Micro-CT to nieniszczące narzędzie, które może analizować struktury roślin w trzech wymiarach. Niniejszy protokół opisuje przygotowanie próbki w celu wykorzystania mikro-CT do analizy struktury i funkcji roślin pasożytniczych. Aby podkreślić zalety tej metody w połączeniu z określonymi preparatami, stosuje się różne gatunki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie mikrotomografii komputerowej do analizy interakcji pasożytniczych między rośliną a żywicielem
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Skanowanie mikro-tomografem komputerowym stało się uznanym narzędziem do badania struktury i funkcji roślin. Jego nieniszczący charakter, w połączeniu z możliwością trójwymiarowej wizualizacji i wirtualnego przekroju, pozwolił na nowatorską i coraz bardziej szczegółową analizę złożonych organów roślinnych. Można również badać interakcje między roślinami, w tym między roślinami pasożytniczymi a ich żywicielami. Jednak przygotowanie próbki przed skanowaniem staje się kluczowe ze względu na interakcję między tymi roślinami, które często różnią się organizacją i składem tkanek. Ponadto podczas pobierania próbek, leczenia i przygotowywania materiału pasożytniczego-żywiciela należy wziąć pod uwagę szeroką różnorodność pasożytniczych roślin kwitnących, począwszy od wysoce zredukowanych ciał wegetatywnych, a skończywszy na drzewach, ziołach i krzewach. Opisano tutaj dwa różne podejścia do wprowadzania roztworów kontrastowych do pasożyta i/lub roślin żywicielskich, koncentrując się na analizie haustorium. Ten narząd wspomaga połączenie i komunikację między dwiema roślinami. Stosując proste podejście, szczegóły organizacji tkanek haustorium można badać trójwymiarowo, jak pokazano tutaj dla gatunków pasożytniczych eufitoidów, winorośli i jemioły. Wybór konkretnych środków kontrastujących i podejść do aplikacji pozwala również na szczegółową obserwację rozprzestrzeniania się endopasożyta w organizmie żywiciela i wykrycie bezpośredniego połączenia między naczyniem a żywicielem, jak pokazano tutaj dla obligatoryjnego pasożyta korzeniowego. W ten sposób omawiany tutaj protokół może być zastosowany do szerokiej gamy pasożytniczych roślin kwitnących, aby pogłębić zrozumienie ich rozwoju, struktury i funkcjonowania.
Wprowadzenie
Wysokorozdzielcza rentgenowska mikrotomografia komputerowa (micro-CT) to metoda obrazowania, w której rejestruje się wiele radiogramów (projekcji) próbki pod różnymi kątami widzenia, a następnie wykorzystuje się je do stworzenia wirtualnej rekonstrukcji obiektu1. Taki wirtualny obiekt może być następnie analizowany, modyfikowany i segmentowany, co umożliwia nieniszczącą eksplorację w trzech wymiarach2. Początkowo zaprojektowana do analiz medycznych, a później do zastosowań przemysłowych, micro-CT oferuje również możliwość wizualizacji organów wewnętrznych i tkanek bez konieczności przeprowadzania inwazyjnych procedur
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Wybór próbek roślin pasożytniczych
- Pobrać całe haustorium rośliny pasożytniczej, wraz z przytwierdzoną łodygą/korzeniem żywiciela oraz fragmentami obu końców (proksymalnego i dystalnego) pasożytowanego organu żywiciela; optymalna długość każdego fragmentu powinna być równa dwukrotności średnicy haustorium.
UWAGA: W przypadku haustoriów bocznych należy dołączyć fragment łodygi/korzenia rośliny pasożytniczej, z którego powstało haustorium (Rycina 1A,B,D). W przypadku endopasożytów należy pobrać fragment łodygi/korzenia żywiciela, w którym widoczne są ślady pasożyta (....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Haustorium roślin pasożytniczych to złożony organ składający się z różnych tkanek i typów komórek, które przeplatają się i łączą z tkankami innej rośliny, pełniącej rolę żywiciela20. Skanowanie mikro-CT można wykorzystać do lepszego zrozumienia tej złożonej struktury w sposób nieniszczący i trójwymiarowy podczas analizy zarówno małych (Rycina 1A-C), jak i dużych (Rycina 1D,E) haustor.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zastosowanie roztworów metali ciężkich w celu poprawy kontrastu tkanek roślinnych stało się kluczowym krokiem w przygotowaniu próbki do analizy mikro-CT. Kilka związków powszechnie dostępnych w laboratoriach mikromorfologii roślin zostało przebadanych przez Staedlera i wsp., którzy zalecają stosowanie fosfotunglastu jako najskuteczniejszego środka w penetracji próbek i zwiększaniu wskaźnika kontrastu8. Wyniki uzyskane w analizie haustorium P. pubera potwierdzają to zalecenie. Jeśli chodzi.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autor nie ma nic do zdradzienia.
Podziękowania
Chciałbym podziękować dr Simone Gomes Ferreira (Laboratorium Mikrotomografii, Uniwersytet w Sao Paulo, Brazylia) i dr Gregowi Linowi (Center for Nanoscale Systems, Harvard University, USA) za ich ogromną pomoc i niezbędne szkolenie użytkowników dla różnych systemów mikrotomografii i oprogramowania do analizy danych. Dziękuję również pracownikom EEB Greenhouse na Uniwersytecie Connecticut (USA), szczególnie Clintonowi Morse'owi i Matthew Opelowi za dostarczenie próbek Viscum minimum. Dr John Wenzel zapewnił możliwość i wielką pomoc w pobraniu próbek Pyrularia pubera. Mgr Carolina Bastos, mgr Yasmin Hirao i Talitha Motta bardzo pomogły w pobraniu próbe....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
P. pubera
3D + A2:D22 Zeiss Versa 620 Służy do skanowania gatunków CT-Pro Oprogramowanie 3D Nikon wersja XT 3.1.11 Służy do trójwymiarowej rekonstrukcji skanów Oprogramowanie CT-Vox Bruker ORS skanowania Scout-and-ScanTM Zeiss wersja 16 Służy do sterowania systemem Zeiss Versa 620 oraz do trójwymiarowej rekonstrukcji skanów Zawór trójdrogowy ToToT DMTWVS-5 Sprzedawany przez Amazon USA Dwuczęściowa strzykawka HSW Henke-Ject 4850001000 Używany bez
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System mikroskopu rentgenowskiego 3D (XRM) | Zeiss Versa 620 | służy do skanowania mikroskopu rentgenowskiego Pyrularia pubera | |
| wersja 3.3.1 | Służy do analiz i pozyskiwania obrazów i filmów | ||
| Oprogramowanie Dragonfly | Object Research Systems - | wersja | Służy do analiz i pozyskiwania obrazów i filmów |
| Szklane fiolki | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | Sprzedawane przez VWR - USA; Upewnij się, że fiolki są w stanie wytrzymać podciśnienie przy ciśnieniu ok. 10 psi |
| Inspect-X | Zeiss | wersja XT 3.1.11 | Służy do sterowania systemem Nikon X-Tek HMXST225 |
| Roztwór jodu 0,0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | Sprzedawany przez VWR - USA |
| Azotan ołowiu II PA 500 g | Vetec | 361.08 | Sprzedawany przez SPLab |
| Skaner mikrotomograficzny | Bruker | Skyscan1176 | Służy do skanowania gatunków C. americana, S. martianus, oraz S. fungiforme |
| Skaner mikrotomograficzny | Nikon | X-Tek HMXST225 | Służy do skanowania gatunków V. Oprogramowanie minimum |
| NRecon | Bruker | w wersji 1.0.0 | Służy do rekonstrukcji trójwymiarowej |
| Kwas fosfowolframowy hydrat 3% w roztworze wodnym | Mikroskopia elektronowa Sciences | 101410-756 | Sprzedawane przez VWR - USA |
| Folia z tworzywa sztucznego (Parafilm) | Heathrow Scientific | PM996 | Sprzedawane przez VWR - USA |
| Plastikowa torba dożylna 500 ml | Taylor | 3478 | Sprzedawana przez Fibra Cirurgica Produtos para Saude |
| Rurki PVC 3/4''Nalge | Nunc International | SC63013-164 | Sprzedawane przez VWR - USA |
| System | Nikon X-Tek służy HMXST225 | do skanowania Viscum minimum | |
| System skanowania | Bruker Skyscan 1176 | służy do skanowania oprogramowania C. americana | |
| tłok | |||
| Komora próżniowa | Spoiwo | 80080-434 | Sprzedawany przez VWR - USA; zawiera pompę i rurki łączące |
| Oprogramowanie VG Studio Max | Volume Graphics | w wersji 3.0 | Służy do analiz i pozyskiwania obrazów i filmów |
Bibliografia
- Stock, S. R. Microcomputed tomography: Methodology and applications. , CRC Press/Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2020).
- Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
