyjnych i czułych kanałów spektralnych zebranych z tego samego obszaru zainteresowania (ROI) obrazu sferoidalnego, stosując prosty wzór R = I_ref/I_sens²⁴^,³⁴. Jeśli nie jest możliwe wyodrębnienie danych o intensywności z surowego obrazu w odpowiednim oprogramowaniu mikroskopowym, dane dotyczące intensywności można uzyskać za pomocą takich programów jak ImageJ lub Fiji (patrz Dyskusja).
1. Otwórz plik .vsi z danymi o intensywności sondy O₂ z referencyjnych i czułych kanałów spektralnych utworzonych w trybie scalonym. Otwórz okno funkcji analizy proporcji z menu pomiaru. Wybierz intensywność kanału odniesienia jako licznik i intensywność kanału wrażliwego jako mianownik do obliczenia R.
  UWAGA: Możliwy jest również odwrócony stosunek sygnałów odniesienia i czułych do obliczenia R, ale w tym przypadku R będzie się zmniejszać wraz ze wzrostem O₂ .
2. Zastosuj odpowiednie ustawienia progu intensywności do każdego kanału spektralnego, aby odjąć tło od scalonego obrazu intensywności. Zwiększaj wartości progowe, aż tło obrazu stanie się jednolicie czarne. Parametr threshold należy zastosować równomiernie do wszystkich obrazów sferoidalnych w zbiorze danych używanym w analizie porównawczej.
  UWAGA: Użyj okna podglądu, aby zoptymalizować ustawienia progowe, obserwując wstępnie obliczony obraz sferoid w fałszywym kolorze R. Wszystkie piksele o intensywności mniejszej niż bieżąca wartość w polu progowym zostaną usunięte z analizy R i przedstawione jako czarne punkty. Po zastosowaniu progu należy uwidocznić tylko obszar odpowiadający fluorescencji sferoidalnej. Wstępne oszacowanie średniego natężenia tła (obszary bez sferoid) niezależnych kanałów widmowych upraszcza wybór odpowiedniego progu do obrazu. Dodatkowo, zastosowanie sferoidalnych granic ROI, zidentyfikowanych na podstawie odpowiedniego obrazu sferoidalnego światła transmisyjnego do połączonego obrazu fluorescencyjnego, pomaga w dokładnym określeniu parametrów progowych, aby zapobiec nadmiernemu odejmowaniu intensywności sygnału innego niż tło.
3. Zachowaj ustawienia tła dla intensywności licznika i mianownika na poziomie 0, ponieważ tło zostało już odjęte za pomocą zastosowania progu.
4. Dostosuj współczynnik skalowania (Skala) do obrazu o proporcjach, aż obraz podglądu zapewni żądaną rozdzielczość gradientu R. Zastosuj parametr skalowania równomiernie do wszystkich obrazów sferoidalnych w zestawie danych używanym w analizie porównawczej.
  UWAGA: Parametr skalowania powinien być wystarczająco duży (co najmniej 1 000), aby zapewnić, że obraz R zawiera jak najwięcej informacji i może być wyświetlany jako współczynnik rozdzielczości dla danych liczbowych R.
5. Zastosuj dostosowane parametry do obrazu sferoidalnego, naciskając przycisk Zastosuj. Dostosuj jasność i kontrast obrazu w oknie dostosowywania ekranu z menu okien narzędzi.
6. Ręcznie określ limity łączenia i rozłączania histogramu rozkładu proporcji za pomocą opcji stałego skalowania w oknie Dostosuj ekran. Spowoduje to określenie zakresu paska w sztucznych kolorach dla parametru R presentation.
  UWAGA: Aby porównać obrazy sferoidalne między różnymi grupami, ważne jest, aby zachować podobny zakres kolorów dla wszystkich próbek analitycznych. Z uwagi na to, że zakres zmian parametru R może być różny pomiędzy grupami, wybrany zakres słupków w kolorze fałszywym powinien być uniwersalny dla histogramów rozkładu we wszystkich grupach analitycznych.
7. Sferoidy często nie są idealnie kuliste, załóżmy, że średnica sferoidy jest najdłuższą linią poprowadzoną przez środek (często niedotlenione jądro) sferoidy. Korzystając z funkcji linijki liniowej z menu pomiaru, określ średnicę sferoidy. Eksportuj dane jako plik tabeli arkusza kalkulacyjnego.
8. Wybierz ROI o wymaganym rozmiarze (jak najmniejszym) i kształcie (np. okrągłym) i zastosuj go do obwodu i niedotlenionego rdzenia sferoidy. Przekształć ROI w mierzony obiekt, aby przeanalizować średni R (peryferyjny R-R_p i rdzeń R-R_c) wewnątrz wybranego ROI. Eksportuj dane w formacie tabeli zgodnym z arkuszem kalkulacyjnym.
  UWAGA: Sferoidy nie mają identycznego rozkładu_O2w grupie, a niedotlenione jądra nie są idealnie kolokalizowane z centrami sferoidalnymi. Aby uprościć i ustandaryzować analizę, zakładamy, że najbardziej niedotlenione obszary odpowiadają idealnemu jądru w środku sferoidy. R_cmierzone w tych strefach stosuje się do obliczeń zakresu gradientu O₂ (R_p-R _c) i stromości (R_p-R _c) /r, gdzie r (najlepiej odległość między obwodem a niedotlenionymi rdzeniem ROI) jest przybliżonym promieniem sferoidy w μm obliczonym na podstawie pomiarów średnicy. Opcjonalnie gradienty sferoidalne O₂ mogą być prezentowane jako liniowe profile liniowe zmiany parametru R (okno profilu linii w menu miary) wykonane wzdłuż średnicy sferoidy. Dane te można również wyeksportować jako plik tabeli arkusza kalkulacyjnego.
9. Zastosuj pomiary do każdej sekcji mikroskopowej sferoid, aby uzyskać zestaw danych o średnicach sferoid, R_c i R_pw celu wykonania dalszych obliczeń i porównań statystycznych. Połącz wszystkie dane w jednym pliku arkusza kalkulacyjnego.
10. Aby przeprowadzić analizę poklatkową fotowybielania lub dynamicznych reakcji na różne bodźce, zastosuj wybrany zwrot z inwestycji do tych samych współrzędnych na każdym obrazie w zestawie. Aby porównać parametry R, przedstaw je jako procent od R pierwszego cyklu w zestawie zdjęć poklatkowych.
11. Do analizy fotowybielania użyj R z kilku ROI, aby obliczyć średnie R w procentach dla każdego cyklu poklatkowego i śledzić zmiany.
12. Załóżmy, że efekt fotowybielania nie jest krytyczny, jeśli po 12 cyklach ciągłego oświetlenia nastąpił spadek początkowej intensywności o mniej niż 5%. Zawsze porównuj dynamiczne zmiany z krzywą fotobielenia jako kontrolą, aby upewnić się, że istotność ratiometrycznej reakcji poklatkowej (patrz Rysunek 2A,B).
13. Z otrzymanych parametrów obliczyć r, (R_p-R _c) i (R_p-R _c) / r dla poszczególnych sferoid w zbiorze danych. Przeanalizuj normalność rozkładu danych za pomocą testów Kołmogorowa-Smirnowa lub odpowiednich testów. Wybierz odpowiednią metodę statystyczną do analizy danych i przystąp do prezentacji danych liczbowych.
  UWAGA: Przedstawione tutaj dane miały rozkład normalny i zastosowano niezależny test t przy p = 0,05 w celu porównania statystycznego między grupami sferoidalnymi.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysokoprzepustowa produkcja wstępnie barwionych sferoidów sondy O₂ przy użyciu metody agarozy mikrowzorzystej jest schematycznie zilustrowana w Rysunek 1C pokazujący przykłady mikrostudzienek agarozowych bez i z wstępnie wybarwionymi sferoidami. Skuteczność tworzenia sferoidów na powłoce agarozowej i ich kształt/kulistość mogą być specyficzne dla komórki. Na przykład, ludzkie komórki HCT116 jelita grubego nigdy nie tworzyły idealnych struktur sferycznych przy użyciu metody mikrostudzienki agarozowej, w przeciwieństwie do pokrytej lipidami powierzchni¹⁷, podczas gdy hDPSC same i współhodowane z HUVEC zawsze wytwarzały sferoidy o wysoce powtarzalnym kształcie i rozmiarze, proporcjonalnym do składu komórki, początkowej liczby komórek i czasu powstawania/wzrostu sferoidów. Wszystkie badane typy komórek skutecznie gromadziły nanocząstki sondy O₂ podczas tworzenia sferoidy (Rysunek 1B) i zachowywały to barwienie przez co najmniej 5 dni, co pozwoliło na ich wykorzystanie do biodruku i późniejszego monitorowania natlenienia tkanki drukowanej (Rysunek 1D).

figure-results-1
Rysunek 1: Zasada działania funkcji sondy O₂ i jej zastosowanie do barwienia sferoidowego i bioprintingu. (A) Uproszczony diagram Yablonskiego, wyjaśniający zasadę wykrywania_O2 przez sondy fosforyzujące nanocząstki (NP). Przeniesienie energii do cząsteczki_O2 podczas zakazanego stanu wzbudzonego trypletem (T) prowadzi do spadku intensywności fosforescencji odwrotnie proporcjonalnie do czasu życia fosforescencji tau, τ (zmiany od τ₁ przy 0% O₂ do τ₂ przy 21% O₂), czyli czas pomiędzy wzbudzeniem do stanu singletowego (S₁) a jego powrotem do stanu podstawowego (G₀)⁴². Ilościowy pomiar_O2 można wykonać za pomocą pomiaru ratiometrycznego lub pomiaru τ (pomiary żywotności fosforescencji). (B) Przykład barwienia sferoidów ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej (hDPSC) barwionych różnymi typami sond nanocząsteczkowych O₂, pokazanych w kanałach fluorescencji światła transmisyjnego, referencyjnego i barwnika wrażliwego na O₂. Podziałka wynosi 100 μm. (C) Schematy wysokoprzepustowej generacji wstępnie barwionej sferoidy sondy O₂metodą agarozy mikrowzorzystej. Od lewej do prawej: stempel silikonowy PDMS umieszczony w studzience płytki hodowlanej, przykład wzoru mikrodołka w agarozie (powiększenie 4x) oraz przykład wstępnie wybarwionych sferoidów MMIR1 wytworzonych z ludzkich komórek raka jelita grubego HCT116 w 2 dniu po wysiewie na agarozie z mikrowzorem (powiększenie 4x). Podziałka wynosi 100 μm. (D) Od lewej do prawej: biodrukowany konstrukt waflowy i analiza mikroskopowa wstępnie barwionego sferoidalnego konstruktu biodrukowanego MMIR1 w 1 i 5 dniu po biodruku. Sygnał fluorescencyjny odpowiada czułemu na O 2-czułemu barwnikowi fosforyzującemu w nanocząstkach MMIR1 (exc. = 635 nm/em. = 760 nm). Podziałka wynosi 400 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Na opisanym zestawie mikroskopowym (konwencjonalny szerokokątny mikroskop fluorescencyjny wyposażony w diodę elektroluminescencyjną (LED) jako źródło światła) czerwona/bliska podczerwień sonda MMIR1 została uznana za najlepszą pod względem fotostabilności swoich referencyjnych i wrażliwych barwników z mniejszym niż 5% spadkiem jasności ich początkowego współczynnika intensywności (R = I_ref/I_sens) po 12 cyklach ciągłego oświetlenia. Pozwoliło to na wykorzystanie sondy MMIR1 do dynamicznego badania w czasie rzeczywistym szybkiej reakcji oddechowej w sferoidach hDPSC po leczeniu rozprzęgaczem mitochondrialnym (FCCP) i inhibitorem kompleksu I łańcucha transportu elektronów (rotenonu) (Rysunek 2A,B). Odkryliśmy, że w sferoidach pochodzących z komórek macierzystych FCCP wykazywał tylko łagodny efekt rozprzęgania z niewielkim spadkiem oddychania komórkowego w ciągu ~80 s po dodaniu tego leku, zgodnie z wcześniej zgłaszanymi cechami metabolicznymi DPSC⁴⁰. Z drugiej strony, rotenon silnie hamował oddychanie, prowadząc do reoksygenacji sferoid (odzwierciedlonej jako wzrost stosunku R_p - sferoidy obwodowej i R_c - sferoidalnego rdzenia) i rozproszenia gradientów O₂ od peryferii do rdzenia w ciągu ~80 s po stymulacji (Rysunek 2A). Dwupunktowa półkalibracja współczynnika MMIR1 sondy (R) przy wysokich (atmosferycznych) i niskich (w obecności siarczynu sodu i oksydazy glukozowej w pożywkach obrazowych) poziomów_O2 potwierdziła spadek R, związany ze spadkiem natlenienia sferoid ze wstępnym zahamowaniem oddychania przez leczenie koktajlem antymycyny A / rotenonu (Rysunek 2C), ilustrując, w jaki sposób pomiar sondy R MMIR1 może być stosowany do półilościowego monitorowania długoterminowych reakcji na natlenienie w stanie ustalonym i szybkim w 3D.

figure-results-2
Rysunek 2: Analiza kinetyczna reakcji sondy O₂ na różne bodźce. (A) Reprezentatywny wynik obrazowania natlenienia sferoidalnego hDPSC w spoczynku i w odpowiedzi na leczenie FCCP i rotenonem. Podziałka skali wynosi 100 μm. (B) Odpowiedź kinetyczna stosunku intensywności MMIR1 na FCCP i leczenie rotenonem w porównaniu z kinetyką początkowego współczynnika intensywności fotowybielania (%). (C) Zmiany w obrazach współczynnika intensywności sondy MMIR1 w sferoidach hDPSC w stanie utlenienia (addycja antymycyny A + rotenonu) i odtlenienia (dodatek oksydazy glukozowej). Kolorowy pasek reprezentuje rozkład współczynnika intensywności sondy O₂ (R = I_ref / I_sens) na obrazie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby zilustrować zastosowanie sondy MMIR1 do obrazowania metabolicznego na żywo, przeprowadzono analizę porównawczą gradientów O₂ w sferoidach homokomórkowych hDPSC w porównaniu z heterokomórkowymi sferoidami hDPSC/HUVEC (1:1). Wykorzystując dostępność wolnych kanałów spektralnych niebieskiej i zielonej fluorescencji, przeprowadzono jednoczesne barwienie z Hoechst 34580 (HXT) i SYTOX Green (SYTOX) w celu zademonstrowania zastosowania sondy O₂ do badań wieloparametrycznych (Rysunek 3). Korzystając z automatycznego protokołu obliczeń współczynnika intensywności piksel po pikselu dostarczonym przez oprogramowanie do obrazowania, uzyskano obrazy rozkładu R w sferoidach o sztucznych proporcjach kolorów, wizualizując w czasie rzeczywistym wykryte gradienty O₂ od peryferii do rdzenia we wszystkich typach sferoid: z natlenionymi peryferiami i niszami niedotlenionymi w środku (Rysunek 2 i Rysunek 3A). Jednak wartości R_p i R_c, a także stromość gradientu O₂ w środkowych przekrojach poprzecznych różniły się dla różnych typów sferoidów: patrz profile liniowe środkowych przekrojów w sferoidach hDPSC w porównaniu ze sferoidami hDPSC/HUVEC i hDPSC w porównaniu ze sferoidami hDPSC drukowanymi (Rysunek 3B,C). Z uwagi na brak powszechnie akceptowanego sposobu opisu gradientów_O2 wprowadziliśmy kilka parametrów pozwalających na łatwe porównanie i szczegółowy opis ogólnego natlenienia sferoidalnego: R_p i_{R c} oraz takie charakterystyki gradientów O₂ jak różnica między strefami utlenionymi i niedotlenionymi jak (R_p-R _c) oraz średnie zmiany natlenienia na μm jako (R_p-R _c) / r, gdzie r jest odległością między obwodem a niedotlenionym jądrem, korelującą w środkowym przekroju z promieniem sferoidalnym (Rysunek 3D). Statystyczne porównanie tych parametrów wraz z danymi z martwych komórek martwiczych uwidocznionych przez SYTOX w sferoidach, pomogło nam wyciągnąć wstępne wnioski na temat pochodzenia gradientów dystrybucji O₂specyficznych dla komórek sferoidalnych.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza porównawcza gradientów natlenienia w sferoidach. (A) Reprezentatywne przykłady żywej mikroskopii natlenienia (ratiometryczna mikroskopia fluorescencyjna MMIR1) i barwienia żywych/martwych komórek (Hoechst 34580, HXT, niebieski i SYTOX zielony, SYTOX) w sferoidach homokomórkowych hDPSC przed i po wydrukowaniu oraz sferoidach heterokomórkowych hDPSC/HUVEC (1:1). hDPSC we wszystkich typach sferoid pochodziły z tej samej hodowli komórkowej. Sferoidy były wstępnie barwione 5 μg/ml sondy MMIR1 przez 2 dni podczas ich formowania, a następnie używane do obrazowania lub biodrukowania (tylko sferoidy hDPSC), z późniejszą analizą obrazową w 1 dniu po bioprintingu. Obrazy w sztucznych barwach obrazów o współczynniku intensywności (I_ref/I_sens) sferoid barwionych MMIR1 odpowiadają ich gradientom O₂od peryferii do rdzenia. Podziałka wynosi 100 μm. Kolorowy pasek reprezentuje rozkład współczynnika intensywności sondy O₂ (R = I_ref/I_sens) na obrazie. Numery 1 i 2 przekrojów średnic odpowiadają profilom intensywności pokazanym w B i C. (B,C) Porównanie profili współczynnika intensywności między jednorodnymi sferoidami hDPSC a heterogenicznymi sferoidami hDPSC/HUVEC (B) i jednorodnymi sferoidami hDPSC przed i po biodrukowaniu (C). Profile zostały zmierzone dla przekrojów sferoid pokazanych na (A). (D) Schematyczne przedstawienie parametrów używanych do opisu gradientów_{O 2} od peryferii do rdzenia w sferoidach, gdzie r jest promieniem sferoidy, a R_p i R_c są odpowiednio stosunkami intensywności obwodu i obszaru rdzenia sferoidy. Kolorowy pasek schematycznie przedstawia rozkład gradientu_O2od wysokich (czerwonych) do niskich (niebieskich) poziomów w idealnie sferoidalnej sferoidzie. (E,F) Analiza porównawcza gradientów_{O 2} od peryferii do rdzenia (R,_p-R,_c) / wartości r w sferoidach hDPSC/HUVEC i hDPSC (E) oraz w sferoidach hDPSC przed i w dniu 1 po biodrukowaniu (F). Analizę statystyczną przeprowadzono dla jednego powtórzenia doświadczalnego (n = 18-23). Pola odpowiadają odchyleniom standardowym. Gwiazdki wskazują statystyczną różnicę między grupami (przy p = 0,05); ** = p < 0,0005. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W porównaniu do sferoid homokomórkowych hDPSC, sferoidy hDPSC/HUVEC miały znacznie bardziej strome nachylenia: wyższe wartości parametru (R_p-R _c) / r parametru i zakresu (R_p-R _c; Rysunek 3F). Jednocześnie wykazywały one wyższe natlenienie obwodu (R_p) i rdzenia (R_c) (Rysunek 4A, Tabela 1). Co ciekawe, były one również statystycznie większe (Rysunek 4A, Tabela 1), co sugeruje, że takie różnice w natlenieniu były spowodowane ich różnymi profilami bioenergetycznymi komórek. Dane te są zgodne z dobrze znanymi cechami metabolicznymi komórek HUVEC, które mają ogólnie niższą aktywność oddechową komórek z silnym uzależnieniem od szlaków glikolizy i pentozo-fosforanu jako głównych źródeł bioenergetycznych ATP i NAD(P)H⁴¹. Jednocześnie wyraźny gradient O₂ od peryferii do rdzenia utworzony w heterogenicznych sferoidach jest prawdopodobnie generowany przez hDPSC w ich składzie, charakteryzującym się hiperspolaryzowanymi mitochondriami i aktywnym łańcuchem transportu elektronów⁴⁰ i, zgodnie z wynikami natlenienia sferoid hDPSC, o silnej aktywności oddechowej (Rysunek 3, Rysunek 4A i Tabela 1). Tak więc, ogólnie wyższa żywotność sferoidów hDPSC / HUVEC potwierdzona niższą intensywnością barwienia ich martwych komórek za pomocą SYTOX (Figura 3A) jest potencjalnie związana z ich wyższymi poziomami natlenienia.

Aby zilustrować możliwość zastosowania obrazowania sferoidowego w biofabrykacji za pomocą obrazowania mikroskopowego na żywo w biofabrykacji, do biodruku w biotuszu GelMA użyto wstępnie barwionych sferoidów MMIR1 O_2-probe z następującym porównaniem gradientów O₂ w sferoidach hDPSC przed i w dniu 1 po biodruku (Rysunek 3A,C,F, Rysunek 4B i Tabela 2). Sferoidy hDPSC z nadrukiem biologicznym miały znacznie utlenione peryferia (wyższe R_p) w porównaniu ze sferoidami, mierzone przed biodrukowaniem, podczas gdy ich natlenienie rdzenia miało podobne wartości (Ryc. 4B). Zmiany w ich natlenieniu na obrzeżach wpływają na zakres (wzrost (R_p-R _c) i stromość (zwiększony (R_p-R _c)/r) ich gradientów O₂ od peryferii do rdzenia, które różniły się statystycznie od sferoid hDPSC mierzonych przed biodrukowaniem (Rysunek 3F i Rysunek 4B). Barwienie martwych komórek było na ogół jaśniejsze w sferoidach z nadrukiem biologicznym, co sugeruje, że zmniejszona żywotność sferoidów jest zaangażowana w zmianę natlenienia sferoidów (Ryc. 3A).

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza porównawcza średnicy i intensywności sferoid barwionych MMIR1. (A) Porównanie sferoid hetero- hDPSC/HUVEC i homokomórkowych hDPSC. (B) Porównanie homokomórkowych sferoidów hDPSC przed i po bioprintingu. R_p i R_c - stosunek intensywności odpowiednio na obrzeżach i w jądrze sferoid; (R_p-R _c) - różnica we współczynniku natężenia, odpowiadająca zakresowi gradientu_O2 w sferoidach. Analizę statystyczną przeprowadzono dla jednej kontrpróby eksperymentalnej (n = 18-23). Pola odpowiadają odchyleniom standardowym. Gwiazdki wskazują różnicę statystyczną między grupami (przy p = 0,05), gdzie * = p < 0,005 i ** = p < 0,0005. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rodzaj sferoidy (N)	Średnica [μm]	R_p [a.u.]	R_c [a.u.]	R_p-R _c [a.u.]	(R_p-R _c)/r [a.u./μm]
hDPSC / HUVEC (18)	113,2 ± 10,6	0,779 ± 0,034	0,398 ± 0,055	0,982 ± 0,051	0,00677 ± 0,00091
hDPSC (18)	88,1 ± 9,9	0,558 ± 0,025	0,331 ± 0,034	0,227 ± 0,032	0,00520 ± 0,00090
Wartość p	1,5 x ^10-8 *	1,5 x ^10-21 *	1,3 x ^10-4 *	1,4 x ^10-12 *	9,2 x ^10-6 *

Tabela 1. Średnica sferoidy, stosunek intensywności w jądrze (R_c) i na obrzeżach (R_p) sferoid, różnica w stosunku intensywności (R_p-R _c) i (R_p-R _c) / wartość r w sferoidach heterogenicznych hDPSC/HUVEC i jednorodnych hDPSC. Wartość p testu t na sferoidach N pokazuje różnicę statystyczną i jest również oznaczona gwiazdką.

pkt. pkt.

Rodzaj sferoidy (N)	Średnica [μm]	R_p [a.u.]	R_c [a.u.]	R_p-R _c [a.u.]	(R_p-R _c)/r [a.u./μm]
hDPSC (18)	88,1 ± 9,9	0,558 ± 0,025	0,331 ± 0,034	0,227 ± 0,032	0,00520 ± 0,00090
Druk biologiczny hDPSC (23)	80,9 ± 12,5	0,584 ± 0,023	0,323 ± 0,038	0,261 ± 0,039	0,00658 ± 0,00144
Wartość p	0,054	0,0024 *	0,46	9,9 x ^10-4 *	6,3 x ^10-6 *

Tabela 2. Średnica sferoidy, stosunek intensywności w rdzeniu (R_c) i na obrzeżach (R_p) sferoid, różnica w stosunku intensywności (R_p-R _c) i (R_p-R _c) / wartość r w jednorodnych sferoidach hDPSC przed i po bioprintingu. wartość p analizy statystycznej (sferoidy N). Różnica statystyczna jest oznaczona gwiazdką.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znaczenie. Pomiar natlenienia tkanek daje wgląd w metabolizm specyficzny dla komórek i tkanek, wzrost i rozwój tkanek, żywotność, nowotworzenie i migrację komórek oraz interakcje z drobnoustrojami i innymi patogenami. Przedstawiona metoda daje nowe narzędzie do lepszego zrozumienia fizjologii wielokomórkowych kultur sferoidalnych: analizę natlenienia za pomocą ratiometrycznych sond nanocząstek_O2 oraz dostarcza środków do oceny niedotlenienia, wizualizacji zależności od określonych szlaków produkcji energii oraz uzupełnia badania modelowe i alternatywne podejścia do obrazowania metabolicznego ^43,44 na powszechnie dostępnym, niedrogim mikroskopie fluorescencyjnym. Pomiary ratiometryczne można wykonywać na fluorescencyjnym mikroskopie szerokopolowym (preferowane impulsowe wzbudzenie LED), laserowo-skaningowym mikroskopie konfokalnym, arkuszowym świetlnym i dwufotonowym, idealnie wyposażonym w komory inkubatora T_{i O2}. Co ważne, prezentowany pomiar mikroskopowy_O2 można łatwo połączyć z wieloparametrową analizą na żywo różnych parametrów fizjologicznych i znaczników komórkowych (w przypadku heterokomórkowych kultur sferoidalnych), żywotności (barwienie żywe/martwe), metabolizmu lipidów (sondy fluorescencyjne wykrywające lipidy), dynamiki pH (barwniki, nanocząstki i białka fluorescencyjne) lub [Ca²⁺] wykonywane w dostępnych kanałach spektralnych fluorescencji lub równolegle, dając rozszerzony wgląd w funkcję komórek w czasie rzeczywistym w sferoidach, biodrukowanych konstruktach i potencjalnych przeszczepach tkanek.

Hodowle sferoidalne znajdują zastosowanie w badaniach komórek nowotworowych, mikrośrodowiska niszowego guza i komórek macierzystych, nowotworów, badań przesiewowych skuteczności leków i toksyczności, a także jako elementy budulcowe tkanek do biofabrykacji tkanek i samoorganizacji⁴⁵. Mogą one być generowane z wielu typów komórek przy użyciu różnych podejść⁴⁶. Popularność modelu sferoidalnego wymusza ich standaryzację z punktu widzenia rzetelności badań i poprawy analizy danych, czego ostatnio próbowano poprzez opracowanie pierwszej bazy danych sferoidów⁸.

Oczekuje się, że nasz protokół pomoże lepiej zrozumieć żywy metabolizm sferoidów, ustandaryzować ten model eksperymentalny, a następnie poprawić ich długoterminową stabilność, odtwarzalność i żywotność w materiałach biodrukowanych i wszczepialnych.

Modyfikacje. Protokół ten opisuje zastosowanie mikrowzorzystej powierzchni agarozy o niskiej przyczepności (tworzenie oparte na mikropleśni²⁹) do wysokowydajnego wytwarzania sferoid obciążonych sondą O₂do analizy natleniania. Alternatywne metody produkcji sferoidów, takie jak wiszące krople, nakładanie ultra niskich płytek mocujących, powlekanie lipidowe lub tworzenie swobodnego pływania, są również zgodne z sugerowanym protokołem ładowania sondy_O2. Prezentowany protokół został zoptymalizowany dla sferoid hDPSC i sferoid kokulturowych hDPSC z HUVEC (1:1). Inne linie komórkowe są z pewnością możliwe do zastosowania 15,17,47,48; Jednak może być wymagana pewna optymalizacja protokołu ze względu na różne właściwości adhezji komórek, warunki hodowli, wymagania dotyczące substratu metabolicznego i kompatybilność komórek z barwieniem nanocząstek. Wybór odpowiedniej ratiometrycznej sondy czułej na nanocząstki O₂ musi być dokonany w zależności od konkretnego modelu komórki i zgodnie z właściwościami fotowybielania sondy w zastosowanym zestawie mikroskopowym (intensywność i rodzaj źródła światła, czułość spektralna kamery) oraz dostępność odpowiednich filtrów wzbudzenia/emisji dla odpowiednich referencyjnych i czułych kanałów spektralnych O₂ sondy.

Niektóre ratiometryczne sondy_O2 są dostępne na rynku². Alternatywnie można je przygotować we własnym zakresie poprzez współwytrącanie barwników referencyjnych i wrażliwych na_O2-2 z polimerem, jak opisano w innym miejscu 24,25,49. Dla każdego indywidualnego modelu należy wykonać badania wstępne w celu określenia odpowiedniej sondy i optymalnych warunków mikroskopowych oraz zminimalizowania efektu fotowybielania sondy lub fotoindukowanego zużycia_O2 podczas pomiarów ratiometrycznych. Wcześniejsze badania nanocząstek wykrywających_O2 wykazały ich niską toksyczność komórkową, co pozwala na zastosowanie w szerokim zakresie stężeń barwienia (1-20 μg/ml). Ponieważ niektóre nanocząstki kationowe mogą samoczynnie agregować się podczas przechowywania, zalecamy utrzymywanie ich stężenia obciążenia na jak najniższym poziomie, aby zminimalizować ich potencjalny wpływ na tworzenie sferoidów. Opcjonalnie zawiesina nanocząstek może być filtrowana (0,2 μm) lub oczyszczana przez wirowanie (10 000 x g, 5 min) przed użyciem w celu usunięcia wszystkich agregatów z zawiesiny.

Chociaż oprogramowanie BioCAD i HMI jest specyficzne dla prezentowanej biodrukarki, protokół ten ma zastosowanie do innych biodrukarek, ponieważ zapewnione jest przygotowanie biotuszu, montaż, napełnianie standardowego wkładu oraz konstrukcja porowatego rusztowania hydrożelowego. Ponadto parametry biodruku, takie jak szybkość drukowania i temperatura, powinny być porównywalne dla różnych biodrukarek opartych na wytłaczaniu. Ciśnienie drukowania i średnica rozpórki zależą od rodzaju i średnicy igły, składu biotuszu, temperatury i lepkości wynikowej, ale mogą być punktem wyjścia do optymalizacji parametrów drukowania w celu biodruku biotuszów na bazie GelMA za pomocą różnych biodrukarek, chociaż niektóre biodrukarki używają wrzecion zamiast ciśnienia powietrza do wytłaczania biotuszu⁵⁰.

Krytyczne kroki i rozwiązywanie problemów. Jednym z krytycznych etapów jest wybór sondy_O2 , który opiera się na następujących względach: po pierwsze, dostępna konfiguracja mikroskopu fluorescencyjnego (tj. kompatybilne źródło światła wzbudzenia, filtry wzbudzenia i emisji, czułość kamery i przepuszczalność widmowa oraz apertura numeryczna obiektywu), które mogą ograniczać liczbę dostępnych sond pod względem ich fotostabilności, jasność i potencjalną fototoksyczność. Należy również zauważyć, że niektóre rodzaje olejków immersyjnych (w przypadku obiektywów immersyjnych z olejkiem) mogą zakłócać sygnały fluorescencji w kolorze czerwonym i podczerwonym. Uważamy, że testy fotostabilności są bardzo ważne i że muszą być wykonywane podczas wstępnej konfiguracji i testów wstępnych. Należy wziąć pod uwagę potencjalny przesłuch spektralny między kanałami fluorescencyjnymi a różnymi barwnikami. Rzeczywiście, potencjalna ciemna i fotoindukowana toksyczność sondy_O2 i innych wybranych barwników, w odniesieniu do konkretnego modelu komórkowego, musi zostać oceniona podczas optymalizacji protokołu⁵¹. Specyficznym problemem dla nanocząstek może być ich samoagregacja, którą można złagodzić poprzez optymalizację ich stężenia roboczego, składu podłoża barwiącego (np. zawartość surowicy), sonikację nanocząstek przed zmieszaniem z pożywką lub użycie wstępnie wybarwionych i przemytych komórek za pomocą sondy O₂ do tworzenia sferoid zamiast ładowania sondy podczas procedury tworzenia i kompaktyzacji sferoidy.

Nie zaobserwowaliśmy problemów związanych z głębokością penetracji światła w opisywanych modelach sferoidalnych, ale należy to wziąć pod uwagę przy doborze sygnałów o intensywności ratiometrycznej, wielkości konstruktów sferoidalnych i biofabrykowanych (przeszczepów tkankowych) oraz optymalizacji barwienia komórek odpowiednimi barwnikami. Oczekuje się, że sonda MMIR1 o ściśle dopasowanych długościach fal emisji czerwonej i bliskiej podczerwieni zapewni najniższe tło i najlepszą penetrację światła tkankowego w porównaniu z innymi sondami biosensorów fluorescencyjnych emitujących światło czerwono-niebieskie lub zielone.

Produkcja i obsługa obrazów proporcjowych (i potencjalnie demiksowanie lub dekonwolucja spektralna) może być wykonana w oprogramowaniu dostarczonym przez dostawcę lub w opcjach opensource, takich jak ImageJ, Fiji^52,53, napari (https://napari.org), MATLAB i inne. Krytycznym krokiem będzie odjęcie tła i zmierzenie zmian intensywności sygnału w zakresie liniowym.

Kalibracja sondy_O2: Rotenon i antymycyna A są inhibitorami kompleksów I i III mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów, odpowiednio, blokując oddychanie komórkowe 54,55,15 i indukując rozpraszanie gradientów O 2 w sferoidach i ich równoważenie ze środowiskowym_O2. Tak więc zmiana stężenia środowiskowego_O2 (tj. 20%, 15%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0% O₂) pozwoli na ratiometryczną kalibrację intensywności lub żywotności fosforescencji sondy O₂ czułej na komórki w komórkach. Zazwyczaj inkubatory sterowane_O2 nie są w stanie osiągnąć bezwzględnego 0%_O2 i w niektórych sytuacjach wymagany jest szybki test odpowiedzi sondy na odtlenienie. W takich przypadkach do próbki należy dodać 25-100 μg/ml oksydazy glukozowej lub mieszaniny Na₂SO₃/K₂HPO₄ (50 mg/ml na każdy związek na 10-krotny roztwór w wodzie destylowanej). Co ważne, jeśli linia komórkowa ma znaczny stopień niemitochondrialnego zużycia_O2, należy to wziąć pod uwagę podczas wykonywania eksperymentów z hamowaniem oddychania i kalibracją.

Ograniczenia i przyszłe badania. Głównym ograniczeniem proponowanej metody i detekcji ratiometrycznej w ogóle jest kalibracja i konwersja obserwowanych poziomów proporcji na rzeczywiste poziomy_O2 , co ze względu na wewnętrzne różnice w sprzęcie i ustawieniach akwizycji obrazu użytkownika sprawiłoby, że kalibracja proporcji byłaby specyficzna dla przyrządu i komórki. Co ważne, w przypadku szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego i opisanej konfiguracji, obrazy proporcji odzwierciedlają raczej połączone projekcje niż idealne przekroje optyczne, a kalibracja_O2 nie miałaby sensu. Z drugiej strony pokazujemy, że półilościowe pomiary wskaźnikowe dostarczają statystycznie istotnego i łatwego do zmierzenia fenotypowania porównawczego sferoid wytwarzanych z różnych źródeł i mających różnice w natlenieniu.

Przyszłe badania nad stworzeniem bardziej dostępnych i przystępnych cenowo podejść mikroskopowych zaprojektowanych dla żywych obiektów 3D, takich jak SPIM, arkusz świetlny, theta, obrazowanie dwufotonowe i luminescencyjne w połączeniu z uczeniem maszynowym 56,57,58,59,19, pomogą wprowadzić wieloparametryczne obrazowanie _O2 do jeszcze większej liczby zastosowań ilościowych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez grant Specjalnego Funduszu Badawczego Uniwersytetu w Gandawie (BOF/STA/202009/003) oraz Program ITN 7PR UE "Chebana", umowa grantowa nr 264772 (dla AVK). Dane są dostępne na żądanie. Kod G do biodruku jest dostępny do udostępnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05% Trypsyna-EDTA	Gibco	25300-054	Dostępne również z
12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych Sigma, sterylne	Greiner bio-one	665-180	Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning i innych firmach.
Szkiełko z 12 studniami, wyjmowane	Ibidi	81201	Dostępne również w Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific i innych
15 ml probówkach wirówkowych	Nerbe plus	02-502-3001	Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach
Wkład 3cc, zabezpieczony promieniowaniem UV, luer lock	RegenHU	C-033CC-UV	Dostępne również w CelIink i innych
Odkrywanie 3D Bioprinter	RegenHU	N/A	Bioprinter wyposażony w głowicę drukującą opartą na wytłaczaniu, płaszcz grzewczy, lampę utwardzającą UV-LED, oprogramowanie 3D Discovery HMI (oprogramowanie CAD/CAM z bezpośrednim sterowaniem maszyną) oraz oprogramowanie BioCAD (wersja 1.1-12)
6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych, sterylne	Greiner bio-one	657160	Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach
Antymycyna A firmy Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	A8674-25MG	Stosowany jako inhibitor kompleksu III mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów, blokujący oddychanie komórkowe
Nasadka B-Braun Tip, luer lock	RegenHU	TC-BB-B	Dostępne również w Regemat, Cellink i innych
Widok komórki Naczynie do hodowli komórkowych, PS, 35/10mm, szklane dno, 1 komora, sterylny	Greiner bio-one	627861	Do mikroskopii sferoid
drukowanychKolagen z ludzkiego łożyska, typ IV	Sigma	C5533	Do przygotowania 0,07 mg / ml kolagenu i 0,03 mg / ml naczyń mikroskopowych pokrytych poli-D-lizyną
D(+)-glukoza	Merck	8342	Przygotuj 1M roztwór podstawowy, 1/100 do przygotowania pożywki obrazowej (końcowe stężenie 10mM)
Zmodyfikowana pożywka Eagle's Dulbecco (DMEM), bez czerwieni fenolowej, glukozy, pirogronianu i glutaminy	Sigma-Aldrich	D5030-10X1L	Do przygotowania podłoża do obrazowania
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka 2	PromoCell	C-22011	Dostępne również w Lonza i innych
Suplement na wzrost śródbłonkaMix	PromoCell	C-39216	Dostępne również w Lonza i innych
FCCP, 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonylu	Sigma-Aldrich	C2920-10MG	Stosowany jako rozprzęgacz mitochondrialny
Surowica bydlęca	płodu Gibco	10270-098	Dostępne również w Sigma
GelMA	N/A	N/A	GelMA została zsyntetyzowana przez grupę PBM (prof. dr Peter Dubruel i Sandra Van Vlierberghe, Uniwersytet w Gandawie) [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961213011782], ale są również dostępne z Xpect Inx
Oksydaza glukozowa z Aspergillus nige (10000 u)	Sigma-Aldrich	G7141	Służy do badania odpowiedzi sondy na odtlenienie
GlutaMAX 100x Suplement	Gibco	35050-038	Rozcieńczenie 1/100 do przygotowania podłoża obrazowego (stężenie końcowe 2mM)
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	Rozcieńczenie 1/100 do przygotowania podłoża obrazowego (stężenie końcowe 10mM)
Hoechst 34580	Invitrogen (Life Technologies)	H21486	Dostępne również w Sigma, BDBiosciences i inne
Ludzkie komórki macierzyste miazgi zębowej (hDPSC)	Lonza	PT-5025	Dostępne również w ATCC lub u innych dostawców
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)	Lonza	CC-2517	Dostępne również w ATCC lub u innych dostawców
KH2PO4 (diwodorofosforan potasu)	Merck	4873	Do przygotowania roztworu siarczynu sodu (5 mg / ml Na2SO3 i 5 mg / ml KH2PO4). Przygotuj świeże z 10x stężonego roztworu podstawowego dziennie.
Li-TPO	N/A	N/A	Li-TPO-L został zsyntetyzowany przez grupę PBM (prof. dr Peter Dubruel i Sandra Van Vlierberghe, Uniwersytet w Gandawie) [https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F97 8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination] ale porównywalne fotoinicjatory są dostępne w Sigma
MEM Alpha Medium + Glutamax Minimum essential medium	Gibco	32561-029	Dostępne również w Sigma i innych
Stemple PDMS z mikrowzorzyskiem drukowane w 3D, studzienki o średnicy 400 &mikro; m, grubość, całkowita liczba odwiertów 1585	Wytwarzane		Znaczki te zostały samodzielnie wykonane przez Centrum Technologii Mikrosystemów (prof. dr Jan Vanfleteren, Uniwersytet w Gandawie), ale można je również uzyskać komercyjnie od Merck (Z764094, Microtissues 3D Petri Dish micro-mold mixed spheroid kit)
Na2SO3 (siarczyn sodu)	Sigma-Aldrich	239321-500G	Do przygotowania roztworu siarczynu sodu (5 mg / ml Na2SO3 i 5 mg / ml KH2PO4). Przygotuj świeże z 10x stężonego roztworu podstawowego dziennie.
Sondy O2: MMIR1, SI-0,2+, SII-0,2+	N/A	N/A	Można przygotować ' we własnym zakresie" przy użyciu dostępnych na rynku barwników, polimerów i metody wytrącania [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]. Niektóre nanocząstki są dostępne na rynku, jak omówiono w [https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-018-2840-x
Pen Strep :P enicylina (10 000 U/ml) / streptomycyna (10 000 μ g / mL) 100x roztwór	Gibco	15140-122	Dostępne również w Sigma . Stosować w rozcieńczeniu 1:100
szalki Petriego, sterylne	Greiner bio-one	633181	Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach
Tłok do wkładu 3cc	RegenHU	P-03CC-UV	Dostępne również w Cellink, Regemat i innych
Poli-D-lizyna	Sigma	P6407-5mg	Do przygotowania 0,07 mg/ml kolagenu i 0,03 mg/ml mikroskopii pokrytej poli-D-lizyną naczynia
filtr strzykawkowy PVDF 0,22 i mikro; m	Novolab	A35149	Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach
Rotenon	Sigma-Aldrich	R8875-1G	Stosowany jako inhibitor kompleksu I mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów, blokujący oddychanie komórkowe
Pirogronian sodu (100 mM)	Gibco	11360-070	Rozcieńczenie 1/100 do przygotowania podłoża obrazowego (stężenie końcowe 1mM)
SYTOX Green	Invitrogen (Life Technologies)	S7559	Dostępne również w Sigma, Promega i innych
Końcówka stożkowa o rozmiarze 22 (stożkowa igła PE	Amada Myachi Europe	22K622222	Podobne produkty są również dostępne w RegenHU, Cellink, Regemat i innych
Kolba do hodowli tkankowych (75 cm2)	VWR	734-2313	Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach
Ultrapure Agaroza	Invitrogen (Life Technologies)	16500-500	Inne rodzaje agarozy, takie jak agaroza o niskiej temperaturze topnienia (A-9414, Sigma), Agaroza do rutynowego użytku (A-9539, Sigma)
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny szerokokątny	Olympus	N/A	Odwrócony mikroskop fluorescencyjny IX81, z silnikowym sterowaniem osią Z, CoolLED pE4000 (16 kanałów, 365-770 nm), kamera cMOS ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu), szklana płyta grzewcza Okolab, oprogramowanie CellSens Dimension v.3 i Obiektywy lotnicze 4x/0,13 UPlanFLN i 40x/0,6 LUCPlanFLN. (Opcjonalnie, do obrazowania w wysokiej rozdzielczości) 60x/1,0 LUMPLFLN woda

samodzielnie ]

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Biological detection by optical oxygen sensing. Chemical Society Reviews. 42 (22), 8700-8732 (2013).
Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
Cordeiro, I. R., Tanaka, M. Environmental oxygen is a key modulator of development and evolution: From molecules to ecology: Oxygen-sensitive pathways pattern the developing organism, linking genetic and environmental components during the evolution of new traits. BioEssays. 42 (9), 2000025(2020).
Wenger, R. H., Kurtcuoglu, V., Scholz, C. C., Marti, H. H., Hoogewijs, D. Frequently asked questions in hypoxia research. Hypoxia. 3, 35(2015).
Erecińska, M., Silver, I. A. Tissue oxygen tension and brain sensitivity to hypoxia. Respiration Physiology. 128 (3), 263-276 (2001).
Gholipourmalekabadi, M., Zhao, S., Harrison, B. S., Mozafari, M., Seifalian, A. M. Oxygen-generating biomaterials: a new, viable paradigm for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 34 (12), 1010-1021 (2016).
Zheng, L., Kelly, C. J., Colgan, S. P. Physiologic hypoxia and oxygen homeostasis in the healthy intestine. A review in the theme: cellular responses to hypoxia. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 309 (6), 350-360 (2015).
Peirsman, A., et al. MISpheroID: a knowledgebase and transparency tool for minimum information in spheroid identity. Nature Methods. 18 (11), 1294-1303 (2021).
Suvarnapathaki, S., Wu, X., Lantigua, D., Nguyen, M. A., Camci-Unal, G. Breathing life into engineered tissues using oxygen-releasing biomaterials. NPG Asia Materials. 11 (1), 1-18 (2019).
Salazar-Noratto, G. E., et al. Understanding and leveraging cell metabolism to enhance mesenchymal stem cell transplantation survival in tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells. 38 (1), 22-33 (2020).
Leedale, J. A., et al. Mathematical modelling of oxygen gradients in stem cell-derived liver tissue. Plos One. 16 (2), 0244070(2021).
Sutherland, R., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).
Walenta, S., Dötsch, J., Bourrat-Flöck, B., Mueller-Klieser, W. Size-dependent oxygenation and energy status in multicellular tumor spheroids. Oxygen Transport to Tissue XII. , Springer. (1990).
Hompland, T., Fjeldbo, C. S., Lyng, H. Tumor hypoxia as a barrier in cancer therapy: Why levels matter. Cancers. 13 (3), 499(2021).
Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
Dmitriev, R. I., Borisov, S. M., Jenkins, J., Papkovsky, D. B. Multi-parametric imaging of tumor spheroids with ultra-bright and tunable nanoparticle O2 probes. Imaging, manipulation, and analysis of biomolecules, cells, and tissues XIII. , International Society for Optics and Photonics. (2015).
Dmitriev, R. I., et al. Versatile conjugated polymer nanoparticles for high-resolution O2 imaging in cells and 3D tissue models. ACS Nano. 9 (5), 5275-5288 (2015).
Okkelman, I. A., Puschhof, J., Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Visualization of Stem Cell Niche by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. Intestinal Stem Cells. , Springer. 65-97 (2020).
Dmitriev, R. I., Intes, X., Barroso, M. M. Luminescence lifetime imaging of three-dimensional biological objects. Journal of Cell Science. 134 (9), 1-17 (2021).
Yasukagawa, M., Yamada, K., Tobita, S., Yoshihara, T. Ratiometric oxygen probes with a cell-penetrating peptide for imaging oxygen levels in living cells. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry. 383, 111983(2019).
Xie, B. -R., et al. A near infrared ratiometric platform based π-extended porphyrin metal-organic framework for O2 imaging and cancer therapy. Biomaterials. 272, 120782(2021).
Düssmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O 2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death & Disease. 8 (6), 2853(2017).
Roussakis, E., et al. Theranostic biocomposite scaffold membrane. Biomaterials. 212, 17-27 (2019).
Kondrashina, A. V., et al. A phosphorescent nanoparticle-based probe for sensing and imaging of (intra) cellular oxygen in multiple detection modalities. Advanced Functional Materials. 22 (23), 4931-4939 (2012).
Borisov, S. M., et al. Precipitation as a simple and versatile method for preparation of optical nanochemosensors. Talanta. 79 (5), 1322-1330 (2009).
Borisov, S., Nuss, G., Klimant, I. Red light-excitable oxygen sensing materials based on platinum (II) and palladium (II) benzoporphyrins. Analytical Chemistry. 80 (24), 9435-9442 (2008).
Strobl, M., Rappitsch, T., Borisov, S. M., Mayr, T., Klimant, I. NIR-emitting aza-BODIPY dyes-new building blocks for broad-range optical pH sensors. Analyst. 140 (21), 7150-7153 (2015).
Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
Fukuda, J., et al. Micromolding of photocrosslinkable chitosan hydrogel for spheroid microarray and co-cultures. Biomaterials. 27 (30), 5259-5267 (2006).
Thomsen, A. R., et al. A deep conical agarose microwell array for adhesion independent three-dimensional cell culture and dynamic volume measurement. Lab on a Chip. 18 (1), 179-189 (2018).
Gevaert, E., et al. High throughput micro-well generation of hepatocyte micro-aggregates for tissue engineering. PloS One. 9 (8), 105171(2014).
De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009(2018).
Rivron, N. C., et al. Tissue deformation spatially modulates VEGF signaling and angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (18), 6886-6891 (2012).
Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. Measuring phagosome pH by ratiometric fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (106), e53402(2015).
Billiet, T., Gevaert, E., De Schryver, T., Cornelissen, M., Dubruel, P. The 3D printing of gelatin methacrylamide cell-laden tissue-engineered constructs with high cell viability. Biomaterials. 35 (1), 49-62 (2014).
Tytgat, L., et al. Photopolymerizable materials for cell encapsulation. 3D Printing and Biofabrication. Ovsianikov, A., Yoo, J., Mironov, V. , Springer International Publishing. Berlin. 353-396 (2018).
Markovic, M., et al. Hybrid tissue engineering scaffolds by combination of three-dimensional printing and cell photoencapsulation. Journal of Nanotechnology in Engineering and Medicine. 6 (2), 0210011(2015).
De Moor, L., et al. Hybrid bioprinting of chondrogenically induced human mesenchymal stem cell spheroids. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 484(2020).
Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Hynes, J., Papkovsky, D. B. Kinetic analysis of local oxygenation and respiratory responses of mammalian cells using intracellular oxygen-sensitive probes and time-resolved fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 183-207 (2014).
Uribe-Etxebarria, V., Agliano, A., Unda, F., Ibarretxe, G. Wnt signaling reprograms metabolism in dental pulp stem cells. Journal of Cellular Physiology. 234 (8), 13068-13082 (2019).
Vizán, P., et al. Characterization of the metabolic changes underlying growth factor angiogenic activation: identification of new potential therapeutic targets. Carcinogenesis. 30 (6), 946-952 (2009).
Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Quenched-phosphorescence detection of molecular oxygen: applications in life sciences. Royal Society of Chemistry. , (2018).
Perottoni, S., et al. Intracellular label-free detection of mesenchymal stem cell metabolism within a perivascular niche-on-a-chip. Lab on a Chip. 21 (7), 1395-1408 (2021).
Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) and extracellular flux analyses. Redox Biology. 30, 101420(2020).
Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), 20160877(2017).
Dmitriev, R. I., et al. Imaging oxygen in neural cell and tissue models by means of anionic cell-permeable phosphorescent nanoparticles. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (2), 367-381 (2015).
Jenkins, J., Borisov, S. M., Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Sulforhodamine nanothermometer for multiparametric fluorescence lifetime imaging microscopy. Analytical Chemistry. 88 (21), 10566-10572 (2016).
Fercher, A., Borisov, S. M., Zhdanov, A. V., Klimant, I., Papkovsky, D. B. Intracellular O2 sensing probe based on cell-penetrating phosphorescent nanoparticles. ACS Nano. 5 (7), 5499-5508 (2011).
Wagner, M., Karner, A., Gattringer, P., Buchegger, B., Hochreiner, A. A super low-cost bioprinter based on DVD-drive components and a raspberry pi as controller. Bioprinting. 23, 00142(2021).
Golub, A. S., Pittman, R. N. Monitoring parameters of Oxygen transport to cells in the microcirculation. Quenched-Phosphorescence Detection of Molecular Oxygen. , 193-204 (2018).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Huang, C., Becker, M. F., Keto, J. W., Kovar, D. Annealing of nanostructured silver films produced by supersonic deposition of nanoparticles. Journal of Applied Physics. 102 (5), 054308(2007).
Foster, K. A., Galeffi, F., Gerich, F. J., Turner, D. A., Müller, M. Optical and pharmacological tools to investigate the role of mitochondria during oxidative stress and neurodegeneration. Progress in Neurobiology. 79 (3), 136-171 (2006).
Schmidt, C. A., Fisher-Wellman, K. H., Neufer, P. D. From OCR and ECAR to energy: perspectives on the design and interpretation of bioenergetics studies. The Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101140(2021).
Stelzer, E. H., Lindek, S. Fundamental reduction of the observation volume in far-field light microscopy by detection orthogonal to the illumination axis: confocal theta microscopy. Optics Communications. 111 (5-6), 536-547 (1994).
Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
von Chamier, L., et al. Democratising deep learning for microscopy with ZeroCostDL4Mic. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biofabrykacja sferoid w tr jwymiarowa hodowla kom rek obrazowanie gradientu tlenu mikroskopia fluorescencyjna utlenowanie sferoid w konstrukty biodrukowane ratiometryczna sonda tlenowa charakterystyka fenotypu sferoid w

Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły