Artykuł metodologiczny

Wielkoskalowa, zautomatyzowana produkcja sferoid komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do biodruku 3D

DOI:

10.3791/63430

⸱

31 marca 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Nucleus of Multidisciplinary Research in Biology (Numpex-Bio), Federal University of Rio de Janeiro, 2Laboratory of Tissue Bioengineering, National Institute of Metrology, Quality and Technology (Inmetro), 3Post-graduation Program of Translational Biomedicine (Biotrans), Unigranrio, 4Post-graduation Program in Biotechnology, National Institute of Metrology, Quality and Technology (Inmetro), 5Dental School, Fluminense Federal Fluminense

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy produkcję na dużą skalę sferoidów zrębu/komórek macierzystych (ASC) pochodzących z tkanki tłuszczowej przy użyciu automatycznego systemu pipetowania do zasiewania zawiesiny komórkowej, zapewniając w ten sposób jednorodność wielkości i kształtu sferoidy. Te sferoidy ASC mogą być używane jako elementy budulcowe dla podejść do biodruku 3D.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki zrębowe/macierzyste (ASC) pochodzące z tkanki tłuszczowej to subpopulacja komórek znajdujących się we frakcji zrębu naczyniowego ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej, uznawana za klasyczne źródło mezenchymalnych komórek zrębowych/macierzystych. Opublikowano wiele badań z ASC dla podejść inżynierii tkankowej opartych na rusztowaniach, w których badano głównie zachowanie tych komórek po ich wysianiu na bioaktywnych rusztowaniach. Pojawiają się jednak podejścia bez rusztowań do inżynierii tkanek in vitro i in vivo, głównie przy użyciu sferoidów, w celu przezwyciężenia ograniczeń podejść opartych na rusztowaniach.

Sferoidy to mikrotkanki 3D powstałe w procesie samoorganizacji. Mogą lepiej naśladować architekturę i mikrośrodowisko tkanek natywnych, głównie dzięki powiększeniu interakcji między komórkami i między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową. Ostatnio sferoidy są badane głównie jako modele chorób, badania przesiewowe leków i elementy budulcowe biodruku 3D. Jednak w przypadku podejść do biodruku 3D liczne sferoidy, jednorodne pod względem wielkości i kształtu, są niezbędne do biofabrykacji złożonych modeli tkanek i narządów. Ponadto, gdy sferoidy są wytwarzane automatycznie, istnieje niewielka szansa na zanieczyszczenie mikrobiologiczne, co zwiększa powtarzalność metody.

Produkcja sferoidów na dużą skalę jest uważana za pierwszy obowiązkowy krok do opracowania linii biofabrykacji, która kontynuuje proces biodruku 3D i kończy się pełnym dojrzewaniem konstruktu tkankowego w bioreaktorach. Jednak liczba badań, które dotyczyły produkcji sferoidów ASC na dużą skalę, jest nadal niewielka, wraz z liczbą badań, w których wykorzystano sferoidy ASC jako elementy budulcowe do biodruku 3D. Dlatego artykuł ten ma na celu pokazanie produkcji sferoidów ASC na dużą skalę przy użyciu nieadhezyjnej techniki mikroformowanego hydrożelu rozprowadzającego sferoidy ASC jako elementy budulcowe dla podejść do biodruku 3D.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

sferoidy są uważane za podejście wolne od rusztowań w inżynierii tkankowej. ASC są zdolne do tworzenia sferoid w procesie samoorganizacji. Mikroarchitektura 3D sferoidy zwiększa potencjał regeneracyjny ASC, w tym zdolność różnicowania do wielu linii1,2,3. Ta grupa badawcza pracowała nad sferoidami ASC do inżynierii tkanki chrzęstnej i kostnej4,5,6. Co ważniejsze, sferoidy są uważane za elementy budulcowe w biofabrykacji tkanek i narządów, głównie ze względu na ich zdolność do fuzji.

Wykorzystanie sferoidów do tworzenia tkanek zależy od trzech głównych punktów: (1) rozwoju standardowych i skalowalnych metod robotycznych do ich biofabrykacji7, (2) systematycznego fenotypowania sferoidów tkankowych8, (3) rozwoju metod składania tkanek 3D9. Te sferoidy mogą być formowane z różnych typów komórek i uzyskiwane różnymi metodami, w tym wiszącą kroplą, reagregacją, mikrofluidyką i mikroformami8,9,10. Każda z tych metod ma zalety i wady związane z jednorodnością wielkości i kształtu sferoid, odzyskiwaniem sferoid po uformowaniu, liczbą wytworzonych sferoid, automatyzacją procesów, pracochłonnością i kosztami11.

W metodzie mikroformy, komórki są dozowane i umieszczane na dnie mikroformy z powodu grawitacji. Nieadhezyjny hydrożel nie pozwala komórkom przylegać do dna, a interakcje międzykomórkowe prowadzą do powstania pojedynczej sferoidy na recesję8,12. Ta metoda biofabrykacji generuje sferoidy o jednorodnym i kontrolowanym rozmiarze, może być zrobotyzowana do produkcji na dużą skalę w sposób efektywny czasowo przy minimalnym wysiłku i ma dobre czynniki krytyczne pod względem opłacalności w projektowaniu biofabrykacji sferoidy tkankowej7,8. Metoda ta może być zastosowana do tworzenia sferoid dowolnej linii komórkowej w celu przygotowania nowego typu tkanki o przewidywalnych, optymalnych i kontrolowanych cechach8.

Biofabrykacja jest zdefiniowana jako "zautomatyzowane generowanie biologicznie funkcjonalnych produktów z organizacją strukturalną ... "13. Dlatego zautomatyzowana produkcja sferoid jest uważana za pierwszy obowiązkowy krok do opracowania linii biofabrykacji, która jest kontynuowana w procesie biodruku 3D i kończy się pełnym dojrzewaniem biodrukowanej tkanki przez fuzję sferoidalną. W tym badaniu, aby poprawić skalowalność biofabrykacji sferoidów ASC, używamy zautomatyzowanego systemu pipetowania do wysiewu zawiesiny komórek, zapewniając w ten sposób jednorodność wielkości i kształtu sferoidy. Ten artykuł pokazuje, że możliwe było wyprodukowanie dużej liczby (tysięcy) sferoid potrzebnych do podejść do biodruku 3D w celu biofabrykacji bardziej złożonych modeli tkanek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ASC użyte w tym badaniu zostały wcześniej wyizolowane od zdrowych ludzkich dawców i poddane krioprezerwacji, jak opisano 14 według Komisji Etyki Badań Szpitala Uniwersyteckiego Clementino Fraga Filho, Uniwersytetu Federalnego Rio de Janeiro, Brazylia (25818719.4.0000.5257). Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów i sprzętu użytego w tym badaniu można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Trypsyna monowarstwy ASC w trzecim przejściu

  1. Otworzyć kolbę tkankową o długości 175cm2 zawierającą monowarstwę ASC przy 80% zbiegu i odrzucić supernatant.
  2. Dodać 7 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, 0,01 M) i dwukrotnie przemyć monowarstwę. Następnie wylej płyn.
  3. Dodaj 5 ml 0,125% trypsyny z 0,78 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Dodać 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium firmy Dulbecco o niskiej zawartości glukozy (DMEM LOW) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) do kolby tkankowej o długości 175cm2 i dobrze wymieszać zawiesinę komórkową za pomocą pipety sorologicznej o pojemności 10 ml.
  5. Zawiesinę komórkową pobrać za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Następnie odwirować przy 400 × g przez 5 minut, aby uzyskać osad ASC. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą DMEM LOW zawierającego 10% FBS.
  6. Wykonaj zliczanie komórek przez wykluczenie trypana.
  7. Po policzeniu weź w sumie 1 × 106 ASC w oddzielnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, aby zasiać 81 recesji mikroformowanych nieprzylegającym hydrożelem (w sumie 10 000 komórek/ml wysianych tutaj). Aby zasiać 256 wgłębień mikroformowanego, nieprzylegającego hydrożelu, weź w sumie 5 × 105 ASC do probówki wirówkowej (w sumie 2,500 komórek/ml wysianych tutaj).

2. Produkcja mikroformowanego, nieprzylegającego hydrożelu agarozowego

  1. Przygotuj 50 ml sterylnego roztworu 2% ultraczystej agarozy w 0,9% NaCl w ultraczystej wodzie. Roztwór należy sterylizować w autoklawie przez 30 minut w temperaturze 121 °C.
  2. Dodaj 500 μl sterylnego 2% ultraczystego roztworu agarozy na środek silikonowej formy zawierającej 81 lub 256 okrągłych wgłębień.
  3. Po 40 minutach wyjmij ultraczystą agarozę z formy silikonowej i umieść ją w dołku 12-dołkowej plastikowej płytki.
  4. Dodać 2 ml DMEM LOW do studzienki z mikroformowaną agarozą i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez co najmniej 12 godzin przed wysiewem ASC.

3. Biofabrykacja sferoidów ASC za pomocą automatycznego systemu pipetowania

  1. Sprawdź następujące elementy:
    1. Sprawdź, czy przepływ laminarny jest włączony i czy przepływ powietrza w szafie działa prawidłowo.
    2. Sprawdź, czy urządzenie jest podłączone do właściwej objętościtage.
    3. Sprawdź, czy tablet jest podłączony do urządzenia.
    4. Sprawdź, czy wysokość szyby ochronnej szafy jest na tej samej wysokości, co oznaczenie czujnika urządzenia.
  2. Naciśnij przycisk włączania/wyłączania po lewej stronie urządzenia i poczekaj, aż tablet i urządzenie się uruchomią.
  3. Umieść pudełka na końcówki, stojak na probówki wirówkowe i płytkę zawierającą mikroformowany hydrożel agarozowy w przestrzeni roboczej urządzenia.
  4. Na tablecie z otwartym oprogramowaniem najpierw kliknij Edytor oprogramowania laboratoryjnego.
  5. Skonfiguruj wirtualny stół roboczy i wybierz pozycje pipet, pojemników na końcówki, stojaka na plastikowe rurki i płytek.
    UWAGA: Wirtualny stół roboczy musi reprezentować fizyczne położenie akcesoriów w sprzęcie.
  6. Kliknij przycisk Przełącz na produkcję, aby uwzględnić parametry (patrz krok 3.10) i polecenia, które sprzęt będzie wykonywał przez cały czas trwania eksperymentu. Poczekaj, aż w oprogramowaniu otworzy się pasek narzędzi i lista produktów.
  7. Początkowo, aby wskazać polecenia, należy podać liczbę próbek do pipetowania i przeciągnąć ją do listy producentów.
    UWAGA: Liczba próbek to liczba plastikowych probówek wirówkowych zawierających zawiesinę ASC, która ma być wysiana w środku mikroform.
  8. Po wprowadzeniu liczby próbek kliknij przycisk polecenia Transfer próbki w oprogramowaniu, aby przenieść zawiesinę ASC do dołków 12-dołkowej płytki, zawierającej mikroformy, i przeciągnij ją do listy produktów.
  9. Kliknij Właściwości, aby ustawić pozycję początkową i końcową dla sprzętu do przenoszenia próbki.
  10. Poczekaj, aż oprogramowanie powróci do strony Stół roboczy. Kliknij przycisk Opcje, aby ustawić parametry automatycznego wysiewu ASC: i) Szybkość aspiracji 15,4 s-1; ii) Prędkość dozowania 1 s-1; iii) Opóźnienie ciosu 0 ms; iv) Prędkość nadmuchu 15,4 s-1; v) Początkowy skok 100%. Wybierz Wodę jako Standardowy rodzaj cieczy.
  11. Ustaw parametry mieszania ASC w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny: i) Liczba cykli 5; ii) Prędkość 6,5 s-1; iii) Objętość 300 μl.
  12. Po ustawieniu parametrów dodaj Czas 40 minut do Listy Produktów.
    UWAGA: Ten czas jest potrzebny na poczekanie, aż zawiesina ASC zdekantuje się na dnie mikroformy.
  13. Na liście produktów uwzględnij opcję Transfer odczynników, aby przenieść pożywkę do hodowli sferoidalnej do odpowiednich dołków płytki.
  14. Powtórz kroki 3.9-3.11, aby ustawić konfigurację pozycji i parametrów do przenoszenia pożywki do hodowli sferoidalnej.
  15. Kliknij przycisk z symbolem wyboru na górnym pasku oprogramowania, aby upewnić się, że nie ma błędu programowania.
  16. Kliknij przycisk Odtwórz (z symbolem trójkąta) na górnym pasku oprogramowania, aby uruchomić program.
  17. Pozwól urządzeniu uruchomić się zgodnie z programem i poczekaj, aż wyda dźwięk wskazujący, że się skończyło.
  18. Zebrać 12-dołkową płytkę i inkubować ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez co najmniej 18 godzin, aby sferoidy były całkowicie uformowane i zwarte.
  19. Ręcznie zbierz sferoidy po 1, 3 i 7 dniach hodowli do analizy. Ręcznie przepłukać podłoże mikropipetą, aby uwolnić sferoidy z mikroformowanego, nieprzylegającego hydrożelu agarozowego.
  20. Po 5 minutach sprawdź pod mikroskopem, czy sferoidy są całkowicie uwolnione z mikroformowanego, nieprzylegającego hydrożelu agarozowego.
  21. Zebrać sferoidy ręcznie za pomocą mikropipety i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  22. Przemyć sferoidy co najmniej dwa razy 0,01 M PBS. Ocenić żywotność i przeprowadzić analizy biomechaniczne na świeżych próbkach sferoidów. W celu analizy morfologicznej (histologii) inkubować próbki sferoidalne w 4% paraformaldehydzie w PBS przez co najmniej 18 godzin w temperaturze 2–8 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Automatyczny system pipet może wprowadzić zawiesinę komórek ASC do 12 dołków na jednej 12-dołkowej płytce w ciągu 15 minut. Użycie 81 mikroformowanych, nieprzylegających hydrożeli wytworzy 972 sferoidy na końcu protokołu. Użycie 256 mikroformowanego, nieprzylegającego hydrożelu wytworzy 3,072 sferoidy na końcu protokołu. Sferoidy ASC analizowano pod kątem jednorodności ich wielkości i kształtu. Sferoidy ASC z mikropleśni z 81 recesjami wykazywały jednorodną średnicę w okresie hodowli, w przeciwieństwie do sferoid ASC z m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono wielkoskalową generację sferoid ASC przy użyciu zautomatyzowanego systemu pipet. Kluczowym etapem protokołu jest precyzyjne skonfigurowanie oprogramowania w celu zapewnienia prawidłowej objętości zawiesiny komórek, prędkości i odległości do pipetowania. Parametry opisane w protokole zostały określone po przeprowadzeniu szeregu prób mających na celu optymalizację dozowania zawiesiny komórek ASC do studzienek 12-dołkowych płytek zawierających mikroformowane, nieprzylegające hydrożele. Optymalizacja...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Narodowemu Instytutowi Metrologii, Jakości i Technologii (INMETRO, RJ, Brazylia) za korzystanie z ich urządzeń. Badanie to było częściowo wspierane przez Fundację Carlosa Chagasa Filho na rzecz Wspierania Badań Naukowych Stanu Rio de Janeiro (Faperj) (kod finansowy: E26/202.682/2018 i E-26/010.001771/2019), Narodową Radę Rozwoju Naukowego i Technologicznego (CNPq) (kod finansowy: 307460/2019-3) oraz Biuro Badań Marynarki Wojennej (ONR) (kod finansowy: N62909-21-1-2091). Prace te były częściowo wspierane przez Narodowe Centrum Nauki i Technologii Medycyny Regeneracyjnej – INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
12-dołkowa plastikowa płytkaCorning3512
50 ml probówka wirówkowaCorningCLS430828
EpMotion 5070Eppendorf5070000282
epT.I.P.S. MotionEppendorf30015231
kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Invitrogen15576028
płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco10082147
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW)Gibco31600034
Mikrotkanki 3D Petriego Sferoidy mikro-pleśni - tablica 16 x 16Sigma
Mikrotkanki 3D Sferoidy mikropleśni na szalkę Petriego - matryca 9 x 9SigmaZ764019
bufor soli fosforanowej (PBS)Kolba806552
chlorek sodu (NaCl)SigmaS8776
Corning430720U
trypanLonza17-942E
trypsynaGibco27250018
ultraczysta agarozaInvitrogen16500100
Z764000 do hodowli tkankowych Sigma

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
  2. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  3. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
  4. Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
  5. Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
  6. Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
  7. Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002(2011).
  8. Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
  9. Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104(2018).
  10. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  11. Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027(2017).
  12. Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007(2017).
  13. Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001(2016).
  14. Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
  15. Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755(2015).
  16. Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
  17. Doulgkeroglou, M. -K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811(2020).
  18. Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101(2016).
  19. Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
  20. Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366(2020).
  21. Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502(2021).
  22. Lee, G. -H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548(2018).
  23. Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
  24. Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
  25. De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mesenchymalne kom rki macierzyste z tkanki t uszczowejbiodruk 3Dprodukcja sferoid wzautomatyzowana hodowla kom rkowamikrot oczony hydro elin ynieria tkankowa bez rusztowaniafrakcja naczyniowo stromalnajednorodno sferoid wwysiew zawiesiny kom rkowej

Powiązane artykuły