Tutaj prezentujemy prosty protokół nieinwazyjnego pobierania próbek genetycznych populacji motyli na podstawie zbierania w terenie resztek jaj. Może być używany do potwierdzania tożsamości gatunku i ilościowego określania zmienności genetycznej. Protokół ten można łatwo dostosować do szerszych grup w celu zaangażowania społeczności w naukę.
Artykuł metodologiczny
Rozmieszczenie naukowców w celu przeprowadzenia nieniszczących próbek genetycznych rzadkich populacji motyli
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Globalne spadki liczebności owadów nadal przyspieszają. Skuteczne pobieranie próbek genetycznych jest niezwykle potrzebne, aby pogłębić wiedzę na temat wielu taksonów i wypełnić istniejące luki w wiedzy. Protokół ten stanowi zademonstrowaną metodę nieniszczącego pobierania próbek rzadkich motyli pod kątem struktury genetycznej populacji lub analiz kodów kreskowych DNA. Wykorzystuje kosmówkę wyklutych komórek jajowych motyli w celu uzyskania wystarczająco dużej ilości i jakości DNA, aby umożliwić pomyślne sekwencjonowanie genów w celu potwierdzenia tożsamości gatunku i ilościowego określenia zmienności genetycznej. Może to być szczególnie przydatne, gdy inne techniki pobierania próbek tkanek są niepraktyczne lub niedostępne. Chociaż został opracowany dla lepidoptera, może być jednak łatwo przystosowany do użytku z innymi gatunkami owadów. Został specjalnie zaprojektowany z myślą o łatwości użycia jako cel, aby pomóc zmaksymalizować szerokie wdrożenie przez osoby o różnym doświadczeniu i poziomie umiejętności, takie jak naukowcy społeczni, praktycy ochrony przyrody i studenci, oraz do użytku na dużych obszarach geograficznych w celu ułatwienia szerokiego pobierania próbek populacji. Uzyskane dane mogą pomóc w podejmowaniu decyzji taksonomicznych i dotyczących sporządzania wykazów, działań w zakresie ochrony i zarządzania, a także w usprawnieniu podstawowych badań ekologicznych.
Wprowadzenie
Efektywne pobieranie próbek genetycznych populacji rzadkich, malejących i/lub wymienionych taksonów owadów jest często kluczowe dla informowania o działaniach ochronnych i zarządczych. Metody pobierania próbek tkanek powodujących śmierć lub uszkodzenie są rutynowo stosowane w wielu analizach genetycznych. Jednak metody te są niepożądane lub niedozwolone, ponieważ mogą wyrządzić szkodę wrażliwym istniejącym populacjom lub negatywnie wpłynąć na zachowanie i sprawność. Różne nieśmiercionośne lub nieinwazyjne techniki pobierania próbek obejmujące tkanki, takie jak całe nogi, wycinki czułków lub skrzydeł, wysięki larwalne lub hemolimfy z wydzielin obronnych i inne produkty, takie jak frass, są odpowiednie do badań genetycznych owadów1,2,3,4,5,6,7,8,9. Ogólna wykonalność i możliwość zastosowania tych różnych technik pobierania próbek tkanek różni się znacznie w zależności od biologii, ekologii, zachowania, wielkości i rzadkości organizmu ogniskowego, sytuacji i osób zbierających materiał. Na przykład wycinki całych nóg lub wyrostków wymagają tymczasowego schwytania i ostrożnego obchodzenia się z kilkoma osobnikami na odpowiednim etapie życia, zazwyczaj przez doświadczony personel. Podobnie, źródła tkankowe, takie jak wysięki larwalne lub frass, mogą być praktyczne tylko wtedy, gdy organizmy są w niewoli lub tymczasowo przetrzymywane przez odpowiedni okres.
Dla pytań badawczych zadawanych na poziomie populacji, takich jak te dotyczące potencjalnego zróżnicowania taksonomicznego lub struktury genetycznej, często wymagane jest pobieranie próbek w szerszej skali czasowej lub geograficznej (tj. regionalnej lub kontynentalnej). W rezultacie, niektóre nieinwazyjne źródła tkanek mogą być całkowicie niepraktyczne lub co najmniej nieefektywne w zbieraniu w dużych ilościach. Pobieranie próbek na taką skalę może być dodatkowo logistycznie lub finansowo niepraktyczne lub zaporowe dla indywidualnych badaczy, a nawet mniejszych zespołów terenowych. Podczas gdy bezpośrednie zaangażowanie naukowców ze społeczności jest coraz częściej przyjmowane przez społeczność badawczą, aby pomóc w sprostaniu wielu z tych wyzwań i przyspieszyć gromadzenie dużych zbiorów danych, przyjęcie było ograniczone w przypadku badań obejmujących nieniszczące, nieinwazyjne lub pobieranie próbek eDNA10,11,12.
Aby pomóc przezwyciężyć niektóre z tych potencjalnych ograniczeń, wykazaliśmy, że kosmówka z wyklutych jaj motyli może dostarczyć wystarczająco dużo i jakości DNA, aby pomyślnie sekwencjonować geny, aby potwierdzić tożsamość gatunku i określić ilościowo zmienność genetyczną. Następnie przetestowaliśmy różne protokoły zbierania przy użyciu tej techniki13. Prace pilotażowe posłużyły jako podstawa do dalszych udoskonaleń metodologicznych. Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje wynikający z tego prosty, ale kompleksowy, poprawiony protokół zbierania danych w terenie, który został wdrożony dla naukowców społecznych i innego personelu niebędącego ekspertami. Protokół ten jest częścią obejmującej cały zakres analizy struktury populacji oszronionego motyla elfa (Callophrys irus), która ma pomóc w informowaniu o przyszłych działaniach ochronnych i federalnej decyzji o ewentualnym umieszczeniu na liście gatunków zagrożonych wyginięciem w Stanach Zjednoczonych. Chociaż potencjalnie jest to bardziej pracochłonne niż niektóre metody nieinwazyjne, brak niezbędnego kontaktu z organizmami i łatwość użycia sprawiają, że jest to potencjalnie opłacalny model, który może być zastosowany w innych programach badań genetycznych populacji ukierunkowanych na wybór zarówno owadów pospolitych, jak i tych budzących obawy o ochronę, które pozostawiają resztki jaj po niedawno wyklutych nimfach lub larwach. Przedstawiony tutaj język protokołu został opracowany specjalnie dla motyli z rodziny Lycaenidae i do użytku przez osoby niebędące ekspertami, zdefiniowane tutaj jako naukowcy społeczni lub inne osoby (np. biolodzy agencyjni, stażyści) z ograniczonym doświadczeniem entomologicznym.
Protokół
1. Rozpowszechnianie materiałów dla naukowców społeczności
- Dokładnie przejrzyj i zgromadź pełną listę potrzebnych materiałów związanych ze zbiórką, zapoznając się z pełną tabelą materiałów.
- Jeśli pobieranie próbek będzie odbywać się w wielu lokalizacjach i/lub przez wiele osób/zespołów, zgromadź i zorganizuj wszystkie potrzebne zapasy w oddzielnych jednostkach do rozmieszczenia (Rysunek 1 i Rysunek 2).
- Zaopatrzenie transportowe (jednostki zdolne do rozmieszczenia) dla naukowców społecznych lub innego personelu odpowiedzialnego za zbieranie danych w terenie.
- Jeśli personel nie jest lokalny, ostrożnie zapakuj zapasy (każdą mobilną jednostkę) do osobnego kartonowego pudełka wysyłkowego z kompletną etykietą wysyłkową i wyślij.
UWAGA: Na tym etapie przyspieszona wysyłka nie jest wymagana.
2. Przygotowanie kolekcji dla naukowców społeczności
- Po otrzymaniu materiałów do zbiórki, w tym skrzynki na zbiórkę, należy dokładnie przejrzeć laminowaną listę dostaw i przeprowadzić pełną inwentaryzację. Powiadom lidera projektu, jeśli brakuje jakichkolwiek zapasów.
- Napełnij probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml 180 μl buforu do lizy, naklej etykiety z nadrukowaną unikalną etykietą identyfikacyjną na każdą probówkę do mikrowirówki i umieść wszystkie probówki w 64-dołkowym pojemniku do przechowywania probówek do mikrowirówek. Mocno zabezpiecz pokrywę po załadowaniu.
UWAGA: Jeśli drukarki etykiet nie są dostępne, nanieś unikalne numery identyfikacyjne na bok i wieczko każdej fiolki za pomocą markera odpornego na obecność etanolu. - Upewnij się, że wszystkie urządzenia cyfrowe (np. smartfon lub aparat fotograficzny) są w pełni naładowane, a wszelkie zapasowe baterie są zapakowane.
- Częściowo napełnij małą lodówkę lodem do przechowywania w terenie i lokalnego transportu pobranych próbek.
- Zapakuj wszystkie materiały do zbiórki do pojemnika na odpady lub podobnego solidnego, odpornego na warunki atmosferyczne pojemnika, aby zapewnić bezpieczny transport i skonsolidowane przechowywanie.
- Zapoznaj się ze szczegółowym protokołem nieniszczącego pobierania próbek genetycznych przed wyruszeniem w teren.
UWAGA: Skorzystaj z laminowanego i skondensowanego, ilustrowanego protokołu, aby uzyskać dodatkowe wskazówki w terenie (rysunek uzupełniający S1 i rysunek uzupełniający S2).
3. Pobieranie próbek w terenie
- Po przybyciu na teren pola użyj ołówka lub długopisu na każdą pogodę, aby zapisać w odpornym na warunki atmosferyczne zeszycie polowym porę dnia, datę, ogólną nazwę nieruchomości (np. Las Narodowy Apalachicola), nazwę lub opis konkretnej lokalizacji terenowej oraz odczyt GPS, jeśli jest dostępny, a także pełne imię i nazwisko oraz role wszystkich obecnych osób.
- Zlokalizuj odpowiednie siedlisko, w którym występują larwy gatunków roślin żywicielskich charakterystycznych dla docelowego motyla.
UWAGA: Zachowaj ostrożność, aby uniknąć lub zminimalizować wpływ na wrażliwe siedliska, populacje roślin i dziką przyrodę. Ponadto należy upewnić się, że zabezpieczyłeś wszystkie odpowiednie uprawnienia i/lub pozwolenia właściciela gruntu przed uzyskaniem dostępu do terenu i wydarzeń związanych z pobieraniem próbek. - Za pomocą smartfona lub aparatu fotograficznego wykonaj szczegółowe zdjęcia wszystkich miejsc polowych, miejsc pobierania próbek, roślin żywicielskich i wszelkich innych informacji, które mogą być istotne dla projektu. Używaj smartfonów lub innych aparatów, które rejestrują współrzędne GPS.
UWAGA: Geotagowanie zdjęć musi być włączone na wszystkich smartfonach. - Kompleksowo przeszukaj wszystkie larwalne części roślin żywicielskich, takie jak liście, pąki kwiatowe, kwiaty lub rozwijające się owoce, o których wiadomo, że są wybierane przez składanie jaj przez składanie jaj przez składanie jaj przez dorosłe samice motyli. W przypadku większości Lycaenidae szukaj białych, wyklutych jaj z wyraźnym otworem w środku przypominającym pączka, z którego wyłoniła się larwa noworodka (Ryc. 3). Szukaj niewyklutych jaj, które mają nieco ciemniejszy kolor, często zielony lub niebieskawy i będą całkowicie nienaruszone bez w środku (Rysunek 4). Użyj soczewki ręcznej lub innego urządzenia powiększającego, aby dokładnie przyjrzeć się każdemu jaju.
- Po zlokalizowaniu wyklutego jaja załóż rękawiczki nitrylowe na obie ręce.
- Za pomocą czystych, sterylnych, spiczastych kleszczy chwyć i delikatnie wyciągnij wyklute jajo z rośliny żywicielskiej i umieść je bezpośrednio w oznakowanej probówce do mikrowirówki wypełnionej buforem do lizy pobranej z 64-dołkowego pudełka do przechowywania.
UWAGA: Niektóre materiały przenoszone przez rośliny żywicielskie (o średnicy mniejszej niż 15 mm) są dopuszczalne i normalne podczas zbioru. - Zebrać co najmniej 5 próbek na grządkę/miejsce uprawy żywicielskiej (każda zawierająca od 1 do 20 wyklutych jaj), dążąc do uzyskania łącznie >50 jaj w miejscu, jeśli jest to możliwe.
UWAGA: Pomoże to upewnić się, że przynajmniej część tkanki zostanie pobrana z każdej próbki, rośliny/plastra i zwiększy szanse na wykrycie DNA (osobista obserwacja). - Po każdym pobraniu jaj należy dokładnie oczyścić końcówki kleszczy, zanurzając je w fiolce zawierającej 95% etanol lub oblewając 95% etanolem z wyciskanej butelki lub używając chusteczek nasączonych alkoholem.
UWAGA: Pomoże to zminimalizować przenoszenie tkanek między zdarzeniami pobierania próbek. - Jeśli to możliwe, zbierz kilka wyklutych jaj (1-20 jaj) z wielu roślin w tym samym plastrze żywiciela do jednej probówki do mikrowirówki i mocno zamknij pokrywę. W przypadku gatunków motyli wykorzystujących większe zielne lub drzewiaste gatunki żywicielskie, zbierz wiele jaj z różnych miejsc na tej samej roślinie, jeśli plamy żywiciela są ograniczone.
UWAGA: Rośliny znajdują się w tym samym żywicielu, jeśli ich liście stykają się ze sobą. Jeżeli istnieje zauważalna fizyczna separacja między roślinami lub płatami, należy ją uznać za inną próbkę. W przypadku pobierania innego rodzaju tkanki, takiej jak wysięki larwalne lub pojedyncza noga, należy umieścić tylko jedną nogę, fragment nogi lub wysięk larwalny w probówce do mikrowirówki (jedna próbka na osobę). - Upewnij się, że cały zebrany materiał jest całkowicie zanurzony w buforze do lizy w każdej probówce mikrowirówki o pojemności 1.5 ml. Postukaj dnem danej rurki o twardą powierzchnię, aby w razie potrzeby ponownie zanurzyć próbki.
- Wytrzyj kleszcze do wyschnięcia czystą jednorazową chusteczką laboratoryjną.
UWAGA: Staranne czyszczenie kleszczy jest niezbędne, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami. - Podczas pobierania nowej próbki należy wyrzucić zużyte rękawice nitrylowe i zastąpić je czystą parą.
- W odpornym na warunki atmosferyczne zeszycie polowym użyj ołówka lub długopisu na każdą pogodę, aby zapisać unikalną etykietę identyfikacyjną przypisaną z probówki do mikrowirówki wraz z rodzajem próbki (np. jaja, wysięki larwalne lub noga), przybliżoną liczbą wyklutych jaj oraz informacjami o kolekcji, takimi jak nazwa (imiona) i nazwisko (nazwiska) zbieracza, data, lokalizacja, gatunek rośliny żywicielskiej i wszelkie dodatkowe uwagi (Rysunek 2).
- Umieść zamkniętą probówkę wirówkową z próbką resztek jaj z powrotem w 64-dołkowym pojemniku do przechowywania mikrowirówek.
- Przechowuj 64-dołkowy schowek na mikrowirówkę w chłodziarce z lodem podczas pracy w terenie.
- Utrzymuj wszystkie inne zapasy zbiórki w skrzynce odbiorczej podczas przebywania w terenie, aby zapewnić bezpieczne i skonsolidowane przechowywanie i transport między miejscami.
4. Gdy zbieranie pól jest zakończone
- Upewnij się, że wszystkie probówki do mikrowirówek zawierające próbki znajdują się w 64-dołkowym pojemniku do przechowywania mikrowirówek w chłodziarce z lodem do transportu.
- Umieść wszystkie zapasy do zbierania w terenie z powrotem w pudełku na sprzęt do zbierania.
- Przetransportuj wszystkie próbki z powrotem do biura lub laboratorium i dokładnie sprawdź dwukrotnie każdą probówkę mikrowirówkową, aby upewnić się, że cały materiał próbki jest całkowicie zanurzony w buforze do lizy.
- Umieść 64-dołkowy pojemnik do przechowywania mikrowirówek z próbkami w zamrażarce do czasu wysyłki lub przetworzenia.
UWAGA: Przeciętna komercyjna zamrażarka o temperaturze -18 °C jest dopuszczalna do krótkotrwałego przechowywania. - Dokładnie oceń wszystkie materiały eksploatacyjne w skrzynce z narzędziami do zbierania i wymień je w razie potrzeby.
UWAGA: Jest to szczególnie ważne, jeśli zaplanowanych jest wiele zdarzeń zbierania danych w terenie. - Przechowuj pojemnik na sprzęt do zbiórki w bezpiecznym miejscu do następnego wydarzenia zbiórki w terenie.
- Pobierz wszystkie obrazy cyfrowe i upewnij się, że ich kopia zapasowa jest bezpiecznie tworzona na serwerze lub w systemie pamięci masowej w chmurze.
- Zeskanuj lub sfotografuj oryginalne, odporne na warunki atmosferyczne strony notatnika polowego lub arkusze danych terenowych zawierające dane do momentu, aż wszystkie informacje będzie można wprowadzić do arkusza kalkulacyjnego projektu lub bazy danych.
5. Przesyłanie próbek i danych
- Wyjmij z zamrażarki wszystkie 64-dołkowe pojemniki do przechowywania mikrowirówek z próbkami.
- Ostrożnie zapakuj 64-dołkowe pudełka do przechowywania mikrowirówek z próbkami i notatnikiem terenowym lub arkuszami danych terenowych w standardowe pudełko wysyłkowe, dołącz dostarczoną etykietę wysyłkową z oryginalnym numerem konta nadawcy i wyślij gwarantowaną przez przewoźnika ekspresowego, z dnia na dzień, następnego dnia do dyrektora projektu.
- Wyślij e-mailem numer śledzenia paczki i kopię zeskanowanych stron zeszytu lub arkuszy danych terenowych do dyrektora projektu.
6. Ekstrakcja DNA
- Po otrzymaniu 64-dołkowych pojemników do przechowywania mikrowirówek należy je przechowywać w temperaturze -20 °C w celu zachowania DNA w próbkach do czasu, gdy będą one gotowe do ekstrakcji DNA.
- W laboratorium ekstrahować DNA poprzez mielenie tkanki owadów przechowywanej w buforze do lizy po rozmrożeniu w temperaturze -20 °C. Dodać 20 μl proteinazy K i pozostawić próbkę na noc w temperaturze 56 °C w ogrzewanym inkubatorze nie dłużej niż 24 godziny.
- Dodaj odpowiednie do czyszczenia i mycia, zgodnie z zaleceniami producenta13.
- Przenieść próbkę zawieszoną w buforze do kolumny wirowej dołączonej do fiolki zbiorczej o pojemności 2 ml.
- Wirować z prędkością 6 021 × g przez 60 s za pomocą wirówki. Dodaj odpowiednie do mycia i odpowiednio odwiruj.
- Uwolnić związane DNA za pomocą buforu elucyjnego (30 μl) i odwirować próbkę do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
UWAGA: Przejdź do sekwencjonowania, jeśli stężenie DNA przekracza 0,010 ng/ml. Zobacz Rysunek 5 dla stężenia DNA według typu tkanki.
7. Analiza danych sekwencji DNA
- Przycinanie lub edytowanie wywołań podstawowych o niskiej jakości w sekwencjach wynikowych.
- Wysyłanie zapytań do publicznych baz danych w celu potwierdzenia identyfikacji gatunków.
- Dopasuj sekwencje do siebie, aby porównać różnice między osobami.
Wyniki
Materiały do pobrania do 563 próbek zostały wysłane do ośmiu naukowców zajmujących się ochroną przyrody i badaniami społecznościowymi z dziewięciu stanów obejmujących obszar występowania gatunku w wschodniej Ameryce Północnej. Materiały wysyłano przez trzy miesiące w 2021 roku, przed lokalnymi szczytami okresów lotów. Do tej pory otrzymaliśmy łącznie 160 pobranych próbek tkanek C. irus (Tabela 1). DNA genomiczne wyekstrahowano zgodnie z protokołem dla tego rodzaju próbek opisanym przez Storera i współpracowników14. Z tych 160 próbek pomyślnie wyekstrahowano DNA z 88, przy średnim stężeniu 1,67 ng/μL (SE ± 2,98), a najwyższa wydajność DNA wyniosła 26,8 ng/μL. Stężenia określono za pomocą zestawu do analizy o wysokiej czułości zgodnie z instrukcją producenta, wykorzystując 2 µL ekstraktu.
Choć całkowita liczba otrzymanych próbek jest znacznie niższa niż ogólna liczba materiałów przekazanych do zbioru, wynika to przede wszystkim z faktu dostarczenia nadmiarowej ilości materiałów do pobierania głównemu kolektorowi lub liderowi zespołu, aby zapewnić im maksymalną elastyczność w zakresie wyboru wielu miejsc poboru i/u włączenia naukowców obywatelskich, jeśli zajdzie taka potrzeba. Co więcej, C. iris jest rzadkim i ginącym taksonem, reprezentowanym przez nieliczne i często stosunkowo małe populacje w całym jego obecnym zasięgu. Pomimo tego ograniczenia, całkowita liczba otrzymanych próbek tkanek jest znacząca, zwłaszcza w porównaniu z tym, czego należałoby oczekiwać przy bardziej tradycyjnym pobieraniu próbek od poszczególnych dorosłych motyli.
Rycina 1: Poszczególne jednostki wdrożeniowe wszystkich niezbędnych materiałów oczekujących na wysyłkę do naukowców obywatelskich lub innego personelu odpowiedzialnego za pobieranie próbek w terenie. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Pojedyncza jednostka wdrożeniowa zawierająca wszystkie materiały, przezroczystą plastikową skrzynkę do zbierania próbek oraz wypełnioną etykietę przewozową w oczekiwaniu na wysyłkę do naukowców obywatelskich lub innego personelu odpowiedzialnego za pobieranie próbek w terenie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Zdjęcie wyklutego jaja motyla modraszka (Callophrys irus) na wilcu wiosennym (Lupinus perennis), przedstawiające wyraźny otwór w centrum, z którego wykluła się larva.Należy zauważyć, że ogólny kolor wyklutego jaja jest biały. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Zdjęcie nieowychniętych i wyklutych jaj motyla modraszka (Callophrys irus) na wilczomleczu (Lupinus perennis). Należy zauważyć, że jaja nieowychnięte nie posiadają widocznego otworu centralnego i mają ogólnie niebiesko-zielony kolor. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 5: Stężenie DNA w zależności od rodzaju tkanki. Linie środkowe pudełek reprezentują medianę, każde pudełko obejmuje zakres IQR, a wąsy pudełkowe wynoszą 1,5 × IQR, przy czym punkty znajdujące się poza nimi są wartościami odstającymi. Próbki zawierające pojedynczy kokon posiadały tylko jeden kokon, a próbki zawierające wiele kokonów posiadały co najmniej dwa, przy czym liczba kokonów na próbkę wahała się od 2 do 20 (średnia = 5,3). Skrót: IQR = rozstęp międzykwartylowy. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| Stan | Kapsułka jajowa | Kapsułki jajowe | Odchody owadów | Noga | Linienie | Suma całkowita |
| Arkansas | 2 | 2 | ||||
| Floryda | 3 | 10 | 7 | 22 | 42 | |
| Michigan | ||||||
| New Hampshire | 24 | 6 | 15 | 45 | ||
| Nowy Jork | 30 | 30 | ||||
| Ohio | ||||||
| Wisconsin | 9 | 5 | 5 | 19 | ||
| Oklahoma | 16 | 6 | 22 | |||
| Suma całkowita | 36 | 21 | 16 | 65 | 22 | 160 |
Tabela 1: Liczba i rodzaj pobranego materiału tkankowego w podziale na stany.
Rycina uzupełniająca S1: Strona główna dwustronnego, zalaminowanego, skróconego i zilustrowanego protokołu do użytku w terenie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Rycina dodatkowa S2. Strona tylna dwustronnego, zalaminowanego, skróconego i zilustrowanego protokołu do użytku w terenie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Protokół ten opisuje metodę terenową służącą do nieniszczącego pobierania próbek rzadkich motyli pod kątem struktury genetycznej populacji lub analiz kodów kreskowych DNA. Ogólne korzyści płynące z tego protokołu zostały specjalnie zaprojektowane, aby pomóc zmaksymalizować szerokie wdrożenie przez osoby o różnym doświadczeniu i poziomie umiejętności, takie jak naukowcy społeczni, praktycy ochrony przyrody i studenci. Należą do nich stosunkowo niski koszt całkowity, łatwe do zdobycia materiały eksploatacyjne i sprzęt, prosta i przystępna metoda bez wielu nadmiernie skomplikowanych kroków oraz łatwe wdrożenie na dużym obszarze geograficznym. Dodatkowo celuje w resztkowy materiał organiczny, co eliminuje potrzebę tymczasowego chwytania lub manipulowania, a przy okazji potencjalnie szkodzi organizmom żywym w celu pozyskania próbek genetycznych. Co więcej, wydłuża potencjalny okres dostępny do pobrania próbek poza tradycyjną fenologię lub długość życia na danym etapie życia, zwiększając elastyczność i ogólne możliwości pobierania, aby pomóc zmaksymalizować liczbę próbek.
Podczas gdy głównym taksonem dla tych wysiłków był oszroniony motyl elf, szeroko rozpowszechniony, ale malejący specjalista od siedlisk, protokół ten może być stosowany szerzej do wielu innych owadów, w tym tych budzących obawy o ochronę. Podobnie, chociaż protokół jest ukierunkowany na zbieranie wyklutych jaj jako źródła materiału genetycznego, można go łatwo zaadaptować do innych, potencjalnie bardziej tradycyjnych próbek (np. nóg, fragmentów skrzydeł, klipsów antenowych), a nawet całych organizmów. Jednak ten aspekt jest również potencjalnym ograniczeniem protokołu. Chociaż zdecydowana większość etapów została zaprojektowana tak, aby była stosunkowo prosta i szybka do wykonania, kompleksowe wyszukiwanie płatów larw roślin żywicielskich pod kątem jaj wylęgowych, które pojedynczo mają zwykle <1,0 mm średnicy, jest czasochłonne i pracochłonne. Niemniej jednak tak szeroko zakrojona działalność w zakresie pobierania próbek jest szczególnie idealna dla większej sieci uczestników, takich jak naukowcy społeczni.
Podobnie jak w przypadku innych projektów terenowych, niezbędne jest staranne przygotowanie. Obejmuje to przeprowadzenie pełnej inwentaryzacji materiałów potrzebnych do upewnienia się, że nie brakuje żadnych przedmiotów, że wszelkie wymagane prace przygotowawcze zostały zakończone oraz że są one dobrze zorganizowane, bezpiecznie zapakowane i gotowe do użycia w terenie. Ponadto wszyscy pracownicy terenowi, w szczególności ci, którzy przeprowadzają pobieranie tkanek, powinni szczegółowo zapoznać się z protokołem pobrania przed jakimkolwiek wydarzeniem związanym z pobraniem i kierować wszelkie pytania do osób nadzorujących projekt. Po dotarciu w teren część protokołu dotycząca pobierania próbek wymaga skrupulatnej dbałości o szczegóły. Obejmuje to zlokalizowanie i dokładne sprawdzenie wszelkich komórek jajowych, aby upewnić się, że są wylęgnięte, a tym samym nadają się do pobrania, dokładne czyszczenie kleszczy, wymianę rękawiczek w celu zmniejszenia przenoszenia tkanek między zdarzeniami pobierania próbek oraz upewnienie się, że próbki tkanek są całkowicie zanurzone w buforze do lizy w każdej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Wreszcie, niezbędne jest rejestrowanie dokładnych i szczegółowych danych, które obejmują powiązanie unikalnej etykiety identyfikacyjnej przypisanej z probówki mikrowirówki z konkretną pobraną próbką i wszystkimi innymi istotnymi informacjami o pobraniu. Chociaż ten krok jest rutynowy w badaniach naukowych, często musi być dokładnie wyjaśniony i wzmocniony dla społeczności naukowej.
W tym miejscu pokazujemy potencjał wykorzystania naukowców społecznych do nieśmiercionośnego pobierania próbek od małych, rzadkich i zagrożonych gatunków. Istnieją jednak pewne potencjalne ograniczenia, o których należy pamiętać podczas analizowania wszelkich uzyskanych danych genetycznych. Na przykład, podczas gdy łączenie próbek z jednego plastra zwiększa szanse na odzyskanie wystarczającej ilości DNA do wykrycia, potencjalnie wprowadza również heterozygotyczność. Ponadto, ponieważ protokół obejmuje pobranie kosmówki z wyklutych komórek jajowych, w populacji można pobrać próbki tylko od samic motyli, reprezentujących rodzicielskie DNA. Niemniej jednak, ponieważ żadne wcześniejsze dane genetyczne na poziomie populacji nie były dostępne dla C. irus, uzyskane w ten sposób informacje mogą przynieść korzyści jedynie w zakresie ochrony gatunków i zarządzania nimi. Na przykład, podczas gdy dokładny, szczegółowy projekt badania i staranny dobór markerów byłyby wymagane do odpowiedniej oceny struktury populacji, przedstawiony tutaj protokół pobierania próbek oraz zastosowanie kodu kreskowego DNA podjednostki 1 oksydazy cytochromowej c (CO1) mogą być wykorzystane do wykrycia występowania rzadkich lub zagrożonych taksonów. Dodatkowe omówienie użyteczności i zastosowania sekwencjonowania DNA z nieśmiercionośnego próbkowania opisanego tutaj jest szczegółowo opisane przez Storer et. al.14.
Poza głównym celem, jakim jest zbieranie próbek do analizy genetycznej, protokół podkreśla również, że uczestnicy wykonują szczegółowe zdjęcia cyfrowe wszystkich miejsc polowych, miejsc pobrań, obecnych larw roślin żywicielskich i wszelkich innych elementów otaczającego siedliska, które mogą być istotne. Taka dokumentacja pomaga zapewnić ogólną ocenę siedliska, która jest przydatna do zilustrowania istniejących warunków terenowych, takich jak fenologia roślin, gęstość zasobów żywicielskich i historia zarządzania (np. niedawny przepisany pożar). Takie informacje są szczególnie przydatne w przypadku projektów, w których próbki terenowe są pobierane w szerszym okresie czasowym, aby umożliwić bardziej szczegółowe porównania środowiskowe.
Wreszcie, w związku z tym, że globalny spadek liczebności owadów nadal przyspiesza, niezwykle potrzebne są rozszerzone działania w zakresie oceny i monitorowania gatunków15,16. Wykorzystanie szerszego zaangażowania partycypacyjnego ze strony naukowców społecznych, studentów (np. stażystów i stypendystów U.S. Fish and Wildlife Service) oraz praktyków ochrony przyrody oferuje coraz bardziej realne możliwości obszernego gromadzenia danych wielu typów, w tym próbek DNA. W związku z tym dane generowane przez ten protokół mają wiele możliwych zastosowań. Obejmują one pomoc w informowaniu o działaniach ochronnych (np. planowaniu, odbudowie i zarządzaniu), decyzje dotyczące wpisu na listę lub oceny stanu gatunków oraz badania ekologiczne, populacyjne i taksonomiczne.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Davidowi Cuthrellowi, Amandzie Dillon, Steve'owi Fullerowi, Neilowi Giffordowi, Heidi Holman, Deanowi Jue, Sally Jue, Danielowi Kennedy'emu, Genevieve Kozak, Rebecce Longenecker, Maureen McClung, Mattowi Moranowi, Robinowi Niverowi, Brendzie Smith, Hunterowi Trowbridge'owi i Jessupowi Weicheltowi za pomoc w różnych aspektach projektu, w tym logistyce, koordynacji, pozwoleniach i/lub pobieraniu próbek. Badania te zostały sfinansowane z grantu U.S. Fish and Wildlife Service (Federal Award Identification Number F20AC00356) administrowanego przez Wildlife Management Institute (grant SA 2021-01).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 14-litrowa chłodnica Igloo Playmate Przenośna | Amazon | NA | Ilość na rozkładaną jednostkę: 1 chłodnica |
| 250 kolumn DNeasy Mini Spin, proteinaza K,, probówki zbiorcze (2 ml) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Zestaw chusteczek Ilość na rozkładaną jednostkę: NA |
| Andwin Scientific Supplier Diversity Partner MARKERY LABORATORYJNE CZARNE | FisherSci | NC9280166 | odporny na etanol Ilość na rozkładaną jednostkę: 2 znaczniki |
| Pudełko wysyłkowe | Ilość na rozkładaną jednostkę: w razie potrzeby | ||
| Butelki do mycia z polietylenu Eisco, LDPE | FisherSci | S14091 | butelka ze sprayem lub spryskiwaczem klasy lab (na etanol lub alkohol) Ilość na rozkładaną jednostkę: 1 butelka |
| FedEx U.S. express airbill | wysyłki FedEx | NA Ilość na rozkładaną jednostkę: 2 etykiety | |
| Probówki do mikrowirówek Fisherbrand Premium: 1,5 ml | FisherSci | NC9386261 1,5 ml Ilość na jednostkę, którą można rozmieścić: 128 tubek | |
| Kleszcze, #4a, bardzo cienkie, ale bardzo mocne końcówki (33 mm), o długości 4-3/8" (111 mm) Kleszcze | Bioquip | 4523 | Ilość na rozkładaną jednostkę: 2 proste kleszcze |
| Kleszcze, #7, zakrzywione końcówki (13 mm), bardzo drobne punkty, 4-1/2" (114 mm) długości | Bioquip | 4527 | Ilość na rozkładaną jednostkę: 2 kleszcze zakrzywione |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-warstwowe | chusteczki FisherSci | 06-666A | kimwipes (lub inne sterylne chusteczki nawilżane) Ilość na rozkładaną jednostkę: 1 pudełko |
| Laminowany Ilustrowany protokół zbierania w terenie | Skrócony protokół NA | NA | Ilość na rozkładaną jednostkę: 1 protokół |
| Laminowana lista materiałów | NA | NA | Lista dostaw NA Ilość na rozkładaną jednostkę: 1 lista |
| Lily Sugar 'N Cream Oryginalna solidna przędza, 2.5 uncji, średnia grubość 4, 100% bawełna - gorący róż - Pranie w pralce i Sucha | różowa przędza Amazon NA (do zabezpieczenia kleszczy w celu zapewnienia widoczności) Ilość na rozmieszczaną jednostkę: 2 jardy | ||
| Lupa firmy Bausch & Lomb, 10x lupa Coddington Soczewka | Amazon | NA | Ilość na rozkładaną jednostkę: 2 soczewki ręczne |
| MyGift Przezroczyste plastikowe 2-poziomowe tace Pudełko do przechowywania artykułów rzemieślniczych / futerał pierwszej pomocy z górnym uchwytem i Zamek zatrzaskowy | Pudełko do przechowywania dostaw Amazon NA Ilość na jednostkę, którą można rozmieścić: 1 pudełko | ||
| Nitryl, Rękawiczki jednorazowe, L, Bezpudrowe, Grubość dłoni 2,8 mil Nitrylowe | Grainger | 60NU14 | (duże) Ilość na rozkładaną jednostkę: 1 pudełko |
| Nitryl, Rękawiczki jednorazowe, M, bezpudrowe, 2,8 mil Grubość dłoni | Grainger | 60NU13 | Rękawice laboratoryjne nitrylowe (średnie) Ilość na rozkładaną jednostkę: 1 pudełko |
| Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL bufor do lizy Ilość na jednostkę, którą można rozmieścić: 180 &mikro; l/rura; 128 tubek |
| Rite In The Rain Odporny na warunki atmosferyczne boczny spiralny notebook, żółta okładka, uniwersalny wzór strony (nr 373-MX), 11 x 8,75 x 0,5 | NA | odporny na warunki atmosferyczne notebook polowy Ilość na rozkładaną jednostkę: 1 notebook | |
| Showgard Professional Stamp Szczypce 6" 904 z okrągłą końcówką Pęseta | Amazon | NA | 6" szczypce do końcówek łopatowych Ilość na rozkładaną jednostkę: 2 długie kleszcze łopatkowe |
| Texwipe PolySat Wstępnie zwilżone wycieraczki | FisherSci | 18-366-231 | chusteczki nasączone alkoholem Ilość na rozkładaną jednostkę: 100 chusteczek |
| Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64-dołkowe probówki do mikrowirówek do zbierania/przechowywania Ilość na rozkładaną jednostkę: 2 pudełka |
| Materiał opakowaniowy Ilość na jednostkę, którą można rozmieścić: w razie potrzeby |
Bibliografia
- Donald, H. M., Wood, C. W., Benowitz, K. M., Johnson, R. A., Drodie, E. D. Nondestructive sampling of insect DNA from defensive secretion. Molecular Ecology Resources. 12 (5), 856-860 (2012).
- Feinstein, J. DNA sequence from butterfly frass and exuviae. Conservation Genetics. 5 (1), 103-104 (2004).
- Hamm, C. A., Aggarwal, D., Landis, D. A. Evaluating the impact of non-lethal DNA sampling on two butterflies, Vanessa cardui and Satyrodes Eurydice. Journal of Insect Conservation. 14, 11-18 (2010).
- Holehouse, K. A., Hammond, R. L., Bourke, A. F. G. Non-lethal sampling of DNA from bumblebees for conservation genetics. Insectes Sociaux. 50 (3), 277-285 (2003).
- Lushai, G., et al. Application of molecular techniques to non-lethal tissue samples of endangered butterfly population (Parnassius apollo L.) in Norway for conservation management. Biological Conservation. 94 (1), 43-50 (2000).
- Monroe, E. M., Lynch, C., Soluk, D. A., Britten, H. B. Nonlethal tissue sampling techniques and microsatellite markers used for first report of genetic diversity in two populations of the endangered Somatochlora hineana (Odonata: Corduliidae). Annals of the Entomological Society of America. 103 (6), 1012-1017 (2010).
- Oi, C. A., López-Uribe, M. M., Cervini, M., Del Lama, M. A. Non-lethal method of DNA sampling in euglossine bees supported by mark-recapture experiments and microsatellite genotyping. Journal of Insect Conservation. 17 (5), 1071-1079 (2013).
- Scriven, J. J., Woodall, L. C., Goulson, D. Nondestructive DNA sampling from bumblebee feces. Molecular Ecology Resources. 13 (2), 225-229 (2013).
- Watts, P. C., Thompson, D. J., Daguet, C., Kemp, S. J. Exuviae as a reliable source of DNA for population-genetic analysis of odonates. Odonatologica. 34 (2), 183-187 (2005).
- Andrews, K., et al. All hands on deck: local ecological knowledge and expert volunteers contribute to the first delisting of a marine fish species under the Endangered Species Act. Citizen Science: Theory and Practice. 4 (1), 37(2019).
- Buxton, A., Groombridge, J., Griffiths, G. Comparison of two citizen scientist methods for collecting pond water samples for environmental DNA studies. Citizen Science: Theory and Practice. 3 (2), 2(2018).
- Granroth-Wilding, H., et al. Non-invasive genetic monitoring involving citizen science enables reconstruction of current pack dynamics in a re-establishing wolf population. BMC Ecology. 17 (1), 44(2017).
- Qiagen, DNeasy Blood & Tissue Kit Quick Start Protocol. , Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=63e22fd7-6eed-4bcb-8097-7ec77bcd4de6&lang=en (2016).
- Storer, C., Daniels, J., Xiao, L., Rossetti, K. Using noninvasive genetic sampling to survey rare butterfly populations. Insects. 10 (10), 311(2019).
- Wagner, D. L., et al. Insect decline in the Anthropocene: Death by a thousand cuts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 20239891(2021).
- Montgomery, G. A., et al. Is the insect apocalypse upon us? How to find out. Biological Conservation. 241, 108327(2020).
Przedruki i uprawnienia
