Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezznacznikowe podejście do segmentacji w obrazowaniu przyżyciowym mikrośrodowiska guza sutka

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63413

⸱

24 maja 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, 3Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

W tym artykule

Podsumowanie

Opisana tutaj metoda obrazowania intravital wykorzystuje generowanie drugiej harmonii kolagenu i endogenną fluorescencję z metabolicznego kofaktora NAD(P)H do nieinwazyjnej segmentacji nieoznaczonego mikrośrodowiska guza na przedziały guza, zrębu i naczyń krwionośnych w celu dogłębnej analizy obrazów 4D intravital.

Streszczenie

Możliwość wizualizacji złożonych i dynamicznych interakcji fizjologicznych między wieloma typami komórek a macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) w żywym mikrośrodowisku guza jest ważnym krokiem w kierunku zrozumienia mechanizmów regulujących progresję guza. Chociaż można to osiągnąć za pomocą obecnych technik obrazowania przyżyciowego, pozostaje to wyzwaniem ze względu na niejednorodny charakter tkanek i potrzebę kontekstu przestrzennego w obserwacji eksperymentalnej. W tym celu opracowaliśmy przepływ obrazowania przyżyciowego, który łączy obrazowanie drugiej harmonicznej kolagenu, endogenną fluorescencję z metabolicznego kofaktora NAD(P)H i mikroskopię obrazowania fluorescencji przez całe życie (FLIM) jako sposób na nieinwazyjny podział mikrośrodowiska guza na podstawowe domeny gniazda guza, otaczającego zrębu lub ECM i układu naczyniowego. Ten nieinwazyjny protokół szczegółowo opisuje proces krok po kroku, począwszy od pozyskiwania zdjęć poklatkowych modeli guza sutka po analizę post-processingu i segmentację obrazu. Główną zaletą tego przepływu pracy jest to, że wykorzystuje on sygnatury metaboliczne do kontekstualizacji dynamicznie zmieniającego się żywego mikrośrodowiska guza bez użycia egzogennych znaczników fluorescencyjnych, co czyni go korzystnym dla modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od ludzkiego pacjenta (PDX) i przyszłych zastosowań klinicznych, w których fluorofory zewnętrzne nie są łatwo stosowane.

Wprowadzenie

Wiadomo, że macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) w mikrośrodowisku guza jest dynamicznie odkładana i przebudowywana przez wiele typów komórek, aby jeszcze bardziej ułatwić postęp choroby1,2,3. Te zmiany w matrycy dostarczają zarówno mechanicznych, jak i biologicznych wskazówek, które zmieniają zachowanie komórki i często skutkują ciągłym cyklem przebudowy matrycy4. Badania nad dynamiczną, wzajemną interakcją między komórkami nowotworowymi a macierzą zewnątrzkomórkową są często prowadzone przy użyciu trójwymiarowych (3D) hodowli in vitro lub systemów mikroprzepływowych. Podczas gdy te oddolne podejścia wykazały mechanizmy przebudowy ECM5,6,7, zwiększona proliferacja8, przejście nabłonkowe do mezenchymalnego9,10,11,12, oraz migracja i inwazja komórek nowotworowych7, 13,14,15,16, skupili się przede wszystkim na kilku typach komórek (np. komórkach nowotworowych lub fibroblastach) w jednorodnej matrycy 3D w porównaniu z różnorodnością i niejednorodnością interakcji obecnych w tkance fizjologicznej. Oprócz systemów in vitro, histologia guza ex vivo może również dostarczyć pewnych informacji na temat tych interakcji komórka-komórka i komórka-ECM17. Immunohistochemia ma tę zaletę, że jest w stanie analizować wiele typów komórek w odniesieniu do przestrzennie heterogenicznego składu i architektury ECM, ale statyczne punkty końcowe utrwalonej tkanki nie oddają dynamicznej natury interakcji między komórkami a mikrośrodowiskiem. Obrazowanie przyżyciowe otworzyło drzwi do badania różnorodnych i dynamicznych interakcji w kontekście fizjologicznym natywnego mikrośrodowiska guza.

Możliwości obrazowania guzów w miejscu przyżyciowym szybko się rozwijają. Ulepszenia w projektowaniu okien obrazowania i technikach chirurgicznych do implantacji okien umożliwiły długoterminowe obrazowanie guza podłużnego w różnych lokalizacjach anatomicznych (tj. guz pierwotny, węzły chłonne, miejsca przerzutów18,19,20). Co więcej, zdolność oprzyrządowania optycznego do wizualizacji i gromadzenia danych w wielu wymiarach (tj. spektralnych, przestrzennych intensywności fluorescencji i czasie życia) oraz przy wysokiej rozdzielczości i szybkości (szybkość wideo) staje się coraz bardziej dostępna. Ulepszona technologia daje możliwość zbadania szybkich zmian w sygnalizacji komórkowej i dynamice fenotypowej w środowisku fizjologicznym. Wreszcie, ekspansja narzędzi optogenetycznych i szeroki wachlarz genetycznych konstruktów fluorescencyjnych pozwalają na znakowanie określonych typów komórek w celu uchwycenia migracji komórek w mikrośrodowisku guza lub śledzenia linii komórkowej podczas rozwoju lub progresji choroby21,22. Wykorzystanie tych narzędzi w połączeniu z technologią CRISPR/Cas9 daje naukowcom możliwość generowania unikalnych modeli zwierzęcych w odpowiednim czasie.

Chociaż wszystkie te postępy sprawiają, że obrazowanie przyżyciowe staje się coraz bardziej potężną metodą badania dynamicznych i fizjologicznych interakcji komórkowych, nadal istnieje ważna potrzeba opracowania strategii, które zapewnią przestrzenny, czasowy i strukturalny kontekst na poziomie tkankowym dla tych biologicznych interakcji. Obecnie wiele badań obrazowania przyżyciowego kompensuje brak wizualnych punktów orientacyjnych, takich jak naczynia krwionośne, poprzez wstrzykiwanie barwników fluorescencyjnych do naczyń krwionośnych lub wykorzystanie modeli mysich, które egzogennie eksprymują białka fluorescencyjne w celu określenia cech fizycznych. Barwniki i podłoża do wstrzykiwań, takie jak fluorescencyjny dextrans, są szeroko stosowane do skutecznego oznaczania naczyń krwionośnych w kolekcjach intravital 19, 23, 24. Takie podejście nie jest jednak pozbawione ograniczeń. Po pierwsze, wymaga dodatkowych manipulacji myszą, a jego użyteczność ogranicza się do krótkoterminowych eksperymentów. W przypadku badań podłużnych dekstran fluorescencyjny może być problematyczny, ponieważ obserwujemy akumulację dekstranu w komórkach fagocytarnych lub dyfuzję do otaczającej tkanki w czasie25. Włączenie egzogennych białek fluorescencyjnych do modelu mysiego zostało przedstawione jako alternatywa dla fluorescencyjnego dekstransu, ale ma swoje własne ograniczenia. Dostępność i różnorodność egzogennych fluoroforów w modelach mysich jest nadal ograniczona i kosztowna w tworzeniu. Ponadto w niektórych modelach, takich jak modele PDX, manipulacje genetyczne nie są pożądane ani możliwe. Wykazano również, że obecność białek fluorescencyjnych lub bioluminescencyjnych w komórkach jest rozpoznawana jako obca u myszy, a w immunokompetentnych modelach mysich zmniejsza to ilość przerzutów spowodowanych odpowiedzią układu odpornościowego gospodarza26,27. Wreszcie, egzogenne białka fluorescencyjne lub barwniki fluorescencyjne używane do kontekstu przestrzennego lub do segmentacji kolejnych danych często zajmują podstawowe zakresy widma światła, które w przeciwnym razie mogłyby być wykorzystane do badania interesujących interakcji fizjologicznych.

Wykorzystanie wewnętrznego sygnału z ECM lub endogennej fluorescencji z komórek w tkance stanowi potencjalny uniwersalny sposób segmentacji danych przyżyciowych dla bardziej dogłębnej analizy komórkowej i przestrzennej. Generacja drugiej harmonicznej (SHG) jest od dawna używana do wizualizacji klasy ECM28. Wraz z późniejszym rozwojem ważnych narzędzi pomocnych w charakterystyce organizacji włókien29,30,31, możliwe jest scharakteryzowanie zachowania komórki w odniesieniu do lokalnej struktury ECM. Ponadto autofluorescencja endogennego metabolitu, NAD(P)H, stanowi kolejne bezznacznikowe narzędzie do podziału mikrośrodowiska guza in vivo. NAD(P)H fluoryzuje jasno w komórkach nowotworowych i może być używany do rozróżniania granic rosnącego gniazda guza od otaczającego go zrębu 21,32. Wreszcie, układ naczyniowy jest ważną strukturą fizjologiczną w mikrośrodowisku guza i miejscem kluczowych interakcji specyficznych dla typu komórki33,34,35. Wykazano, że wzbudzenie czerwonych krwinek (RBC) lub osocza krwi zostało wykorzystane do wizualizacji unaczynienia guza, a przy użyciu wzbudzenia dwu- lub trzyfotonowego (2P; 3P) wykazano, że możliwy jest pomiar szybkości przepływu krwi36. Jednak podczas gdy większe naczynia krwionośne można łatwo zidentyfikować na podstawie ich endogennych sygnatur fluorescencyjnych, identyfikacja subtelnych, zmiennych i mniej fluorescencyjnych małych naczyń krwionośnych wymaga większej wiedzy specjalistycznej. Te nieodłączne trudności utrudniają optymalną segmentację obrazu. Na szczęście te źródła endogennej fluorescencji (tj. czerwone krwinki i osocze krwi) mogą być również mierzone za pomocą obrazowania czasu życia fluorescencji37, co wykorzystuje unikalne właściwości fotofizyczne układu naczyniowego i stanowi użyteczny dodatek do rosnącego zestawu narzędzi przyżyciowych.

W tym protokole, proces segmentacji czterowymiarowego (4D) obrazowania przyżyciowego wyraźnie wykorzystującego sygnały wewnętrzne, takie jak endogeniczna fluorescencja i SHG, jest opisany od akwizycji do analizy. Protokół ten jest szczególnie istotny w przypadku badań podłużnych za pomocą okna obrazowania sutka, w których egzogenna fluorescencja może nie być praktyczna lub możliwa, jak ma to miejsce w przypadku modeli PDX. Przedstawione tutaj zasady segmentacji mają jednak szerokie zastosowanie dla użytkowników przyżyciowych badających biologię guza, rozwój tkanek, a nawet normalną fizjologię tkanek. Zgłoszony zestaw podejść analitycznych pozwoli użytkownikom różnicować zachowanie komórek między regionami wyrównanych lub losowych konfiguracji włókien kolagenowych, porównywać liczby lub zachowania komórek znajdujących się w określonych regionach mikrośrodowiska guza i mapować układ naczyniowy do mikrośrodowiska guza przy użyciu tylko sygnału bezznacznikowego lub wewnętrznego. Razem metody te tworzą ramy operacyjne dla maksymalizacji głębokości informacji uzyskanych z obrazowania przyżyciowego gruczołu sutkowego 4D, jednocześnie minimalizując potrzebę dodatkowych znaczników egzogennych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wisconsin-Madison. Dobre samopoczucie i radzenie sobie z bólem we wszystkich eksperymentach na zwierzętach jest najważniejsze. Dlatego dokłada się wszelkich starań, aby zwierzę było wygodne i zadbane na każdym etapie zabiegu.

1. Generowanie okna obrazowania sutka (MIW)

  1. Aby skonstruować okienko obrazowania sutka, należy wykonać pierścień o średnicy 14 mm ze stali nierdzewnej klasy chirurgicznej.
  2. Umyj obrobioną maszynowo ramę okienną za pomocą gorącego roztworu 5% detergentu czyszczącego, spłucz przez 10 minut pod bieżącą wodą dejonizowaną (DI), namocz w 100% etanolu przez 10 minut, a następnie wysusz pod lampą grzewczą. Wysuszoną ramkę MIW należy sterylizować w autoklawie i przechowywać do późniejszego wykorzystania.
  3. Przygotuj szkło nakrywkowe MIW w następujący sposób: Namocz okrągłe szkło nakrywkowe #1.5 12 mm w 100% etanolu na 10 minut, wysusz pod lampą grzewczą, a następnie przymocuj do metalowej ramy MIW za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Utwardź klej przez noc.
  4. Oczyść zmontowany MIW z nadmiaru kleju za pomocą wacika nasączonego acetonem i oczyść, zanurzając go w 70% etanolu na 10 minut. Pozostaw oczyszczone okno do wyschnięcia. Przygotuj MIW z wyprzedzeniem i przechowuj go na sterylnej szalce Petriego przed wszczepieniem implantu chirurgicznego.

2. Chirurgiczne wszczepienie implantu MIW

  1. Autoklaw narzędzi chirurgicznych i odkażaj powierzchnie 70% etanolem przed rozpoczęciem operacji implantacji okna.
  2. Wykonaj operację na odkażonym blacie stołu za pomocą rozgrzewającego koca pokrytego sterylnym polem. Ustaw koc rozgrzewający w taki sposób, aby temperatura mierzona na wierzchu sterylnego pola wynosiła 40 °C.
  3. Użyj dodatkowego zimnego oświetlenia, aby zapobiec wysuszeniu tkanek. Użyj szkieł powiększających, aby ułatwić zabieg chirurgiczny. Nosić środki ochrony osobistej składające się ze sterylnego, jednorazowego fartucha laboratoryjnego, rękawów chirurgicznych, rękawiczek, ochrony oczu i maski na twarz, zgodnie z zaleceniami najlepszych praktyk chirurgicznych.
  4. Znieczulić mysz za pomocą parownika anestezjologicznego o ustawieniu izofluranu 2,0% i natężeniu przepływu tlenu 2,0 l/min. Podawać środek przeciwbólowy (10 mg/kg meloksykamu) we wstrzyknięciu podskórnym.
    UWAGA: Dodatkowe dawki należy podać w ciągu pierwszych 24 godzin, najlepiej co 8-12 godzin przez pierwsze 2 dni po zabiegu.
  5. Po znieczuleniu (potwierdzonym brakiem reakcji na szczypanie palców u stóp) nałóż nawilżający żel pod oczy, aby zapobiec wysuszeniu oczu. Użyj kremu do depilacji, aby usunąć sierść w miejscu operacji (4 pachwinowa gruczoł sutkowy), a następnie spłucz sterylną gazą nasączoną wodą.
  6. Przygotuj depilowane miejsce operacyjne do zabiegu, odkażając powierzchnię skóry za pomocą 3 naprzemiennych peelingów betadynowych i etanolowych.
  7. Aby rozpocząć operację, delikatnie unieś skórę nad 4. gruczołem sutkowym nr 4 za pomocą kleszczy. Po odciągnięciu skóry od ściany ciała usuń ~1 mm odcinek warstwy skórnej na czubku kleszczy za pomocą mikronożyczek chirurgicznych. Jeśli wystąpi krwawienie, należy delikatnie uciskać sterylną gazą, aż krwawienie ustanie.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, większe guzy mają większy potencjał krwawienia niż mniejsze guzy lub normalne tkanki.
  8. Odłącz gruczoł sutkowy od warstwy skórnej delikatnymi ruchami kleszczy przy otworze chirurgicznym, aby uniknąć przecięcia leżącego poniżej gruczołu.
  9. Wykonaj nacięcie 10 mm i uwolnij gruczoł sutkowy z warstwy skórnej na obwodzie, aby można było założyć szwy bez penetracji gruczołu sutkowego. Dodaj PBS, aby zakryć odsłonięty gruczoł/guz i zapobiec wysuszeniu.
  10. Stwórz szew ze sznurka do torebki wzdłuż obwodu otworu za pomocą jedwabnego plecionego szwu 5-0. Włóż krawędź MIW tak, aby warstwa skórna zazębiła się z wycięciem odbiorczym MIW.
  11. Delikatnie rozciągnij nabłonek po przeciwnej stronie MIW i wepchnij metalowy MIW na miejsce tak, aby warstwa skórna całkowicie zazębiła się z wcięciem odbiorczym na całym obwodzie MIW. Mocno zaciśnij sznurek torebki, aby wciągnąć warstwę skórną do wycięcia i zwiąż ją, aby w pełni zabezpieczyć MIW.
  12. Dodaj miejscowy antybiotyk do warstwy skórnej w MIW i stale monitoruj mysz, aż odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać leżący mostek. Umieść mysz z implantem MIW oddzielnie na miękkim podłożu z igloo umieszczonym w klatce i pozwól myszy dojść do siebie przez 48 godzin przed obrazowaniem.

3. Ustawianie i utrzymywanie myszy na stoliku mikroskopu do obrazowania

  1. Ustaw komorę grzewczą na stoliku mikroskopu. Stosować system wymuszonego przepływu powietrza ustawiony na 30 °C lub inny podobny system. Użyj grzałki obiektywu, aby uniknąć dryftu ostrości z. Pozwól systemowi dojść do równowagi przez co najmniej 1 godzinę przed obrazowaniem.
    UWAGA: Znieczulone myszy nie są w stanie prawidłowo utrzymać temperatury ciała, dlatego konieczne jest posiadanie podgrzewanego środowiska do wszelkich akwizycji poklatkowych . Grzałka obiektywu pomaga zwalczać skutki rozszerzalności cieplnej, zjawiska, które powoduje dryf ostrości z, gdy soczewka obiektywu i obrazowana tkanka dochodzą do równowagi termicznej.
  2. Gdy komora grzewcza na mikroskopie ustabilizuje się w temperaturze 30 °C, znieczulij mysz biorcy za pomocą ustawień aparatu do znieczulenia na 2% izofluranu i natężeniu przepływu tlenu 2 l/min.
  3. Po uspokojeniu myszy (potwierdzonej brakiem reakcji na szczypanie palców), wyczyść zewnętrzną część szkła MIW za pomocą bawełnianego aplikatora i środka do czyszczenia szkła, dodaj maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu i w razie potrzeby włóż cewnik do żyły ogonowej.
  4. Aby utrzymać prawidłowe nawodnienie, należy wykonać pierwsze wstrzyknięcie 0,5 ml PBS podskórnie lub 100 μl przez cewnik do żyły ogonowej. Powtarzaj co 2 godziny przez cały czas trwania sesji obrazowania.
  5. Po odpowiednim przygotowaniu myszy ustaw mikroskop do obrazowania. Aby zmniejszyć parowanie podczas pomiarów poklatkowych, do mediów zanurzeniowych należy użyć żelu na bazie wody zamiast wody. Należy to zrobić przed umieszczeniem myszy na scenie. Szczegółowe informacje na temat elementów optycznych można znaleźć w tabeli materiałów.
  6. Połóż mysz na stoliku mikroskopu, załóż wąż izofluranowy i wciśnij kołnierz MIW w 14-milimetrowy otwór odbiorczy we wkładzie stolika, aby ustabilizować obrazy. Ustaw ostrość pola obrazowania za pomocą okularów mikroskopu i użyj oświetlenia jasnego pola, aby obserwować naczynia krwionośne z przepływem krwi.
  7. Sprawdź stabilność pola widzenia. Jeśli występują artefakty ruchu oddechowego, zastosuj delikatny ucisk na tylną stronę gruczołu za pomocą małego bloku pianki i kawałka taśmy klejącej przypominającego cincture. Po zastosowaniu kompresji sprawdź, czy przepływ krwi jest utrzymany w całym polu view.
  8. Okresowo reguluj poziomy izofluranu w krokach co 0,25% podczas sesji obrazowania, aby utrzymać odpowiedni poziom sedacji, ręcznie licząc oddech zwierzęcia.
  9. Utrzymuj częstość oddechów na poziomie 36-40 oddechów na minutę (obr./min), aby poprawić długowieczność zwierząt i obrazowanie optyczne. Niższe tempo oddychania może spowodować, że mysz nie przeżyje eksperymentu, podczas gdy częstość oddechów powyżej 60 obr./min może skutkować słabą sedacją, co może zwiększyć artefakty oddychania i ruchu w danych obrazu.

4. Konfiguracja do 4D, opartego na intensywności, bezznacznikowego obrazowania przyżyciowego dynamicznego zachowania komórek

  1. Gdy mysz zostanie uspokojona i bezpiecznie umieszczona na odwróconym stoliku mikroskopu, zacznij lokalizować interesujące Cię obszary.
  2. Korzystając ze źródła światła skierowanego na MIW, użyj okularów mikroskopu, aby zidentyfikować potencjalne obszary do badania. Dodaj i zapisz pozycje x, y w oprogramowaniu, aby powrócić do tych pozycji.
    UWAGA: Drobne szczegóły guza nie będą łatwo widoczne przy tego typu oświetleniu. Celem jest po prostu zidentyfikowanie regionów do dalszych badań. Nacisk kładziony jest na obserwację naczyń krwionośnych i przepływu krwi.
  3. Po zapisaniu kilku pozycji w oprogramowaniu, można wyświetlić podgląd wybranych pól widzenia za pomocą wzbudzenia 890 nm i kostki filtra FAD/SHG. Użyj maksymalnego czasu przebywania 4 μs przy niższej mocy i wysokim ustawieniu PMT. Celem jest podgląd pól widzenia bez nadmiernego wystawiania tkanki na nadmierne światło lasera.
  4. Po ustawieniu odpowiednich poziomów mocy skonfiguruj stosy z. Obserwuj pojawienie się obfitych włókien kolagenowych (SHG) w odległości 20-50 μm pod szklaną powierzchnią MIW. Kolagen stanie się mniej rozpowszechniony, gdy mikroskop wbije się głębiej w guz (Ryc. 1B). Puste przestrzenie w SHG ujawniają lokalizację mas guza.
  5. Ustaw górny plasterek z pod warstwą pojedynczych komórek, gdzie pojawiają się pierwsze włókna kolagenowe na ~50-100 μm. Ustaw dolny plasterek z na ~250 μm, gdzie włókna zanikają i dominuje słaby sygnał. Powtórz tę czynność dla wszystkich zapisanych pozycji x-y.
  6. Po ustawieniu zakresu z-stack zwiększ czas przebywania (do 8 μs) i zoptymalizuj ustawienia zasilania i detektora. Zoptymalizuj poziomy mocy zgodnie z potrzebami, aby wzbudzić tkankę do każdego eksperymentu. Moc do 90 mW przy 750 nm lub 70 mW przy 890 nm przy tylnej aperturze obiektywu mieści się w dopuszczalnym zakresie.
    UWAGA: Głębokość obrazowania, stopień rozproszenia w tkance, charakterystyka obiektywu i czułość detektora będą miały znaczący wpływ na ilość energii potrzebnej do uzyskania obrazu.
  7. Dostosuj interwały czasowe zgodnie z celami eksperymentu. Zacznij od 10-minutowych interwałów między punktami pobierania dla większości filmów o migracji przyżyciowej.
  8. Mimo że wzbudzenie 2P jest łagodne dla komórek i tkanek, należy pamiętać o oznakach fototoksyczności, takich jak pęcherzenie komórek lub szybko rosnąca autofluorescencja oraz nadmierne fotowybielanie. Zmniejsz moc lasera lub zwiększ interwały timelapse, jeśli wskazują na to warunki.

5. Obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) NAD(P)H

  1. Zachowując pozycje x-y z akwizycji poklatkowych, ustaw mikroskop tak, aby zebrał stos FLIM. Włóż filtr 440/80 do uchwytu filtra przed detektorem GaAsP i ustaw napięcie detektora GaAsP na 800 w oprogramowaniu. Wyłącz światła w pomieszczeniu, gdy czujniki są włączone.
  2. W oprogramowaniu przełącz się z obrazowania intensywności opartego na galwanometrze na tryb obrazowania FLIM.
  3. W celu identyfikacji i maskowania układu naczyniowego ustaw rozdzielczość na 512 x 512 pikseli. Aby zebrać komplementarne informacje metaboliczne, ustaw rozdzielczość na 256 x 256 pikseli, aby zwiększyć rozdzielczość czasową sygnatury czasu życia. Ustaw czas przebywania na 4 μs i dostrój laser do 750 nm.
  4. Rozpocznij podgląd skanowania i zacznij regulować moc lasera. Dostosuj moc lasera, aż odczyt dla dyskryminatora frakcji stałej (CFD) będzie mieścił się w przedziale od 1 x 105 do 1 x 106. Nie przekraczaj 1 x 106, ponieważ spowoduje to nagromadzenie fotonów i słabe ogólne wyniki.
  5. Po ustawieniu poziomu mocy ustaw czas integracji od 90 s do 120 s i rozpocznij kolekcję FLIM. Będzie pozyskiwał fotony z pola widzenia przez wyznaczony czas.
  6. Opcjonalnie: Po wykonaniu wszystkich niezbędnych zbiorów i usunięciu myszy ze stołu montażowego, zbierz funkcję odpowiedzi instrumentu (IRF). Zmierz IRF, obrazując powierzchnię dostępnych w handlu kryształów mocznika w naczyniu ze szklanym dnem o tych samych parametrach i ustawieniu używanym do obrazowania tkanki.
    UWAGA: IRF uwzględnia wszelkie opóźnienia lub odbicia spowodowane konfiguracją elektroniczną lub optyczną. IRF jest konwoluowany we wszystkich akwizycjach FLIM, a oddzielenie go od danych może poprawić dokładność obliczonych krzywych rozpadu fluorescencji. Mając to na uwadze, obliczone IRF mogą często rozsądnie odtworzyć jakość krzywych rozpadu fluorescencji z mierzonych IRF. Dobrą praktyką jest mierzenie IRF do momentu ustalenia, że obliczony IRF da równoważne dopasowania krzywych rozpadu i odpowiednio przybliży wyniki zmierzonego IRF.

6. Analiza obrazów z okresu życia NADH

  1. Otwórz oprogramowanie FLIM i zaimportuj obraz okresu istnienia NAD(P)H ze zbioru danych. Aby uzyskać więcej informacji na temat prawidłowego korzystania z oprogramowania, zapoznaj się z podręcznikami żywotności świetlówek (patrz Spis materiałów).
  2. Aby rozpocząć, zdefiniuj parametry modelu w oprogramowaniu. Na pasku menu kliknij Opcje > Model. Zaznacz następujące pola: Ustawienia > zaniku wielowykładniczym, Metoda dopasowania > MLE, Przestrzenne kwantowanie > kwadratu, Próg > szczyt i zaznacz opcję Napraw przesunięcie przed obliczeniem obrazu.
  3. Na pasku menu kliknij opcję Kolor >A 1% z menu rozwijanego. Po prawej stronie okna zdefiniuj je jako pasowanie trójskładnikowe. Ustaw rozmiar pojemnika > 3.
  4. Dostosuj próg > ~10. Ponowna ocena dokładności progowej po pierwszym obliczeniu macierzy zaniku.
  5. Napraw τ1 na 200 ps. Oznacza to krótki czas życia czerwonych krwinek. Spróbuj znaleźć wartość, która najlepiej pasuje do wielu miejsc w większym naczyniu krwionośnym, które można zobaczyć na obrazie intensywności. Ustaw τ2 na 1200 ps. Odpowiada to długiej żywotności czerwonych krwinek.
    UWAGA: Ustawione wartości są tylko punktem wyjścia. Wartości będą musiały zostać zoptymalizowane, aby bardziej wydobyć układ naczyniowy. W większości przypadków, ale nie zawsze, wartości te ulegną zmniejszeniu.
  6. W obszarze Oblicz na pasku menu wybierz pozycję Macierz zaniku. Spowoduje to wygenerowanie początkowych obrazów w całym okresie życia A1% z wysokimi wartościami układu naczyniowego. Użyj kursora (krzyżyk), aby najechać kursorem na układ naczyniowy. Systematycznie i pojedynczo znośnoprzeć (odznacz pole Napraw) τ1 i τ2. Zapisz te wartości, ponieważ pomogą one zoptymalizować stałe parametry.
    UWAGA: Celem niekoniecznie jest uzyskanie najdokładniejszych wartości na obrazie, ale raczej maksymalizacja rozbieżności między naczyniem a tkanką bez radykalnego zmniejszania obszaru identyfikowanego jako unaczynienie.
  7. Po zidentyfikowaniu odpowiednich parametrów dla τ1 i τ2 na pasku menu wybierz opcję Oblicz > przetwarzania wsadowego. Upewnij się, że większość ustawień jest podobna między plasterkami z.
  8. Upewnij się, że żadne ustawienie nie różni się rażąco od pozostałych. Jeśli tak, najpierw dostosuj zmianę i spróbuj ponownie. Jeśli problem będzie się powtarzał, zainstaluj ponownie, używając nowych parametrów. Nieprawidłowa zmiana może być dużą przyczyną hałasu w drgawkach i może zwiększyć wartości A1% w sąsiednich obszarach guza.
  9. W zakładce menu zapisz pliki, a następnie wyeksportuj pliki A1%. Prześlij te pliki do ImageJ w celu maskowania i segmentacji.

7. Segmentacja obrazu naczyń krwionośnych

  1. Otwórz ImageJ i zaimportuj obraz A1% jako obraz tekstowy. Powtórz tę czynność dla wszystkich obrazów w stosie.
  2. Po otwarciu wszystkich obrazów A1% wybierz opcję Image > Stack > Z-Project. Użyj projekcji maksymalnej intensywności i zapisz obrazy. Zobacz Dane uzupełniające 1, aby uzyskać reprezentatywny obraz.
  3. Przejdź do sekcji Wtyczki > segmentacji. Wybierz możliwą do trenowania wtyczkę segmentacji WEKA38.
  4. Po otwarciu okna WEKA użyj ustawień domyślnych i rozpocznij szkolenie oprogramowania, tworząc dwie klasy i śledząc linie nad układem naczyniowym (regiony o wysokim poziomie A1%) i nieunaczynionym (obszary o niskim poziomie A1%).
  5. Kontynuuj dodawanie nowych ścieżek do dwóch klas, aż oprogramowanie konsekwentnie zidentyfikuje obszary naczyń krwionośnych o wysokim poziomie A1%, eliminując jednocześnie wszelkie wyższe obszary szumu tła. Zobacz Model uzupełniający dla reprezentatywnego modelu klasyfikatora.
  6. Po utworzeniu sklasyfikowanego obrazu kliknij Obraz > Wpisz > 8 bitów. Proguj obraz i utwórz maskę. Jeśli obraz z progiem nadal wymaga dalszego czyszczenia, użyj funkcji Analizuj cząstki.
  7. Dostosuj rozmiar i okrągłość, aż zostaną wykluczone wszystkie mniejsze i okrągłe obszary obrazu z progiem. Uzyskuje się czystą maskę z samym unaczynieniem i bardzo małym tłem.
  8. Kliknij Edytuj > zaznaczenie> utworzyć wybór. Przenieś wybór do menedżera ROI, klikając Analizuj narzędzia > > Menedżera ROI.
  9. Zduplikuj sklasyfikowany obraz. Przejdź do przetwarzania pliku binarnego >. Aby rozwinąć maskę i określić odległość od układu naczyniowego, która zostanie uwzględniona w segmentacji obrazu, wybierz opcję Rozszerz. Powtarzaj, aż maska rozszerzy się do żądanego zakresu. Zapisz ten obszar zainteresowania (ROI) w menedżerze ROI.
    UWAGA: Celem tego kroku jest ilościowe określenie ilości lub zachowania w określonej odległości naczynia krwionośnego (na przykład liczby komórek obecnych w promieniu X μm od naczyń krwionośnych). Wymagana głębokość dylatacji jest całkowicie zdeterminowana przez kwestię naukową.
  10. Aby określić ilościowo liczbę komórek w regionach restrykcyjnych, wybierz okno (obraz/kanał), które Cię interesuje. Może to być dowolne okno, które ma to samo pole widzenia co maska naczyniowa. Zastosuj oba ROI za pomocą funkcji XOR z menu rozwijanego.
    UWAGA: Ta operacja zmierzy przedmioty w żądanej odległości od naczynia krwionośnego, z wyłączeniem samego naczynia krwionośnego. To połączone podejście do zwrotu z inwestycji można następnie wykorzystać do pomiaru wielu parametrów, takich jak intensywność, liczba komórek lub migracja.

8. Segmentacja obrazu gniazda nowotworu

  1. Otwórz obraz NADH ze skanu o wysokiej rozdzielczości lub kolekcji FLIM w ImageJ.
    UWAGA: Można to zrobić na pojedynczych plasterkach Z, pełnych stosach lub zastosować do projekcji z kilku plasterków.
  2. Przejdź do sekcji Wtyczki > segmentacji. Wybierz wtyczkę segmentacji WEKA, którą można trenować.
  3. Po otwarciu okna WEKA użyj ustawień domyślnych i rozpocznij trenowanie oprogramowania w dwóch klasach: wysokie regiony NADH i niskie regiony NADH. Regiony o wysokim poziomie NADH będą miały bardzo wyraźny wzór komórek z jądrami, a oprogramowanie z łatwością go zidentyfikuje.
  4. Kontynuuj przełączanie się w przód iw tył za pomocą nakładki, aby udoskonalić algorytm za pomocą dodatkowego treningu, aż rozpozna wszystkie obszary guza określone przez oko i wcześniejszą wiedzę na temat morfologii guza. Jest to proces iteracyjny.
  5. Gdy algorytm rozpozna wszystkie regiony guza, wybierz przycisk Utwórz wynik. Spowoduje to utworzenie nowego obrazu. Zduplikuj ten obraz.
  6. Wybierz pierwszy zduplikowany obraz i przekonwertuj go na obraz 8-bitowy, wybierając opcję Typ > obrazu > 8-bitowy. Próg tego obrazu, aby utworzyć maskę binarną. Następnie utwórz wybór i przenieś go do menedżera ROI. Te zwroty akcji zdefiniują zrąb.
  7. Wybierz drugi ze zduplikowanych obrazów i przekonwertuj go na obraz 8-bitowy. Odwróć ten obraz, wybierając opcję Obraz > Edytuj > Odwróć, a następnie proguj ten obraz, aby utworzyć maskę binarną. Ponownie utwórz wybór i przenieś go do menedżera ROI. Ten zwrot z inwestycji określi gniazdo nowotworowe.

9. Segmentacja obrazu według organizacji włókien lub wyrównania

  1. Aby rozpocząć, otwórz obrazy SHG, przygotuj dowolną projekcję z i oceń potrzebę wstępnego przetwarzania. Aby uzyskać dobre wyniki, wymagane są wysokiej jakości obrazy z dostrzegalnymi włóknami i niskim poziomem szumów.
  2. Opcjonalnie: W przypadku wstępnego przetwarzania w ImageJ w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu (SNR) kanału SHG, odejmij tło za pomocą odejmowania toczącej się kuli. W przypadku większości zastosowań należy użyć odejmowania toczącej się kuli między 20 a 50 pikselami. Następnie wygładź obraz i zapisz go.
  3. Otwórz wtyczkę OrientationJ i ustaw parametry przetwarzania. W oknie OrientationJ zdefiniuj rozmiar lokalnego okna tensorowego. Aby uzyskać obraz o 20-krotnej gęstości światłowodu, ustaw 10 pikseli na 15 pikseli jako punkt początkowy.
  4. Wybierz opcję Splajn sześcienny jako model gradientu i zaznacz pole wyboru Color Survey Box. Zdefiniuj ankietę kolorystyczną. Ustaw zarówno Barwę, jak i Nasycenie jako Spójność, a następnie zdefiniuj Jasność jako Oryginalny obraz, naciśnij Uruchom.
  5. Plikiem wyjściowym wtyczki jest mapa kolorów RGB. Dostosuj wartość lokalnego okna tensora do momentu, gdy wyrównane obszary, określone przez oko, zostaną prawidłowo podświetlone odcieniami niebieskiego i karmazynowego.
  6. Gdy obraz wyjściowy będzie zadowalający, rozdziel ten obraz RGB na 3 kanały. Wybierz opcję Obraz > Kolor > Podziel kanał.
  7. Aby poprawić wygląd wyrównanych obszarów na potrzeby maskowania, użyj kalkulatora obrazów, wybierając opcję Przetwarzaj > Kalkulator obrazów. Za pomocą tego operatora odejmij zielony obraz od niebieskiego obrazu. Aby uzyskać bardziej restrykcyjną maskę, odejmij zielony obraz od czerwonego. W przypadku regionów losowych odejmij kanał niebieski od kanału zielonego.
  8. Proguj wynikowy obraz za pomocą algorytmu Moments. W większości przypadków nie powinno to wymagać dalszych dostosowań. Jednak w razie potrzeby dostosuj. Spowoduje to utworzenie obrazu binarnego.
  9. Po utworzeniu obrazu binarnego wypełnij otwory, wybierając opcję Process > Binary > Fill Holes between fibers (Przetwarzaj binarnie) Fill Holes (Wypełnij otwory między włóknami) i zaokrąglij granice maski za pomocą filtra mediany. Filtr mediany wynoszący 10 jest dobrym punktem wyjścia, dostosuj go, aby dobrze pasował do danych. Ręcznie sprawdź maskę pod kątem zgodności i usuń wszelkie błędne zwroty akcji.
  10. Gdy maska będzie zadowalająca, utwórz zaznaczenie, wybierając opcję Edytuj > Zaznaczenie > Utwórz zaznaczenie. Przenieś ten wybór do menedżera ROI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Instalacja okna obrazowego wewnątrz organizmu (MIW) oraz podstawowe planowanie eksperymentu stanowią pierwsze etapy tego procesu. Ta konkretna konstrukcja i protokół MIW są bardziej odpowiednie do badań podłużnych19 i zostały z powodzeniem zastosowane zarówno w mikroskopach prostych, jak i odwróconych. W tym przypadku wykorzystano mikroskop odwrócony, ponieważ zapewnił on większą stabilność obrazu gruczołu piersiowego przy mniejszej liczbie artefaktów oddechowych. Na Rysunku 1...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obrazowanie intravitalne 4D jest potężnym narzędziem do badania dynamicznych oddziaływań fizjologicznych w kontekście przestrzennym i czasowym natywnego mikrośrodowiska guza. Niniejszy artykuł przedstawia bardzo podstawowe i adaptowalne ramy operacyjne do wydzielania dynamicznych oddziaływań komórkowych w obrębie masy guza, sąsiedniego zrębu lub w pobliżu sieci naczyniowej, wykorzystując wyłącznie sygnały endogenne z generowania drugiej harmonicznej lub autofluorescencji NAD(P)H. Protokół ten dostarcza kompleksowej, krok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować NCI R01 CA216248, CA206458 i CA179556 granty za sfinansowanie tej pracy. Chcielibyśmy również podziękować dr Kevinowi Eliceiri i jego grupie obrazowania za ich wiedzę techniczną we wczesnym rozwoju naszego programu intravital. Dziękujemy również dr Benowi Coxowi i innym członkom Grupy Produkcyjnej Eliceiri w Instytucie Badawczym Morgridge za ich niezbędny projekt techniczny we wczesnych fazach MIW. Dr Ellen Dobson pomogła w przydatnych rozmowach na temat narzędzia do segmentacji WEKA, które można trenować w ImageJ. Ponadto chcielibyśmy podziękować dr Melissie Skala i dr Alexie Barres-Heaton za terminowe użycie ich mikroskopu. Na koniec chcielibyśmy podziękować dr Brigitte Raabe, D.V.M., za wszystkie przemyślane dyskusje i porady dotyczące obchodzenia się z myszami i pielęgnacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#1.5 Okrągła szklana osłona 12 mmWarner Instruments# 64-0712Konstrukcja MIW
Strzykawka 1,0 ml do iniekcji SQStrzykawkaBD309659
Obiektyw 20xZeiss421452-988Zanurzenie w wodzie
Igła 27G do wstrzykiwań SQIgła do 1188827012 Covidien
40xobiektyw NikonMRD77410Zanurzenie w wodzie
5-0 jedwabny szew plecionyEthiconK870Szew do implantacji MIW
Żel do sztucznych łezAkornNDC 59399-162-35Żel do oczu
Roztwór betadyny, 5%Fisher ScientificNC1558063Surgery antyseptyczny
aplikator z bawełnianą końcówkąFisher Scientific23-400-101
Klej cyjanoakrylowyLoctite1365882MIW konstrukcja
fluorescencyjny dekstranSigmaT1287-50mgdożylne znakowanie
kleszczykówMckesson.comMiltex #18-782nierdzewna, 4-calowa, zakrzywiona
rurka fotopowielacza GaAsPHamamatsu 
koc grzewczyCARA 72 poduszka grzewcza  038056000729Komora
grzewczazbudowany
Podręcznik żywotności fluorescencjiBecker i Hicklhttps://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
odwrócona podstawa mikroskopuNikon
IsofluraneAkornNDC 59399-106-01Anestezjologia
Liqui-NoxFisher Scientific16-000-125MIW czyszczenie
MeloxicamNorbrookNDC 55529-040-10przeciwbólowy
Scientific Commodities INC.  Wielofotonowa głowica skanująca BB31695-PE/1
Wieloteleskopowagłowica skanująca Bruker Ultima IIi platforma obrazowania
Filtr NADH FLIMChroma284994ET 440/80 m-2P
NairCVS339826Krem do depilacji
Podgrzewacz obiektywuTokai HitSTRG-WELSX-SET
Filtr SHG/FADChroma320740ET450/ 40m-2P
Sparkle płyn do mycia szkłaAmazon.comB00814ME24Płyn do mycia szkła do wszczepionej
płytki do liczenia fotonów MIW SPC-150Becker i Hickl
FAJB06XV1VQVZLED na gęsiej szyi
Excelta366nierdzewna, 3-calowa
potrójna maść antybiotykowaActavis PharmaNDC 0472-0179-34
Antybiotykowy cewnik telewizyjnyNiestandardowaigła BD 30G: 305106Cewnik do wstrzykiwań TV
Filtr dwufotonowyChroma320282ET585/65m-2P
laser dwufotonowyKoherentny charmeleonPrzestrajalny wielofotonowy laserowy
żel ultradźwiękowyParkerPKR-03-02Żel zanurzeniowy w wodzie
Mocznik kryształySigmaU5128-5GOpcjonalnie: FLIM IRF
naczyniowych do wyboru temperatury w domu Mikrowąż Krem do depilacji Lampa chirurgiczna Magnetyczne mikronożyczki chirurgiczne

Bibliografia

  1. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (3), 171-198 (2019).
  2. Afik, R., et al. Tumor macrophages are pivotal constructors of tumor collagenous matrix. The Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2315-2331 (2016).
  3. Varol, C., Sagi, I. Phagocyte-extracellular matrix crosstalk empowers tumor development and dissemination. The FEBS Journal. 285 (4), 734-751 (2018).
  4. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 5120(2020).
  5. Han, W., et al. Oriented collagen fibers direct tumor cell intravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11208-11213 (2016).
  6. Malandrino, A., Mak, M., Kamm, R. D., Moeendarbary, E. Complex mechanics of the heterogeneous extracellular matrix in cancer. Extreme Mechanics Letters. 21, 25-34 (2018).
  7. Lugo-Cintrón, K. M., et al. Breast Fibroblasts and ECM Components Modulate Breast Cancer Cell Migration Through the Secretion of MMPs in a 3D Microfluidic Co-Culture Model. Cancers. 12 (5), 1173(2020).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. The Journal of Cell Biology. 163 (3), 583-595 (2003).
  9. Zhang, K., et al. The collagen receptor discoidin domain receptor 2 stabilizes SNAIL1 to facilitate breast cancer metastasis. Nature Cell Biology. 15 (6), 677-687 (2013).
  10. Malik, G., et al. Plasma fibronectin promotes lung metastasis by contributions to fibrin clots and tumor cell invasion. Cancer Research. 70 (11), 4327-4334 (2010).
  11. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-mesenchymal transition phenotype is associated with clinicopathological factors that indicate aggressive biological behavior and poor clinical outcomes in invasive breast cancer. Journal of Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  12. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature Cell Biology. 17 (5), 678-688 (2015).
  13. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophysical Journal. 107 (11), 2546-2558 (2014).
  14. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 8 (8), 821-835 (2016).
  15. Ray, A., Morford, R. K., Ghaderi, N., Odde, D. J., Provenzano, P. P. Dynamics of 3D carcinoma cell invasion into aligned collagen. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 10 (2), 100-112 (2018).
  16. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  17. Esbona, K., et al. The Presence of Cyclooxygenase 2, Tumor-Associated Macrophages, and Collagen Alignment as Prognostic Markers for Invasive Breast Carcinoma Patients. The American Journal of Pathology. 188 (3), 559-573 (2018).
  18. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  19. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  20. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
  21. Boone, P. G., et al. A cancer rainbow mouse for visualizing the functional genomics of oncogenic clonal expansion. Nature Communications. 10 (1), 5490(2019).
  22. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  23. Leung, E., et al. Blood vessel endothelium-directed tumor cell streaming in breast tumors requires the HGF/C-Met signaling pathway. Oncogene. 36 (19), 2680-2692 (2017).
  24. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: Bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of The American Society of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  25. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  26. Baklaushev, V. P., et al. Modeling and integral X-ray, optical, and MRI visualization of multiorgan metastases of orthotopic 4T1 breast carcinoma in BALB/c Mice. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 581-588 (2015).
  27. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase Expression Allows Bioluminescence Imaging But Imposes Limitations on the Orthotopic Mouse (4T1) Model of Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715(2017).
  28. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  29. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 16007(2014).
  30. Liu, Y., et al. Fibrillar Collagen Quantification With Curvelet Transform Based Computational Methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198(2020).
  31. Püspöki, Z., Storath, M., Sage, D., Unser, M. Transforms and Operators for Directional Bioimage Analysis: A Survey. Advances in Anatomy, Embryology, and Cell Biology. 219, 69-93 (2016).
  32. Saytashev, I., et al. Multiphoton excited hemoglobin fluorescence and third harmonic generation for non-invasive microscopy of stored blood. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3449-3460 (2016).
  33. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  34. von Au, A., et al. Circulating fibronectin controls tumor growth. Neoplasia. 15 (8), New York, N.Y. 925-938 (2013).
  35. Murgai, M., et al. KLF4-dependent perivascular cell plasticity mediates pre-metastatic niche formation and metastasis. Nature Medicine. 23 (10), 1176-1190 (2017).
  36. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2125(2018).
  37. Yakimov, B. P., et al. Label-free characterization of white blood cells using fluorescence lifetime imaging and flow-cytometry: molecular heterogeneity and erythrophagocytosis. Biomedical Optics Express. 10 (8), 4220-4236 (2019).
  38. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), Oxford, England. 2424-2426 (2017).
  39. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  40. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38(2006).
  41. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  42. Szulczewski, J. M., et al. In Vivo Visualization of Stromal Macrophages via label-free FLIM-based metabolite imaging. Scientific Reports. 6, 25086(2016).
  43. Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. Biomechanical Contributions to Macrophage Activation in the Tumor Microenvironment. Frontiers in Oncology. 10, 787(2020).
  44. Pakshir, P., et al. Dynamic fibroblast contractions attract remote macrophages in fibrillar collagen matrix. Nature Communications. 10 (1), 1850(2019).
  45. Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (4), 547-573 (2016).
  46. Shirshin, E. A., et al. Two-photon autofluorescence lifetime imaging of human skin papillary dermis in vivo: assessment of blood capillaries and structural proteins localization. Scientific Reports. 7 (1), 1171(2017).
  47. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modele guz w piersigenerowanie drugiej harmonicznejobrazowanie czasu ycia fluorescencjiautofluorescencja NADPHw kna kolagenowezr b guzaidentyfikacja naczy krwiono nych
Bezznacznikowe podejście do segmentacji w obrazowaniu przyżyciowym mikrośrodowiska guza sutka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.