Wysokorozdzielcza rentgenowska mikrotomografia komputerowa (micro-CT) to metoda obrazowania, w której rejestruje się wiele radiogramów (projekcji) próbki pod różnymi kątami widzenia, a następnie wykorzystuje się je do stworzenia wirtualnej rekonstrukcji obiektu1. Taki wirtualny obiekt może być następnie analizowany, modyfikowany i segmentowany, co umożliwia nieniszczącą eksplorację w trzech wymiarach2. Początkowo zaprojektowana do analiz medycznych, a później do zastosowań przemysłowych, micro-CT oferuje również możliwość wizualizacji organów wewnętrznych i tkanek bez konieczności przeprowadzania inwazyjnych procedur3. Podobnie jak inne formy obrazowania, micro-CT wiąże się z kompromisem między polem widzenia a rozmiarem piksela, co oznacza, że obrazowanie dużych próbek w wysokiej rozdzielczości jest niemal nieosiągalne4. Stale postępuje rozwój w wykorzystaniu wysokoenergetycznych źródeł promieni rentgenowskich (np. synchrotronów) oraz wtórnego powiększenia optycznego, co pozwala na osiągnięcie rozdzielczości poniżej 100 nm5,6. Niemniej jednak, w przypadku dużych próbek niezbędny jest dłuższy czas skanowania, co zwiększa ryzyko wystąpienia artefaktów wynikających z ruchu lub deformacji próbki wewnątrz skanera. Ponadto micro-CT jest zazwyczaj ograniczona naturalnymi różnicami gęstości w obrębie próbki oraz sposobem, w jaki próbka oddziałuje z promieniami X. Choć wyższa dawka promieniowania rentgenowskiego jest najskuteczniejsza w penetracji gęstszych próbek, jest ona mniej efektywna w rejestrowaniu różnic gęstości wewnątrz próbki oraz pomiędzy próbką a otaczającym ją medium7. Z drugiej strony, niższa dawka promieniowania X zapewnia mniejszą zdolność penetracji i często wymaga dłuższego czasu skanowania, ale oferuje większą czułość w detekcji gęstości7.
Ograniczenia te od dawna utrudniały wykorzystanie mikrotomografii w naukach o roślinach, biorąc pod uwagę, że większość tkanek roślinnych składa się z tkanek lekkich (mało gęstych) o niskiej absorpcji promieni Rentgena8. Pierwsze zastosowania mikro-CT koncentrowały się na mapowaniu sieci korzeniowych w matrycy glebowej9,10. Później zaczęto badać struktury roślinne o bardziej znaczących różnicach w gęstości tkanek, takie jak drewno. Pozwoliło to na badanie funkcjonalności ksylemu11,12, rozwoju złożonych organizacji tkankowych13,14 oraz interakcji między roślinami15,16,17. Analiza tkanek miękkich i jednorodnych staje się powszechna dzięki środkom kontrastowym, których stosowanie jest obecnie standardową procedurą w przygotowaniu próbek roślinnych do skanowania mikro-CT. Jednak protokoły wprowadzania kontrastu mogą dawać różne wyniki w zależności od objętości próbki, właściwości strukturalnych oraz rodzaju zastosowanego roztworu8. Idealnie środek kontrastowy powinien wzmacniać rozróżnialność między różnymi tkankami, umożliwiać ocenę funkcjonalności tkanek/organów i/lub dostarczać informacji biochemicznych o tkance18. Dlatego odpowiednia obróbka, przygotowanie i montaż próbki przed skanowaniem stają się kluczowe dla każdej analizy mikro-CT.
Mikro-CT haustorium rośliny pasożytniczej
Pasożytnicze rośliny kwiatowe stanowią odrębną funkcjonalną grupę okrytonasiennych, charakteryzującą się obecnością organu zwanego haustorium19. Ten wielokomórkowy organ, będący rozwojowym hybrydą zmodyfikowanej łodygi i korzenia, odpowiada za przytwierdzenie, penetrację oraz kontakt pasożyta z gospodarzem20. Z tego powodu uważa się, że haustorium „ucieleśnia samą ideę pasożytnictwa wśród roślin”21. Szczegółowe zrozumienie rozwoju, struktury i funkcjonowania tego organu jest kluczowe dla badań nad ekologią, ewolucją i zwalczaniem roślin pasożytniczych. Niemniej jednak, ogólna złożoność i silnie zmodyfikowana struktura roślin pasożytniczych oraz ich haustoriów często utrudniają szczegółową analizę i porównania. Połączenia haustorialne są zazwyczaj rozległe i niejednorodne pod względem rozmieszczenia tkanek i komórek (Rycina 1). W tym kontekście, choć praca z małymi fragmentami tkanek umożliwia łatwiejszą manipulację i uzyskanie wyższej rozdzielczości, może ona prowadzić do błędnych wniosków na temat trójwymiarowej architektury złożonych struktur, takich jak haustorium rośliny pasożytniczej.
Mimo obszernej literatury dotyczącej anatomii i ultrastruktury haustoriów u większości gatunków roślin pasożytniczych, organizacja trójwymiarowa oraz przestrzenne relacje między tkankami pasożyta i gospodarza pozostają słabo zbadane17. W niedawnej pracy Masumoto i wsp.22 wykonano obrazy ponad 300 seryjnych półcienkich przekrojów mikrotomicznych, które zrekonstruowano w trójwymiarowy wirtualny obiekt reprezentujący haustoria dwóch gatunków pasożytów. Doskonały poziom szczegółowości tej metody zapewnia bezprecedensowy wgląd w komórkową i anatomiczną strukturę 3D haustorium. Jednak tak czasochłonna technika uniemożliwiłaby podobną analizę u pasożytów o bardziej rozbudowanych połączeniach haustorialnych. Wykorzystanie mikro-CT jawi się jako doskonałe narzędzie do trójwymiarowej analizy złożonych i często masywnych haustoriów roślin pasożytniczych. Choć nie zastępuje ono szczegółowego cięcia anatomicznego i innych komplementarnych form analiz mikroskopowych17,23, wyniki uzyskane via skanowanie mikro-CT, zwłaszcza w przypadku dużych próbek, mogą służyć jako wskazówka do pobierania podpróbek mniejszych segmentów, które mogą być następnie analizowane za pomocą innych narzędzi, takich jak mikroskopia konfokalna i elektronowa, lub ponownie analizowane przy użyciu systemów mikro-CT o wysokiej rozdzielczości.

Rysunek 1: Rośliny pasożytnicze z różnych grup funkcjonalnych wykorzystane w niniejszym protokole. Pasożyt eufytoidny Pyrularia pubera (A), endopasożyt Viscum minimum (B) z zielonymi owocami (czarne przerywane koło), pnącze pasożytnicze Cuscuta americana (C), jemioła Struthanthus martianus (D), obligatoryjny pasożyt korzeni Scybalium fungiforme (E). Odcinki korzenia gospodarza (Hr) lub łodygi gospodarza (Hs) ułatwiają podanie kontrastu do haustorium pasożyta (P). Obecność korzenia/łodygi macierzystej pasożyta (strzałki) w próbce umożliwia analizę organizacji naczyń haustorium. Prostokąty wskazują segmenty próbki wykorzystane do analizy. Paski skali = 2 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
W miarę jak mikro-CT staje się coraz popularniejszą techniką w naukach o roślinach, powstaje coraz więcej przewodników, protokołów i literatury dotyczącej skanowania próbek, rekonstrukcji trójwymiarowej, segmentacji i analizy3,10,24. W związku z tym etapy te nie będą tutaj omawiane. Podobnie jak w przypadku każdej techniki obrazowania, odpowiednia obróbka i montaż próbek stanowią fundamentalną, choć często pomijaną procedurę. Z tego powodu niniejszy protokół koncentruje się na przygotowaniu próbek haustoriów do skanowania mikro-CT. Bardziej szczegółowo, protokół ten opisuje dwa podejścia do wprowadzania środków kontrastowych do próbek haustoriów w celu poprawy wizualizacji różnych tkanek i typów komórek w haustorium, ułatwienia wykrywania tkanki pasożytniczej wewnątrz korzenia/łodygi gospodarza oraz analizy trójwymiarowych połączeń naczyniowych między pasożytem a gospodarzem. Opisane tutaj metody przygotowania mogą zostać zaadaptowane również do analizy innych struktur roślinnych.
W celu lepszego zilustrowania wygody opisanego tutaj protokołu wykorzystano pięć gatunków. Każdy gatunek reprezentuje jedną z pięciu grup funkcjonalnych pasożytniczych roślin kwiatowych, co pozwala odnieść się do specyficznych kwestii związanych z funkcjonalnością każdej z grup. Pyrularia pubera (Santalaceae) została wybrana do reprezentowania pasożytów eufitoidalnych, które kiełkują w glebie i tworzą liczne haustoria łączące pasożyta z korzeniami roślin żywicieli25. Haustoria tworzone przez te rośliny są często wiotkie i łatwo odrywają się od żywiciela26 (Rysunek 1A), co wymaga bardziej delikatnego procesu manipulacji. Endopasożyty są tutaj reprezentowane przez Viscum minimum (Viscaceae). Gatunki z tej grupy funkcjonalnej są widoczne poza ciałem swoich żywicieli tylko przez krótkie okresy (Rysunek 1B) i przez większość cykli życiowych bytują jako znacznie zredukowane, przypominające grzybnię pasma komórek zatopione w tkankach żywiciela25. Trzecia grupa funkcjonalna obejmuje pnącza pasożytnicze, które kiełkują w glebie, lecz tworzą jedynie rudymentarne korzenie, polegając na licznych haustoriach przyczepiających się do łodyg roślin żywicieli25 (Rysunek 1C). W tym przypadku grupę funkcjonalną tę reprezentuje Cuscuta americana (Convolvulaceae). W przeciwieństwie do pnączy pasożytniczych, jemioły kiełkują bezpośrednio na gałęziach swoich roślin żywicieli i rozwijają albo liczne, albo pojedyncze haustoria25. Gatunkiem wybranym do zilustrowania tej grupy funkcjonalnej jest Struthanthus martianus (Loranthaceae), który tworzy różne połączenia z gałęzią żywiciela (Rysunek 1D). Analizę pojedynczych haustoriów jemioły z wykorzystaniem kombinacji mikro-CT i mikroskopii świetlnej można znaleźć w pracy Teixeira-Costa & Ceccantini17. Na koniec, obligatoryjne pasożyty korzeniowe obejmują gatunki, które kiełkują w glebie i wnikają w korzenie roślin żywicieli, od których są całkowicie zależne od najwcześniejszych etapów wzrostu25. Rośliny te są tutaj reprezentowane przez Scybalium fungiforme (Balanophoraceae), które wytwarzają duże, przypominające bulwy haustoria (Rysunek 1E).
Wszystkie próbki roślin wykorzystane w tym protokole utrwalono w 70% roztworze formaliny, kwasu octowego i alkoholu (FAA 70). Utrwalenie podczas pobierania próbek jest kluczowe dla zachowania tkanek roślinnych, szczególnie jeśli wymagane są późniejsze analizy anatomiczne. W przypadku haustoriów roślin pasożytniczych utrwalenie jest również niezbędne, ponieważ organ ten składa się często głównie z niezdrewniałych komórek miąższowych20. Szczegółowe protokoły utrwalania tkanek roślinnych, w tym przygotowanie roztworów utrwalających, można znaleźć w innych źródłach27. Z drugiej strony, w różnym stopniu utrwalacze mogą powodować zmiany właściwości fizycznych i chemicznych próbki, czyniąc ją nieprzydatną do specyficznych analiz biomechanicznych i histochemicznych. W związku z tym w tym protokole można stosować również próbki świeże, tj. materiał nieutrwalony, pobrany bezpośrednio przed przygotowaniem. Szczegółowe informacje na temat postępowania z próbkami świeżymi oraz sugestie dotyczące rozwiązywania problemów z materiałem utrwalonym znajdują się w sekcji dyskusji.