Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63411

⸱

20 grudnia 2021

 ,  ,  , 
1Department of Electronic and Computer Engineering, The Hong Kong University of Science and Technology, 2State Key Laboratory of Molecular Neuroscience, The Hong Kong University of Science and Technology, 3Center of Systems Biology and Human Health, The Hong Kong University of Science and Technology, 4Molecular Neuroscience Center, The Hong Kong University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia bezznacznikowe obrazowanie biomolekuł na podstawie ich wewnętrznej wibracji określonych wiązań chemicznych. W tym protokole opisano instrumentalną konfigurację zintegrowanego mikroskopu SRS i dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego w celu wizualizacji struktur komórkowych w rdzeniu kręgowym żywych myszy.

Streszczenie

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia bezznacznikowe obrazowanie tkanek biologicznych w ich naturalnym mikrośrodowisku w oparciu o wewnętrzne wibracje molekularne, dostarczając tym samym doskonałe narzędzie do badania in vivo procesów biologicznych w rozdzielczości subkomórkowej. Dzięki zintegrowaniu obrazowania fluorescencji wzbudzonej dwufotonem (TPEF) z mikroskopem SRS, dwumodalne obrazowanie in vivo tkanek może pozyskiwać krytyczne informacje biochemiczne i biofizyczne z wielu perspektyw, co pomaga zrozumieć dynamiczne procesy związane z metabolizmem komórkowym, odpowiedzią immunologiczną i przebudową tkanek itp. W tym protokole wideo przedstawiono konfigurację systemu mikroskopowego TPEF-SRS, a także metodę obrazowania in vivo rdzenia kręgowego zwierzęcia. Rdzeń kręgowy, jako część ośrodkowego układu nerwowego, odgrywa kluczową rolę w komunikacji między mózgiem a obwodowym układem nerwowym. Osłonka mielinowa, bogata w fosfolipidy, otacza i izoluje akson, umożliwiając przewodzenie solne potencjałów czynnościowych. Obrazowanie in vivo osłonek mielinowych w rdzeniu kręgowym jest ważne dla badania postępu chorób neurodegeneracyjnych i uszkodzeń rdzenia kręgowego. W protokole opisano również przygotowanie zwierząt i metody obrazowania in vivo TPEF-SRS w celu uzyskania obrazów biologicznych o wysokiej rozdzielczości.

Wprowadzenie

Mikroskopia Ramanowska1,2 jawi się jako potężna metoda obrazowania tkanek biologicznych bez znaczników na podstawie charakterystycznych częstotliwości różnych wiązań chemicznych w biomolekułach. Ze względu na nieinwazyjne i dobrze adaptacyjne możliwości obrazowania, mikroskopia Ramana jest szeroko stosowana do obrazowania składników wzbogaconych w lipidy w tkankach biologicznych, takich jak osłonka mielinowa3,4,5, adipocytes6,7 i krople lipidów8,9,10. Sygnał wymuszonego rozpraszania Ramanowskiego (SRS) uzyskany jako wymuszone wzmocnienie Ramana (SRG) lub wymuszona utrata Ramana (SRL) jest wolny od tła, wykazując idealne podobieństwo widmowe do spontanicznego rozpraszania Ramanowskiego11,12. Ponadto SRL i SRG są liniowo zależne od stężenia analitu, co pozwala na ilościową analizę składników biochemicznych9,11,13. Mikroskopia fluorescencyjna wzbudzona dwoma fotonami (TPEF) jest szeroko stosowana do obrazowania biologicznego in vivo ze względu na swoją wrodzoną zdolność do sekcji optycznej, głęboką głębokość penetracji i niską fototoksyczność14,15,16. Jednak wydajność obrazowania TPEF zależy od charakterystyki znaczników fluorescencyjnych, a liczba rozdzielczych kolorów jest ograniczona ze względu na szerokopasmowe widma fluorescencji8,17,18,19. Bezznacznikowe obrazowanie SRS i obrazowanie TPEF oparte na fluorescencji to dwie uzupełniające się metody obrazowania, a ich połączenie może dostarczyć obfitych informacji biofizycznych i biochemicznych tkanek. Te dwie metody obrazowania opierają się na nieliniowych procesach optycznych (NLO), co umożliwia łatwą integrację w jednym systemie mikroskopowym. Połączenie obrazowania SRS i TPEF, tzw. obrazowania dualmodalnego, umożliwia wysokowymiarowe obrazowanie i profilowanie komórek i tkanek, ułatwiając kompleksowe zrozumienie złożonych systemów biologicznych. W szczególności pikosekundowa (ps) mikroskopia SRS może osiągnąć obrazowanie wiązań chemicznych z wysoką rozdzielczością spektralną w porównaniu z techniką femtosekundową (fs) SRS11, co pozwala na różnicowanie wielu składników biochemicznych w tkance biologicznej, zwłaszcza w zatłoczonym obszarze odcisków palców20,21. Ponadto, w porównaniu z innym powszechnie stosowanym dwumodalnym systemem mikroskopowym NLO z integracją koherentnego mikroskopu rozpraszania anty-Stokesa (CARS), SRS wykazuje lepsze wyniki niż CARS pod względem interpretacji widma i obrazu, a także czułości wykrywania11. Mikroskop SRS-TPEF był używany jako potężne narzędzie do badania różnych układów biologicznych, takich jak Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis kijanka brain5, mouse brain23,24, rdzeń kręgowy25,26, nerw obwodowy27 i tkanka tłuszczowa7, itd.

Rdzeń kręgowy wraz z mózgiem tworzy centralny układ nerwowy (OUN). Wizualizacja aktywności komórkowej w OUN in vivo w warunkach fizjologicznych i patologicznych ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów zaburzeń OUN28,29,30 oraz dla opracowania odpowiednich terapii31,32,33. Osłonka mielinowa, która owija i izoluje aksony w celu szybkiego przewodzenia potencjału czynnościowego, odgrywa znaczącą rolę w rozwoju OUN. Demielinizacja jest uważana za cechę charakterystyczną w zaburzeniach istoty białej, takich jak stwardnienie rozsiane34. Ponadto, po urazie rdzenia kręgowego35, resztki mieliny mogą modulować aktywację makrofagów, przyczyniając się do przewlekłego stanu zapalnego i wtórnego urazu36. Dlatego obrazowanie in vivo osłonki mielinowej wraz z neuronami i komórkami glejowymi w żywych modelach mysich jest bardzo pomocne w zrozumieniu dynamicznych procesów w zaburzeniach OUN.

W tym protokole opisano podstawowe procedury konfiguracji domowego mikroskopu TPEF-SRS oraz przedstawiono dwumodalne metody obrazowania in vivo dla rdzenia kręgowego myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach wykonywane w tej pracy są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Zakładu Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Nauki i Technologii w Hongkongu (HKUST) i zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt HKUST. Szkolenie w zakresie bezpieczeństwa obsługi lasera jest wymagane do konfiguracji i obsługi mikroskopu TPEF-SRS. Zawsze noś laserowe okulary ochronne o odpowiednim zakresie długości fal podczas pracy z laserem.

1. Konfiguracja mikroskopu TPEF-SRS (schemat konfiguracji patrz Rysunek 1)

  1. Użyj zintegrowanego optycznego oscylatora parametrycznego (OPO) połączonego z laserem światłowodowym iterbowym z synchronizacją modów jako źródła lasera ps do obrazowania SRS.
    UWAGA: OPO wyprowadza wiązkę Stokesa (1031 nm) i wiązkę pompy (przestrajalną od 780 nm do 960 nm) z czasem trwania impulsu 2 ps i częstotliwością powtarzania 80 MHz. Wiązka Stokesa jest modulowana z częstotliwością 20 MHz przez wbudowany modulator elektrooptyczny (EOM) do wykrywania wrażliwych na fazę SRS o wysokiej częstotliwości na poziomie MHz.
  2. Użyj lasera fs tytan (Ti): szafir jako źródła lasera do obrazowania TPEF.
  3. Użyj pary soczewek (L1 i L2) do kolimacji i dostosowania rozmiaru wiązki fs do 3 mm.
  4. Użyj pary soczewek (L3 i L4), aby skolimować wiązkę laserową ps i zwiększyć jej średnicę do 3 mm.
  5. Zmień polaryzację wiązki laserowej fs z polaryzacji p na polaryzację s za pomocą płytki półfalowej.
  6. Połącz dwie wiązki laserowe za pomocą rozdzielacza wiązki polaryzacyjnej (PBS).
  7. Dodaj parę luster galwanometrycznych 3 mm XY-scan za PBS do skanowania wiązką.
  8. Użyj telecentrycznej soczewki skanującej (L5) i soczewki tubusu z korekcją nieskończoności (L6), aby sprzęgnąć lustro skanujące i tylną źrenicę soczewki obiektywu 25x. Rozszerz wiązkę lasera za pomocą soczewki skanującej i soczewki tubusu, aby wypełnić tylną aperturę obiektywu.
  9. Umieść PBS lub zwierciadło dichroiczne (D2) między soczewką tubusu a soczewką obiektywu w celu zbierania sygnału SRS lub fluorescencji. Użyj zmotoryzowanej płetwy, aby przełączać się między PBS i D2.
    UWAGA: Część sygnału SRS rozpraszanego wstecznie jest tracona podczas przechodzenia przez PBS w wyniku jego losowo przesuniętej polaryzacji.
  10. Użyj pary soczewek (L7 i L9), aby zawęzić wiązkę wykrywania i sprzężyć tylną źrenicę soczewki obiektywu 25x z czujnikiem fotodiodowym.
  11. Użyj pary soczewek (L8 i L10), aby zawęzić wiązkę detekcji i sprzężyć tylną źrenicę obiektywu 25x z powierzchnią detekcji fotopowielacza (PMT).
  12. Użyj lustra dichroicznego (D3), aby oddzielić ścieżkę detekcji sygnałów fluorescencyjnych i SRS.
  13. Umieść zestaw filtrów (Fs1) przed detektorem fotodiody, aby zablokować laser Stokesa i przepuszczać tylko wiązkę pompy.
  14. Umieść zestaw filtrów (Fs2) przed detektorem PMT, aby przepuszczał tylko docelowy sygnał fluorescencyjny.
  15. Podłącz PMT do prądu amplifier w celu wzmocnienia sygnału.
  16. Podłącz fotodiodę do wzmacniacza lock-in.
  17. Podłącz sygnał synchronizacji z wbudowanego wyjścia EOM do wejścia referencyjnego wzmacniacza lock-in w celu demodulacji sygnału SRS.
  18. Podłącz PMT amplifier i lock-in amplifier wyjścia do modułu akwizycji danych.

2. Kalibracja systemu mikroskopowego TPEF-SRS

  1. Uruchomienie laserów
    1. Przełącz przełącznik kluczykowy z pozycji Standby na On, aby włączyć laser Ti: sapphire i poczekaj 30 minut, aż laser się rozgrzeje.
    2. Włącz OPO, klikając przycisk Start na panelu sterowania OPO i poczekaj 20 minut, aż laser się rozgrzeje.
    3. Po rozgrzaniu lasera ps użyj szybkiego fotodetektora, aby sprawdzić głębokość modulacji wiązki Stokesa. Otwórz migawkę lasera dla wiązki Stokesa. Kliknij pole Ustaw moc OPO i wprowadź 20. Umieść szybki fotodetektor na wyjściu OPO, aby wykryć wiązkę. Podłącz port wyjściowy fotodetektora do portu wejściowego oscyloskopu za pomocą koncentrycznego ze złączem Bayonet Neill-Concelman (BNC) w celu monitorowania impulsu laserowego.
    4. Otwórz okno Kontrola EOM w oprogramowaniu sterującym OPO. Dostosuj moc i fazę EOM zgodnie z wykresem intensywności impulsów pokazanym na oscyloskopie, aby osiągnąć maksymalną głębokość modulacji przy 20 MHz.
      UWAGA: Wydajność EOM jest zwykle stabilna i należy ją sprawdzić tylko wtedy, gdy sygnał SRS zostanie stwierdzony jako znacznie zmniejszony.
  2. Ustawienie optyczne kombinowanego mikroskopu TPEF-SRS
    1. Wykonaj wyrównanie optyczne w celu kolokalizacji wiązek ps i fs zgodnie z opisem w krokach od 2.2.2 do 2.2.13.
    2. Otwórz migawkę lasera pompy, zatrzymując wyjście Stokesa w oprogramowaniu sterującym OPO. Użyj oprogramowania sterującego OPO, aby ustawić długość fali wiązki pompy na 796 nm, klikając pole Ustaw sygnał i wprowadzając wartość długości fali 796. Kliknij pole Ustaw moc OPO i wprowadź 20, aby ustawić jego moc na minimum (~20 mW) w celu wyrównania optycznego.
    3. Włącz komputer mikroskopowy i wszystkie powiązane elementy elektroniczne, w tym skanery, siłowniki obiektywów, fotodiody, PMT, wzmacniacze prądu, wzmacniacze blokujące i płetwy z napędem. Uruchom oprogramowanie sterujące mikroskopem.
      UWAGA: Oprogramowanie sterujące mikroskopem jest interfejsem domowej roboty.
    4. Umieść dwie płytki wyrównujące (P1 i P2 w Rysunek 1) na ścieżce optycznej. Umieść P1 za PBS w odległości około 10 cm i umieść P2 za P1 w odległości około 30 cm.
      UWAGA: Belki ps i fs są łączone za pomocą PBS (Rysunek 1). Dwie płytki wyrównujące służą do sprawdzania wyrównania, a także kolokalizacji dwóch wiązek laserowych.
    5. Otwórz migawkę mikroskopu dla wiązki laserowej ps.
    6. Wyreguluj lustro M1, aby zlokalizować środek wiązki laserowej ps w otworze przelotowym P1. Użyj lunety na podczerwień (IR), aby obserwować położenie plamki wiązki w P1 podczas regulacji lustra M1.
    7. Wyreguluj lustro M2, aby zlokalizować środek wiązki laserowej ps w otworze przelotowym P2. Użyj lunety IR, aby obserwować położenie plamki wiązki w P2 podczas regulacji lustra M2.
    8. Powtarzaj kroki 2.2.6 i 2.2.7, aż środek belki ps znajdzie się w otworze przelotowym obu płyt wyrównujących. Zamknij migawkę wiązki ps w oprogramowaniu sterującym mikroskopem.
    9. Ustaw długość fali lasera fs Ti: szafirowego na 740 nm i otwórz migawkę lasera. Ustaw moc lasera na 5 mW (mierzoną w porcie wejściowym systemu mikroskopu) w celu wyrównania optycznego.
    10. Otwórz migawkę mikroskopu dla wiązki laserowej fs.
    11. Wyreguluj lustro M3, aby zlokalizować środek plamki wiązki laserowej fs w otworze przelotowym P1.
    12. Wyreguluj lustro M4, aby zlokalizować środek plamki wiązki laserowej w otworze przelotowym P2.
    13. Powtarzaj kroki 2.2.11 i 2.2.12, aż środek wiązki laserowej fs znajdzie się w otworach przelotowych dwóch płyt wyrównujących. Zamknij migawkę mikroskopu dla wiązki fs.
    14. Wykonaj przestrzenne nakładanie się pompy i belek Stokesa zgodnie z opisem w krokach od 2.2.15 do 2.2.18.
      UWAGA: Chociaż wiązki pompy i Stokesa są z grubsza nałożone na siebie wewnątrz lasera ps, w celu uzyskania optymalnej wydajności SRS wymagane jest precyzyjne dostrojenie pozycji dwóch wiązek laserowych. Ponieważ belka pompy jest najpierw ustawiana zgodnie z wcześniejszym opisem, następnie belka Stokesa jest dostosowywana do kolokalizacji z belką pompy.
    15. Umieść kamerę w pozycji obiektywu, aby zwizualizować położenie dwóch punktów wiązki. Zaznacz położenie belki pompy na ekranie kamery jako odniesienie.
    16. Umieść płytkę wyrównującą P0 przed L3 (Rysunek 1). Użyj klucza imbusowego, aby wyregulować zwierciadło optyczne 1 (OM1) tak, aby środek wiązki Stokesa przechodził przez otwór przelotowy płyty wyrównującej i kolokalizował się z wiązką pompy w porcie wyjściowym lasera. Użyj lunety IR, aby potwierdzić położenie plamki wiązki w P0 podczas regulacji.
      UWAGA: OM1 i OM2 to dwa lustra w głowicy OPO do regulacji położenia wiązki Stokesa 1031 nm.
    17. Zdejmij płytkę wyrównującą P0 i użyj klucza imbusowego, aby wyregulować OM2 tak, aby środek wiązki Stokesa kolokalizował się ze znakiem odniesienia belki pompy na kamerze.
    18. Powtarzaj kroki 2.2.16 i 2.2.17, aż wiązka Stokesa dokładnie zachodzi na belkę pompy zarówno w płaszczyźnie P0, jak i kamery.
      UWAGA: Podczas wizualizacji punktów wiązki na kamerze należy usunąć wszystkie płytki wyrównujące ze ścieżki optycznej.
  3. Zoptymalizuj warunki obrazowania
    1. Wykonaj regulację fazy wzmacniacza lock-in zgodnie z opisem w krokach od 2.3.2. do 2.3.7.
      UWAGA: Detekcja SRS opiera się na schemacie czułości fazowej wysokiej częstotliwości. W przypadku detekcji SRL intensywność wiązki Stokesa jest modulowana na częstotliwości 20 MHz, a do demodulacji sygnału używany jest wzmacniacz lock-in. Faza i przesunięcie wzmacniacza lock-in muszą być dostosowane, aby uzyskać optymalny kontrast obrazu.
    2. Otwórz oprogramowanie sterujące wzmacniaczem lock-in.
    3. Ustaw długość fali lasera pompującego na 796 nm, a moc pompy i wiązki Stokesa odpowiednio na 15 mW i 25 mW na próbce.
      UWAGA: Tutaj użyj oliwy z oliwek do optymalizacji i kalibracji obrazowania SRS. Pik ramanowski oliwy z oliwek w obszarze węgiel-wodór wynosi 2863,5 cm-1, co odpowiada długości fali wiązki pompy przy 796 nm.
    4. Zamknij oliwę z oliwek w szkiełku i przymocuj złożoną bibułkę do dolnej części szkiełka, aby zwiększyć rozpraszanie zwrotne sygnału w celu wykrycia epi-SRS. Umieść próbkę oliwy z oliwek na stoliku i wyreguluj ostrość obiektywu 25x na próbce.
    5. Użyj oprogramowania sterującego mikroskopem, aby ustawić parametry obrazowania w następujący sposób: 512 x 512 pikseli dla pola widzenia (FOV) 500 μm x 500 μm, czas przebywania pikseli 6,4 μs. Użyj oprogramowania sterującego wzmacniaczem typu lock-in, aby ustawić wartość stałej czasowej na 10 μs, co jest bliskie czasowi przebywania pikseli.
    6. Zeskanuj wiązkę laserową nad próbką. Użyj oprogramowania sterującego wzmacniaczem lock-in, aby dostroić fazę (0-180°) z krokiem 22.5°, aż intensywność sygnału SRS osiągnie maksimum.
      UWAGA: W tym całkowicie analogowym wzmacniaczu typu lock-in wyjściem sygnału jest składowa w fazie, która jest zależna od fazy sygnału odniesienia. Faza może być regulowana przez oprogramowanie sterujące wzmacniaczem typu lock-in o rozdzielczości 11°, co pozwala zmaksymalizować wykryty sygnał z dokładnością do ~2%12. Wzmacniacz lock-in wychodzi z fazy, gdy sygnał synchronizacji zostanie zakłócony. Faza musi być ponownie regulowana za każdym razem, gdy sygnał synchronizacji jest ponownie ustanawiany.
    7. Zeskanuj próbkę przy zamkniętej przesłonie laserowej. Użyj oprogramowania sterującego wzmacniaczem lock-in, aby dostroić wartość przesunięcia o wielkość kroku 1 mV, aż średni sygnał SRS będzie bliski zeru.
      UWAGA: Średni sygnał SRS jest szacowany jako średnia intensywność wszystkich pikseli na obrazie SRS, która jest obliczana automatycznie przez oprogramowanie sterujące mikroskopem. Przesunięcia są przydatne do anulowania niepożądanych sygnałów koherentnych fazowo.
    8. Wykonaj optymalizację synchronizacji czasowej zgodnie z opisem w krokach od 2.3.9 do 2.3.14.
    9. Otwórz okno dialogowe Delay Manager (Rysunek 2) w oprogramowaniu sterującym OPO.
    10. Zeskanuj oliwę z oliwek i dostrój opóźnienie stage, aż sygnał SRS oliwy z oliwek osiągnie maksimum.
      UWAGA: Po raz pierwszy w obrazowaniu SRS, gdy faza wzmacniacza lock-in nie została zoptymalizowana, synchronizacja czasowa jest najpierw z grubsza dostosowywana w celu wizualizacji sygnału SRS próbki przed optymalizacją fazy wzmacniacza lock-in.
    11. Zatrzymaj skanowanie i kliknij przycisk Dodaj dane w oknie dialogowym menedżera opóźnień, aby zarejestrować bieżące dane dotyczące opóźnienia.
    12. Powtórzyć kroki 2.3. 10 i 2.3.11 dla różnych próbek chemicznych o różnych długościach fali.
      UWAGA: Koraliki polistyrenowe, ciężka woda, 5-etynylo-2′-deoksyurydyna, glicerol są używane do pomiaru danych opóźnienia w różnych pasmach wibracji.
    13. Wybierz opcję Dopasowanie danych i kolejność 5 w oknie dialogowym menedżera opóźnień, aby dopasować bieżące punkty danych do funkcji wielomianu piątego rzędu. Zastosuj dopasowane dane, klikając przycisk Użyj jako niestandardowego i zaznaczając pole wyboru. Stopień opóźnienia zostanie automatycznie dostosowany przy różnych długościach fal zgodnie z dopasowaną krzywą opóźnienia.
    14. Zapisz wszystkie dane opóźnienia w pliku tekstowym, który można załadować do wykorzystania w przyszłości.

3. Chirurgiczne przygotowanie myszy do obrazowania in vivo fluorescencji i SRS

  1. Wysterylizuj wszystkie wymagane narzędzia, w tym skalpele, nożyczki sprężynowe, kleszcze, szkiełka nakrywkowe i gaziki.
  2. Zdezynfekuj wszystkie powierzchnie, które byłyby dotykane podczas zabiegu za pomocą 70% etanolu. Przykryj obszar roboczy blatu sterylnymi zasłonami. Umieść poduszkę grzewczą pod zasłoną.
  3. Użyj Thy1-YFP-H (Tg(Thy1-YFP)HJrs/J)37 transgenicznych myszy, które wykazują ekspresję wzmocnionego białka żółtej fluorescencji (EYFP) w neuronach aferentnych zwoju korzenia grzbietowego do obrazowania rdzenia kręgowego in vivo. Zważyć mysz i wywołać znieczulenie przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy i ksylazyny (87,5 mg kg-1 i 12,5 mg kg-1).
  4. Ściśnij palec myszy u nogi, aby zapewnić głębokie znieczulenie. W razie potrzeby uzupełnij połową pierwotnej dawki środków znieczulających. Nałóż maść na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
  5. Ogol włosy z tyłu powyżej odcinka piersiowego kręgosłupa, a następnie całkowicie usuń włosy za pomocą kremu do depilacji. Zdezynfekuj ogolony obszar roztworem jodu.
  6. Wykonaj małe nacięcie w linii środkowej (~1,5 cm) skóry nad kręgiem T11-T13 za pomocą skalpela.
  7. Naciąć mięśnie i ścięgna zarówno na górze, jak i po bokach kręgu T11-T13 za pomocą nożyczek sprężynowych i kleszczy. Odsłoń trzy sąsiednie kręgi. Użyj sterylnych gazików i sterylnego soli fizjologicznej, aby zatamować krwawienie i oczyścić pole operacyjne.
  8. Ustabilizuj kręgosłup za pomocą dwóch prętów bocznych ze stali nierdzewnej na specjalnie zaprojektowanym stopniu stabilizacji (Rysunek 2B).
  9. Użyj kleszczyka #2, aby wykonać laminektomię w T12. Ostrożnie użyj kleszczyka, aby rozbić blaszkę kawałek po kawałku, aż cała blaszka kręgu T12 zostanie usunięta.
  10. Zmyj krew pokrywającą rdzeń kręgowy sterylną solą fizjologiczną i użyj gazika, aby wchłonąć nadmiar płynu. Uciskaj miejsce krwawienia kawałkiem gaziku, aby zatamować krwawienie.
  11. Umieścić szkiełko nakrywkowe (22 x 22 mm) na listwie zaciskowej i wypełnić przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a rdzeniem kręgowym solą fizjologiczną.

4. Obrazowanie in vivo TPEF-SRS rdzenia kręgowego myszy

  1. Zamontuj stopień stabilizacyjny na pięcioosiowym stoliku pod mikroskopem TPEF-SRS.
    UWAGA: Pięcioosiowy stolik umożliwia trzyosiową translację oraz ruch zginania w zakresie ±5° i pochylenia.
  2. Zabezpiecz głowę myszy dwoma prętami na głowę i opuść płytkę mocującą, aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca na ruch klatki piersiowej podczas oddychania, łagodząc artefakty ruchu.
  3. Włóż podkładkę grzewczą pod mysz, aby utrzymać mysz w cieple podczas obrazowania.
  4. Dostosuj etap translacyjny z, aby dostroić ostrość, aż obraz unaczynienia rdzenia kręgowego w jasnym polu będzie można obserwować pod obiektywem 10x.
  5. Zlokalizuj żyłę grzbietową rdzenia kręgowego w środku pola widzenia, dostrajając dwuosiowy etap translacyjny etapu pięcioosiowego.
  6. Dostosuj kąty przechyłu i pochylenia pięcioosiowego stolika, aby wyregulować powierzchnię grzbietową rdzenia kręgowego prostopadłą do osi obiektywu na podstawie obrazu w jasnym polu.
  7. Zamień 10x na obiektyw zanurzający w wodzie 25x do obrazowania TPEF-SRS.
  8. Ustaw długość fali wiązki fs na 920 nm. Dostrój moc wiązki fs tak, aby wynosiła 10 mW na próbce.
  9. Ustaw długość fali wiązki pompy na 796 nm. Dostosuj moc pompy i wiązki Stokesa tak, aby wynosiła odpowiednio 60 mW i 75 mW na próbce.
    UWAGA: Obrazowanie SRS rdzenia kręgowego wykonuje się przy liczbie falowej 2863,5 cm-1, która odpowiada pikowi ramanowskiemu osłonek mielinowych w regionie węgiel-wodór na podstawie zmierzonych widm SRS7,9. Moc lasera jest określana w celu zapewnienia wysokiej rozdzielczości obrazowania rdzenia kręgowego TPEF-SRS. W obecnych warunkach obrazowania nie obserwuje się uszkodzenia tkanek.
  10. W przypadku obrazowania SRS wybierz PBS nad obiektywem za pomocą zmotoryzowanej płetwy, naciskając przycisk Switch podłączony do zmotoryzowanej płetwy.
  11. Ustaw parametry obrazowania w następujący sposób: 512 x 512 pikseli dla pola widzenia 150 μm x 150 μm, czas przebywania pikseli 3,2 μs, stała czasowa 2 μs.
  12. Rozpocznij skanowanie próbki i ustaw ostrość na grzbietowej powierzchni rdzenia kręgowego.
  13. Precyzyjnie dostosuj stopień opóźnienia za pomocą oprogramowania sterującego OPO, aż do uzyskania maksymalnego sygnału SRS rdzenia kręgowego.
    UWAGA: Próbki biologiczne mogą wywoływać dodatkową dyspersję chromatyczną, stopień opóźnienia może wymagać regulacji w celu optymalizacji synchronizacji czasowej. Jednak gdy obrazowanie SRS jest wykonywane w pobliżu górnej powierzchni tkanki, różnica czasowa dwóch impulsów laserowych wprowadzanych przez tkankę biologiczną i okno obrazowania jest zwykle niewielka (mniej niż kilkaset fs).
  14. W przypadku obrazowania TPEF wybierz zwierciadło dichroiczne D2 nad obiektywem za pomocą zmotoryzowanej płetwy, naciskając przycisk Switch podłączony do zmotoryzowanej płetwy.
  15. Ustaw parametry obrazowania i rozpocznij skanowanie próbki. Aby przechwycić stos obrazów TPEF-SRS, należy uzyskać obrazy TPEF i SRS sekwencyjnie w odstępie 1 s na tej samej głębokości przed przejściem do następnej głębokości. Parametry obrazowania dla obrazowania TPEF to 512 x 512 pikseli, 150 μm x 150 μm FOV, czas przebywania pikseli 3,2 μs.
  16. Usuń zwierzę z etapu stabilizacji po zebraniu wszystkich obrazów.
  17. Oczyść odsłoniętą tkankę, spłukując ją solą fizjologiczną i wchłonij nadmiar płynu za pomocą gaziku. Nałóż żel silikonowy na odsłonięty rdzeń kręgowy i odczekaj ~5 minut, aż się utwardzi.
  18. Zszyj skórę szwem chirurgicznym #6-0, aby zamknąć ranę. Nałóż krem na oparzenia na skórę miejsca operowanego, aby zapobiec infekcji. Leki przeciwbólowe należy podawać podskórnie (0,1 mg/kg buprenorfiny).
  19. Umieść zwierzę w czystej klatce i umieść klatkę na poduszce grzewczej, aż mysz w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia.
  20. Powtarzaj podawanie przeciwbólowe co 12 godzin przez 3 dni po zabiegu.
  21. Zamknij migawkę lasera OPO i fs. Ustaw moc pompy i wiązki Stokesa na maksimum.
    UWAGA: Ustawienie maksymalnej mocy przed wyłączeniem lasera jest korzystne dla konserwacji lasera.
  22. Ustaw długość fali wiązki pompy i lasera fs na 800 nm.
  23. Przełącz oba lasery w tryb czuwania, zamknij całe oprogramowanie sterujące elektroniką i wyłącz wszystkie powiązane urządzenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

In vivo obrazowanie dualmodalne aksonów rdzeniowych oraz osłonek mielinowych przeprowadzono z wykorzystaniem myszy transgenicznych Thy1-YFP, które wykazują ekspresję EYFP w neuronach aferentnych zwojów korzeni grzbietowych (Rysunek 3). Te znakowane neurony aferentne przekazują informacje sensoryczne z nerwu obwodowego do rdzenia kręgowego, przy czym gałąź centralna znajduje się w tylnym sznurze rdzenia kręgowego. Przy użyciu mikroskopu TPEF-SRS, gęsto rozmieszczone osłonki mielinowe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole szczegółowo opisano podstawową konfigurację mikroskopu TPEF-SRS. W przypadku obrazowania SRS pompa i wiązki Stokesa nakładają się czasowo i przestrzennie na siebie wewnątrz OPO. Jednak to nakładanie się może zostać zakłócone po przejściu przez system mikroskopowy. Dlatego zarówno przestrzenna, jak i czasowa optymalizacja kolokalizacji pompy i wiązek Stokesa jest konieczna i krytyczna dla uzyskania optymalnego obrazowania SRS. Opóźnienie czasowe między pompą a wiązką Stokesa jest związane z różnicą drogi o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia i nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Radę Grantów Badawczych Hongkongu poprzez granty 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, Komisję ds. Innowacji i Technologii (ITCPD/17-9), Program Obszaru Doskonałości Komitetu ds. Grantów Uniwersyteckich (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) oraz Uniwersytet Nauki i Technologii w Hongkongu (HKUST) poprzez RPC10EG33 grantów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#2 KleszczeDumont11223-20Do laminektomii
10X obiektywNikonCFI Plan Apo Lambda 10X
25X obiektywOlympusXLPLN25XSVMP2
Burn kremBetadine
CameraSonyα 6300
Wzmacniacz prądowyStanford researchSR570
Moduły fotopowielacza prąduHamamatsuH11461-01
D2 665 nm długoprzepustowe zwierciadło dichroiczneSemrockFF665-Di02-25x36Do kierowania sygnału epi-fluorescencji do modułu detekcyjnego
D3 700 nm krótkoprzepustowe zwierciadło dichroiczneEdmund69-206Do oddzielania SRS od Ścieżka detekcji TPEF
Krem do depilacji Filtr
FS1 975 nmEdmund86-108Do blokowania wiązki stokes
FS1 Filtr pasmowo-przepustowySemrockFF01-850/310Do blokowania wiązki stokes
Fs2 Filtr pasmowo-przepustowySemrockFF01-525/50Do wyboru sygnału YFP
Fs2 Filtr krótkoprzepustowySemrockFF01-715/SP-25Do blokowania wiązki laserowej wzbudzenia fs
Płyta półfalowaThorlabsSAHWP05M-1700
Szybki fotodetektorMenloSystemsFPD 310-FDo sprawdzania modulacji wiązki Stokesa
JodBetadyna
IR ScopeFJWFIND-R-SCOPE Przeglądarka podczerwieni 2X Zestaw Model 84499C2X
IrisThorlabsCPA1
L1ThorlabsAC254-060-B-ML
L10ThorlabsLA4052-A
L2ThorlabsLA1422-B
L3ThorlabsAC254-050-B
L4ThorlabsAC254-060-B-ML
L7f=100 mm, powłoka AB
L8ThorlabsLA4874-A
L9ThorlabsAC254-035-B-ML
Wzmacniacz blokującyLustro APE
ThorlabsPF10-03-P01
Zmotoryzowana płetwaThorlabsMFF101/M
Oscyloskop National InstrumentPCIe-6363
TektronixTDS2012C
FotodiodaAPEDo wykrywania sygnału SRS
Picosecond źródło laseraAPEpicoEmerald
Rozdzielacz wiązki polaryzacyjnejThorlabsCCM1-PBS252/M
Miernik mocyNewport843-R
SalineBraun
Scan lens L5Lustro skanujące ThorlabsSL50-CLS2
Cambridge Technology6215H
Żel silikonowyWorld Precision Inc.KWIK-SIL
Ti:szafirowy laser fsKoherentChameleon Ultra II
Soczewka tubusu L6ThorlabsTTL200-S8
krótkoprzepustowy Veet Wielofunkcyjna karta akwizycyjna

Bibliografia

  1. Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711(1928).
  2. Turrell, G., Corset, J. Raman Microscopy: Developments and Applications. , Academic Press. (1996).
  3. Tian, F., et al. Monitoring peripheral nerve degeneration in ALS by label-free stimulated Raman scattering imaging. Nature Communications. 7 (1), 13283(2016).
  4. Shi, Y., et al. Longitudinal in vivo coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of demyelination and remyelination in injured spinal cord. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106012(2011).
  5. Hu, C. R., Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -X., Hu, B. Label-free real-time imaging of myelination in the Xenopus laevis tadpole by in vivo Stimulated Raman Scattering Microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (8), 086005(2014).
  6. Den Broeder, M. J., et al. Altered adipogenesis in Zebrafish larvae following high fat diet and chemical exposure is visualised by Stimulated Raman Scattering Microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 894(2017).
  7. He, S., et al. In vivo metabolic imaging and monitoring of brown and beige fat. Journal of Biophotonics. 11 (8), (2018).
  8. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  9. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  10. Zhang, C., Li, J., Lan, L., Cheng, J. -X. Quantification of lipid metabolism in living cells through the dynamics of lipid droplets measured by Stimulated Raman Scattering Imaging. Analytical Chemistry. 89 (8), 4502-4507 (2017).
  11. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Li, X., Jiang, M., Lam, J. W. Y., Tang, B. Z., Qu, J. Y. Mitochondrial imaging with combined fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy using a probe of the aggregation-induced emission characteristic. Journal of the American Chemical Society. 139 (47), 17022-17030 (2017).
  14. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  15. Pawlicki, M., Collins, H. A., Denning, R. G., Anderson, H. L. Two-photon absorption and the design of two-photon dyes. Angewandte Chemie International Edition. 48 (18), 3244-3266 (2009).
  16. König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200 (2), 83-104 (2000).
  17. Dean, K. M., Palmer, A. E. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nature Chemical Biology. 10 (7), 512-523 (2014).
  18. Tsurui, H., et al. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  19. Niehörster, T., et al. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy. Nature Methods. 13 (3), 257-262 (2016).
  20. Zhang, X., et al. Label-free live cell imaging of nucleic acids using Stimulated Raman Scattering (SRS) Microscopy. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (4), 1054-1059 (2012).
  21. Ji, M., et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer's disease with stimulated Raman scattering microscopy. Science Advances. 4 (11), 7715(2018).
  22. Li, X., et al. Integrated femtosecond stimulated Raman scattering and two-photon fluorescence imaging of subcellular lipid and vesicular structures. Journal of Biomedical Optics. 20 (11), 110501(2015).
  23. Imitola, J., et al. Multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy reveals microglia-associated myelin and axonal dysfunction in multiple sclerosis-like lesions in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 021109(2011).
  24. Uckermann, O., et al. Label-free multiphoton microscopy reveals altered tissue architecture in hippocampal sclerosis. Epilepsia. 58 (1), 1-5 (2017).
  25. Tamosaityte, S., et al. Inflammation-related alterations of lipids after spinal cord injury revealed by Raman spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), 061008(2016).
  26. Uckermann, O., et al. Endogenous two-photon excited fluorescence provides label-free visualization of the inflammatory response in the rodent spinal cord. BioMed Research International. 2015, 859084(2015).
  27. van Hameren, G., et al. In vivo real-time dynamics of ATP and ROS production in axonal mitochondria show decoupling in mouse models of peripheral neuropathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 1-16 (2019).
  28. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3 (1), 1-15 (2012).
  29. Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  30. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  31. Lau, S. -F., et al. IL-33-PU.1 transcriptome reprogramming drives functional state transition and clearance activity of microglia in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 31 (3), 107530(2020).
  32. Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Scientific Reports. 5, 9691(2015).
  33. Yang, Z., Xie, W., Ju, F., Khan, A., Zhang, S. In vivo two-photon imaging reveals a role of progesterone in reducing axonal dieback after spinal cord injury in mice. Neuropharmacology. 116, 30-37 (2017).
  34. Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
  35. Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. Journal of Comparative Neurology. 486 (4), 373-383 (2005).
  36. Kopper, T. J., Gensel, J. C. Myelin as an inflammatory mediator: Myelin interactions with complement, macrophages, and microglia in spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 96 (6), 969-977 (2018).
  37. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  38. Pedrotti, F. L., Pedrotti, L. M., Pedrotti, L. S. Introduction to Optics. , Higher Education from Cambridge University Press. (2017).
  39. Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), 37-61 (2013).
  40. Zhang, D., Slipchenko, M. N., Cheng, J. -X. Highly sensitive vibrational imaging by Femtosecond Pulse Stimulated Raman Loss. The Journal of Physical Chemistry Letters. 2 (11), 1248-1253 (2011).
  41. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  42. Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  43. Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging. Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
  44. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  45. Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an Alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
  46. van Manen, H. -J., Lenferink, A., Otto, C. Noninvasive imaging of protein metabolic labeling in single human cells using stable isotopes and Raman Microscopy. Analytical Chemistry. 80 (24), 9576-9582 (2008).
  47. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  48. Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995(2018).
  49. Ahuja, C. S., et al. Traumatic spinal cord injury. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 1-21 (2017).
  50. Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia SRSobrazowanie TPEFobrazowanie rdzenia kr gowegoos onka mielinowamikroskopia dwumodalnarozdzielczo podkom rkowachoroby neurodegeneracyjne
In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.