Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przepiórcza błona chorioallantoiczna - narzędzie do diagnostyki i terapii fotodynamicznej

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63422

⸱

28 kwietnia 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre of Biosciences SAS, IABG, Bratislava, Slovakia, 2Center for Interdisciplinary Biosciences, University of Pavol Jozef Šafárik, Košice, Slovakia

W tym artykule

Podsumowanie

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) ptasiego zarodka jest bardzo użytecznym i przydatnym narzędziem w różnych dziedzinach badań. Specjalny model ex ovo przepiórki japońskiej CAM nadaje się do badań nad leczeniem fotodynamicznym.

Streszczenie

Błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) ptasiego zarodka to cienka, pozaembrionalna błona, która funkcjonuje jako główny organ oddechowy. Jego właściwości sprawiają, że jest doskonałym modelem eksperymentalnym in vivo do badania angiogenezy, wzrostu guza, systemów dostarczania leków lub diagnostyki fotodynamicznej (PDD) i terapii fotodynamicznej (PDT). Jednocześnie model ten odnosi się do wymogu zastąpienia zwierząt doświadczalnych odpowiednią alternatywą. Wyhodowany zarodek ex ovo umożliwia łatwą aplikację substancji, dostęp, monitorowanie i dokumentację. Najczęściej stosowany jest chick CAM; jednak w tym artykule opisano zalety japońskiego CAM przepiórczego jako modelu o niskich kosztach i wysokiej przepustowości. Kolejną zaletą jest krótszy rozwój zarodkowy, co pozwala na większą rotację doświadczalną. Badana jest tutaj przydatność przepiórki CAM do PDD i PDT infekcji nowotworowych i bakteryjnych. Jako przykład opisano zastosowanie fotouczulacza hiperycyny w połączeniu z lipoproteinami lub nanocząstkami jako systemem dostarczania. Określono ocenę uszkodzeń od obrazów w świetle białym oraz zmiany intensywności fluorescencji tkanki CAM w świetle fioletowym (405 nm) wraz z analizą przekrojów histologicznych. Przepiórka CAM wyraźnie wykazała wpływ PDT na układ naczyniowy i tkanki. Ponadto można było zaobserwować zmiany, takie jak krwotok włośniczkowy, zakrzepica, liza małych naczyń i krwawienie większych naczyń. Przepiórka japońska CAM jest obiecującym modelem in vivo do diagnostyki fotodynamicznej i badań nad terapią, z zastosowaniami w badaniach angiogenezy nowotworów, a także terapii przeciwnaczyniowej i przeciwbakteryjnej.

Wprowadzenie

Model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka (CAM) jest dobrze znany i szeroko stosowany w różnych dziedzinach badań. Jest to bogato unaczyniony narząd pozaembrionalny, który zapewnia wymianę gazową i transport minerałów1. Ze względu na przezroczystość i dostępność tej błony, poszczególne naczynia krwionośne i ich zmiany strukturalne można obserwować w czasie rzeczywistym2. Pomimo zalet, CAM piskląt ma również pewne ograniczenia (np. większe obiekty hodowlane, produkcja jaj i spożycie paszy), których można by uniknąć, wykorzystując inne gatunki ptaków. W niniejszym protokole opisano alternatywny model CAM ex ovo z wykorzystaniem zarodka przepiórki japońskiej (Coturnix japonica). Ze względu na niewielkie rozmiary pozwala na wykorzystanie znacznie większej liczby osobników doświadczalnych niż CAM kurczaka. Co więcej, krótszy, 16-dniowy rozwój embrionalny zarodków przepiórczych jest kolejną zaletą. Pierwsze większe naczynia na CAM przepiórki pojawiają się w 7 dniu embrionalnym (ED). Można to bezpośrednio porównać z rozwojem zarodka pisklęcia (etapy 4-35); Jednak późniejsze etapy rozwoju nie są już porównywalne i wymagają mniej czasu dla zarodka przepiórki3. Interesujące jest regularne występowanie rozgałęzień mikronaczyniowych podobnych do tych u kurczaków CAMs4,5,6. Szybkie dojrzewanie płciowe, wysoka produkcja jaj i tania hodowla to inne przykłady, które przemawiają za użyciem tego eksperymentalnego modelu7.

Model CAM ptaków jest często używany w badaniach nad terapią fotodynamiczną (PDT)8. PDT jest stosowana w leczeniu kilku postaci raka (małe zlokalizowane guzy) i innych chorób nieonkologicznych. Jego zasada polega na dostarczeniu leku fluorescencyjnego, fotouczulacza (PS), do uszkodzonej tkanki i jego aktywacji światłem o odpowiedniej długości fali. Jednym z potencjalnych PS wykorzystywanych w badaniach jest hiperycyna, pierwotnie wyizolowana z rośliny leczniczej zwyczajnego (Hypericum perforatum)9. Silne działanie fotouczulające tego związku opiera się na jego właściwościach fotochemicznych i fotofizycznych. Charakteryzują się one wielokrotnymi pikami wzbudzenia fluorescencji w zakresie 400-600 nm, które indukują emisję fluorescencji przy około 600 nm. Maksima absorpcji hiperycyny w paśmie widmowym mieszczą się w zakresie 540-590 nm, a maksima fluorescencji mieszczą się w zakresie 590-640 nm9. Aby osiągnąć te fotouczulające efekty, hiperycyna jest wzbudzana światłem laserowym o długości fali 405 nm po miejscowym podaniu10. W obecności światła hiperycyna może wykazywać działanie wirusobójcze, antyproliferacyjne i cytotoksyczne11, podczas gdy nie występuje toksyczność ogólnoustrojowa i jest szybko uwalniana z organizmu. Hiperycyna jest substancją lipofilową, która tworzy nierozpuszczalne w wodzie, niefluorescencyjne agregaty, dlatego kilka rodzajów nanonośników, takich jak nanocząstki polimerowe12,13 lub lipoproteiny o wysokiej i niskiej gęstości (HDL, LDL)14,15, są stosowane w celu ułatwienia jej dostarczania i przenikania do komórek. Ponieważ CAM jest systemem z naturalnym niedoborem odporności, komórki nowotworowe mogą być implantowane bezpośrednio na powierzchni błony. Model doskonale nadaje się również do rejestrowania zakresu uszkodzeń naczyń krwionośnych wywołanych przez PDT zgodnie ze zdefiniowanym wynikiem16,17. Światło o mniejszym natężeniu w porównaniu do PDT może być wykorzystywane w diagnostyce fotodynamicznej (PDD). Monitorowanie tkanki pod wpływem fioletowego światła LED wzbudzonego światłem LED prowadzi również do fotoaktywacji fotouczulaczy18,19,20, co powoduje emisję światła fluorescencyjnego, ale nie dostarcza wystarczającej ilości energii, aby rozpocząć reakcję PDT i uszkodzić komórki. To sprawia, że jest to dobre narzędzie do wizualizacji i diagnozowania guza lub monitorowania farmakokinetyki używanych PSS14,15.

Ten artykuł opisuje przygotowanie testu CAM ex ovo przepiórek z przeżywalnością powyżej 80%. Ta hodowla ex ovo została z powodzeniem zastosowana w wielu eksperymentach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Cały sprzęt i odczynniki muszą zostać poddane autoklawowaniu lub sterylizacji 70% etanolem lub światłem UV.

1. Inkubacja jaj

  1. Zapłodnione jaja przepiórcze przechowywać w temperaturze 10-15 °C przez maksymalnie 4-5 dni przed rozpoczęciem inkubacji. Należy używać wyłącznie czystych i nieuszkodzonych jaj.
  2. Inkubować jaja w inkubatorze z wymuszonym obiegiem powietrza przez ~ 53-54 h. Jaja należy ułożyć poziomo przy wyłączonej rotacji, w wilgotności 50%-60% i temperaturze inkubacji 37.5 °C.

2. Przygotowanie hodowli ex ovo

UWAGA: Po wstępnej inkubacji jaja nadają się do rozpoczęcia hodowli ex ovo.

  1. Zdezynfekuj powierzchnię jaja 70% etanolem, nie obracając jaja.
  2. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza otwórz skorupkę jaja za pomocą małych sterylnych nożyc chirurgicznych i przenieś zawartość do 6-dołkowej płytki hodowlanej. Przy prawidłowym wykonaniu zarodek będzie spoczywać na nieuszkodzonym żółtku. Po każdym jaju zdezynfekuj nożyce 70% etanolem.
  3. Dodaj około 5 mL sterylnej wody do wolnych przestrzeni w płytce 6-dołkowej, ponieważ wilgotność jest niezbędna, aby zapobiec wysychaniu CAM.
  4. Umieść zarodki w inkubatorze do czasu dalszych eksperymentów, utrzymując temperaturę 37 °C oraz wilgotność 80%-90%.
  5. Gdy CAM będzie w pełni rozwinięta (od ED7), umieść sterylizowany pierścień silikonowy (o średnicy 6 mm i grubości około 1,5 mm) na powierzchni CAM, wzdłuż małych naczyń włosowatego. Podczas umieszczania pierścienia unikaj głównych naczyń krwionośnych.
    UWAGA: Pierścień wyznacza obszar roboczy, pomaga zaznaczyć miejsce aplikacji substancji i zapobiega wyciekaniu płynnej zawartości.
  6. Zakończ hodowlę zarodków zgodnie z obowiązującym prawodawstwem krajowym.
  7. Ważne jest, aby podczas pracy używać rękawiczek lub utrzymywać dłonie zdezynfekowane 70% etanolem. Zarodki nieprawidłowo ułożone lub jaja niezapłodnione usuń za pomocą aspiratora próżniowego.

Eksperyment z wylęganiem jaj przekrzątek; rękawice podczas obsługi jaj, zestaw inkubacyjny, stadia rozwoju zarodkowego.
Rysunek 1: Przygotowanie hodowli ex ovo. (A) Jaja przekrzątek japońskich podczas przechowywania i inkubacji. (B) Dezynfekcja powierzchni jaj etanolem. (C) Wycięcie skorupy jaja nożyczkami. (D) Przelanie zawartości jaja do dołka. (E) Prawidłowo przygotowany 3-dniowy embrion z rozwijającym się układem naczyniowym błony chalazowej (CAM). (F) Płytki hodowlane przechowywane w inkubatorze. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Eksperyment z hodowlą komórkową; rozwój zarodka; układ płytki 6-dołkowej; badanie angiogenezy; analiza laboratoryjna.
Rysunek 2: Płytka hodowlana 6-dołkowa z zarodkami i umieszczonymi na górze pierścieniami silikonowymi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Inokulacja komórek nowotworowych

UWAGA: Wszystkie procedury wymagają użycia sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza.

  1. Hodować różne typy komórek adherentnych w kolbach zgodnie z odpowiednimi protokołami hodowli.
    1. Usunąć starą pożywkę z kolb i wypłukać warstwę komórek sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), aby usunąć pozostałości pożywki.
    2. Po trypsynizacji zahamować działanie trypsyny poprzez dodanie pożywki hodowlanej i zebrać komórki do probówek wirówkowych. Odwiruj komórki i resuspendować osad komórkowy w świeżej pożywce hodowlanej. Policzyć komórki i resuspendować je w pożywce do hodowli komórkowej w pożądanym stężeniu.
      UWAGA: Możliwe jest również wytworzenie trójwymiarowych hodowli komórkowych, tj. sferoidów, stosując na przykład metodę kropli wiszącej21.
  2. Zaimplantować 1 x 105-1 x 106 komórek nowotworowych lub 5-15 sferoidów (na jedną błonę CAM) w 30 µL roztworu pożywki komórkowej do pierścienia silikonowego umieszczonego na błonie CAM.
    UWAGA: Objętość zależy od rozmiaru użytego pierścienia silikonowego. W przypadku zastosowania pierścienia o większej średnicy wymagana jest większa objętość, aby pokryć cały obszar. W zależności od typu komórek lub rodzaju eksperymentu można stosować różne stężenia komórek. Czasami stosuje się delikatne zdrapywanie błony CAM, aby poprawić adhezję wszczepionych komórek.
  3. Przenieść błony CAM z zaszczepionymi komórkami z powrotem do inkubatora (37 °C i 80%-90% wilgotności).

Przygotowanie hodowli komórkowej, pipetowanie roztworów do studzienek w eksperymentach tkankowych, proces laboratoryjny.
Rysunek 3: Inokulacja CAM guzami. (A) Aspiracja sferoidów pipetą oraz (B) implantacja na powierzchni CAM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Aplikacja fotouczulacza

  1. Aplikacja hyperycyny
    1. Przy słabym oświetleniu przygotować roztwór stokowy hyperycyny o stężeniu 2 mM, rozpuszczając ją w 100% dimetylosulfoksydzie (DMSO). Krótko przed eksperymentem przygotować roztwór roboczy hyperycyny o stężeniu 79 µM w sterylnym PBS lub roztworze soli fizjologicznej. Należy upewnić się, że końcowe stężenie DMSO we wszystkich roztworach nie przekracza 0,2%, co nie wpływa na rozwój zarodka.
    2. W warunkach sterylnych nanieść odpowiednią objętość roztworu hyperycyny do pierścienia silikonowego. Objętość 30 µL jest wystarczająca do wypełnienia pierścienia o średnicy 6 mm.
    3. Przechowywać zarodki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i wilgotności 80%-90%. Hyperycyna w roztworze wodnym staje się fotoaktywna po monomeryzacji w tkance, około 3 h po aplikacji na CAM.
  2. Aplikacja hyperycyny z wykorzystaniem LDL, HDL lub nanocząsteczek jako systemów transportowych
    UWAGA: Te systemy transportowe są stosowane w celu poprawy penetracji hyperycyny do wnętrza komórek i struktur komórkowych.
    1. Ze względu na światłoczułość wszystkie etapy, w tym przygotowanie roztworów, należy przeprowadzać przy słabym oświetleniu, a roztwory przechowywać w ciemności.
    2. Przygotować formulacje hyperycyna-LDL oraz hyperycyna-HDL poprzez zmieszanie odpowiednich objętości lipoprotein i roztworów stokowych hyperycyny w PBS zgodnie z referencją15. Stosunek stężeń LDL lub HDL do hyperycyny wynosi 20:115.
    3. Zsyntetyzować polimerowe nanocząsteczki metodą żyjącej kationowej polimeryzacji z otwarciem pierścienia zgodnie z referencjami12,13. Dostosować stężenie hyperycyny w polimerowych nanocząsteczkach za pomocą PBS do poziomu 10 μM12,13.

5. PDD i PDT

  1. Przeprowadzenie PDD
    1. W warunkach sterylnych nanieść fotouczulacz (hiperycynę, polimerowe nanocząstki załadowane hiperycyną lub hiperycynę z nośnikiem lipoproteinowym) na powierzchnię CAM, z komórkami nowotworowymi (ED 7-9) lub bez nich.
    2. Naświetlać CAM fioletowym światłem wzbudzenia (specjalnie wykonana kolista lampa LED o długości fali 405 nm) i rejestrować fluorescencję hiperycyny w tkance CAM oraz w komórkach nowotworowych za pomocą kamery cyfrowej w odstępach czasu 0, 1, 3, 5, 24 i 48 h po podaniu hiperycyny.
    3. Jeśli badanie wymaga obrazu CAM w białym świetle, zarejestrować CAM przed podaniem hiperycyny oraz na koniec eksperymentu, krótko przed utrwaleniem tkanki, ponieważ światło wpływa na fotoaktywację hiperycyny.
    4. Ocenić intensywność fluorescencji za pomocą programu do przetwarzania i analizy obrazu (np. ImageJ22).
      1. Rozdzielić kanały obrazu RGB na oddzielne obrazy czerwony, zielony i niebieski. Analizować obraz intensywności czerwieni w formie 8-bitowej. Ocenić intensywność czerwieni z obszaru wewnątrz pierścienia i przyjąć ją jako fluorescencję hiperycyny. Uzyskać wykresy profilu całego obrazu (używając wtyczki Profile Plot w programie ImageJ) w różnych odstępach czasu po podaniu hiperycyny (tj. od 0 h, bezpośrednio po podaniu, do 48 h).
  2. Przeprowadzenie PDT
    1. Wykonać PDT co najmniej 3 h po zastosowaniu hiperycyny.
    2. Umieścić światłowód nad powierzchnią CAM tak, aby promień lasera obejmował cały obszar wewnątrz silikonowego pierścienia.
    3. Przeprowadzić naświetlanie in vivo (1-2 min) światłem laserowym o długości fali 405 nm przy gęstości mocy 285 mW/cm2.
    4. Zarejestrować CAM przy użyciu białego światła i światła fluorescencyjnego 405 nm przed i po terapii fotodynamicznej (24 h i 48 h).
    5. Wykryć uszkodzenia fotochemiczne 24 h i 48 h po PDT na podstawie obrazów wykonanych w białym świetle. Ocenić uszkodzenia naczyniowe za pomocą półilościowej oceny16: 1 - brak zniszczeń; 2 - częściowe zamknięcie kapilar (średnica ≤10 µm) bez zniszczenia naczyń średnich lub większych (średnica ≥50 µm) oraz mniejszych naczyń (średnica 10-50 µm); 3 - częściowe zamknięcie mniejszych naczyń wraz z zanikiem kapilar; 4 - częściowe zamknięcie większych naczyń wraz z zanikiem mniejszych naczyń i kapilar; oraz 5 - całkowita fototromboza z zanikiem większości naczyń.

Ustawienie eksperymentu hodowli komórkowej z inkubatorem i cyfrową kontrolą temperatury do analizy badań biologicznych.
Rysunek 4: Naświetlanie CAM światłem laserowym. Zdjęcie wykonano w celach ilustracyjnych. W przypadku PDD lub PDT pomieszczenie musi być zaciemnione. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

6. Przygotowanie CAM do dalszej oceny

  1. Zatapianie w parafinie
    1. Utrwal tkankę CAM w płytce hodowlanej w 4% paraformaldehydzie (PFA) w PBS przez minimum 2 h i maksymalnie przez noc.
    2. Usunąć PFA i ostrożnie wyciąć z CAM fragment tkanki znajdujący się w obrębie pierścienia silikonowego.
    3. Bezzwłocznie odwodnić tkankę CAM w rosnących stężeniach alkoholi w następujący sposób: umieścić tkankę CAM w 70% etanolu przez 3 min, w roztworze eozyny przez 2 min (dla łatwiejszej lokalizacji tkanki w bloku parafiny), w 96% etanolu 3 x 5 min (zawsze w nowej płytce Petriego), w 100% etanolu przez 5 min oraz w ksylenie 2 x 10 min.
    4. Za pomocą szpatułki lub cienkiego pędzla jak najszybciej przenieść próbki do roztopionej parafiny w płytkach Petriego (59 °C). Po 24 h umieścić tkankę w formie histologicznej, wypełnić ją medium do zatapiania w parafinie i pozwolić jej zastygnać w lodówce. Wyciąć zastygniętą tkankę CAM z medium zatapiającego, obrócić ją w kasecie o 90°, ponownie wypełnić medium zatapiającym i pozostawić do zastygnięcia.
    5. Przygotować skrawki o grubości 5-10 µm na mikrotomie do analizy histopatologicznej w celu oceny uszkodzeń indukowanych przez PDT.
  2. Przygotowanie zamrożonych skrawków CAM do histologii
    UWAGA: W przypadku niektórych metodologii, w tym histologii, bardziej odpowiednie są skrawki mrożone przygotowane na mikrotomie kriostatu. W celu przygotowania zamrożonych skrawków CAM należy postępować zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Ostrożnie zamocować natywną lub utrwaloną w 4% paraformaldehydzie błonę CAM na szkiełku przedmiotowym.
    2. Wypełnić formę do zatapiania do połowy związku OCT (optimal cutting temperature compound) i zamrozić w ciekłym azocie lub mieszaninie suchego lodu i etanolu.
    3. Po zamrożeniu ostrożnie przechylić i zsunąć CAM ze szkiełka przedmiotowego na powierzchnię zamrożonego medium OCT. Ponownie umieścić w formie, przykryć medium OCT i zamrozić zgodnie z krokiem 6.2.2.
  3. Analiza fraktalna CAM przepiórnika
    UWAGA: Zmiany w układzie naczyniowym wywołane przez PDT można ocenić poprzez obliczenie współczynnika wymiaru fraktalnego19.
    1. W komorze z laminarnym przepływem powietrza zalać CAM w płytce hodowlanej uprzednio podgrzanym (37 °C) roztworem utrwalającym składającym się z 4% paraformaldehydu i 2% glutaraldehydu w PBS.
    2. Usunąć roztwór utrwalający po 48 h. Ostrożnie oddzielić CAM od zarodka za pomocą mikronoareczek i cienkiego pędzla, a następnie przemyć w PBS.
    3. Zamocować przemyty CAM na szkiełku przedmiotowym i pozwolić mu powoli wyschnąć.
    4. Wykonać zdjęcie szkiełka za pomocą aparatu cyfrowego, używając transiluminatora jako źródła jednorodnego białego światła.
    5. Przetworzyć obrazy cyfrowe w oprogramowaniu ImageJ22. Do analizy wybrać kwadratowy obszar (512 × 512 pikseli) z regionu z dystalnymi gałęziami tętniczymi. Binaryzować i zszkieletować obrazy, a następnie obliczyć współczynnik wymiaru fraktalnego (Df) zgodnie z procedurami opisanymi w referencji31.
  4. Analiza molekularna tkanki CAM
    1. Do analizy molekularnej ostrożnie oddzielić natywny CAM, zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    2. Określić ekspresję genów zgodnie ze standardowymi protokołami izolacji RNA23, odwrotnej transkrypcji do cDNA oraz ilościowego PCR24.

Schemat układu naczyniowego rośliny przedstawiający złożone użyłkowienie liści do badań biologicznych.
Rysunek 5: Tkanka CAM do analizy fraktalnej. Po PDT tkanka CAM zostaje utrwalona, umieszczona na szkiełku i wysuszona w celu przeprowadzenia analizy fraktalnej. Zdjęcie wykonano w świetle białym przy użyciu transiluminatora. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Lokalizacja guza na powierzchni CAM jest trudna do ustalenia w świetle białym. Oczekuje się, że fotosensybilizator (w tym przypadku hyperycyna) stosowany w PDD zostanie selektywnie pobrany przez guza, co pomaga w jego wizualizacji. Dodanie hyperycyny i zastosowanie światła fluorescencyjnego (np. 405 nm) pozwoliło bardzo dokładnie zobrazować położenie guza (brodawczaka TE1) (Rycyna 6A). Analiza histologiczna wykazała obecność żywotnych komórek nowotworowych naciekających zdrowe tkanki. Widocz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby udała się uprawa ex ovo , ważne jest, aby postępować zgodnie z powyższym protokołem. Co więcej, jeśli jaja nie zostaną wystarczająco ostrożnie otwarte lub podczas uprawy nie ma wystarczającej wilgotności, worek żółtkowy przykleja się do skorupki i często pęka. Rozpoczęcie hodowli ex ovo w czasie około 60 godzin inkubacji jaj zapewnia wysoką przeżywalność zarodków, ponieważ są one już wystarczająco duże, aby przetrwać obchodzenie się z nimi. W późniejszych stadiach rozwojowych CAM staje się cieńszy i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Praca była wspierana przez VEGA 2/0042/21 i APVV 20-0129. Wkład V. Huntošovej jest wynikiem realizacji projektu: Otwarta społeczność naukowa na rzecz nowoczesnych interdyscyplinarnych badań w medycynie (akronim: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 wspieranego przez Program Operacyjny Zintegrowana Infrastruktura, finansowanego ze środków EFRR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowychSarstedt83.392Przezroczysty polistyren, sterylny
CO2 Inkubator ESCO CCL-0508ESCO, SingapurCCL-050B-8CO2 inkubator do hodowli komórkowych
cryocut Leica CM 1800Reichert-Jung, Stany Zjednoczone
aparat cyfrowy Canon EOS 6D IICanon, Japonia
laser diodowy 405 nmOcean Optics, USA
DMSOSigma-Aldrich67-68-5dimetylosulfoksydek
eozynaSigma-Aldrich15086-94-9
etanolSigma-Aldrich64-17-5
cienka szczotka rozmiar 2Szczotka 281802 Faber-Castelldo separacji i manipulacji CAM
aldehydglutarowySigma-Aldrich111-30-8
hematoksylinaSigma-Aldrich517-28-2
hiperycynaSigma-Aldrich84082-80-4
inkubator Bios MidiBios Sedlfigure-materials-1any, RepublikaInkubator z wymuszonym ciągiem do inkubatora do inkubacji wstępnej
Memmert IF160Memmert, NiemcyInkubator z wymuszonym obiegiem powietrza do inkubacji CAM
Kaiser slimlite plano, kaseton świetlny LEDKaiser, Niemcy2453Światło transiluminatora
LED 405 nmwykonany na zamówienie okrągły
obiektyw makro LED Canon MP- E 65 mm f/ 2.8Canon, Japonia
mikroskop Kapa 2000Kvant, Słowacjaoptyczny
mikrotom Auxilab 508Auxilab, Hiszpaniaręczny rotacyjny
mikrotom paraformaldehydSigma-Aldrich30525-89-4
Paraplast PlusSigma-AldrichP3683pożywka parafinowa do zatapiania tkanek
PBSSigma-AldrichP4417Nożyczki buforowe do soli fosforanowej
CastroviejoOrimed  OR66-108mikronożyczki do oprogramowania do separacji CAM
ImageJ 1.53program do przetwarzania i analizy obrazóww domenie
podstawowy HDLSigma-Aldrich437641-10MGlipoprotein o wysokiej gęstości
LDLSigma-Aldrich437644-10MGlipoproteiny o niskiej gęstości
Tissue-Tek OCT ZwiązekSakura Finetek4583Butelki do wyciskania o optymalnej temperaturze cięcia 118 ml
Czeska mikroskop publicznej roztwór roztwór podstawowy

Bibliografia

  1. Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
  2. van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation. Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).
  3. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3(2010).
  4. De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).
  5. Sandau, K., Kurz, H. Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis. Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).
  6. Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marmé, D., Christ, B. Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application. Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).
  7. Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model. Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).
  8. Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).
  9. Miškovský, P. Hypericin - a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules. Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).
  10. Čavarga, I., et al. Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model. Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).
  11. Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro. Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).
  12. Datta, S., et al. Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery. Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).
  13. Huntošová, V., et al. Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin. Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).
  14. Buríková, M., et al. Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery. General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).
  15. Lenkavska, L., et al. Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).
  16. Rück, A., Böhmler, A., Steiner, R. PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).
  17. Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).
  18. Buzzá, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).
  19. Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. Journal of the National Cancer Institute. 90, 889-905 (1998).
  20. Xiang, L., et al. Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).
  21. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720(2011).
  22. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  23. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  24. Máčajová, M., Čavarga, I., Sýkorová, M., Valachovič, M., Novotná, V., Bilčík, B. Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model. Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).
  25. Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials. ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).
  26. Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).
  27. Merlos Rodrigo, M. A., et al. Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells. Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).
  28. Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica). Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).
  29. Kohli, N., et al. Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).
  30. Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications. Biology-Basel. 10 (4), 301(2021).
  31. Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).
  32. Buzzá, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., Gómez-García, P. B., Kurachi, C. Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Terapia fotodynamicznahodowla ex ovoangiogeneza nowotworowahiperycyna jako fotouczulaczsystemy dostarczania lekówanaliza histologicznaunaczynienie błony żółtkowej (CAM)terapia przeciwdrobnoustrojowa
Przepiórcza błona chorioallantoiczna - narzędzie do diagnostyki i terapii fotodynamicznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.