Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie mikrotomografii komputerowej do analizy interakcji pasożytniczych między rośliną a żywicielem

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63423

⸱

12 stycznia 2022

1Harvard University Herbaria, 2Hanse-Wissenschaftskolleg

W tym artykule

Podsumowanie

Micro-CT to nieniszczące narzędzie, które może analizować struktury roślin w trzech wymiarach. Niniejszy protokół opisuje przygotowanie próbki w celu wykorzystania mikro-CT do analizy struktury i funkcji roślin pasożytniczych. Aby podkreślić zalety tej metody w połączeniu z określonymi preparatami, stosuje się różne gatunki.

Streszczenie

Skanowanie mikro-tomografem komputerowym stało się uznanym narzędziem do badania struktury i funkcji roślin. Jego nieniszczący charakter, w połączeniu z możliwością trójwymiarowej wizualizacji i wirtualnego przekroju, pozwolił na nowatorską i coraz bardziej szczegółową analizę złożonych organów roślinnych. Można również badać interakcje między roślinami, w tym między roślinami pasożytniczymi a ich żywicielami. Jednak przygotowanie próbki przed skanowaniem staje się kluczowe ze względu na interakcję między tymi roślinami, które często różnią się organizacją i składem tkanek. Ponadto podczas pobierania próbek, leczenia i przygotowywania materiału pasożytniczego-żywiciela należy wziąć pod uwagę szeroką różnorodność pasożytniczych roślin kwitnących, począwszy od wysoce zredukowanych ciał wegetatywnych, a skończywszy na drzewach, ziołach i krzewach. Opisano tutaj dwa różne podejścia do wprowadzania roztworów kontrastowych do pasożyta i/lub roślin żywicielskich, koncentrując się na analizie haustorium. Ten narząd wspomaga połączenie i komunikację między dwiema roślinami. Stosując proste podejście, szczegóły organizacji tkanek haustorium można badać trójwymiarowo, jak pokazano tutaj dla gatunków pasożytniczych eufitoidów, winorośli i jemioły. Wybór konkretnych środków kontrastujących i podejść do aplikacji pozwala również na szczegółową obserwację rozprzestrzeniania się endopasożyta w organizmie żywiciela i wykrycie bezpośredniego połączenia między naczyniem a żywicielem, jak pokazano tutaj dla obligatoryjnego pasożyta korzeniowego. W ten sposób omawiany tutaj protokół może być zastosowany do szerokiej gamy pasożytniczych roślin kwitnących, aby pogłębić zrozumienie ich rozwoju, struktury i funkcjonowania.

Wprowadzenie

Wysokorozdzielcza rentgenowska mikrotomografia komputerowa (micro-CT) to metoda obrazowania, w której rejestruje się wiele radiogramów (projekcji) próbki pod różnymi kątami widzenia, a następnie wykorzystuje się je do stworzenia wirtualnej rekonstrukcji obiektu1. Taki wirtualny obiekt może być następnie analizowany, modyfikowany i segmentowany, co umożliwia nieniszczącą eksplorację w trzech wymiarach2. Początkowo zaprojektowana do analiz medycznych, a później do zastosowań przemysłowych, micro-CT oferuje również możliwość wizualizacji organów wewnętrznych i tkanek bez konieczności przeprowadzania inwazyjnych procedur3. Podobnie jak inne formy obrazowania, micro-CT wiąże się z kompromisem między polem widzenia a rozmiarem piksela, co oznacza, że obrazowanie dużych próbek w wysokiej rozdzielczości jest niemal nieosiągalne4. Stale postępuje rozwój w wykorzystaniu wysokoenergetycznych źródeł promieni rentgenowskich (np. synchrotronów) oraz wtórnego powiększenia optycznego, co pozwala na osiągnięcie rozdzielczości poniżej 100 nm5,6. Niemniej jednak, w przypadku dużych próbek niezbędny jest dłuższy czas skanowania, co zwiększa ryzyko wystąpienia artefaktów wynikających z ruchu lub deformacji próbki wewnątrz skanera. Ponadto micro-CT jest zazwyczaj ograniczona naturalnymi różnicami gęstości w obrębie próbki oraz sposobem, w jaki próbka oddziałuje z promieniami X. Choć wyższa dawka promieniowania rentgenowskiego jest najskuteczniejsza w penetracji gęstszych próbek, jest ona mniej efektywna w rejestrowaniu różnic gęstości wewnątrz próbki oraz pomiędzy próbką a otaczającym ją medium7. Z drugiej strony, niższa dawka promieniowania X zapewnia mniejszą zdolność penetracji i często wymaga dłuższego czasu skanowania, ale oferuje większą czułość w detekcji gęstości7.

Ograniczenia te od dawna utrudniały wykorzystanie mikrotomografii w naukach o roślinach, biorąc pod uwagę, że większość tkanek roślinnych składa się z tkanek lekkich (mało gęstych) o niskiej absorpcji promieni Rentgena8. Pierwsze zastosowania mikro-CT koncentrowały się na mapowaniu sieci korzeniowych w matrycy glebowej9,10. Później zaczęto badać struktury roślinne o bardziej znaczących różnicach w gęstości tkanek, takie jak drewno. Pozwoliło to na badanie funkcjonalności ksylemu11,12, rozwoju złożonych organizacji tkankowych13,14 oraz interakcji między roślinami15,16,17. Analiza tkanek miękkich i jednorodnych staje się powszechna dzięki środkom kontrastowym, których stosowanie jest obecnie standardową procedurą w przygotowaniu próbek roślinnych do skanowania mikro-CT. Jednak protokoły wprowadzania kontrastu mogą dawać różne wyniki w zależności od objętości próbki, właściwości strukturalnych oraz rodzaju zastosowanego roztworu8. Idealnie środek kontrastowy powinien wzmacniać rozróżnialność między różnymi tkankami, umożliwiać ocenę funkcjonalności tkanek/organów i/lub dostarczać informacji biochemicznych o tkance18. Dlatego odpowiednia obróbka, przygotowanie i montaż próbki przed skanowaniem stają się kluczowe dla każdej analizy mikro-CT.

Mikro-CT haustorium rośliny pasożytniczej
Pasożytnicze rośliny kwiatowe stanowią odrębną funkcjonalną grupę okrytonasiennych, charakteryzującą się obecnością organu zwanego haustorium19. Ten wielokomórkowy organ, będący rozwojowym hybrydą zmodyfikowanej łodygi i korzenia, odpowiada za przytwierdzenie, penetrację oraz kontakt pasożyta z gospodarzem20. Z tego powodu uważa się, że haustorium „ucieleśnia samą ideę pasożytnictwa wśród roślin”21. Szczegółowe zrozumienie rozwoju, struktury i funkcjonowania tego organu jest kluczowe dla badań nad ekologią, ewolucją i zwalczaniem roślin pasożytniczych. Niemniej jednak, ogólna złożoność i silnie zmodyfikowana struktura roślin pasożytniczych oraz ich haustoriów często utrudniają szczegółową analizę i porównania. Połączenia haustorialne są zazwyczaj rozległe i niejednorodne pod względem rozmieszczenia tkanek i komórek (Rycina 1). W tym kontekście, choć praca z małymi fragmentami tkanek umożliwia łatwiejszą manipulację i uzyskanie wyższej rozdzielczości, może ona prowadzić do błędnych wniosków na temat trójwymiarowej architektury złożonych struktur, takich jak haustorium rośliny pasożytniczej.

Mimo obszernej literatury dotyczącej anatomii i ultrastruktury haustoriów u większości gatunków roślin pasożytniczych, organizacja trójwymiarowa oraz przestrzenne relacje między tkankami pasożyta i gospodarza pozostają słabo zbadane17. W niedawnej pracy Masumoto i wsp.22 wykonano obrazy ponad 300 seryjnych półcienkich przekrojów mikrotomicznych, które zrekonstruowano w trójwymiarowy wirtualny obiekt reprezentujący haustoria dwóch gatunków pasożytów. Doskonały poziom szczegółowości tej metody zapewnia bezprecedensowy wgląd w komórkową i anatomiczną strukturę 3D haustorium. Jednak tak czasochłonna technika uniemożliwiłaby podobną analizę u pasożytów o bardziej rozbudowanych połączeniach haustorialnych. Wykorzystanie mikro-CT jawi się jako doskonałe narzędzie do trójwymiarowej analizy złożonych i często masywnych haustoriów roślin pasożytniczych. Choć nie zastępuje ono szczegółowego cięcia anatomicznego i innych komplementarnych form analiz mikroskopowych17,23, wyniki uzyskane via skanowanie mikro-CT, zwłaszcza w przypadku dużych próbek, mogą służyć jako wskazówka do pobierania podpróbek mniejszych segmentów, które mogą być następnie analizowane za pomocą innych narzędzi, takich jak mikroskopia konfokalna i elektronowa, lub ponownie analizowane przy użyciu systemów mikro-CT o wysokiej rozdzielczości.

Proces pasożytnictwa roślin; schemat przedstawiający relacje gospodarz-symbiont; badanie oddziaływań botanicznych.
Rysunek 1: Rośliny pasożytnicze z różnych grup funkcjonalnych wykorzystane w niniejszym protokole. Pasożyt eufytoidny Pyrularia pubera (A), endopasożyt Viscum minimum (B) z zielonymi owocami (czarne przerywane koło), pnącze pasożytnicze Cuscuta americana (C), jemioła Struthanthus martianus (D), obligatoryjny pasożyt korzeni Scybalium fungiforme (E). Odcinki korzenia gospodarza (Hr) lub łodygi gospodarza (Hs) ułatwiają podanie kontrastu do haustorium pasożyta (P). Obecność korzenia/łodygi macierzystej pasożyta (strzałki) w próbce umożliwia analizę organizacji naczyń haustorium. Prostokąty wskazują segmenty próbki wykorzystane do analizy. Paski skali = 2 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

W miarę jak mikro-CT staje się coraz popularniejszą techniką w naukach o roślinach, powstaje coraz więcej przewodników, protokołów i literatury dotyczącej skanowania próbek, rekonstrukcji trójwymiarowej, segmentacji i analizy3,10,24. W związku z tym etapy te nie będą tutaj omawiane. Podobnie jak w przypadku każdej techniki obrazowania, odpowiednia obróbka i montaż próbek stanowią fundamentalną, choć często pomijaną procedurę. Z tego powodu niniejszy protokół koncentruje się na przygotowaniu próbek haustoriów do skanowania mikro-CT. Bardziej szczegółowo, protokół ten opisuje dwa podejścia do wprowadzania środków kontrastowych do próbek haustoriów w celu poprawy wizualizacji różnych tkanek i typów komórek w haustorium, ułatwienia wykrywania tkanki pasożytniczej wewnątrz korzenia/łodygi gospodarza oraz analizy trójwymiarowych połączeń naczyniowych między pasożytem a gospodarzem. Opisane tutaj metody przygotowania mogą zostać zaadaptowane również do analizy innych struktur roślinnych.

W celu lepszego zilustrowania wygody opisanego tutaj protokołu wykorzystano pięć gatunków. Każdy gatunek reprezentuje jedną z pięciu grup funkcjonalnych pasożytniczych roślin kwiatowych, co pozwala odnieść się do specyficznych kwestii związanych z funkcjonalnością każdej z grup. Pyrularia pubera (Santalaceae) została wybrana do reprezentowania pasożytów eufitoidalnych, które kiełkują w glebie i tworzą liczne haustoria łączące pasożyta z korzeniami roślin żywicieli25. Haustoria tworzone przez te rośliny są często wiotkie i łatwo odrywają się od żywiciela26 (Rysunek 1A), co wymaga bardziej delikatnego procesu manipulacji. Endopasożyty są tutaj reprezentowane przez Viscum minimum (Viscaceae). Gatunki z tej grupy funkcjonalnej są widoczne poza ciałem swoich żywicieli tylko przez krótkie okresy (Rysunek 1B) i przez większość cykli życiowych bytują jako znacznie zredukowane, przypominające grzybnię pasma komórek zatopione w tkankach żywiciela25. Trzecia grupa funkcjonalna obejmuje pnącza pasożytnicze, które kiełkują w glebie, lecz tworzą jedynie rudymentarne korzenie, polegając na licznych haustoriach przyczepiających się do łodyg roślin żywicieli25 (Rysunek 1C). W tym przypadku grupę funkcjonalną tę reprezentuje Cuscuta americana (Convolvulaceae). W przeciwieństwie do pnączy pasożytniczych, jemioły kiełkują bezpośrednio na gałęziach swoich roślin żywicieli i rozwijają albo liczne, albo pojedyncze haustoria25. Gatunkiem wybranym do zilustrowania tej grupy funkcjonalnej jest Struthanthus martianus (Loranthaceae), który tworzy różne połączenia z gałęzią żywiciela (Rysunek 1D). Analizę pojedynczych haustoriów jemioły z wykorzystaniem kombinacji mikro-CT i mikroskopii świetlnej można znaleźć w pracy Teixeira-Costa & Ceccantini17. Na koniec, obligatoryjne pasożyty korzeniowe obejmują gatunki, które kiełkują w glebie i wnikają w korzenie roślin żywicieli, od których są całkowicie zależne od najwcześniejszych etapów wzrostu25. Rośliny te są tutaj reprezentowane przez Scybalium fungiforme (Balanophoraceae), które wytwarzają duże, przypominające bulwy haustoria (Rysunek 1E).

Wszystkie próbki roślin wykorzystane w tym protokole utrwalono w 70% roztworze formaliny, kwasu octowego i alkoholu (FAA 70). Utrwalenie podczas pobierania próbek jest kluczowe dla zachowania tkanek roślinnych, szczególnie jeśli wymagane są późniejsze analizy anatomiczne. W przypadku haustoriów roślin pasożytniczych utrwalenie jest również niezbędne, ponieważ organ ten składa się często głównie z niezdrewniałych komórek miąższowych20. Szczegółowe protokoły utrwalania tkanek roślinnych, w tym przygotowanie roztworów utrwalających, można znaleźć w innych źródłach27. Z drugiej strony, w różnym stopniu utrwalacze mogą powodować zmiany właściwości fizycznych i chemicznych próbki, czyniąc ją nieprzydatną do specyficznych analiz biomechanicznych i histochemicznych. W związku z tym w tym protokole można stosować również próbki świeże, tj. materiał nieutrwalony, pobrany bezpośrednio przed przygotowaniem. Szczegółowe informacje na temat postępowania z próbkami świeżymi oraz sugestie dotyczące rozwiązywania problemów z materiałem utrwalonym znajdują się w sekcji dyskusji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wybór próbek roślin pasożytniczych

  1. Pobrać całe haustorium rośliny pasożytniczej, wraz z przytwierdzoną łodygą/korzeniem żywiciela oraz fragmentami obu końców (proksymalnego i dystalnego) pasożytowanego organu żywiciela; optymalna długość każdego fragmentu powinna być równa dwukrotności średnicy haustorium.
    UWAGA: W przypadku haustoriów bocznych należy dołączyć fragment łodygi/korzenia rośliny pasożytniczej, z którego powstało haustorium (Rycina 1A,B,D). W przypadku endopasożytów należy pobrać fragment łodygi/korzenia żywiciela, w którym widoczne są ślady pasożyta (Rycina 1B). W przypadku połączeń terminalnych należy pobrać całą roślinę (Rycina 1E).
  2. Zanurzyć całą próbkę w roztworze utrwalającym (np. FAA) w proporcji objętościowej 1:10 (próbka: utrwalacz). Pozostawić próbki w utrwalaczu na co najmniej 1 dobę, zależnie od wielkości próbki27.
    UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w utrwalaczu przed skanowaniem lub przeniesione do roztworu konserwującego (np. etanol 70%). Można również używać świeżych próbek, jeśli nie jest wymagana późniejsza analiza anatomiczna (patrz sekcja Dyskusja). Przy pracy z materiałem świeżym należy przygotować aparat do perfuzji roztworu kontrastowego, a następnie pobrać próbkę. Nie wolno dopuścić do wyschnięcia próbki.

2. Aplikacja roztworów kontrastowych

  1. Wybierz metodę aplikacji. Zastosuj metodę próżniową (krok 2.3) dla próbek małych (Rysunek 1A) lub niezdrewniałych (Rysunek 1B). Zastosuj metodę perfuzyjną dla większych próbek, pod warunkiem, że zawierają one odcinek łodygi/korzenia rośliny żywiciela (Rysunek 1A,C-E).
  2. Podczas manipulowania próbką, niezależnie od wybranej metody w kolejnych krokach, należy używać rękawic gumowych i innych odpowiednich środków ochrony indywidualnej (np. fartucha laboratoryjnego).
    UWAGA: Wszystkie roztwory kontrastowe zawierają w swoim składzie sole metali ciężkich, dlatego nie wolno z nimi pracować bez odpowiednich środków ochrony indywidualnej i poza dygestorium.
  3. W przypadku metody próżniowej wykonaj poniższe kroki.
    1. Wybierz odpowiednią fiolkę i ją opisz. Fiolka musi być wystarczająco duża, aby pomieścić próbkę i roztwór kontrastowy, zazwyczaj w proporcji 1:10. Sprawdź instrukcje producenta, aby upewnić się, że fiolka jest odporna na niskie i umiarkowane próżnie.
      UWAGA: Nie napełniaj fiolki po brzegi, ponieważ podciśnienie (próżnia) może spowodować rozlanie cieczy.
    2. Umieść próbkę w fiolce z roztworem kontrastowym (1% jod lub 3% fosfotungstan, patrz Tabela materiałów). Następnie umieść fiolkę w komorze próżniowej lub eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej. Zdejmij korek z fiolki, a następnie zamknij komorę próżniową lub eksykator.
    3. Sprawdź, czy komora próżniowa/eksykator nie posiada pęknięć oraz czy pompa próżniowa ma wystarczającą ilość oleju.
    4. Zamknij zawór odpływowy pompy, aby zapobiec ucieczce powietrza, i otwórz zawór odpływowy komory/eksykatora, aby wymusić wypchnięcie powietrza na zewnątrz.
    5. Włącz pompę i poczekaj, aż ciśnienie osiągnie około 20" Hg.
      UWAGA: Proces ten przebiega zazwyczaj szybko, dlatego nie należy pozostawiać systemu próżniowego bez nadzoru.
      UWAGA: Chociaż jednostką ciśnienia w systemie metrycznym jest paskal (Pa), manometry w większości laboratoryjnych pomp próżniowych wyświetlają ciśnienie w calach słupa rtęci ("Hg), funtach na cal kwadratowy (psi) lub barach. 20" Hg odpowiada ok. 67,7 Pa, 10 psi lub 0,7 bar.
    6. Zamknij zawór odpływowy komory/eksykatora, aby zapobiec ponownemu dostaniu się powietrza, a następnie szybko wyłącz pompę.
    7. Pozostaw próbkę pod próżnią przez co najmniej 2 h; większe próbki wymagają więcej czasu na penetrację roztworu kontrastowego.
    8. Po upływie wymaganego czasu wyjmij próbkę z roztworu kontrastowego, aby przygotować ją do skanowania.
    9. Powoli otwórz zawór odpływowy komory/eksykatora, aby dopuścić powietrze do środka.
    10. Poczekaj, aż ciśnienie w komorze/eksykatorze zostanie całkowicie wyrównane (tj. manometr wskaże wartość bliską 0), a następnie ostrożnie otwórz urządzenie, aby wyjąć próbkę.
    11. Utylizuj roztwór kontrastowy w odpowiedni sposób i zachowaj próbkę do skanowania.
  4. W przypadku metody perfuzyjnej wykonaj poniższe kroki.
    1. Wybierz zbiornik z roztworem kontrastowym odpowiednio do wielkości próbki. Użyj strzykawki 50 mL (bez igły i tłoka) dla małych próbek (Rysunek 2A) lub medycznego zestawu do infuzji dożylnej 1 L dla dużych próbek (Rysunek 2B).
    2. Podłącz jeden koniec przezroczystej rurki plastikowej (patrz Tabela materiałów) do zbiornika z roztworem, a drugi koniec do zaworu dwudrożnego lub trójdrożnego. Podłącz drugą rurkę do innego wylotu zaworu (Rysunek 2A,B).
    3. Zamocuj zbiornik z roztworem w pozycji podwyższonej, nie rozmontowując aparatury przygotowanej w poprzednim kroku.
      UWAGA: Odległość pionowa między zbiornikiem a próbką będzie determinować ciśnienie perfuzji roztworu (Rysunek 2B). Odległość 20-50 cm jest wystarczająca dla małych próbek. Dla dużych próbek bardziej odpowiednia jest odległość 1 m.
    4. Zamknij zawór trójdrożny (Rysunek 2C) lub dwudrożny (Rysunek 2D), aby zapobiec wypływowi cieczy z systemu rurek, a następnie wlej roztwór kontrastowy do zbiornika. W przypadku użycia medycznego zestawu do infuzji, napełnij worek roztworem i zamknij zawór przed zamocowaniem aparatury w pozycji podwyższonej.
    5. Upewnij się, że w systemie rurek nie powstały duże pęcherzyki powietrza (Rysunek 2E). W razie potrzeby pozwól roztworowi kontrastowemu wypłynąć z rurek, aż pęcherzyki zostaną usunięte. Ponownie zamknij zawór i pozostaw aparaturę na miejscu.
    6. Aby przygotować próbkę do perfuzji roztworem kontrastowym, utrzymuj ją zanurzoną w cieczy (wodzie, etanolu lub utrwalaczu) i odetnij koniec proksymalny łodygi/korzenia rośliny żywiciela w próbce (Rysunek 2F).
    7. Wyjmij próbkę z cieczy, w której była przechowywana, i owiń ją folią parafinową, aby zapobiec wysychaniu. Trzymaj próbkę w pobliżu, gotową do podłączenia do aparatury.
    8. Ostrożnie otwórz zawór, aby roztwór kontrastowy powoli przepływał i wypełniał plastikową rurkę podłączoną do zbiornika, trzymając otwarty koniec systemu w lekko uniesionej pozycji, aby zapobiec rozlaniu roztworu. Ponownie upewnij się, że w rurce nie powstały duże pęcherzyki powietrza.
    9. Podłącz koniec proksymalny łodygi/korzenia rośliny żywiciela w próbce do otwartego końca systemu rurek (Rysunek 2B, obszar powiększony). Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza do systemu podczas tego kroku. W razie potrzeby odłącz próbkę od aparatury i usuń pęcherzyki powietrza z systemu, pozwalając na przepływ roztworu.
    10. Trzymając próbkę podłączoną do aparatury, umieść ją w pojemniku, aby uniknąć wycieku roztworu kontrastowego do miejsca, w którym ustawiono eksperyment. Użyj rurek o różnych średnicach, plastikowych opasek zaciskowych i adapterów zaworowych (Rysunek 2G), aby zapewnić szczelność wszystkich połączeń w aparaturze, dopasowanie do gałęzi żywiciela o różnych rozmiarach oraz zapobiec wyciekowi roztworu z systemu rurek (Rysunek 2B, obszar powiększony).
    11. Pozostaw próbkę do perfuzji roztworem przez co najmniej 2 h lub do momentu, gdy roztwór zgromadzi się w pojemniku.
    12. Zamknij zawór i ostrożnie odłącz próbkę od aparatury. Zlej pozostałość roztworu do pojemnika i zutylizuj go w odpowiedni sposób.
    13. Usuń folię parafinową z próbki w ramach przygotowania do skanowania.

Schemat układu równowagi statycznej; obejmuje rurki, zawory i roślinę w badaniu transpiracji.
Rysunek 2Metoda perfuzyjna aplikacji kontrastu. Małe (A) i dużych (BWersje aparatu perfuzyjnego obejmują zbiornik zasilający (st) oraz dwie plastikowe rurki (t1 i t2) połączone zaworem (va). Proksymalny koniec łodygi gospodarza (H), do której przytwierdzony jest pasożyt (P) poprzez haustorium (ha) jest połączone z otwartym końcem układu (B, powiększenie). Trójdrożny (C) lub dwukierunkowy (DZawór służy do zapobiegania powstawaniu pęcherzyków powietrza wewnątrz układu drenów, które blokują przepływ roztworu kontrastowego (E). Koniec proksymalny łodygi gospodarza (H) należy przeciąć pod wodą, aby umożliwić przepływ roztworu kontrastowego (F). Opaski zaciskowe, adaptery zaworów oraz rurki o różnych średnicach pomagają zapewnić szczelniejsze połączenia i zapobiegają wyciekom w systemie (G). Ryciny 2B, D i F zostały przygotowane za pomocą programu BioRender. Paski skali = 2 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

3. Przygotowanie i montaż próbki

  1. Przemyć próbkę, zanurzając ją w wodzie na 2 min.
    UWAGA: Nie myć próbek w zlewie, ponieważ wszystkie roztwory kontrastujące zawierają w swoim składzie sole metali ciężkich. Wodę użytą do mycia należy traktować jako rozcieńczony roztwór kontrastujący i utylizować ją w odpowiedni sposób.
  2. Umieścić próbkę na ręczniku papierowym w temperaturze pokojowej, aby pozwolić nadmiarowi wody odparować przez 2-5 min, w zależności od wielkości próbki. Alternatywnie można lekko osuszyć próbkę za pomocą ręcznika papierowego. Nie doprowadzać do całkowitego wyschnięcia próbki.
  3. Owinąć próbkę folią parafinową, rozciągając ją do postaci cienkiej warstwy. Należy unikać składania folii parafinowej na powierzchni próbki.
  4. Zamocować owiniętą próbkę w uchwycie, zapewniając jej stabilność i stałą pozycję podczas obrotu w trakcie skanowania. Do unieruchomienia próbki można użyć taśmy klejącej, pianki o niskiej gęstości, końcówek do pipet i/lub przezroczystych plastikowych pojemników.
  5. Zeskanować próbkę i przeanalizować obrazy zgodnie ze specyficznymi protokołami i wytycznymi opracowanymi dla dostępnego systemu mikro-CT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Haustorium roślin pasożytniczych to złożony organ składający się z różnych tkanek i typów komórek, które przeplatają się i łączą z tkankami innej rośliny, pełniącej rolę żywiciela20. Skanowanie mikro-CT można wykorzystać do lepszego zrozumienia tej złożonej struktury w sposób nieniszczący i trójwymiarowy podczas analizy zarówno małych (Rycina 1A-C), jak i dużych (Rycina 1D,E) haustor...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zastosowanie roztworów metali ciężkich w celu poprawy kontrastu tkanek roślinnych stało się kluczowym krokiem w przygotowaniu próbki do analizy mikro-CT. Kilka związków powszechnie dostępnych w laboratoriach mikromorfologii roślin zostało przebadanych przez Staedlera i wsp., którzy zalecają stosowanie fosfotunglastu jako najskuteczniejszego środka w penetracji próbek i zwiększaniu wskaźnika kontrastu8. Wyniki uzyskane w analizie haustorium P. pubera potwierdzają to zalecenie. Jeśli chodzi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

Chciałbym podziękować dr Simone Gomes Ferreira (Laboratorium Mikrotomografii, Uniwersytet w Sao Paulo, Brazylia) i dr Gregowi Linowi (Center for Nanoscale Systems, Harvard University, USA) za ich ogromną pomoc i niezbędne szkolenie użytkowników dla różnych systemów mikrotomografii i oprogramowania do analizy danych. Dziękuję również pracownikom EEB Greenhouse na Uniwersytecie Connecticut (USA), szczególnie Clintonowi Morse'owi i Matthew Opelowi za dostarczenie próbek Viscum minimum. Dr John Wenzel zapewnił możliwość i wielką pomoc w pobraniu próbek Pyrularia pubera. Mgr Carolina Bastos, mgr Yasmin Hirao i Talitha Motta bardzo pomogły w pobraniu próbek grzybów Scybalium. Mgr inż. Ariadne Furtado oraz dr Fernanda Oliveira i dr Maria Aline Neves dostarczyły informacji na temat stosowania floksyny B do analizy grzybów endofitycznych. Nagrywanie filmów na Vrije Universiteit Brussel było możliwe dzięki pomocy dr Philippe'a Claeysa, dr Christophe'a Snoecka, mgr inż. Jake'a Griffitha, dr Barabary Veselki i dr Harry'ego Olde Venterinka. Finansowanie zostało zapewnione przez Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES, Brazylia) oraz Harvard University Herbaria (USA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

P. pubera
Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System mikroskopu rentgenowskiego 3D (XRM)Zeiss Versa 620służy do skanowania mikroskopu rentgenowskiego Pyrularia pubera
wersja 3.3.1Służy do analiz i pozyskiwania obrazów i filmów
Oprogramowanie DragonflyObject Research Systems -wersjaSłuży do analiz i pozyskiwania obrazów i filmów
Szklane fiolkiGlass Vials Inc. SEV2708C-FM-SPSprzedawane przez VWR - USA; Upewnij się, że fiolki są w stanie wytrzymać podciśnienie przy ciśnieniu ok. 10 psi
Inspect-XZeisswersja XT 3.1.11Służy do sterowania systemem Nikon X-Tek HMXST225
Roztwór jodu 0,0282 NWR Chemicals BDHBDH7422-1Sprzedawany przez VWR - USA
Azotan ołowiu II PA 500 gVetec361.08Sprzedawany przez SPLab
Skaner mikrotomograficznyBrukerSkyscan1176Służy do skanowania gatunków C. americana, S. martianus, oraz S. fungiforme
Skaner mikrotomograficznyNikonX-Tek HMXST225Służy do skanowania gatunków V. Oprogramowanie minimum
NReconBrukerw wersji 1.0.0Służy do rekonstrukcji trójwymiarowej
Kwas fosfowolframowy hydrat 3% w roztworze wodnymMikroskopia elektronowa Sciences101410-756Sprzedawane przez VWR - USA
Folia z tworzywa sztucznego (Parafilm)Heathrow ScientificPM996Sprzedawane przez VWR - USA
Plastikowa torba dożylna 500 mlTaylor3478Sprzedawana przez Fibra Cirurgica Produtos para Saude
Rurki PVC 3/4''NalgeNunc InternationalSC63013-164Sprzedawane przez VWR - USA
SystemNikon X-Tek służy HMXST225do skanowania Viscum minimum
System skanowaniaBruker Skyscan 1176służy do skanowania oprogramowania C. americana
tłok
Komora próżniowaSpoiwo80080-434Sprzedawany przez VWR - USA; zawiera pompę i rurki łączące
Oprogramowanie VG Studio MaxVolume Graphicsw wersji 3.0Służy do analiz i pozyskiwania obrazów i filmów
3D + A2:D22 Zeiss Versa 620 Służy do skanowania gatunków CT-Pro Oprogramowanie 3D Nikon wersja XT 3.1.11 Służy do trójwymiarowej rekonstrukcji skanów Oprogramowanie CT-Vox Bruker ORS skanowania Scout-and-ScanTM Zeiss wersja 16 Służy do sterowania systemem Zeiss Versa 620 oraz do trójwymiarowej rekonstrukcji skanów Zawór trójdrogowy ToToT DMTWVS-5 Sprzedawany przez Amazon USA Dwuczęściowa strzykawka HSW Henke-Ject 4850001000 Używany bez

Bibliografia

  1. Stock, S. R. Microcomputed tomography: Methodology and applications. , CRC Press/Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2020).
  2. Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), 1016-1022 (1973).
  3. Dutilleul, P., Lafond, J. A. Editorial: Branching and rooting out with a CT Scanner: The why, the how, and the outcomes, present and possibly future pierre. Frontiers in Plant Science. 7 (41), 5-6 (2016).
  4. Metscher, B. D. Biological applications of X-ray microtomography: Imaging micro- anatomy, molecular expression and organismal diversity. Microscopy and Analysis. 27 (2), 13-16 (2013).
  5. Sakdinawat, A., Attwood, D. Nanoscale X-ray imaging. Nature Photonics. 4 (12), 840-848 (2010).
  6. Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano-tomography. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  7. Lafond, J. A., Han, L., Dutilleul, P. Concepts and analyses in the ct scanning of root systems and leaf canopies: A timely summary. Frontiers in Plant Science. 6 (1111), 85-91 (2015).
  8. Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via X-Ray Tomography: Simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS ONE. 8 (9), 75295(2013).
  9. Heeraman, D. A., Hopmans, J. W., Clausnitzer, V. Three dimensional imaging of plant roots in situ with X-ray Computed Tomography. Plant and Soil. 189, 167-179 (1997).
  10. Dhondt, S., Vanhaeren, H., Van Loo, D., Cnudde, V., Inzé, D. Plant structure visualization by high-resolution X-ray computed tomography. Trends in Plant Science. 15 (8), 419-422 (2010).
  11. McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162(2013).
  12. Cochard, H., Delzon, S., Badel, E. X-ray microtomography (micro-CT): A reference technology for high-resolution quantification of xylem embolism in trees. Plant, Cell and Environment. 38 (1), 201-206 (2015).
  13. Bastos, C. L., Tamaio, N., Angyalossy, V. Unravelling roots of lianas: A case study in Sapindaceae. Annals of Botany. 118 (4), 733-746 (2016).
  14. da Cunha Neto, I. L., et al. Diversity, distribution, development, and evolution of medullary bundles in Nyctaginaceae. American Journal of Botany. 107 (5), 707-725 (2020).
  15. Milien, M., Renault-Spilmont, A. S., Cookson, S. J., Sarrazin, A., Verdeil, J. L. Visualization of the 3D structure of the graft union of grapevine using X-ray tomography. Scientia Horticulturae. 144, 130-140 (2012).
  16. Paya, A. M., Silverberg, J. L., Padgett, J., Bauerle, T. L. X-ray computed tomography uncovers root-root interactions: Quantifying spatial relationships between interacting root systems in three dimensions. Frontiers in Plant Science. 6 (274), 54-65 (2015).
  17. Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. C. T. Aligning microtomography analysis with traditional anatomy for a 3D understanding of the host-parasite interface - Phoradendron spp. Case study. Frontiers in Plant Science. 7, 1340(2016).
  18. Lusic, H., Grinstaff, M. W. X-ray-computed tomography contrast agents. Chemical Reviews. 113 (3), 1641-1666 (2013).
  19. Těšitel, J. Functional biology of parasitic plants: a review. Plant Ecology and Evolution. 149 (1), 5-20 (2016).
  20. Teixeira-Costa, L. A living bridge between two enemies: Haustorium structure and evolution across parasitic flowering plants. Revista Brasileira de Botanica. 44 (1), 165-178 (2021).
  21. Kuijt, J. The Biology of Parasitic Flowering Plants. , University of California Press. Berkeley, USA. (1969).
  22. Masumoto, N., et al. Three-dimensional reconstructions of haustoria in two parasitic plant species in the Orobanchaceae. Plant Physiology. 185 (4), 1429-1442 (2021).
  23. Calo, C. M., et al. A correlation analysis of Light Microscopy and X-ray MicroCT imaging methods applied to archaeological plant remains' morphological attributes visualization. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  24. Brodersen, C. R., Roddy, A. B. New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function. American Journal of Botany. 103 (2), 184-188 (2016).
  25. Teixeira-Costa, L., Davis, C. C. Life history, diversity, and distribution in parasitic flowering plants. Plant Physiology. 187 (1), 32-51 (2021).
  26. Simpson, B. B. Krameriaceae. Flora Neotropica Monograph. 49, (1989).
  27. Ruzin, S. E. Plant microtechnique and microscopy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1999).
  28. Nikolov, L. A., Tomlinson, P. B., Manickam, S., Endress, P. K., Kramer, E. M., Davis, C. C. Holoparasitic Rafflesiaceae possess the most reduced endophytes and yet give rise to the world's largest flowers. Annals of Botany. 114, 233-242 (2014).
  29. Thorogood, C. J., Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G., Davis, C., Hiscock, S. J. Endoparasitic plants and fungi show evolutionary convergence across phylogenetic divisions. New Phytologist. 232 (3), 1159-1167 (2021).
  30. Largent, D., Johnson, D., Watling, R. How to Identify Mushrooms to Genus III: Microscopic Features. , Mad River Press Inc. Eureka, CA. USA. (1977).
  31. Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
  32. Sperry, J. S., Donnelly, J. R., Tyree, M. T. A method for measuring hydraulic conductivity and embolism in xylem. Plant, Cell and Environment. 11, 35-40 (1988).
  33. Calvin, C. L. Host-formed tyloses in vessels of the mistletoe Phoradendron (Viscaceae). IAWA Journal. 18 (2), 117-126 (1997).
  34. Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. Embolism increase and anatomical modifications caused by a parasitic plant. IAWA Journal. 36 (2), 138-151 (2015).
  35. Ellmore, G. S., Ewers, F. W. Fluid flow in the outermost xylem increment of a ring-porous tree, Ulmus americana. American Journal of Botany. 73 (12), 1771-1774 (1986).
  36. Ellis, E. A. Staining sectioned biological specimens for transmission electron microscopy: Conventional and En bloc stains. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117, 57-72 (2014).
  37. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography. Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
  38. Brodersen, C. R., et al. Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography. New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
  39. Lee, K., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18 (9), 2145-2156 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Interakcje ro lin paso ytniczychinterfejs ro lina gospodarzanaliza haustori wperfuzja kontrastowametoda pr niowaaparat do perfuzjiwizualizacja tr jwymiarowawirtualne przekrojerdze naczyniowy
Wykorzystanie mikrotomografii komputerowej do analizy interakcji pasożytniczych między rośliną a żywicielem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.