Artykuł metodologiczny

Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową

4.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63403

⸱

6 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  , 
1Tissue Engineering and Biomaterials Group, Department of Human Structure and Repair, Faculty of Medical and Health Sciences, Ghent University, 2Health and Happiness (H&H) Group, National Food Innovation Hub, 3Institute of Analytical Chemistry and Food Chemistry, Graz University of Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisuje wysokoprzepustowe generowanie sferoidów do biodruku przy użyciu wieloparametrycznej analizy ich natlenienia i śmierci komórki pod standardowym mikroskopem fluorescencyjnym. Podejście to można zastosować do kontrolowania żywotności sferoid i przeprowadzania standaryzacji, co jest ważne w modelowaniu tkanki 3D, mikrośrodowiska guza i udanej biofabrykacji (mikro)tkanek.

Streszczenie

Sferoidy wielokomórkowe są ważnymi narzędziami do badania fizjologii tkanek i nowotworów w 3D i są często używane w inżynierii tkankowej jako jednostki do składania tkanek do biofabrykacji. Podczas gdy główna moc modelu sferoidalnego polega na naśladowaniu gradientów fizyczno-chemicznych w mikroskali tkankowej, rzeczywiste środowisko fizjologiczne (w tym dynamika aktywności metabolicznej, natlenienie, śmierć komórki i proliferacja) wewnątrz sferoid jest na ogół ignorowane. Jednocześnie wpływ składu pożywki wzrostowej i metody tworzenia na uzyskany fenotyp sferoidy jest dobrze udokumentowany. W związku z tym charakterystyka i standaryzacja fenotypu sferoidalnego są niezbędne do zapewnienia odtwarzalności i przejrzystości wyników badań. Analiza średniego natlenienia sferoidowego i wartości gradientówO2 w trzech wymiarach (3D) może być prostym i uniwersalnym sposobem charakterystyki fenotypu sferoidalnego, wskazującym na ich aktywność metaboliczną, ogólną żywotność i potencjał do rekapitulacji mikrośrodowiska tkanek in vivo. Wizualizację natlenienia 3D można łatwo połączyć z wieloparametryczną analizą dodatkowych parametrów fizjologicznych (takich jak śmierć komórki, proliferacja i skład komórki) i zastosować do ciągłego monitorowania natlenienia i/lub pomiarów punktu końcowego. Ładowanie sondyO2 odbywa się na etapie tworzenia sferoid i jest zgodne z różnymi protokołami generowania sferoidów. Protokół zawiera wysokoprzepustową metodę generowania sferoidów z wprowadzonymi ratiometrycznymi nanoczujnikami fluorescencyjnymi O2 emitującymi światło czerwone i bliskiej podczerwieni oraz opis wieloparametrowej oceny natlenienia sferoidów i śmierci komórek przed i po bioprintingu. Przykłady eksperymentalne pokazują porównawczą analizę gradientówO2 w sferoidach homo- i heterokomórkowych, a także w biodrukowanych konstruktach opartych na sferoidach. Protokół jest kompatybilny z konwencjonalnym mikroskopem fluorescencyjnym posiadającym wiele filtrów fluorescencyjnych i diodę elektroluminescencyjną jako źródło światła.

Wprowadzenie

Tlen cząsteczkowy (O2) jest jednym z kluczowych metabolitów regulujących żywotność, funkcjonowanie i śmierć komórek i tkanek. W warunkach fizjologicznych miejscowe utlenowanie tkanek jest dynamicznie regulowane przez unaczynienie tkanek, przepływ krwi i metabolizm komórkowy, co w niektórych przypadkach prowadzi do powstawania gradientówO2, niedotlenienia mikrośrodowiska i/lub stresu oksydacyjnego1,2. Komórki wyczuwają gradienty O2 poprzez bezpośrednie zaangażowanie molekularnego O2 w funkcję sygnalizacyjną (poprzez sygnalizację za pośrednictwem czynnika indukowanego hipoksją (HIF), demetylazy lizyny histonowej KDM i w inny sposób), zmiany w komórkowym potencjale redoks (reaktywne gatunki O2 wykrywają za pomocą sygnalizacji Nrf2 / Keap1 lub białek regulatorowych żelaza), a następnie mogą dostosować swój metabolizm, Proliferacja, siła działania i zróżnicowanie3. Tak więc niejednorodność utlenowania komórek i tkanek, jej gradienty i związane z tym zjawiska są ważnymi graczami w rozwoju tkanek i homeostazie. Różne tkanki i typy komórek często wymagają różnych "normalnych" fizjologicznych poziomówO2, które definiują specjalną architekturę tkanek z komórkami ustawionymi zgodnie z mikrogradientami tkankiO 2 4. Niektóre typy komórek są wrażliwe na spadekO2 (np. neurony, hepatocyty, komórki wysp trzustkowych lub komórki mięśniowe)5,6, podczas gdy inne mogą wytrzymać ekstremalne niedotlenienie i tworzyć strome gradienty O2 (np. w nabłonku jelita grubego)7. Wraz z postępem w bioinżynierii tkankowej i biowytwarzaniu istotna staje się konieczność kwantyfikacjiO2 w mikroagregatach i sferoidalnych konstruktach tkanek 3D. Jednym z problemów jest standaryzacja parametrów fizjologicznych wielokomórkowego modelu sferoidowego, które zależą od metody generowania sferoidów i warunków hodowli8. Ponadto niekontrolowane stosowanie biomateriałów uwalniającychO2 lub perfuzjiO2 w mikrotkankach pozbawionych funkcjonalnego unaczynienia może być toksyczne dla komórek, prowadzić do przeprogramowania ich metabolizmu i zmniejszenia przeżycia w okresie po przeszczepie9,10. Wiarygodność podejścia do pomiaruO2 i optymalizacji środowiska natleniania w celu osiągnięcia wydajnej hodowli fizjologicznie istotnych mikroagregatów została niedawno udowodniona przez modelowanie matematyczne sferoidów wątroby pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych użyte jako przykład11. Inną dziedziną, w której uznaje się wiedzę o poziomach O2 w tkankach, jest terapia nowotworów12,13. Heterogeniczne niedotlenienie guza może osłabić skuteczną terapię przeciwnowotworową. Mierzenie i kontrolowanie dokładnych poziomów natlenienia podczas leczenia pacjenta lub modelowania niedotlenienia guza pozwoliłoby na ulepszenie indywidualnych i spersonalizowanych strategii terapeutycznych14. W związku z tym ilościowe monitorowanie dynamicznego natleniania w biofabrykowanych konstruktach i modelach 3D guzów jest znaczącym narzędziem do fizjologicznej analizy ich aktywności oddechowej, metabolizmu i optymalizacji hodowli tkankowej, warunków produkcji lub podstawowych badań odpowiedzi terapeutycznej za pośrednictwem hipoksji.

Szereg metod umożliwia multipleksowaną (lub wieloparametrową) analizę natlenienia komórek w sferoidalnych i mikrozagregowanych konstrukcjach tkankowych. Pionierskie w dziedzinie neurosfer i sferoidów nowotworowych 15,16,17, podejście oparte na mikroskopii obrazowania czasu życia fosforescencji (PLIM) umożliwia bezpośrednie ilościowe określenie natlenienia komórek w żywych mikrotkankach i ustalenie jego korelacji z żywotnością komórek, proliferacją lub dystrybucją funkcjonalnych typów komórek. Pomimo siły tego podejścia, aktualizacja mikroskopii PLIM nadal nie jest powszechnie dostępna nawet wśród popularnych dostawców mikroskopów18,19. Na szczęście duża liczba penetrujących komórki sond nanocząstek O2 może być również używana do pomiaru ratiometrycznego opartego na intensywności fluorescencji15,17,20,21,22,23,24. Zazwyczaj sonda wyświetla dwie długości fal emisyjnych, tj. O2 czułą i niewrażliwą (referencyjną), które można zmierzyć za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, obrazika przesiewowego o wysokiej zawartości lub czytnika mikropłytek. Takie nanocząstki wykrywająceO2 mogą być wytwarzane techniką wytrącania z biokompatybilnymi polimerami, czujnikiemO2 i barwnikami referencyjnymi obejmującymi widma widzialne i bliskiej podczerwieni, lub można je kupić komercyjnie2,25. Ponieważ analiza grubych mikrotkanek 3D skorzystałaby na zastosowaniu barwników fluorescencyjnych z przesunięciem ku czerwieni, skonstruowano ratiometryczną sondę nanocząstek O2 multimodalną podczerwień numer 1 (MMIR1), składającą się z O2-sensing PtTPTBPF26 i reference aza-BODIPY27 barwników impregnowanych dodatnio naładowanym kopolimerem na bazie polimetakrylanu28. W tej konstrukcji sygnał czuły naO2 (bliska podczerwień, wzbudzenie (exc.) = 635 nm, emisja (em.) = 760 nm; Isens) zależy od stężenia [O2] w procesie hartowania fosforescencyjnego, podczas gdy intensywność czerwonego barwnika referencyjnego (exc. = 580 nm, em. = 650 nm; Iref) pozostaje nienaruszony (Rysunek 1A). W ten sposób stosunek Iref / Isens (R) w barwionych komórkach może umożliwić kalibrację O222.

Tutaj opisujemy półilościowe podejście do monitorowania natlenienia żywych komórek w sferoidach i biodrukowanych konstruktach, pomagając oszacować gradienty O2 w punktach końcowych i pomiarach kinetycznych. Takie obrazowanieO2 można wykonać za pomocą innych typów ratiometrycznych sond O2 (Rysunek 1B) i, w zależności od liczby dostępnych źródeł światła i filtrów fluorescencyjnych, można je stosować z innymi barwnikami w celu uzyskania informacji o żywych/martwych komórkach, funkcji mitochondriów i śledzeniu innych typów komórek. Można również korzystać z zaawansowanych trybów pomiaru, takich jak mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM)19. Największym wyzwaniem związanym z zastosowaniem barwników barwiących komórki i wrażliwych na O2 nanocząstek jest optymalizacja protokołu barwienia. W przypadku sondy MMIR1 i powiązanych nanocząstek, komórki są albo wstępnie wybarwione, albo współinkubowane podczas procesu tworzenia sferoid. W opisanym protokole sferoidy barwione sondą O2 zostały wygenerowane na mało przylegającej powierzchni agarozy29,30,31,32 (Rysunek 1C), co umożliwia późniejsze biodrukowanie w oparciu o sferoidy i wieloparametrową analizę O2 i śmierć komórki. Aby zilustrować możliwość zastosowania tego podejścia, porównano poziomy natlenienia w sferoidach z ludzkich komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSC) przed i po biodruku, przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego.

Protokół

1. Generacja sferoid o wysokiej przepustowości z wbudowaną sondą czułą na O2

  1. Przygotowanie płytki do hodowli tkankowej pokrytej agarozą pokrytej mikrowzorzystą
    UWAGA: Płytki do hodowli tkankowych pokrytych agarozą z mikrowzorzyskiem są używane do jednoczesnego generowania dużej liczby sferoidów (1585 na stempel PDMS, patrz Tabela materiałów) do biodruku i innych zastosowań, w których potrzebne są wielokrotne powtórzenia eksperymentalne lub duża liczba sferoidów.
    1. Przygotuj wszystkie sterylne materiały i narzędzia (szpatułki i pęsety) przez autoklawowanie, jeśli to możliwe, lub przez sterylizację filtra. Wyczyść nadające się do recyklingu znaczki PDMS33 z agarozy i przechowuj je aseptycznie w 70% etanolu. Zrób to co najmniej 1 dzień przed generacją sferoidów.
    2. Przenieść stemple PDMS z mikrowzorzyskiem z fiolki do przechowywania na sterylną szalkę Petriego i wysuszyć na powietrzu gładką powierzchnią do góry w sterylnych warunkach laminarnego przepływu powietrza przez 10 minut.
    3. Umieść każdy stempel z powierzchnią z mikrowzorem do góry (i gładką powierzchnią do dołu) w środku dołka 12-dołkowej sterylnej płytki do hodowli tkankowej. Suszyć na powietrzu przez 1-2 minuty z otwartą pokrywą.
      UWAGA: Bardzo ważne jest odparowanie nadmiaru płynu, ponieważ tylko suche stemple idealnie przylegają do plastikowej powierzchni i pozostają przymocowane podczas zabiegu.
    4. Odważyć 1,5 g agarozy do czystej szklanej butelki o pojemności 200 ml, dodać 50 ml sterylnej wody destylowanej, przykryć pokrywką i rozpuść w kuchence mikrofalowej, aby uzyskać 50 ml 3% jednorodnego roztworu agarozy.
      UWAGA: Roztwór agarozy jest bardzo gorący i należy obchodzić się z nim ostrożnie. Wstrząśnięty natychmiast po procedurze topienia gorący roztwór agarozy może zacząć bulgotać i wydostać się z naczynia. Aby uniknąć sporadycznych urazów, należy używać wystarczająco dużych naczyń wypełnionych roztworem agarozy maksymalnie w 50% objętości.
    5. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej natychmiast dodaj ~ 2 ml gorącego roztworu agarozy do każdej studzienki z 12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych, aby całkowicie pokryć włożony stempel PDMS. Pozostawić agarozę do zestalenia się na 20 minut, inkubując pod sterylnym strumieniem powietrza z otwartą pokrywką płytki.
      UWAGA: Warstwa agarozy powinna być co najmniej dwa razy grubsza niż stempel PDMS, aby zapewnić integralność mikrostudzienek agarozy po usunięciu stempla PDMS (Rysunek 1C).
    6. Za pomocą sterylnej małej szpatułki dokładnie obróć agarozę z osadzonym stemplem PDMS do góry nogami w każdym dołku, aby uzyskać gładką powierzchnię stempla do góry. Dodaj ~200 μL sterylnej wody na gładką górną stronę stempla, delikatnie oderwij go od agarozy szpatułką i wyjmij z dołka. Unikaj uszkadzania mikrostudzienek.
    7. Dodać 1 ml odpowiedniej sterylnej pożywki do hodowli komórkowych do stempli agarozy do bezpośredniego użycia. Przykryć płytkę pokrywką i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Do długotrwałego przechowywania (do 2 tygodni) należy użyć roztworu PBS (zamiast podłoża). Nie pozwól, aby agaroza wyschła. Przed użyciem ogrzewać płytki z mikrowzorem agarozy przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z stężeniemCO2.
      UWAGA: Inkubacja jest potrzebna do zrównoważenia i usunięcia pęcherzyków powietrza z mikrostudzienek agarozowych. Przejdź do kroku 1.2 protokołu.
  2. Przygotowanie sferoid z sondą O2
    1. Stosować α minimalną pożywkę egzogenną (MEM) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) oraz pożywką do wzrostu komórek śródbłonka uzupełnioną czynnikami wzrostu 2 do hodowli odpowiednio linii komórkowych hDPSC i HUVEC. Przygotuj heterokomórkową sferoidalną pożywkę wzrostową hDPSC / HUVEC, dodając pożywki wzrostowe HUVEC i hDPSC w stosunku 1:1.
    2. Przygotuj 70%-90% zlewającą się hodowlę komórkową (~3-4 dni przygotowania). Do generowania sferoid heterokomórkowych należy przygotować odpowiednio kultury hDPSC i HUVEC.
      UWAGA: Liczba przejść HUVEC i hDPSC nie może przekraczać 8. Aby zapewnić szybki wzrost kultur komórkowych, należy je zawsze dzielić na 1/3 całkowitej hodowli komórkowej (przy 70%-80% konfluencji) za pomocą nowej kolby co 3 do 4 dni.
    3. Przepłukać 70%-90% zlewającą się hodowlę komórkową wstępnie podgrzanym (37 °C) PBS (10 ml na 75 cm2 kolbę). Dodać dysocjujący roztwór enzymu (0,05% trypsyny i 1 mM EDTA; 1 ml na 75 cm2 kolby) i inkubować przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO2, wilgotności 95% do oderwania komórek i sprawdzić oderwanie komórek pod mikroskopem. Po zakończeniu zneutralizuj trypsynę kompletną pożywką do hodowli komórkowych zawierającą 10% FBS (5 ml pożywki na 1 ml roztworu dysocjacyjnego).
      UWAGA: Zapobiegaj nadmiernej ekspozycji komórek na dysocjujący roztwór enzymu, ponieważ może to wpłynąć na ich żywotność.
    4. W przypadku HUVEC hodowanego w pożywce o niskiej zawartości FBS należy przeprowadzić neutralizację trypsyny, dodając 0,5 ml 100% FBS do hodowli komórkowej traktowanej trypsyną, a następnie odwirować w celu przeniesienia komórek na pożywkę wzrostową.
      UWAGA: Otrzymana zawiesina komórkowa powinna zawierać ~1 milion komórek na 1 ml. W razie potrzeby do protokołu można dodać dodatkowy etap wirowania w celu zagęszczenia zawiesiny komórek.
    5. Dysocjację agregatów komórkowych należy przeprowadzić poprzez pipetowanie za pomocą końcówki pipety o pojemności 1000 μl umieszczonej na górze pipety serologicznej o pojemności 10 ml w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Użyj komory zliczającej (hemocytometr typu Neubauera lub alternatywa), aby policzyć liczbę komórek na 1 ml zawiesiny komórkowej34. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do 500 000 komórek na ml. W przypadku heterokomórkowego hDPSC / HUVEC w stosunku sferoidalnym 1:1 dodaj równe objętości odpowiednich zawiesin komórkowych, aby uzyskać końcowe stężenie komórek 500 000 komórek na ml.
      UWAGA: Zmiana stężenia komórek w zawiesinie dodanej do stempla agarozowego z mikrowzorem pozwala na zmianę średniej wielkości wytwarzanych sferoid, która zależy od liczby komórek na mikrodołek stempla agarozowego. W opisanym układzie sferoidy ~300 komórek są generowane z 1 ml zawierającego 500 000 komórek na stemplu agarozowym z 1585 mikrodołkami.
    6. Dodać skoncentrowany roztwór sondyO2 (nanocząstki, 1 mg/ml podstawowy) do przygotowanej zawiesiny komórek do końcowego stężenia 5 μg/ml.
      UWAGA: Tworzenie się sferoid w obecności nanocząstek wykrywających O2 zapewnia wydajne barwienie, które jest utrzymywane przez co najmniej 5 dni (Rysunek 1D). Z kolei barwienie wstępnie uformowanych sferoid wielokomórkowych nanocząstkami będzie mniej wydajne15.
    7. Wymienić 1 ml starych pożywek w mikrowzorzystej studzience z 12-dołkowymi płytkami do hodowli komórkowych pokrytych agarozą (patrz krok 1.1.7) na 1 ml przygotowanej zawiesiny komórkowej (500 000 komórek na 1 ml, z sondą 5 μg/mlO2). Hodować sferoidy w inkubatorze CO2 przez 2-5 dni w ciągłej obecności sondyO2, aby zapewnić jej obciążenie podczas tworzenia i zagęszczania sferoidów.
      UWAGA: Unikaj nadmiernego parowania pożywki w kulturze sferoidalnej. W razie potrzeby ostrożnie (nie naruszać sferoid w mikrostudzienkach) dodać 0,2-0,5 ml pożywki hodowlanej z dodatkowym rozcieńczeniem sondyO2.
    8. Po utworzeniu sferoidy wymień pożywkę wzrostową na nową bez sondy. Barwienie sondy zostanie zachowane w wygenerowanych sferoidach przez 7-14 dni lub dłużej, co pozwoli na długoterminowe monitorowanie jej sygnałów w sferoidach.

2. Drukowanie biologiczne sferoidów

UWAGA: Sferoidy są biodrukowane w biotuszu na bazie żelatyny modyfikowanej metakrylamidem (GelMA). Poniżej znajduje się opis składników biotuszu, procedury przygotowania biotuszu i biodruku.

  1. Przygotowanie biotuszu
    1. Przygotować 10% (w/v) roztwór GelMA (2 ml) w pożywce pod laminarnym przepływem powietrza35 w następujący sposób: odważyć 0,2 g sterylnego GelMA o stopniu podstawienia 78 w probówce o pojemności 15 ml, dodać 1,9 ml α-MEM i pozostawić do rozpuszczenia, mieszając na wytrząsarce obrotowej w temperaturze 37 °C (~2 h).
      UWAGA: Nie dodawaj pełnej ilości pożywki, ponieważ inne związki, takie jak sferoidy i fotoinicjator Li-TPO-L, zostaną dodane później.
    2. Ponownie zawiesić sferoidy w studzienkach z mikrowzorami przez pipetowanie i zebrać je do probówki o pojemności 15 ml. Wykonaj dodatkowe płukanie PBS, aby upewnić się, że wszystkie sferoidy zostały zebrane z mikrostudzienek agarozowych. Unikaj dotykania/uszkadzania mikrostudzienek agarozy, ponieważ płatki agarozy mogą blokować igłę podczas bioprintingu.
    3. Zebrać sferoidy przez odwirowanie w probówce o pojemności 15 ml o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Odessać supernatant za pomocą pipety, dodać 50 μl pożywki do sferoid i zawiesić je ponownie przez delikatne pipetowanie.
    4. Dodać mieszaninę sferoidów do ciepłego roztworu GelMA i wymieszać delikatnie pipetując. Utrzymuj stężenie sferoidów na poziomie 6340-12860 sferoidów (z 4-8 mikrowzorów) na ml biotuszu do biodruku. Unikaj wyższych stężeń sferoid, ponieważ łatwo powoduje to zablokowanie igły drukującej.
    5. Dodać wysterylizowany filtrem roztwór podstawowy Li-TPO-L (32 mg/ml) o końcowym stężeniu 2% molowym w stosunku do liczby wiązań podwójnych i wymieszać delikatnie pipetując36,37.
      UWAGA: Ilość Li-TPO-L można obliczyć zgodnie z równaniem:
      Objętość fotoinicjatora (PI) = (0,000385 molNH 2- grupy / g GelMA x 294,10 g Li-TPO-L / mol x 0,78 x 0,02) / 0,032 g Li-TPO-L / ml x 0,2 g GelMA = 0,0107 ml zapasu Li-TPO-L
  2. Procedura biodruku
    1. Zapoznaj się z krokami w Protokole Uzupełniającym 1, aby zapoznać się z projektowaniem rusztowania w CAD. Aby wydrukować bioprint projektu, wykonaj poniższe czynności.
    2. Zamknij koniec sterylnego wkładu o pojemności 3 ml nakrętką z końcówką (luer lock) i napełnij biotuszem przez pipetowanie. Włóż tłok do wkładu. Przytrzymaj wkład do góry nogami i zdejmij nasadkę końcówki, popchnij tłok w kierunku biotuszu, aż całe powietrze z wkładu zostanie usunięte.
      UWAGA: Należy unikać kontaktu biotuszu GelMA z bokami wkładu, ponieważ może to hamować ruch tłoka z powodu żelowania biotuszu.
    3. Pozwól biotuszowi ostygnąć w płaszczu grzewczym biodrukarki w temperaturze 23 °C (20-30 min). Wkręć adapter ciśnieniowy na górze wkładu. Zamknij zacisk na rurce wlotowej, aby zapobiec wyciekaniu biotuszu, zamontuj stożkową igłę PE 22 G na kartridżu. Dostosuj rozmiar i średnicę igły do konstrukcji rusztowania oraz średnicy i stężenia sferoidy.
      UWAGA: Noś maskę na usta i spryskane rękawice, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
    4. Spryskaj biodrukarkę 70% etanolem i wytrzyj ją do sucha papierem absorpcyjnym. Zainstaluj wkład w płaszczu grzewczym na głowicy drukującej opartej na wytłaczaniu. Podłącz wlot ciśnienia i otwórz zacisk na wlocie. Załaduj plik G-code swojego projektu do oprogramowania do drukowania.
    5. Rozpocznij pomiar długości igły. Reguluj ciśnienie drukowania, dozując trochę biotuszu na sterylnej szalce Petriego. Ciśnienie druku 0,025-0,045 MPa jest typowe dla druku biotuszów na bazie GelMA38.
    6. Zainstaluj płytkę 6-dołkową, otwórz płytkę dołka, zamknij pokrywę i rozpocznij drukowanie. Po wydrukowaniu pozostaw rusztowania do fizycznego usieciowania przez 10 minut w temperaturze 5 °C i naświetlaj wydrukowane rusztowania przez 60 s lampą UV LED (365 nm; 500 mW wg producenta).
      UWAGA: Czas sieciowania UV zależy od właściwości światła UV, typu i stężenia fotoinicjatora, pożądanego stopnia usieciowania rusztowania, pęcznienia i modułu sprężystości.
    7. Natychmiast dodać odpowiednią pożywkę wzrostową zawierającą 100 j./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (P/S) do wszystkich studzienek z biodrukowanymi siatkami (2 ml na studzienkę 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej).
    8. Hodowlę w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C do momentu rozpoczęcia mikroskopii. W przypadku mikroskopii konstrukcji biodrukowanych przenieś wydrukowaną siatkę waflową do naczynia mikroskopowego, przykryj nośnikiem obrazowym i wykonaj kroki 3.2 i 3.3.
      UWAGA: W przypadku pływających konstruktów z biodruku, muszą one być utrwalone w naczyniu mikroskopowym bez wpływu na żywotność komórek, np. za pomocą kleju cytokompatybilnego. W przypadku transferu za pomocą mikroskopu odwróconego, bioprint należy umieścić w naczyniu mikroskopowym ze szklanym dnem i przykryć nośnikiem obrazowym (~200-500 μL, patrz uwaga do kroku 3.1 dotycząca składu nośnika do obrazowania), aby uniknąć niepożądanego unoszenia się próbki. Barwienie za pomocą dodatkowych sond fluorescencyjnych można przeprowadzić w naczyniu do hodowli komórkowej przed przeniesieniem biodrukowanych konstruktów do naczyń mikroskopowych (patrz krok 3.1.6).

3. Ratiometryczna fluorescencyjna mikroskopia na żywo natlenienia sferoidalnego w biofabrykowanej tkance

UWAGA: Aby przeliczyć ratiometryczną odpowiedź intensywności (R) sondy O2 na rzeczywiste poziomy niedotlenienia, odpowiedź sondy musi być skalibrowana przy użyciu procedur opisanych w24. Ponieważ jednak kalibracja ratiometryczna jest specyficzna dla danego urządzenia i wymaga zainstalowania inkubatora sterowanego T/O2/CO2 (nie zawsze dostępnego), preferowaną opcją jest zastosowanie półilościowego wykrywania proporcji.

  1. Przygotowanie sferoid do analizy obrazowania na żywo
    1. W celu przyłączenia sferoidów na tym etapie, wstępnie pokryj sterylne naczynia mikroskopowe kolagenem IV i/lub poli-D-lizyną lub użyj dostępnych na rynku39. Sprawdź kompatybilność naczyń mikroskopowych z odległością roboczą i innymi cechami obiektywu mikroskopu.
      UWAGA: W przypadku obrazowania wieloparametrowego wszystkie dodatkowe procedury barwienia muszą być wykonywane w szalkach na płytkach hodowlanych z wystarczającą ilością pożywki chroniącej komórki przed parowaniem, szokiem osmotycznym lub innym stresem. Przed użyciem przygotować i podgrzać pożywkę do obrazowania: DMEM uzupełniony wodorowęglanem sodu (1,2 g/L), HEPES-Na, pH 7,2 (10 mM), pirogronianem sodu (1 mM), L-glutaminą (2 mM) i glukozą (5 mM), bez czerwieni fenolowej.
    2. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml delikatnie wypłukać wstępnie wybarwione sferoidy z sondyO2 z mikrostudzienek agarozy. Podczas gdy sferoidy nadal unoszą się w pożywce, przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    3. Aby zapewnić zebranie wszystkich sferoid ze studzienki z mikrowzorami, należy przepłukać studzienkę 1 do 3 razy dodatkowym 1 ml pożywki hodowlanej, łącząc wszystkie zawiesiny sferoidalne w jednej fiolce. Pozostawić fiolkę w pozycji pionowej na maksymalnie 10 minut, aby sferoidy osiadły na dnie fiolki, tworząc widoczną osadówkę.
    4. Ostrożnie wyjmij pożywkę z rurki, pozostawiając sferoidy w spokoju. Delikatnie zawiesić je ponownie w ilości świeżej pożywki hodowlanej, która będzie wystarczająca na co najmniej 20 sferoid na naczynie na próbkę mikroskopową. Zminimalizuje to zużycie pożywek hodowlanych i uprości lokalizowanie sferoid podczas obrazowania.
      UWAGA: Użyj autoklawowalnej silikonowej części μ-komorowej płytki 12-dołkowej (patrz Tabela materiałów) przymocowanej do szkła nakrywkowego jako naczynia na próbki mikroskopowe (24 x 60 mm, grubość #1) o maksymalnej objętości pożywki 300 μl na studzienkę. Silikonowa część tej komory hodowlanej może być sterylizowana i ponownie używana z dowolnymi innymi powierzchniami plastikowymi i szklanymi po przyklejeniu do naczynia.
    5. Natychmiast dodać równą objętość zawiesiny sferoidalnej do każdej płytki mikroskopowej/studzienki. Pozostawić sferoidy na 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 w celu przymocowania do powierzchni naczynia mikroskopowego. W przypadku analizy natleniania w połączeniu z użyciem innych barwników należy postępować zgodnie z krokiem 3.1.6. W celu prostej analizy natlenienia należy postępować zgodnie z krokiem 3.1.7.
      UWAGA: Niewystarczający czas inkubacji (<1 h) może prowadzić do sporadycznego usuwania sferoidów i utraty podczas wymiany pożywki, co przerywa eksperyment. Jednocześnie nadmierna inkubacja (>3 h) może prowadzić do częściowej lub całkowitej utraty ich organizacji 3D z powodu migracji komórek ze sferoid na powierzchnię czaszy mikroskopowej i wpływając na ich natlenienie w czasie rzeczywistym.
    6. (opcjonalnie) Ostrożnie wymienić pożywkę na pożywkę zawierającą sondę fluorescencyjną (sondy) fluorescencyjną rozcieńczoną do stężenia barwiącego i kontynuować inkubację przez dodatkowy 1 godzinę, aby osiągnąć optymalną intensywność. Aby uniknąć usunięcia sferoid podczas wymiany pożywki, należy ostrożnie odessać pożywkę pipetą o pojemności 200 μl od krawędzi naczyń mikroskopowych i przeprowadzić dodawanie pożywki z boku w naczyniu mikroskopowym. Przejdź do kroku 3.1.7.
      UWAGA: Aby uzyskać skuteczne barwienie sondami o słabej dyfuzji w agregatach wielokomórkowych, należy wydłużyć stężenie obciążenia i/lub czas. Przed użyciem określ opcjonalne parametry obciążenia sondy we wstępnych eksperymentach.
    7. Wyjmij pożywkę z naczynia mikroskopowego i spłucz raz pożywką do obrazowania. Dodać dokładną ilość pożywki do obrazowania do próbki (np. 300 μl na mikrodołek w komorze μ 12-dołkowej płytki hodowlanej). Przejdź do kroku 3.2.
  2. Akwizycja obrazu
    1. Włącz mikroskop i podłączone urządzenia (tj. źródło światła wzbudzającego, kamerę, komputer, inkubator i inne działające bloki elektroniczne) 30 minut przed obrazowaniem, aby się rozgrzały i zrównoważyły warunki pomiaru (temperatura, różne wartościO2, 5% CO2, wilgotność, jeśli jest to wymagane). Uruchom oprogramowanie operacyjne mikroskopu dostarczone z dokładną konfiguracją mikroskopu.
      UWAGA: Opisany protokół jest dostosowany do oprogramowania CellSens Dimension v.3.
    2. Dobierz odpowiednie filtry wzbudzenia (źródła, mocy) i emisji oraz czas naświetlania dla wybranych sond fluorescencyjnych (lub fosforyzujących). W przypadku analiz wieloparametrowych, 3D i mikroskopii poklatkowej należy zapisać protokoły automatycznych sekwencji pomiarowych w oprogramowaniu mikroskopu operacyjnego.
    3. Empirycznie określ optymalne ustawienia obrazowania dla każdej sondy, modelu eksperymentalnego i linii komórkowej we wstępnych eksperymentach. Upewnij się, że ustawienia mają minimalne fotowybielanie w kanałach referencyjnych (Iref) i O2 detekcji (Isens) oraz minimalny wpływ na współczynnik intensywności (R = Iref / Isens), szczególnie w eksperymentach z pomiarami 3D i poklatkowymi.
    4. Ustaw naczynie mikroskopowe z barwionymi sferoidami na stoliku mikroskopowym. Korzystając z obiektywu o małym powiększeniu, wyświetl podgląd próbki w świetle transmisyjnym, wykonaj wstępne ustawienie ostrości na sferoidach i umieść je w środku obrazu.
      UWAGA: Do wstępnego ustawiania ostrości wystarczą standardowe obiektywy powietrzne o powiększeniu od 4x do 10x, natomiast do rzeczywistego pomiaru zalecamy obiektywy o aperturze numerycznej (NA) od 20x do 40x z obiektywami o aperturze numerycznej (NA) 0,6 lub większej (zanurzenie w powietrzu lub wodzie) o wystarczającej odległości roboczej dla sferoid przymocowanych do czaszy.
    5. Ustawić obiektyw z wymaganym dużym powiększeniem w pozycji roboczej. Skoncentruj się na trybie światła transmisyjnego w środkowym (równikowym) przekroju sferoidy. Natlenienie w obiektach 3D zależy bezpośrednio od głębokości przekroju obrazowania. Aby to zapewnić, przeanalizuj podobne przekroje w grupach i między nimi, np. środkowe i górne/dolne przekroje sferoid.
      UWAGA: W celu szczegółowej i precyzyjnej analizy i rekonstrukcji gradientówO2 zalecamy skanowanie i tworzenie stosów Z za pomocą mikroskopów konfokalnych, arkuszy świetlnych lub mikroskopów dwufotonowych (najlepsza opcja). W przypadku konwencjonalnej mikroskopii szerokokątnej, w której sygnał ze wszystkich przekrojów będzie zbierany jednocześnie, można przeprowadzić średnie oszacowanie na podstawie środkowego przekroju poprzecznego, a nie dokładną analizę gradientówO2. W tym przypadku środkowy przekrój poprzeczny jest definiowany jako przekrój ogniskowy, w którym sferoidy mają maksymalną średnicę z ostrym ogniskiem na ich granicach.
    6. Dostosuj ustawienia zbierania sygnałów fluorescencji/fosforescencji referencyjnych i czułych kanałów spektralnych sondyO2 i innych sond fluorescencyjnych stosowanych do obrazowania wieloparametrycznego.
    7. W celu ilościowego porównania opartego na intensywności zastosuj te same wybrane ustawienia obrazowania dotyczące czasu ekspozycji, mocy wzbudzenia źródła światła, rozdzielczości, prędkości skanowania i rozmiaru otworu dla wszystkich mierzonych obiektów w grupach.
      UWAGA: Wiele wersji oprogramowania do mikroskopii dostarczonych przez dostawców umożliwia automatyczne obliczanie współczynnika natężenia. Zastosuj scalanie funkcji do pomiarów intensywności kanałów odniesienia i czułych kanałów sondyO2, podczas pisania programu akwizycji obrazowania w menedżerze eksperymentów w używanym tutaj oprogramowaniu do obrazowania.
    8. Zbierz obrazy z tej samej sekcji optycznej dla referencyjnych i czułych kanałów widmowych sondyO2 oraz, w razie potrzeby, dodatkowych kanałów fluorescencyjnych. Dla tego protokołu należy użyć sondy MMIR1 z czerwonym widmem odniesienia (exc. = 580 nm, em. = 650 nm) i czułym na bliską podczerwień O2 (exc. =635 nm, em. = 760 nm).
    9. Powtórzyć kroki 3.2.5–3.2.8, aby zebrać wystarczającą liczbę punktów danych do analizy statystycznej. Do dynamicznej analizy szybko zmieniających się odpowiedzi komórkowych po leczeniu różnymi lekami, mitochondrialnymi rozprzęgaczaczami lub inhibitorami łańcucha transportu elektronów i innymi szybko działającymi związkami należy użyć trybu pomiaru poklatkowego (krok 3.2.10).
    10. Pomiary należy wykonywać w pożywkach obrazowych, w temperaturze 37 °C z okresowym oświetleniem próbki i zbierać sygnały z interesujących fluoroforów (np. sondyO2 kanałów odniesienia i czujników), np. co 10 s przez ponad 2 minuty.
    11. Po wykonaniu pomiarów okresowych wykonaj kontrolę ostrości dla każdej sferoidy, aby upewnić się, że podczas obrazowania nie wystąpił dryft ostrości. W razie potrzeby czynność powtórzyć. Przejdź do kroku 3.3 w celu analizy danych.
      UWAGA: Bez stymulacji komórek i dodawania leku można wykonać pomiar poklatkowy w celu oceny fotostabilności w porównaniu z barwnikiem referencyjnym, np. fluoresceiną, zielenią kalceinową AM lub estrem metylowym tetrametylorodaminy.
  3. Prezentacja obrazu
    UWAGA: Tutaj opisujemy, jak automatycznie obliczyć współczynnik intensywności sondy O2 (R) w sferoidach za pomocą funkcji analizy proporcji w oprogramowaniu do obrazowania i zastosować obliczenia R piksel po pikselu w celu wygenerowania obrazów rozkładu R w sztucznych kolorach sekcji mikroskopii sferoidalnej. R można również obliczyć ręcznie na podstawie danych intensywności referencyjnych i czułych kanałów spektralnych zebranych z tego samego obszaru zainteresowania (ROI) obrazu sferoidalnego, stosując prosty wzór R = Iref/Isens24,34. Jeśli nie jest możliwe wyodrębnienie danych o intensywności z surowego obrazu w odpowiednim oprogramowaniu mikroskopowym, dane dotyczące intensywności można uzyskać za pomocą takich programów jak ImageJ lub Fiji (patrz Dyskusja).
    1. Otwórz plik .vsi z danymi o intensywności sondy O2 z referencyjnych i czułych kanałów spektralnych utworzonych w trybie scalonym. Otwórz okno funkcji analizy proporcji z menu pomiaru. Wybierz intensywność kanału odniesienia jako licznik i intensywność kanału wrażliwego jako mianownik do obliczenia R.
      UWAGA: Możliwy jest również odwrócony stosunek sygnałów odniesienia i czułych do obliczenia R, ale w tym przypadku R będzie się zmniejszać wraz ze wzrostem O2 .
    2. Zastosuj odpowiednie ustawienia progu intensywności do każdego kanału spektralnego, aby odjąć tło od scalonego obrazu intensywności. Zwiększaj wartości progowe, aż tło obrazu stanie się jednolicie czarne. Parametr threshold należy zastosować równomiernie do wszystkich obrazów sferoidalnych w zbiorze danych używanym w analizie porównawczej.
      UWAGA: Użyj okna podglądu, aby zoptymalizować ustawienia progowe, obserwując wstępnie obliczony obraz sferoid w fałszywym kolorze R. Wszystkie piksele o intensywności mniejszej niż bieżąca wartość w polu progowym zostaną usunięte z analizy R i przedstawione jako czarne punkty. Po zastosowaniu progu należy uwidocznić tylko obszar odpowiadający fluorescencji sferoidalnej. Wstępne oszacowanie średniego natężenia tła (obszary bez sferoid) niezależnych kanałów widmowych upraszcza wybór odpowiedniego progu do obrazu. Dodatkowo, zastosowanie sferoidalnych granic ROI, zidentyfikowanych na podstawie odpowiedniego obrazu sferoidalnego światła transmisyjnego do połączonego obrazu fluorescencyjnego, pomaga w dokładnym określeniu parametrów progowych, aby zapobiec nadmiernemu odejmowaniu intensywności sygnału innego niż tło.
    3. Zachowaj ustawienia tła dla intensywności licznika i mianownika na poziomie 0, ponieważ tło zostało już odjęte za pomocą zastosowania progu.
    4. Dostosuj współczynnik skalowania (Skala) do obrazu o proporcjach, aż obraz podglądu zapewni żądaną rozdzielczość gradientu R. Zastosuj parametr skalowania równomiernie do wszystkich obrazów sferoidalnych w zestawie danych używanym w analizie porównawczej.
      UWAGA: Parametr skalowania powinien być wystarczająco duży (co najmniej 1 000), aby zapewnić, że obraz R zawiera jak najwięcej informacji i może być wyświetlany jako współczynnik rozdzielczości dla danych liczbowych R.
    5. Zastosuj dostosowane parametry do obrazu sferoidalnego, naciskając przycisk Zastosuj. Dostosuj jasność i kontrast obrazu w oknie dostosowywania ekranu z menu okien narzędzi.
    6. Ręcznie określ limity łączenia i rozłączania histogramu rozkładu proporcji za pomocą opcji stałego skalowania w oknie Dostosuj ekran. Spowoduje to określenie zakresu paska w sztucznych kolorach dla parametru R presentation.
      UWAGA: Aby porównać obrazy sferoidalne między różnymi grupami, ważne jest, aby zachować podobny zakres kolorów dla wszystkich próbek analitycznych. Z uwagi na to, że zakres zmian parametru R może być różny pomiędzy grupami, wybrany zakres słupków w kolorze fałszywym powinien być uniwersalny dla histogramów rozkładu we wszystkich grupach analitycznych.
    7. Sferoidy często nie są idealnie kuliste, załóżmy, że średnica sferoidy jest najdłuższą linią poprowadzoną przez środek (często niedotlenione jądro) sferoidy. Korzystając z funkcji linijki liniowej z menu pomiaru, określ średnicę sferoidy. Eksportuj dane jako plik tabeli arkusza kalkulacyjnego.
    8. Wybierz ROI o wymaganym rozmiarze (jak najmniejszym) i kształcie (np. okrągłym) i zastosuj go do obwodu i niedotlenionego rdzenia sferoidy. Przekształć ROI w mierzony obiekt, aby przeanalizować średni R (peryferyjny R-Rp i rdzeń R-Rc) wewnątrz wybranego ROI. Eksportuj dane w formacie tabeli zgodnym z arkuszem kalkulacyjnym.
      UWAGA: Sferoidy nie mają identycznego rozkładuO2 w grupie, a niedotlenione jądra nie są idealnie kolokalizowane z centrami sferoidalnymi. Aby uprościć i ustandaryzować analizę, zakładamy, że najbardziej niedotlenione obszary odpowiadają idealnemu jądru w środku sferoidy. Rc mierzone w tych strefach stosuje się do obliczeń zakresu gradientu O2 (Rp-R c) i stromości (Rp-R c) /r, gdzie r (najlepiej odległość między obwodem a niedotlenionymi rdzeniem ROI) jest przybliżonym promieniem sferoidy w μm obliczonym na podstawie pomiarów średnicy. Opcjonalnie gradienty sferoidalne O2 mogą być prezentowane jako liniowe profile liniowe zmiany parametru R (okno profilu linii w menu miary) wykonane wzdłuż średnicy sferoidy. Dane te można również wyeksportować jako plik tabeli arkusza kalkulacyjnego.
    9. Zastosuj pomiary do każdej sekcji mikroskopowej sferoid, aby uzyskać zestaw danych o średnicach sferoid, Rc i Rp w celu wykonania dalszych obliczeń i porównań statystycznych. Połącz wszystkie dane w jednym pliku arkusza kalkulacyjnego.
    10. Aby przeprowadzić analizę poklatkową fotowybielania lub dynamicznych reakcji na różne bodźce, zastosuj wybrany zwrot z inwestycji do tych samych współrzędnych na każdym obrazie w zestawie. Aby porównać parametry R, przedstaw je jako procent od R pierwszego cyklu w zestawie zdjęć poklatkowych.
    11. Do analizy fotowybielania użyj R z kilku ROI, aby obliczyć średnie R w procentach dla każdego cyklu poklatkowego i śledzić zmiany.
    12. Załóżmy, że efekt fotowybielania nie jest krytyczny, jeśli po 12 cyklach ciągłego oświetlenia nastąpił spadek początkowej intensywności o mniej niż 5%. Zawsze porównuj dynamiczne zmiany z krzywą fotobielenia jako kontrolą, aby upewnić się, że istotność ratiometrycznej reakcji poklatkowej (patrz Rysunek 2A,B).
    13. Z otrzymanych parametrów obliczyć r, (Rp-R c) i (Rp-R c) / r dla poszczególnych sferoid w zbiorze danych. Przeanalizuj normalność rozkładu danych za pomocą testów Kołmogorowa-Smirnowa lub odpowiednich testów. Wybierz odpowiednią metodę statystyczną do analizy danych i przystąp do prezentacji danych liczbowych.
      UWAGA: Przedstawione tutaj dane miały rozkład normalny i zastosowano niezależny test t przy p = 0,05 w celu porównania statystycznego między grupami sferoidalnymi.

Wyniki

Schematycznie przedstawiono wysokoprzepustową produkcję sferydoidów wstępnie wybarwionych sondą O2 metodą mikrouzorowanej agarozy na Rysunku 1C, pokazującym przykłady mikrowłości agarozowych bez i z wstępie wybarwionymi sferydoidami. Skuteczność formowania sferydoidów na powłoce z agarozy oraz ich kształt/sferyczność może zależeć od typu komórki. Na przykład komórki ludzkich jelita grubego HCT116 nigdy nie tworzyły idealnych struktur kulistych przy użyciu metody mikrowłości agarozowych, w przeciwieństwie do powierzchni pokrytych lipidami17, natomiast hDPSC samodzielnie oraz w kulturze wspólnej z HUVEC zawsze tworzyły sferydoidy o wysoce powtarzalnym kształcie i rozmiarze proporcjonalnym do składu komórkowego, początkowej liczby komórek oraz czasu formowania/rosnących sferydoidów. Wszystkie badane typy komórek wydajnie gromadziły nanocząstki sondy O2 podczas formowania sferydoidów (Rysunek 1B) i zachowywały to wybarwienie przez co najmniej 5 dni, umożliwiając ich wykorzystanie do biowytłaczania oraz późniejszego monitorowania natlenienia wydrukowanych tkanek (Rysunek 1D).

Diagram równowagi statycznej z metodą fosforylacji; przegląd procesu mikrouzorowanego żelu agarozowego.
Rycina 1: Zasada działania sondy do pomiaru O2 oraz jej zastosowanie w barwieniu sferydoidów i biodruku. (A) Uproszczony diagram Yablonskiego wyjaśniający zasadę wykrywania O2 przez fosforylujące nanocząstki (NP). Przeniesienie energii do cząsteczkowego O2 w trakcie zakazanego wzbudzonego stanu trypletowego (T) prowadzi do zmniejszenia intensywności fosforylacji, co jest odwrotnie proporcjonalne do czasu życia fosforylacji tau, τ (zmiany od τ1 przy 0% O2 do τ2 przy 21% O2), czyli czasu pomiędzy wzbudzeniem do stanu singletowego (S1) a powrotem do stanu podstawowego (G0)42. Ilościowy pomiar O2 może być przeprowadzony metodą ratiometryczną lub poprzez pomiar τ (pomiar czasu życia fosforylacji).(B) Przykład barwienia sferydoidów ludzkich komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSC) różnymi typami nanocząstek O2 jako sond do wykrywania tlenu, pokazany w świetle przechodzącym, kanale referencyjnym oraz kanale fluorescencji barwnika wrażliwego na O2. Szerokość skali wynosi 100 µm. (C) Schemat generowania sferydoidów wstępnie oznakowanych sondą O2 metodą wysokoprzepływową z wykorzystaniem mikrouzorowanego żelu agarozowego. Od lewej do prawej: stemple krzemowe z PDMS umieszczone w dołku płytki hodowlanej, przykład mikrodobrzegowego wzoru w agarozie (powiększenie 4x) oraz przykład sferydoidów wstępnie oznakowanych sondą MMIR1, wytworzonych z ludzkich komórek raka okrężnicy HCT116, dwa dni po posiewie na mikrouzorowanym żelu agarozowym (powiększenie 4x). Szerokość skali wynosi 100 µm. (D) Od lewej do prawej: wydrukowana konstrukcja typu „waffle” oraz analiza mikroskopowa konstruktu z sferydoidów wstępnie oznakowanych sondą MMIR1, wydrukowanego metodą bioprintingu, w dniach 1 i 5 po wydrukowaniu. Sygnał fluorescencyjny odpowiada barwnikowi fosforylującemu wrażliwemu na O2 w nanocząstkach MMIR1 (wzbudz. = 635 nm/em. = 760 nm). Szerokość skali wynosi 400 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

W opisanym układzie mikroskopowym (konwencjonalny fluorescencyjny mikroskop o polu jasnym wyposażony w diodę elektroluminescencyjną (LED) jako źródło światła) sonda MMIR1 w zakresie czerwonym/bliskim podczerwieni okazała się najlepsza pod względem fotostabilności barwników referencyjnego i wrażliwego, z mniejszym niż 5% spadkiem jasności ich początkowego stosunku intensywności (R = Iref/Iczułość) po 12 cyklach ciągłego oświetlenia. Umożliwiło to zastosowanie sondy MMIR1 do dynamicznych badań w czasie rzeczywistym szybkiej odpowiedzi oddechowej sferoidów hDPSC po zastosowaniu rozprzęgacza mitochondriów (FCCP) oraz inhibitora kompleksu I łańcucha transportu elektronów (rotanon)Rycina 2A, B). Stwierdziliśmy, że w sferoidach pochodzących ze stromalnych komórek macierzystych FCCP wykazuje jedynie łagodny efekt rozprzęgający, z niewielkim spadkiem respiracji komórkowej około 80 s po dodaniu tego leku, zgodnie z wcześniej opisanymi cechami metabolicznymi DPSC40Z drugiej strony rotanon silnie hamował oddychanie, prowadząc do ponownego natlenienia sferoidów (co odzwierciedla się w wzroście wartości R)p - stosunek peryferii sferoidu i Rc - stosunek rdzenia sferyoidu) oraz rozpraszanie tlenu od obwodu do rdzenia2 gradienty w ciągu ~80 s po stymulacji (Rycina 2A). Półkalibracja dwupunktowa stosunku sygnałów sondy MMIR1 (R) przy wysokim (atmosferycznym) i niskim (w obecności siarczanu sodu i glukozy oksydazy w medium do wizualizacji) stężeniu O2 poziomy potwierdziły zmniejszenie się R, związane ze spadkiem natlenienia sferoidów z wstępnym zahamowaniem oddychania poprzez leczenie koktajlem antymycyny A/rotenuRycina 2C), ilustrujące, jak pomiar sondy MMIR1 R może być wykorzystywany do półilościowego monitorowania długoterminowych odpowiedzi w stanie ustalonym oraz szybkich odpowiedzi tlenowych w 3D.

Wizualizacja natlenienia komórek za pomocą FCCP/rotenu; wykres stosunku fluorescencji; aktywność mitochondrialna.
Rycina 2: Analiza kinetyczna odpowiedzi sondy O2 na różne bodźce. (A) Reprezentatywny wynik wizualizacji natlenienia sferoidów hDPSC w stanie spoczynkowym oraz po działaniu FCCP i rotenu. Szerokość szkalowana to 100 µm. (B) Odpowiedź kinetyczna stosunku intensywności MMIR1 na działanie FCCP i rotenu w porównaniu z początkową kinetyką stosunku intensywności fotowybielania (%). (C) Zmiany na obrazach stosunku intensywności sondy MMIR1 w sferoidach hDPSC w stanie natlenionym (dodanie antymycyny A + rotenu) i odnatlenionym (dodanie oksydazy glukozy). Skala kolorów przedstawia rozkład stosunku intensywności sondy O2 (R = Iref / Isens) na całym obrazie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Aby zilustrować zastosowanie sondy MMIR1 w obrazowaniu metabolicznym żywych komórek, przeprowadzono analizę porównawczą O2 gradient w homokomórkowych hDPSC w porównaniu z heterokomórkowymi hDPSC/HUVEC (1:1) sferoidach. Wykorzystując dostępność wolnych kanałów fluorescencyjnych w zakresie niebieskim i zielonym, przeprowadzono współbarwienie za pomocą Hoechst 34580 (HXT) i SYTOX Green (SYTOX), aby zademonstrować zastosowanie O2 sonda do badań wieloparametrycznych (Rycina 3). Korzystając z automatycznego protokołu obliczania stosunku intensywności piksel po pikselu dostarczonego przez oprogramowanie do analizy obrazów, wygenerowano obrazów stosunku w fałszywych kolorach przedstawiających rozkład R w sferoidach, wizualizując w czasie rzeczywistym wykryte wartości stosunku O od peryferii do rdzenia2 gradienty w wszystkich typach sferoidów: z natlenionym obwodem i hipoksjami w centrum (Rycina 2 i Rycina 3A). Jednakże Rp i Rc wartości, jak również stromość O2 gradient w przekrojach środkowych różnił się w zależności od typu sferoidów: zobacz profile liniowe przekrojów środkowych sferoidów hDPSC w porównaniu z sferoidami hDPSC/HUVEC oraz sferoidów hDPSC w porównaniu z bioodtładowanymi sferoidami hDPSC (Rycina 3B, C). Ze względu na brak powszechnie akceptowanej metody opisywania O2 gradientów wprowadzono kilka parametrów umożliwiających łatwe porównanie oraz szczegółowy opis ogólnego natlenienia sferoidów: Rp i Rc, oraz takie cechy O2 gradienty jako różnica między strefami natlenionymi i hipoksyjnymi jako (Rp–c) oraz średnie zmiany natlenienia na µm jako (Rp–Rc) / r, gdzie r jest odległością między obwodem a jądrem hipoksyjnym, korelującą w przekroju środkowym z promieniem sferoidu (Rycina 3D). Statystyczne porównanie tych parametrów wraz z danymi dotyczącymi martwych komórek nekotycznych wizualizowanych za pomocą SYTOX w sferoidach pozwoliło nam sformułować wstępne wnioski dotyczące pochodzenia typu komórkowego charakterystycznego dla sferoidów O2 gradienty rozkładu

Wyniki testu żywotności komórek; obrazowanie komórek, stosunek fluorescencji, zielony Sytox, porównanie biowytłaczania hDPSC.
Rycina 3: Porównawcza analiza gradientów natlenienia w sferoidach. (A) Przykładowe obrazy mikroskopii żyjących komórek pod względem natlenienia (mikroskopia ratiometryczna fluorescencyjna MMIR1) oraz barwienia żywych/martwych komórek (Hoechst 34580, HXT, niebieski i SYTOX Green, SYTOX) w homokomórkowych sferoidach hDPSC przed i po wydruku oraz w heterokomórkowych sferoidach hDPSC/HUVEC (1:1). hDPSC we wszystkich typach sferoidów pochodziły z tej samej hodowli komórkowej. Sferoidy były wstępnie barwione przez 2 dni podczas ich formowania za pomocą sondy MMIR1 w stężeniu 5 µg/mL, a następnie użyte albo do obrazowania, albo do biowytłaczania (tylko sferoidy hDPSC), po czym przeprowadzono analizę obrazowania w dniu 1 po biowytłaczaniu. Obrazy w fałszywych kolorach przedstawiają rozkład stosunku intensywności (Iref/Isens) sferoidów barwionych MMIR1, odpowiadający gradientom O2 od obwodu do rdzenia. Skala długości to 100 µm. Pasek kolorów reprezentuje rozkład stosunku intensywności sondy O2 (R = Iref/Isens) na całym obrazie. Numery 1 i 2 przekrojów średnicowych odpowiadają profilom intensywności pokazanym na rycinie B i C. (B,C) Porównanie profili stosunku intensywności między jednorodnymi sferoidami hDPSC a heterogenicznymi sferoidami hDPSC/HUVEC (B) oraz jednorodnymi sferoidami hDPSC przed i po biowytłaczaniu (C). Profile zmierzono dla przekrojów sferoidów pokazanych na rycinie (A). (D) Schematyczne przedstawienie parametrów używanych do opisu gradientów O2 od obwodu do rdzenia w sferoidach, gdzie r to promień sferoidu, a Rp i Rc to odpowiednio stosunki intensywności w strefie obwodowej i centralnej sferoidu. Pasek kolorów schematycznie przedstawia rozkład gradientu O2 od wysokich (czerwony) do niskich (niebieski) poziomów w idealnie sferycznym sferoidzie. (E,F) Porównawcza analiza wartości gradientów O2 od obwodu do rdzenia (Rp–Rc) / r w sferoidach hDPSC/HUVEC i hDPSC (E) oraz w sferoidach hDPSC przed i w dniu 1 po biowytłaczaniu (F). Analizę statystyczną przeprowadzono dla jednego powtórzenia eksperymentu (n = 18–23). Pudełka odpowiadają odchyleniom standardowym. Gwiazdki wskazują istotność statystyczną różnic między grupami (przy p = 0,05); ** = p < 0,0005. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego obrazu.

W porównaniu do homokomórkowych sferoidów hDPSC, sferoidy hDPSC/HUVEC wykazywały istotnie bardziej strome gradienty: wyższe wartości (Rp–c) / r parametr i zakres (Rp–Rc; Rycina 3F). Jednocześnie wykazali wyższe natlenienie peryferii (Rp) i rdzeń (Rc) (Rycina 4A, Tabela 1). Ciekawe, że były one również statystycznie większe (Rycina 4A, Tabela 1), co sugeruje, że różnice w natlenieniu wynikają z odmiennych profili bioenergetycznych komórek. Dane te są zgodne z dobrze znanymi cechami metabolicznymi komórek HUVEC, które charakteryzują się ogólnie niższą aktywnością oddychania i silnym zależeniem od glikolizy oraz szlaku pentozofosforanowego jako głównych źródeł bioenergetycznych ATP i NAD(P)H41. Jednocześnie wyraźne jest od krawędzi do środka O2 gradient utworzony w heterogenicznych sferoidach jest najprawdopodobniej generowany przez hDPSC w ich składzie, charakteryzujący się hiperpolaryzowanymi mitochondriami oraz aktywnym łańcuchem transportu elektronów40 i, zgodnie z wynikami dotyczącymi natlenienia sferoidów hDPSC, wykazujące silną aktywność oddechową (Rycina 3, Rycina 4A, oraz Tabela 1). Tak więc ogólnie wyższa żywotność sferoidów hDPSC/HUVEC potwierdzona została przez niższą intensywność barwienia martwych komórek za pomocą SYTOX (Rycina 3Amoże być potencjalnie związane z ich wyższym poziomem natlenienia.

Aby zademonstrować zastosowanie obrazowania mikroskopowego żywych sferoidów pod kątem ich natlenienia w procesie biofabrykacji, sferoidy hDPSC wstępnie oznaczone sondą O2 MMIR1 wykorzystano do biodruku w bioczynniku GelMA, porównując gradienty O2 w sferoidach hDPSC przed biodrukiem oraz w pierwszym dniu po biodruku (Rycina 3A,C,F, Rycina 4B oraz Tabela 2). Sferoidy hDPSC po biodruku charakteryzowały się istotnie lepiej natlenioną obwodową częścią (wyższe Rp) w porównaniu do sferoidów zmierzonych przed biodrukiem, podczas gdy natlenienie rdzenia pozostawało na podobnym poziomie (Rycina 4B). Zmiany w natlenieniu obwodu wpływały na zakres (wzrost wartości (Rp-Rc)) oraz stromość (zwiększenie (Rp-Rc)/r) gradientów O2 od obwodu do rdzenia, które statystycznie różniły się od gradientów sferoidów hDPSC zmierzonych przed biodrukiem (Rycina 3F i Rycina 4B). Barwienie martwych komórek było ogólnie intensywniejsze w sferoidach po biodruku, co sugeruje, że obniżona żywotność sferoidów przyczynia się do zmian w ich natlenieniu (Rycina 3A).

Wykres porównawczy wzrostu sferoidów komórkowych; hDPSC, HUVEC, wpływ biodruku; analiza statystyczna.
Rycina 4: Analiza porównawcza średnicy sferoidów oraz stosunku intensywności barwienia MMIR1. (A) Porównanie sferoidów hetero- hDPSC/HUVEC i homokomórkowych hDPSC. (B) Porównanie sferoidów homokomórkowych hDPSC przed i po biodruku. Rp i Rc – stosunek intensywności na obwodzie i w centrum sferoidów odpowiednio; (Rp-Rc) – różnica w stosunku intensywności odpowiadająca zakresowi gradientu O2 w sferoidach. Analizę statystyczną przeprowadzono dla jednego replikatu eksperymentalnego (n = 18–23). Pudełka odpowiadają odchyleniom standardowym. Gwiazdki wskazują istotność statystyczną różnic między grupami (przy p = 0,05), gdzie * = p < 0,005 oraz ** = p < 0,0005. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Typ sferoidu (N)Średnica [µm]Rp [a.j.]Rc [a.j.]Rp-Rc [a.j.](Rp-Rc)/r [a.j./µm]
hDPSC / HUVEC (18)113,2 ± 10,60,779 ± 0,0340,398 ± 0,0550,982 ± 0,0510,00677 ± 0,00091
hDPSC (18)88,1 ± 9,90,558 ± 0,0250,331 ± 0,0340,227 ± 0,0320,00520 ± 0,00090
p-wartość1,5 x 10-8 *1,5 x 10-21 *1,3 x 10-4 *1,4 x 10-12 *9,2 x 10-6 *

Tabela 1. Średnica sferoidów, stosunek intensywności w centrum (Rc) i na peryferiach (Rp) sferoidów, różnica w stosunku intensywności (Rp–Rc) oraz wartość (Rp–Rc) / r w heterogenicznych sferoidach hDPSC/HUVEC i homogenicznych sferoidach hDPSC. Wartość p testu t dla N sferoidów wykazuje różnicę statystyczną i została oznaczona gwiazdką.

Typ sferoidu (N)Średnica [µm]Rp  [j.m.]Rc [j.m.]Rp-Rc [j.m.](Rp-Rc)/r [j.m./µm]
hDPSC (18)88.1 ± 9.90.558 ± 0.0250.331 ± 0.0340.227 ± 0.0320.00520 ± 0.00090
Wydrukowane biologicznie hDPSC (23)80.9 ± 12.50.584 ± 0.0230.323 ± 0.0380.261 ± 0.0390.00658 ± 0.00144
Wartość p0,0540,0024 *0,469,9 x 10-4 *6,3 x 10-6 *

Tabela 2. Średnica sferoidów, stosunek intensywności w centrum (Rc) i na peryferiach (Rp) sferoidów, różnica w stosunku intensywności (Rp–Rc) oraz wartość (Rp–Rc) / r w homogenicznych sferoidach hDPSC przed i po biodruku. Wartość p analizy statystycznej (N sferoidów). Różnice statystyczne oznaczono gwiazdką.

Dyskusja

Znaczenie. Pomiar natlenienia tkanek daje wgląd w metabolizm specyficzny dla komórek i tkanek, wzrost i rozwój tkanek, żywotność, nowotworzenie i migrację komórek oraz interakcje z drobnoustrojami i innymi patogenami. Przedstawiona metoda daje nowe narzędzie do lepszego zrozumienia fizjologii wielokomórkowych kultur sferoidalnych: analizę natlenienia za pomocą ratiometrycznych sond nanocząstekO2 oraz dostarcza środków do oceny niedotlenienia, wizualizacji zależności od określonych szlaków produkcji energii oraz uzupełnia badania modelowe i alternatywne podejścia do obrazowania metabolicznego 43,44 na powszechnie dostępnym, niedrogim mikroskopie fluorescencyjnym. Pomiary ratiometryczne można wykonywać na fluorescencyjnym mikroskopie szerokopolowym (preferowane impulsowe wzbudzenie LED), laserowo-skaningowym mikroskopie konfokalnym, arkuszowym świetlnym i dwufotonowym, idealnie wyposażonym w komory inkubatora Ti O2. Co ważne, prezentowany pomiar mikroskopowyO2 można łatwo połączyć z wieloparametrową analizą na żywo różnych parametrów fizjologicznych i znaczników komórkowych (w przypadku heterokomórkowych kultur sferoidalnych), żywotności (barwienie żywe/martwe), metabolizmu lipidów (sondy fluorescencyjne wykrywające lipidy), dynamiki pH (barwniki, nanocząstki i białka fluorescencyjne) lub [Ca2+] wykonywane w dostępnych kanałach spektralnych fluorescencji lub równolegle, dając rozszerzony wgląd w funkcję komórek w czasie rzeczywistym w sferoidach, biodrukowanych konstruktach i potencjalnych przeszczepach tkanek.

Hodowle sferoidalne znajdują zastosowanie w badaniach komórek nowotworowych, mikrośrodowiska niszowego guza i komórek macierzystych, nowotworów, badań przesiewowych skuteczności leków i toksyczności, a także jako elementy budulcowe tkanek do biofabrykacji tkanek i samoorganizacji45. Mogą one być generowane z wielu typów komórek przy użyciu różnych podejść46. Popularność modelu sferoidalnego wymusza ich standaryzację z punktu widzenia rzetelności badań i poprawy analizy danych, czego ostatnio próbowano poprzez opracowanie pierwszej bazy danych sferoidów8.

Oczekuje się, że nasz protokół pomoże lepiej zrozumieć żywy metabolizm sferoidów, ustandaryzować ten model eksperymentalny, a następnie poprawić ich długoterminową stabilność, odtwarzalność i żywotność w materiałach biodrukowanych i wszczepialnych.

Modyfikacje. Protokół ten opisuje zastosowanie mikrowzorzystej powierzchni agarozy o niskiej przyczepności (tworzenie oparte na mikropleśni29) do wysokowydajnego wytwarzania sferoid obciążonych sondą O2 do analizy natleniania. Alternatywne metody produkcji sferoidów, takie jak wiszące krople, nakładanie ultra niskich płytek mocujących, powlekanie lipidowe lub tworzenie swobodnego pływania, są również zgodne z sugerowanym protokołem ładowania sondyO2. Prezentowany protokół został zoptymalizowany dla sferoid hDPSC i sferoid kokulturowych hDPSC z HUVEC (1:1). Inne linie komórkowe są z pewnością możliwe do zastosowania 15,17,47,48; Jednak może być wymagana pewna optymalizacja protokołu ze względu na różne właściwości adhezji komórek, warunki hodowli, wymagania dotyczące substratu metabolicznego i kompatybilność komórek z barwieniem nanocząstek. Wybór odpowiedniej ratiometrycznej sondy czułej na nanocząstki O2 musi być dokonany w zależności od konkretnego modelu komórki i zgodnie z właściwościami fotowybielania sondy w zastosowanym zestawie mikroskopowym (intensywność i rodzaj źródła światła, czułość spektralna kamery) oraz dostępność odpowiednich filtrów wzbudzenia/emisji dla odpowiednich referencyjnych i czułych kanałów spektralnych O2 sondy.

Niektóre ratiometryczne sondyO2 są dostępne na rynku2. Alternatywnie można je przygotować we własnym zakresie poprzez współwytrącanie barwników referencyjnych i wrażliwych naO2-2 z polimerem, jak opisano w innym miejscu 24,25,49. Dla każdego indywidualnego modelu należy wykonać badania wstępne w celu określenia odpowiedniej sondy i optymalnych warunków mikroskopowych oraz zminimalizowania efektu fotowybielania sondy lub fotoindukowanego zużyciaO2 podczas pomiarów ratiometrycznych. Wcześniejsze badania nanocząstek wykrywającychO2 wykazały ich niską toksyczność komórkową, co pozwala na zastosowanie w szerokim zakresie stężeń barwienia (1-20 μg/ml). Ponieważ niektóre nanocząstki kationowe mogą samoczynnie agregować się podczas przechowywania, zalecamy utrzymywanie ich stężenia obciążenia na jak najniższym poziomie, aby zminimalizować ich potencjalny wpływ na tworzenie sferoidów. Opcjonalnie zawiesina nanocząstek może być filtrowana (0,2 μm) lub oczyszczana przez wirowanie (10 000 x g, 5 min) przed użyciem w celu usunięcia wszystkich agregatów z zawiesiny.

Chociaż oprogramowanie BioCAD i HMI jest specyficzne dla prezentowanej biodrukarki, protokół ten ma zastosowanie do innych biodrukarek, ponieważ zapewnione jest przygotowanie biotuszu, montaż, napełnianie standardowego wkładu oraz konstrukcja porowatego rusztowania hydrożelowego. Ponadto parametry biodruku, takie jak szybkość drukowania i temperatura, powinny być porównywalne dla różnych biodrukarek opartych na wytłaczaniu. Ciśnienie drukowania i średnica rozpórki zależą od rodzaju i średnicy igły, składu biotuszu, temperatury i lepkości wynikowej, ale mogą być punktem wyjścia do optymalizacji parametrów drukowania w celu biodruku biotuszów na bazie GelMA za pomocą różnych biodrukarek, chociaż niektóre biodrukarki używają wrzecion zamiast ciśnienia powietrza do wytłaczania biotuszu50.

Krytyczne kroki i rozwiązywanie problemów. Jednym z krytycznych etapów jest wybór sondyO2 , który opiera się na następujących względach: po pierwsze, dostępna konfiguracja mikroskopu fluorescencyjnego (tj. kompatybilne źródło światła wzbudzenia, filtry wzbudzenia i emisji, czułość kamery i przepuszczalność widmowa oraz apertura numeryczna obiektywu), które mogą ograniczać liczbę dostępnych sond pod względem ich fotostabilności, jasność i potencjalną fototoksyczność. Należy również zauważyć, że niektóre rodzaje olejków immersyjnych (w przypadku obiektywów immersyjnych z olejkiem) mogą zakłócać sygnały fluorescencji w kolorze czerwonym i podczerwonym. Uważamy, że testy fotostabilności są bardzo ważne i że muszą być wykonywane podczas wstępnej konfiguracji i testów wstępnych. Należy wziąć pod uwagę potencjalny przesłuch spektralny między kanałami fluorescencyjnymi a różnymi barwnikami. Rzeczywiście, potencjalna ciemna i fotoindukowana toksyczność sondyO2 i innych wybranych barwników, w odniesieniu do konkretnego modelu komórkowego, musi zostać oceniona podczas optymalizacji protokołu51. Specyficznym problemem dla nanocząstek może być ich samoagregacja, którą można złagodzić poprzez optymalizację ich stężenia roboczego, składu podłoża barwiącego (np. zawartość surowicy), sonikację nanocząstek przed zmieszaniem z pożywką lub użycie wstępnie wybarwionych i przemytych komórek za pomocą sondy O2 do tworzenia sferoid zamiast ładowania sondy podczas procedury tworzenia i kompaktyzacji sferoidy.

Nie zaobserwowaliśmy problemów związanych z głębokością penetracji światła w opisywanych modelach sferoidalnych, ale należy to wziąć pod uwagę przy doborze sygnałów o intensywności ratiometrycznej, wielkości konstruktów sferoidalnych i biofabrykowanych (przeszczepów tkankowych) oraz optymalizacji barwienia komórek odpowiednimi barwnikami. Oczekuje się, że sonda MMIR1 o ściśle dopasowanych długościach fal emisji czerwonej i bliskiej podczerwieni zapewni najniższe tło i najlepszą penetrację światła tkankowego w porównaniu z innymi sondami biosensorów fluorescencyjnych emitujących światło czerwono-niebieskie lub zielone.

Produkcja i obsługa obrazów proporcjowych (i potencjalnie demiksowanie lub dekonwolucja spektralna) może być wykonana w oprogramowaniu dostarczonym przez dostawcę lub w opcjach opensource, takich jak ImageJ, Fiji52,53, napari (https://napari.org), MATLAB i inne. Krytycznym krokiem będzie odjęcie tła i zmierzenie zmian intensywności sygnału w zakresie liniowym.

Kalibracja sondyO2: Rotenon i antymycyna A są inhibitorami kompleksów I i III mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów, odpowiednio, blokując oddychanie komórkowe 54,55,15 i indukując rozpraszanie gradientów O 2 w sferoidach i ich równoważenie ze środowiskowymO2. Tak więc zmiana stężenia środowiskowegoO2 (tj. 20%, 15%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0% O2) pozwoli na ratiometryczną kalibrację intensywności lub żywotności fosforescencji sondy O2 czułej na komórki w komórkach. Zazwyczaj inkubatory sterowaneO2 nie są w stanie osiągnąć bezwzględnego 0%O2 i w niektórych sytuacjach wymagany jest szybki test odpowiedzi sondy na odtlenienie. W takich przypadkach do próbki należy dodać 25-100 μg/ml oksydazy glukozowej lub mieszaniny Na2SO3/K2HPO4 (50 mg/ml na każdy związek na 10-krotny roztwór w wodzie destylowanej). Co ważne, jeśli linia komórkowa ma znaczny stopień niemitochondrialnego zużyciaO2, należy to wziąć pod uwagę podczas wykonywania eksperymentów z hamowaniem oddychania i kalibracją.

Ograniczenia i przyszłe badania. Głównym ograniczeniem proponowanej metody i detekcji ratiometrycznej w ogóle jest kalibracja i konwersja obserwowanych poziomów proporcji na rzeczywiste poziomyO2 , co ze względu na wewnętrzne różnice w sprzęcie i ustawieniach akwizycji obrazu użytkownika sprawiłoby, że kalibracja proporcji byłaby specyficzna dla przyrządu i komórki. Co ważne, w przypadku szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego i opisanej konfiguracji, obrazy proporcji odzwierciedlają raczej połączone projekcje niż idealne przekroje optyczne, a kalibracjaO2 nie miałaby sensu. Z drugiej strony pokazujemy, że półilościowe pomiary wskaźnikowe dostarczają statystycznie istotnego i łatwego do zmierzenia fenotypowania porównawczego sferoid wytwarzanych z różnych źródeł i mających różnice w natlenieniu.

Przyszłe badania nad stworzeniem bardziej dostępnych i przystępnych cenowo podejść mikroskopowych zaprojektowanych dla żywych obiektów 3D, takich jak SPIM, arkusz świetlny, theta, obrazowanie dwufotonowe i luminescencyjne w połączeniu z uczeniem maszynowym 56,57,58,59,19, pomogą wprowadzić wieloparametryczne obrazowanie O2 do jeszcze większej liczby zastosowań ilościowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez grant Specjalnego Funduszu Badawczego Uniwersytetu w Gandawie (BOF/STA/202009/003) oraz Program ITN 7PR UE "Chebana", umowa grantowa nr 264772 (dla AVK). Dane są dostępne na żądanie. Kod G do biodruku jest dostępny do udostępnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna-EDTAGibco25300-054Dostępne również z
12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych Sigma, sterylneGreiner bio-one665-180Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning i innych firmach.
Szkiełko z 12 studniami, wyjmowaneIbidi81201Dostępne również w Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific i innych
15 ml probówkach wirówkowychNerbe plus02-502-3001Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach
Wkład 3cc, zabezpieczony promieniowaniem UV, luer lockRegenHUC-033CC-UVDostępne również w CelIink i innych
Odkrywanie 3D BioprinterRegenHUN/ABioprinter wyposażony w głowicę drukującą opartą na wytłaczaniu, płaszcz grzewczy, lampę utwardzającą UV-LED, oprogramowanie 3D Discovery HMI (oprogramowanie CAD/CAM z bezpośrednim sterowaniem maszyną) oraz oprogramowanie BioCAD (wersja 1.1-12)
6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych, sterylneGreiner bio-one657160Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach
Antymycyna A firmy Streptomyces sp.Sigma-AldrichA8674-25MGStosowany jako inhibitor kompleksu III mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów, blokujący oddychanie komórkowe
Nasadka B-Braun Tip, luer lockRegenHUTC-BB-BDostępne również w Regemat, Cellink i innych
Widok komórki Naczynie do hodowli komórkowych, PS, 35/10mm, szklane dno, 1 komora, sterylnyGreiner bio-one627861Do mikroskopii sferoid
drukowanychKolagen z ludzkiego łożyska, typ IVSigmaC5533Do przygotowania 0,07 mg / ml kolagenu i 0,03 mg / ml naczyń mikroskopowych pokrytych poli-D-lizyną
D(+)-glukozaMerck8342Przygotuj 1M roztwór podstawowy, 1/100 do przygotowania pożywki obrazowej (końcowe stężenie 10mM)
Zmodyfikowana pożywka Eagle's Dulbecco (DMEM), bez czerwieni fenolowej, glukozy, pirogronianu i glutaminySigma-AldrichD5030-10X1LDo przygotowania podłoża do obrazowania
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka 2PromoCellC-22011Dostępne również w Lonza i innych
Suplement na wzrost śródbłonkaMixPromoCellC-39216Dostępne również w Lonza i innych
FCCP, 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonyluSigma-AldrichC2920-10MGStosowany jako rozprzęgacz mitochondrialny
Surowica bydlęcapłodu Gibco10270-098Dostępne również w Sigma
GelMAN/AN/AGelMA została zsyntetyzowana przez grupę PBM (prof. dr Peter Dubruel i Sandra Van Vlierberghe, Uniwersytet w Gandawie) [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961213011782], ale są również dostępne z Xpect Inx
Oksydaza glukozowa z Aspergillus nige (10000 u)Sigma-AldrichG7141Służy do badania odpowiedzi sondy na odtlenienie
GlutaMAX 100x SuplementGibco35050-038Rozcieńczenie 1/100 do przygotowania podłoża obrazowego (stężenie końcowe 2mM)
HEPES (1M)Gibco15630-080Rozcieńczenie 1/100 do przygotowania podłoża obrazowego (stężenie końcowe 10mM)
Hoechst 34580Invitrogen (Life Technologies)H21486Dostępne również w Sigma, BDBiosciences i inne
Ludzkie komórki macierzyste miazgi zębowej (hDPSC)LonzaPT-5025Dostępne również w ATCC lub u innych dostawców
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)LonzaCC-2517Dostępne również w ATCC lub u innych dostawców
KH2PO4 (diwodorofosforan potasu)Merck4873Do przygotowania roztworu siarczynu sodu (5 mg / ml Na2SO3 i 5 mg / ml KH2PO4). Przygotuj świeże z 10x stężonego roztworu podstawowego dziennie.
Li-TPON/AN/ALi-TPO-L został zsyntetyzowany przez grupę PBM (prof. dr Peter Dubruel i Sandra Van Vlierberghe, Uniwersytet w Gandawie)  [https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F97
8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination] ale porównywalne fotoinicjatory są dostępne w Sigma
MEM Alpha Medium + Glutamax Minimum essential mediumGibco32561-029Dostępne również w Sigma i innych
Stemple PDMS z mikrowzorzyskiem drukowane w 3D, studzienki o średnicy 400 &mikro; m, grubość, całkowita liczba odwiertów 1585WytwarzaneZnaczki te zostały samodzielnie wykonane przez Centrum Technologii Mikrosystemów (prof. dr Jan Vanfleteren, Uniwersytet w Gandawie), ale można je również uzyskać komercyjnie od Merck (Z764094, Microtissues 3D Petri Dish micro-mold mixed spheroid kit)
Na2SO3 (siarczyn sodu)Sigma-Aldrich239321-500GDo przygotowania roztworu siarczynu sodu (5 mg / ml Na2SO3 i 5 mg / ml KH2PO4). Przygotuj świeże z 10x stężonego roztworu podstawowego dziennie.
Sondy O2: MMIR1, SI-0,2+, SII-0,2+N/AN/AMożna przygotować ' we własnym zakresie" przy użyciu dostępnych na rynku barwników, polimerów i metody wytrącania [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]. Niektóre nanocząstki są dostępne na rynku, jak omówiono w [https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-018-2840-x
Pen Strep :P enicylina (10 000 U/ml) / streptomycyna (10 000 μ g / mL) 100x roztwórGibco15140-122Dostępne również w Sigma . Stosować w rozcieńczeniu 1:100
szalki Petriego, sterylneGreiner bio-one633181Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach
Tłok do wkładu 3ccRegenHUP-03CC-UVDostępne również w Cellink, Regemat i innych
Poli-D-lizynaSigmaP6407-5mgDo przygotowania 0,07 mg/ml kolagenu i 0,03 mg/ml mikroskopii pokrytej poli-D-lizyną naczynia
filtr strzykawkowy PVDF 0,22 i mikro; mNovolabA35149Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach
RotenonSigma-AldrichR8875-1GStosowany jako inhibitor kompleksu I mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów, blokujący oddychanie komórkowe
Pirogronian sodu (100 mM)Gibco11360-070Rozcieńczenie 1/100 do przygotowania podłoża obrazowego (stężenie końcowe 1mM)
SYTOX GreenInvitrogen (Life Technologies)S7559Dostępne również w Sigma, Promega i innych
Końcówka stożkowa o rozmiarze 22 (stożkowa igła PEAmada Myachi Europe22K622222Podobne produkty są również dostępne w RegenHU, Cellink, Regemat i innych
Kolba do hodowli tkankowych (75 cm2)VWR734-2313Podobne produkty są również dostępne w Sarstedt, Corning, VWR i innych firmach
Ultrapure AgarozaInvitrogen (Life Technologies)16500-500Inne rodzaje agarozy, takie jak agaroza o niskiej temperaturze topnienia (A-9414, Sigma), Agaroza do rutynowego użytku (A-9539, Sigma)
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny szerokokątnyOlympusN/AOdwrócony mikroskop fluorescencyjny IX81, z silnikowym sterowaniem osią Z, CoolLED pE4000 (16 kanałów, 365-770 nm), kamera cMOS ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu), szklana płyta grzewcza Okolab, oprogramowanie CellSens Dimension v.3 i Obiektywy lotnicze 4x/0,13 UPlanFLN i 40x/0,6 LUCPlanFLN. (Opcjonalnie, do obrazowania w wysokiej rozdzielczości) 60x/1,0 LUMPLFLN woda
samodzielnie ]

Bibliografia

  1. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Biological detection by optical oxygen sensing. Chemical Society Reviews. 42 (22), 8700-8732 (2013).
  2. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
  3. Cordeiro, I. R., Tanaka, M. Environmental oxygen is a key modulator of development and evolution: From molecules to ecology: Oxygen-sensitive pathways pattern the developing organism, linking genetic and environmental components during the evolution of new traits. BioEssays. 42 (9), 2000025(2020).
  4. Wenger, R. H., Kurtcuoglu, V., Scholz, C. C., Marti, H. H., Hoogewijs, D. Frequently asked questions in hypoxia research. Hypoxia. 3, 35(2015).
  5. Erecińska, M., Silver, I. A. Tissue oxygen tension and brain sensitivity to hypoxia. Respiration Physiology. 128 (3), 263-276 (2001).
  6. Gholipourmalekabadi, M., Zhao, S., Harrison, B. S., Mozafari, M., Seifalian, A. M. Oxygen-generating biomaterials: a new, viable paradigm for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 34 (12), 1010-1021 (2016).
  7. Zheng, L., Kelly, C. J., Colgan, S. P. Physiologic hypoxia and oxygen homeostasis in the healthy intestine. A review in the theme: cellular responses to hypoxia. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 309 (6), 350-360 (2015).
  8. Peirsman, A., et al. MISpheroID: a knowledgebase and transparency tool for minimum information in spheroid identity. Nature Methods. 18 (11), 1294-1303 (2021).
  9. Suvarnapathaki, S., Wu, X., Lantigua, D., Nguyen, M. A., Camci-Unal, G. Breathing life into engineered tissues using oxygen-releasing biomaterials. NPG Asia Materials. 11 (1), 1-18 (2019).
  10. Salazar-Noratto, G. E., et al. Understanding and leveraging cell metabolism to enhance mesenchymal stem cell transplantation survival in tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells. 38 (1), 22-33 (2020).
  11. Leedale, J. A., et al. Mathematical modelling of oxygen gradients in stem cell-derived liver tissue. Plos One. 16 (2), 0244070(2021).
  12. Sutherland, R., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Research. 46 (10), 5320-5329 (1986).
  13. Walenta, S., Dötsch, J., Bourrat-Flöck, B., Mueller-Klieser, W. Size-dependent oxygenation and energy status in multicellular tumor spheroids. Oxygen Transport to Tissue XII. , Springer. (1990).
  14. Hompland, T., Fjeldbo, C. S., Lyng, H. Tumor hypoxia as a barrier in cancer therapy: Why levels matter. Cancers. 13 (3), 499(2021).
  15. Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
  16. Dmitriev, R. I., Borisov, S. M., Jenkins, J., Papkovsky, D. B. Multi-parametric imaging of tumor spheroids with ultra-bright and tunable nanoparticle O2 probes. Imaging, manipulation, and analysis of biomolecules, cells, and tissues XIII. , International Society for Optics and Photonics. (2015).
  17. Dmitriev, R. I., et al. Versatile conjugated polymer nanoparticles for high-resolution O2 imaging in cells and 3D tissue models. ACS Nano. 9 (5), 5275-5288 (2015).
  18. Okkelman, I. A., Puschhof, J., Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Visualization of Stem Cell Niche by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. Intestinal Stem Cells. , Springer. 65-97 (2020).
  19. Dmitriev, R. I., Intes, X., Barroso, M. M. Luminescence lifetime imaging of three-dimensional biological objects. Journal of Cell Science. 134 (9), 1-17 (2021).
  20. Yasukagawa, M., Yamada, K., Tobita, S., Yoshihara, T. Ratiometric oxygen probes with a cell-penetrating peptide for imaging oxygen levels in living cells. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry. 383, 111983(2019).
  21. Xie, B. -R., et al. A near infrared ratiometric platform based π-extended porphyrin metal-organic framework for O2 imaging and cancer therapy. Biomaterials. 272, 120782(2021).
  22. Düssmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O 2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death & Disease. 8 (6), 2853(2017).
  23. Roussakis, E., et al. Theranostic biocomposite scaffold membrane. Biomaterials. 212, 17-27 (2019).
  24. Kondrashina, A. V., et al. A phosphorescent nanoparticle-based probe for sensing and imaging of (intra) cellular oxygen in multiple detection modalities. Advanced Functional Materials. 22 (23), 4931-4939 (2012).
  25. Borisov, S. M., et al. Precipitation as a simple and versatile method for preparation of optical nanochemosensors. Talanta. 79 (5), 1322-1330 (2009).
  26. Borisov, S., Nuss, G., Klimant, I. Red light-excitable oxygen sensing materials based on platinum (II) and palladium (II) benzoporphyrins. Analytical Chemistry. 80 (24), 9435-9442 (2008).
  27. Strobl, M., Rappitsch, T., Borisov, S. M., Mayr, T., Klimant, I. NIR-emitting aza-BODIPY dyes-new building blocks for broad-range optical pH sensors. Analyst. 140 (21), 7150-7153 (2015).
  28. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  29. Fukuda, J., et al. Micromolding of photocrosslinkable chitosan hydrogel for spheroid microarray and co-cultures. Biomaterials. 27 (30), 5259-5267 (2006).
  30. Thomsen, A. R., et al. A deep conical agarose microwell array for adhesion independent three-dimensional cell culture and dynamic volume measurement. Lab on a Chip. 18 (1), 179-189 (2018).
  31. Gevaert, E., et al. High throughput micro-well generation of hepatocyte micro-aggregates for tissue engineering. PloS One. 9 (8), 105171(2014).
  32. De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009(2018).
  33. Rivron, N. C., et al. Tissue deformation spatially modulates VEGF signaling and angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (18), 6886-6891 (2012).
  34. Nunes, P., Guido, D., Demaurex, N. Measuring phagosome pH by ratiometric fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (106), e53402(2015).
  35. Billiet, T., Gevaert, E., De Schryver, T., Cornelissen, M., Dubruel, P. The 3D printing of gelatin methacrylamide cell-laden tissue-engineered constructs with high cell viability. Biomaterials. 35 (1), 49-62 (2014).
  36. Tytgat, L., et al. Photopolymerizable materials for cell encapsulation. 3D Printing and Biofabrication. Ovsianikov, A., Yoo, J., Mironov, V. , Springer International Publishing. Berlin. 353-396 (2018).
  37. Markovic, M., et al. Hybrid tissue engineering scaffolds by combination of three-dimensional printing and cell photoencapsulation. Journal of Nanotechnology in Engineering and Medicine. 6 (2), 0210011(2015).
  38. De Moor, L., et al. Hybrid bioprinting of chondrogenically induced human mesenchymal stem cell spheroids. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 484(2020).
  39. Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Hynes, J., Papkovsky, D. B. Kinetic analysis of local oxygenation and respiratory responses of mammalian cells using intracellular oxygen-sensitive probes and time-resolved fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 183-207 (2014).
  40. Uribe-Etxebarria, V., Agliano, A., Unda, F., Ibarretxe, G. Wnt signaling reprograms metabolism in dental pulp stem cells. Journal of Cellular Physiology. 234 (8), 13068-13082 (2019).
  41. Vizán, P., et al. Characterization of the metabolic changes underlying growth factor angiogenic activation: identification of new potential therapeutic targets. Carcinogenesis. 30 (6), 946-952 (2009).
  42. Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Quenched-phosphorescence detection of molecular oxygen: applications in life sciences. Royal Society of Chemistry. , (2018).
  43. Perottoni, S., et al. Intracellular label-free detection of mesenchymal stem cell metabolism within a perivascular niche-on-a-chip. Lab on a Chip. 21 (7), 1395-1408 (2021).
  44. Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) and extracellular flux analyses. Redox Biology. 30, 101420(2020).
  45. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
  46. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), 20160877(2017).
  47. Dmitriev, R. I., et al. Imaging oxygen in neural cell and tissue models by means of anionic cell-permeable phosphorescent nanoparticles. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (2), 367-381 (2015).
  48. Jenkins, J., Borisov, S. M., Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Sulforhodamine nanothermometer for multiparametric fluorescence lifetime imaging microscopy. Analytical Chemistry. 88 (21), 10566-10572 (2016).
  49. Fercher, A., Borisov, S. M., Zhdanov, A. V., Klimant, I., Papkovsky, D. B. Intracellular O2 sensing probe based on cell-penetrating phosphorescent nanoparticles. ACS Nano. 5 (7), 5499-5508 (2011).
  50. Wagner, M., Karner, A., Gattringer, P., Buchegger, B., Hochreiner, A. A super low-cost bioprinter based on DVD-drive components and a raspberry pi as controller. Bioprinting. 23, 00142(2021).
  51. Golub, A. S., Pittman, R. N. Monitoring parameters of Oxygen transport to cells in the microcirculation. Quenched-Phosphorescence Detection of Molecular Oxygen. , 193-204 (2018).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Huang, C., Becker, M. F., Keto, J. W., Kovar, D. Annealing of nanostructured silver films produced by supersonic deposition of nanoparticles. Journal of Applied Physics. 102 (5), 054308(2007).
  54. Foster, K. A., Galeffi, F., Gerich, F. J., Turner, D. A., Müller, M. Optical and pharmacological tools to investigate the role of mitochondria during oxidative stress and neurodegeneration. Progress in Neurobiology. 79 (3), 136-171 (2006).
  55. Schmidt, C. A., Fisher-Wellman, K. H., Neufer, P. D. From OCR and ECAR to energy: perspectives on the design and interpretation of bioenergetics studies. The Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101140(2021).
  56. Stelzer, E. H., Lindek, S. Fundamental reduction of the observation volume in far-field light microscopy by detection orthogonal to the illumination axis: confocal theta microscopy. Optics Communications. 111 (5-6), 536-547 (1994).
  57. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
  58. Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
  59. von Chamier, L., et al. Democratising deep learning for microscopy with ZeroCostDL4Mic. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Biofabrykacja sferoidówtrójwymiarowa hodowla komórekobrazowanie gradientu tlenumikroskopia fluorescencyjnautlenowanie sferoidówkonstrukty biodrukowaneratiometryczna sonda tlenowacharakterystyka fenotypu sferoidów
Przystępna cenowo biofabrykacja sferoid wielokomórkowych wspomagana mikroskopią tlenową
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.