Artykuł metodologiczny

Kauteryzacja pełnego koła rąbka splotu naczyniowego w przypadku jaskry wywołanej chirurgicznie u gryzoni

DOI:

10.3791/63442

⸱

15 lutego 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie nowego modelu neurodegeneracji jaskry opartej na 360° termicznej kauteryzacji rąbkowego splotu naczyniowego, wywołującej podostre nadciśnienie oczne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jaskra, druga najczęstsza przyczyna ślepoty na świecie, to niejednorodna grupa zaburzeń oczu charakteryzujących się strukturalnym uszkodzeniem nerwu wzrokowego i zwyrodnieniem komórek zwojowych siatkówki (RGC), powodującym dysfunkcję wzroku poprzez przerwanie transmisji informacji wzrokowej z oka do mózgu. Podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe jest najważniejszym czynnikiem ryzyka; W związku z tym opracowano kilka modeli nadciśnienia ocznego u gryzoni za pomocą podejść genetycznych lub eksperymentalnych w celu zbadania przyczyn i skutków choroby. Wśród nich odnotowano pewne ograniczenia, takie jak inwazyjność chirurgiczna, nieodpowiednia ocena funkcjonalna, wymóg intensywnego szkolenia i bardzo zróżnicowane rozszerzenie uszkodzenia siatkówki. Niniejsza praca charakteryzuje prostą, tanią i skuteczną metodę wywoływania nadciśnienia ocznego u gryzoni, opartą na niskotemperaturowej, pełnej kauteryzacji splotu naczyniowego rąbka, głównego składnika drenażu wodnistego. Nowy model zapewnia technicznie łatwe, nieinwazyjne i powtarzalne podostre nadciśnienie oczne, związane z postępującym RGC i zwyrodnieniem nerwu wzrokowego, oraz unikalny pooperacyjny wskaźnik rekonwalescencji klinicznej, który umożliwia badania funkcjonalne in vivo zarówno metodami elektrofizjologicznymi, jak i behawioralnymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Literatura medyczna definiuje jaskrę jako niejednorodną grupę neuropatii nerwu wzrokowego charakteryzującą się postępującą degeneracją komórek zwojowych siatkówki (RGC), dendrytów, somy i aksonów, co skutkuje strukturalnym stawianiem baniek (wykopami) tarczy wzrokowej i funkcjonalnym pogorszeniem funkcjonowania nerwu wzrokowego, prowadzącym do ślepoty w niekontrolowanych przypadkach poprzez przerwanie transmisji informacji wzrokowej z oka do mózgu1. Jaskra jest obecnie najczęstszą przyczyną nieodwracalnej ślepoty na świecie, przewiduje się, że w 2040 r. dotrze do około 111,8 miliona osób2, co ma głęboki wpływ na jakość życia pacjentów (QoL) i prowadzi do poważnych problemów społeczno-ekonomicznych3.

Podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) jest jednym z najważniejszych i jedynym modyfikowalnym czynnikiem ryzyka rozwoju i progresji jaskry. Spośród wielu typów jaskry wszystkie, z wyjątkiem jaskry normalnego napięcia (NTG), są związane z podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym w pewnym momencie historii klinicznej choroby. Pomimo niezwykłych postępów klinicznych i chirurgicznych w zakresie celowania w ciśnienie wewnątrzgałkowe i spowalniania lub zatrzymywania postępu choroby, pacjenci nadal tracą wzrok z powodu jaskry4,5. Dlatego dokładne zrozumienie złożonej i wieloczynnikowej patofizjologii tej choroby jest niezbędne do opracowania skuteczniejszych metod leczenia, zwłaszcza w celu zapewnienia neuroprotekcji RGC.

Wśród różnych eksperymentalnych podejść do zrozumienia mechanizmów choroby, modele zwierzęce oparte na nadciśnieniu ocznym (OHT) najbardziej przypominają jaskrę ludzką. Modele gryzoni są szczególnie przydatne, ponieważ są tanie, łatwe w obsłudze, mogą być modyfikowane genetycznie, mają krótką żywotność i wykazują cechy anatomiczne i fizjologiczne oka porównywalne z ludzkimi, takie jak produkcja i drenaż cieczy wodnistej6,7,8,9,10,11,12,13. Obecnie stosowane modele obejmują stwardnienie siatki beleczkowej po wstrzyknięciu hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej do żył nadtwardówkowych14, dokomorowe wstrzykiwanie mikrogranulek15 lub substancje lepkosprężyste16, kauteryzacja żył wirowych17, fotokoagulacja siatki beleczkowej za pomocą lasera argonowego18, szew okołolimbowy19oraz wykorzystanie transgenicznego modelu OHT związanego z wiekiem (myszy DBA/2J)8. Jednak inwazyjność, pooperacyjne zmętnienie rogówki, przerwanie przedniego odcinka, rozległe krzywe uczenia się, drogi sprzęt i bardzo zmienne pooperacyjne IOPS to tylko niektóre z niewielu zgłaszanych pułapek związanych z obecnymi modelami, co sprawia, że opracowanie alternatywnego modelu OHT jest wymogiem przezwyciężenia tych problemów20,21,22.

Obecny protokół formalizuje nowatorską procedurę chirurgiczną mającą na celu wywołanie OHT jako wskaźnika jaskry, opartą na kauteryzacji splotu rąbkowego (LPC) u gryzoni23. Jest to łatwy, powtarzalny, dostępny i nieinwazyjny model, który zapewnia wysoką skuteczność i niską zmienność wzrostu ciśnienia wewnątrzgałkowego, co wiąże się z wyjątkowo wysokim wskaźnikiem pełnego powrotu do zdrowia klinicznego, zapewniając w ten sposób ocenę funkcjonalną in vivo u zmniejszonej liczby zwierząt wykorzystanych w każdym eksperymencie. Technika chirurgiczna indukuje podostre OHT ze stopniowym powrotem do poziomów wyjściowych w ciągu kilku dni, co modeluje atak nadciśnieniowy obserwowany w ostrej jaskrze z zamkniętym kątem przesączania. Co więcej, po powrocie do ciśnienia wewnątrzgałkowego w modelu następuje ciągła neurodegeneracja jaskry, co jest przydatne w przyszłych badaniach mechanistycznych wtórnego zwyrodnienia RGC, które występuje w kilku przypadkach jaskry ludzkiej pomimo odpowiedniej kontroli IOP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Oświadczeniem o Wykorzystaniu Zwierząt w Badaniach Oftalmicznych i Wizualnych Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) oraz zatwierdzonym przez Komitet Etyki ds. Wykorzystania Zwierząt w Eksperymentach Naukowych z Centrum Nauk o Zdrowiu, Federalny Uniwersytet Rio de Janeiro (protokół 083/17). W niniejszej pracy wykorzystano szczury Lister Hooded obu płci, w wieku 2-3 miesięcy i o wadze 180-320 g. Jednak procedura może być dostosowana do różnych szczepów szczurów w różnym przedziale wiekowym.

1. Operacja nadciśnienia ocznego i obserwacja kliniczna

  1. Zwierzęta trzymane w pomieszczeniach o kontrolowanej temperaturze i 12-godzinnym cyklu światło/ciemność (6 rano: światło włączone / 6 wieczorem: wyłączone) ze standardowym granulowanym pokarmem napromieniowanym promieniowaniem gamma (Nuvilab® CR-1, Quimtia S/A, Brazylia) i wodą (potrójny filtr, z nietoksycznym węglem aktywnym) dostępnym ad libitum.
  2. Przygotuj podstawowy koktajl znieczulający składający się z trzech części 10% chlorowodorku ketaminy i jednej części 2% chlorowodorku ksylazyny (rozcieńczalnik: sterylna woda).
  3. Delikatnie przytrzymać zwierzę trzymając skórę grzbietową i wywołać znieczulenie, podając dootrzewnowo 1 μl/g masy ciała mieszaniny (ketamina: 75 mg/kg; ksylazyna: 5 mg/kg). Sprawdź, czy znieczulenie jest prawidłowe po około 5 minutach, wykonując reakcję szczypania palca u nogi.
  4. Znieczulić miejscowo obie powierzchnie oczu, wkraplając 0,5% kropli do oczu chlorowodorek proksymetakainy. Odczekaj 30-60 s i usuń pozostały roztwór z przedniej części gałki ziemskiej, delikatnie dotykając spojówki nosowej lub bocznej opuszkowej małym sterylnym wacikiem.
  5. Zmierz wyjściowe ciśnienie wewnątrzgałkowe zarówno eksperymentalnych, jak i przeciwległych oczu kontrolnych, umieszczając zwierzę w brzusznej pozycji odleżynowej na stole tak, aby powierzchnia rogówki była łatwo dostępna dla końcówki tonometru.
  6. Użyj przenośnego tonometru aplanacyjnego lub odbicia (Rysunek 1A). Ustaw końcówkę tonometru tak, aby lekko dotykała prostopadle środkowej strefy rogówki. Zdobądź i uśrednij 3-5 wiarygodnych średnich generowanych maszynowo. Każda średnia jest automatycznie obliczana przez urządzenie po sześciu udanych indywidualnych pomiarach.
    1. Załaduj tonometr odbicia sondą i naciśnij raz przycisk pomiaru, aby go włączyć, jednocześnie umieszczając końcówkę urządzenia do góry, aby uniknąć upadku sondy. Po włączeniu na wyświetlaczu pojawi się 00 wskazujące, że sprzęt jest gotowy do pomiaru.
    2. Ustaw urządzenie końcówką sondy w odległości 1-4 mm od rogówki i uzyskaj pomiary, szybko i ostrożnie naciskając przycisk pomiaru, bez przesuwania urządzenia. Każdy udany pomiar jest identyfikowany krótkim sygnałem dźwiękowym, a po sześciu razach średnia jest wyświetlana na ekranie urządzenia.
      UWAGA: Pomimo długiego doświadczenia z tonometrem aplanacyjnym, w celu optymalizacji całej procedury autorzy zalecają zastosowanie tonometru odbicia, który zapewnia łatwiejsze uzyskanie wiarygodnego pomiaru IOP.
  7. Umieść zwierzę w lekkiej bocznej pozycji odleżynowej pod mikroskopem stereoskopowym i starannie zaplanuj operację, oglądając eksperymentalne oko w 40-krotnym powiększeniu. Nie zapomnij o utrzymaniu nawilżenia przeciwległego oka kontrolnego podczas zabiegu poprzez wkroplenie kropli karmelozy sodowej lub hialuronianu sodu.
  8. Za pomocą zakrzywionych kleszczyków delikatnie popchnij eksperymentalną gałkę oczną do przodu, aby odsłonić układ naczyniowy otaczający 360° limbus13. Drugą ręką delikatnie kauteryzuj naczynia wokół rogówki za pomocą niskotemperaturowego kauteryzacji okulistycznej (1,300 ° F; Bovie Medical, Stany Zjednoczone) (Rysunek 1B-E).
    UWAGA: Wspomniana kauteryzacja ma okrągłą końcówkę, która powinna dotykać wzdłużnie rąbka
    9. .
  9. Należy uważać, aby nie kauteryzować obwodu rogówki, ponieważ może to spowodować pooperacyjne zmętnienie rogówki, co wyklucza ocenę funkcji siatkówki in vivo.
  10. Obserwuj pojawienie się małych kolistych śladów kauteryzacji na rąbku twardówki, zatarcie naczyń rąbkowych i rozszerzenie źrenicy w operowanym oku, które są oznakami udanego zabiegu chirurgicznego.
    UWAGA: Ponieważ unaczynienie rąbkowe szczurów i myszy jest anatomicznie podobne13,24, a zastosowana kauteryzacja ma delikatną małą końcówkę, ten protokół może działać również dla oka myszy bez żadnej adaptacji.
  11. Po zabiegu należy sprawdzić bezpośrednio po operacji ciśnienie wewnątrzgałkowe w obu oczach, jak opisano w kroku 1.5.
  12. Nałóż kroplę octanu prednizolonu (1,2 mg / ml) i utrzymuj ją w kontakcie z przednią powierzchnią oka doświadczalnego przez około 40 s, a następnie zastąp ją maścią okulistyczną z antybiotykami (chlorowodorek oksytetracykliny 30 mg / g plus polimyksyna B 10 000 U/g; lub cyprofloksacyna 3,5 mg / g). Wykonać domięśniowe wstrzyknięcie chlorowodorku tramadolu (pojedyncza dawka; 2 mg/kg), aby zapobiec bólowi po zabiegu.
  13. Uważnie obserwuj powrót zwierzęcia do zdrowia po znieczuleniu, najlepiej w ciepłym otoczeniu, takim jak poduszka grzewcza lub w klatce z odpowiednią ściółką. Zwróć uwagę na wzorzec oddechowy.
  14. Przeprowadzaj codzienną obserwację kliniczną oka eksperymentalnego za pomocą leków miejscowych składających się z niesteroidowego leku przeciwzapalnego (NLPZ, np. ketorolac trometamol 0,5% kropli do oczu) i maści z antybiotykiem (najlepiej tej samej, którą stosuje się bezpośrednio po operacji).
    UWAGA: Zaleca się stosowanie NLPZ zamiast steroidowych przeciwzapalnych kropli do oczu, ponieważ te ostatnie mogą indukować OHT i są regularnie stosowane w modelach jaskry wywołanej glikokortykosteroidami u gryzoni.
    1. W lekkim uspokojeniu (ketamina: 18,75 mg/kg; ksylazyna: 1,25 mg/kg) należy preferencyjnie mierzyć ciśnienie wewnątrzgałkowe o tej samej porze dnia, aby uniknąć błędu systematycznego spowodowanego fizjologicznymi wahaniami ciśnienia wewnątrzgałkowego w rytmie dobowym.
    2. Podczas badania okulistycznego należy zwrócić uwagę na rzadkie wystąpienia kliniczne, takie jak strzępka, zwłóknienie rogówki lub ścieńczenie twardówki związane z wypadnięciem błony naczyniowej oka. Obrzęk rogówki, chemoza i przekrwienie spojówek są powszechne, ale tymczasowe.
    3. Zauważ pełną regenerację kliniczną około 7 dnia po operacji. Rewaskularyzacja rąbka ramienia zwykle rozpoczyna się w ciągu pierwszych dwóch dni po operacji, zgodnie z oczekiwanym stopniowym powrotem IOP do stanu wyjściowego.

2. Analiza odpowiedzi optomotorycznej (OMR)

UWAGA: Do tej procedury użyto określonego systemu25.

  1. Ustaw cztery monitory komputerowe w czworoboku, który wyznacza arenę z platformą pośrodku. Na monitorach wyświetlaj obraz wirtualnego cylindra z pionowo zorientowanymi siatkami sinusoidalnymi (naprzemienne czarno-białe paski), obracającego się wokół platformy ze stałą prędkością (12 stopni/s) i kontrastem (100%).
  2. Umieść kamerę wideo nad platformą, aby eksperymentator mógł obserwować ruchy zwierzęcia. Wykonaj test w warunkach fotopowych i ustaw oprogramowanie preferencyjnie na tryb ręczny/osobny, aby ocenić każde oko z osobna.
  3. Pozwól zwierzętom przyzwyczaić się na platformie przez około 2 minuty. Utrzymuj czerwony kursor celownika na klatce wideo między oczami swobodnie poruszającego się zwierzęcia, ponieważ wskazuje on środek wirtualnego cylindra (Rysunek 1G)25.
  4. Obserwuj OMR, polegający na odruchowym śledzeniu głowy i szyi zwierzęcia wywoływanym przez obracające się kraty. Przetestuj lewą i prawą ścieżkę wzrokową, obracając kierunki siatek sinusoidalnych odpowiednio zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.
    1. Początkowo prezentują bodziec o niskiej częstotliwości przestrzennej (0,042 cykli/stopień). Następnie stopniowo zwiększaj częstotliwość, aż ruch śledzenia przestanie być zauważalny. Najwyższa częstotliwość przestrzenna, w której wywoływany jest wyraźny OMR, odpowiada progowej częstości przestrzennej ocenianego oka.
    2. Jeśli zwierzę w końcu spadnie z platformy podczas egzaminu, natychmiast zwróć je na platformę i wznów test.

3. Zapis wzorca-elektroretinogramu (PERG)

UWAGA: Elektroretinogram został zarejestrowany przy użyciu specjalnego systemu do przetwarzania sygnałów i powiązanego oprogramowania do przechowywania i analizy przebiegów.

  1. Głęboko znieczulić zwierzęta poprzez domięśniowe wstrzyknięcie chlorowodorku ketaminy i chlorowodorku ksylazyny (odpowiednio 75 mg/kg i 5 mg/kg). Głębokie znieczulenie (płaszczyzna chirurgiczna) zmniejsza ryzyko wystąpienia artefaktów spowodowanych mimowolnymi ruchami mięśni lub alternatywnymi źródłami hałasu podczas badania. Sprawdź, czy znieczulenie jest prawidłowe, wykonując reakcję na szczypanie palca u nogi.
    UWAGA: Wymienione środki znieczulające nie wpływają na amplitudę odpowiedzi26. Ponieważ mała igła wprowadzona do rogówki została użyta jako elektroda aktywna, preferowane jest znieczulenie domięśniowe zamiast dootrzewnowego, ponieważ łatwiej jest ponownie wstrzyknąć w przypadku, gdy szczur potrzebuje dawki przypominającej (1/2 dawki początkowej), z mniejszymi szansami na modyfikację położenia elektrody, a tym samym prowadząc do bardziej powtarzalnych zapisów podczas całego eksperymentu, które mogą trwać do 60 min.
  2. Znieczulenie miejscowo rogówki kroplą chlorowodorku proksymetakainy 0,5% i utrzymuj nawilżenie drugiego oka lubrykantami okulistycznymi.
  3. Ostrożnie wprowadzić aktywną elektrodę (igła ze stali nierdzewnej 0,25 mm × 15 mm) na skroniowym obrzeżu rogówki. Dodatkowo włóż elektrody odniesienia i uziemiającą (igła ze stali nierdzewnej 0,4 mm × 37 mm) do tkanki podskórnej ipsilateralnego kąta skroniowego i odpowiednio do jednej z kończyn tylnych (Rysunek 1I).
  4. W przypadku PERG ustaw bodziec na czarno-białą szachownicę rezerwującą, na przemian z prędkością 15 odwróceń/s ze stałą średnią luminancją (250 cd/m2). Ustaw filtr pasmowo-przepustowy na 1 Hz-100 Hz.
    UWAGA: Szybki bodziec odwracający generuje PERG w stanie ustalonym, stabilną i odtwarzalną sinusoidę, która gromadzi składową falową najprawdopodobniej związaną z reakcją bioelektryczną RGC: odchylenie NII stanu przejściowego PERG.
  5. Umieść zwierzę w odległości 20 cm od ekranu bodźca (monitor LCD 0,58 m; Rysunek 1I), monitoruj linię bazową sygnału i rozpocznij akwizycję PEREG, naciskając przycisk Analiza w systemie akwizycji.
  6. Podczas zabiegu należy utrzymywać zwierzęta przystosowane do światła otoczenia (białe światło o natężeniu ~140 luksów). W tym przypadku sześć różnych częstotliwości przestrzennych (w cyklach na stopień: 0,018, 0,037, 0,073, 0,146, 0,292, 0,585) zostało zaprezentowanych w losowej kolejności.
    UWAGA: Oprogramowanie używane do przetwarzania sygnału automatycznie przeprowadza uśrednianie. Średnia 200-300 pojedynczych fal została uznana za wystarczającą, aby wyróżnić się z szumu i przeanalizować amplitudę fal.

4. Kwantyfikacja komórek zwojowych siatkówki

UWAGA: Poniższa procedura służy do ilościowego oznaczania somy RGC, opartej na immunohistochemicznym barwieniu płaskich wierzchowców siatkówki przeciwciałem przeciwko specyficznemu dla mózgu białku homeobox/domenie POU 3A (Brn3a).

  1. Poddaj zwierzęta doświadczalne eutanazji zwichnięcia szyjki macicy, poprzedzonej wdychaniem dwutlenku węgla w celu wywołania utraty przytomności.
  2. Bezpośrednio po eutanazji należy przeprowadzić sekcję obu oczu pod mikroskopem stereoskopowym, używając kleszczy zębatych i zakrzywionych nożyczek.
  3. Przeprowadzić staranną sekcję tak, aby zarówno dystalna część mięśni zewnątrzgałkowych, jak i karułek pozostały przyczepione do gałki ocznej, ponieważ są ważnymi punktami orientacyjnymi dla orientacji topograficznej siatkówki (opisanej w kroku 4.5). Postaraj się zachować odcinek nerwu wzrokowego przyczepionego do kuli ziemskiej tak długo, jak to możliwe, do przyszłej analizy.
  4. Po enukleacji umieść oczy w 1 ml roztworu 4% paraformaldehydu (4% PFA) w 0,1 M buforze fosforanowym (PBS) i trzymaj go przez 24 godziny w celu prawidłowego utrwalenia chemicznego.
  5. Oddziel siatkówkę od reszty tkanek oka.
    1. Pod mikroskopem preparacyjnym umieść gałkę oczną na szalce Petriego pokrytej 1x PBS i zwróć uwagę na ważne punkty orientacyjne, takie jak karunek nosowy, szczeliny naczyniówki i odciski twardówki z żył wirowych, aby zapewnić prawidłową orientację topograficzną27.
    2. Przeniknij do przedniej komory z centralnej rogówki za pomocą ząbkowanych kleszczy i zakrzywionych nożyczek (westcott). Wykonaj dwa promieniste cięcia w górnej (grzbietowej) części twardówki, w kierunku otworu twardówkowego nerwu wzrokowego, tak aby wyznaczyć grzbietowy kwadrant gałki ocznej.
    3. Oddziel rogówkę od reszty kuli ziemskiej za pomocą podłużnego cięcia 360° na rąbku twardówki. Usunąć soczewkę i tęczówkę i wyznaczyć kwadrant grzbietowej siatkówki, stosując te same promieniowe rozgraniczenia twardówki, które opisano powyżej (krok 4.5.2).
    4. Ostrożnie odłącz tkankę siatkówki od naczyniówki i twardówki, unikając zarówno przypadkowych skaleczeń w całej tkance, jak i ewentualnej utraty orientacji topograficznej.
    5. Oddziel ciało rzęskowe od siatkówki lub serrata. Ostrożnie usuń pozostały ciałko szkliste z miseczki siatkówki, używając zarówno zakrzywionych, nieząbkowanych kleszczy, jak i zakrzywionych nożyczek (pociągnij ciało szkliste i wypreparuj je blisko wewnętrznej błony ograniczającej) i małej szczoteczki.
      UWAGA: Usunięcie cieczy ciała szklistego jest ważnym krokiem do uzyskania silnego i czystego sygnału immunohistochemicznego.
  6. Przenieś izolowane siatkówki na 24-dołkową płytkę hodowlaną (jedna siatkówka na dołek) zawierającą 1 ml 1x PBS i trzymaj wewnętrzną siatkówkę skierowaną do góry.
  7. Przepuszczalność tkanek poprzez przemycie 3x przez 10 min niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym 0,5% rozcieńczonym w 1x PBS (0,3 ml). Następnie delikatnie wstrząsaj tkanką w 5% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w niejonowym środku powierzchniowo czynnym 2% i 1x PBS (roztwór blokujący; 0,25 ml) przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
  8. W kroku 4.7 przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego Brn3a, rozcieńczając go w stosunku 1:200 w 0,5% niejonowym środku powierzchniowo czynnym i 1x PBS plus 5% BSA, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C.
  9. Po 60 minutach blokowania tkanek inkubować siatkówki w 0,2 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego w temperaturze 4 °C przez 72 godziny, delikatnie wstrząsając.
  10. Myć tkankę 3x przez 10 min z 1x PBS, następnie inkubować tkankę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w 0,2 ml roztworu przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego 1:750 w 1x PBS plus 5% BSA.
  11. Następnie inkubować tkankę przez 10 minut w roztworze przeciwbarwnika jądrowego do barwienia jąder fluorescencyjnych. Zakończ immunohistochemię ostatnim etapem płukania z 1x PBS (0,3 ml) powtórzonym 3x.
  12. Przenieś siatkówki za pomocą dwóch małych szczoteczek na szklane szkiełka mikroskopowe, utrzymując stronę szklistą do góry. Umieść kwadrant grzbietowej siatkówki do góry na szkiełkach mikroskopowych (wcześniej wyznaczonych w kroku 4.5.3). Wykonaj jeszcze dwa promieniste nacięcia w kierunku głowy nerwu wzrokowego, aby wyznaczyć pozostałe 3 ćwiartki (nosową, brzuszną i skroniową).
    UWAGA: Wymiary cięcia nie są stałe. Nie powinny być zbyt krótkie, aby upośledzać skuteczne spłaszczenie siatkówki na szkiełku i nie powinny być zbyt długie, aby docierały do otworu nerwu wzrokowego i całkowicie oddzielały wyznaczony kwadrant siatkówki od reszty tkanki.
  13. Na koniec nałóż 0,2 ml podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu na szklane szkiełko nakrywkowe i umieść je na płasko zamontowanej siatkówce w celu analizy mikroskopowej tkanek. Aby oszacować gęstość RGC, zbadaj płaskie mocowania pod konfokalnym mikroskopem epifluorescencyjnym przy użyciu obiektywu 40x/1,3.
  14. Dla każdej ćwiartki siatkówki wykonaj osiem zdjęć: dwa z centralnej siatkówki (~0,9 mm od tarczy nerwu wzrokowego), trzy ze środkowej siatkówki (~2,0 mm od tarczy nerwu wzrokowego) i trzy z siatkówki obwodowej (~3,7 mm od tarczy nerwu wzrokowego), co daje w sumie 32 zdjęcia na siatkówkę. Użyj oprogramowania FIJI, aby policzyć komórki Brn3a-dodatnie i oszacować średnią gęstość komórek.

5. Badanie nerwu wzrokowego

  1. Po eutanazji i enukleacji gałki ocznej (kroki 4.1-4.3) należy usunąć proksymalny odcinek wewnątrzoczodołowej części nerwu wzrokowego (1-2 mm), w tym część wewnątrzgałkową i natychmiast umieścić próbki w fiolkach/probówkach zawierających 0,2-0,3 ml zimnego utrwalacza (2,5% roztwór aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,4)) przez 2 godziny
    UWAGA: Następujące kroki przetwarzania nerwu wzrokowego są wykonywane w tych samych fiolkach/probówkach z kroku 5.1
  2. Przemyć materiał 3x przez 5 min zimnym 0,1 M buforem kakodylanu sodu. Po utrwaleniu tkanki przez 1 godzinę pod delikatnym wstrząsaniem w roztworze 1,0% tetratlenku osmu w 0,8% żelazocyjanku potasu i 5 nM chlorku wapnia rozcieńczonego w 0,1 M buforze kakodylanu sodu w temperaturze 4 °C (0,1-0,2 ml).
  3. Przemywać fragmenty nerwu wzrokowego 3x przez 5 min zimnym 0,1 M buforem kakodylanu sodu, a następnie zimną wodą destylowaną, 3x przez 1 min. Przechowywać materiał przez noc pod delikatnym wstrząsaniem w roztworze 1,0% octanu uranylu w wodzie destylowanej do barwienia w temperaturze 4 °C (0,1-0,2 ml). Umyj fragmenty 3x zimną wodą destylowaną.
  4. Stopniowo odwadniać tkankę za pomocą stopniowanej serii acetonów (po 0,5 ml każda), a następnie zastępować następujące rozcieńczenia w wodzie destylowanej: 2x 7 min inkubacja w 15% lodowatym acetonie; 2x 7 min inkubacja w 30% lodowatym acetonie; 2x 7 min inkubacja w 50% lodowatym acetonie; 2x 7 min inkubacja w 70% lodowatym acetonie; 2x 7 min inkubacja w 80% lodowatym acetonie; 2x 7 min inkubacja w 90% lodowatym acetonie; 2x 15 min inkubacja w 100% aceton w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Wykonaj 3 etapy infiltracji/zatapiania, a następnie zamianę następujących roztworów: 1 część żywicy epoksydowej: 2 części acetonu (całkowita objętość: 0,5 ml), w temperaturze pokojowej przez 12 godzin; 1 część żywicy epoksydowej: 1 część acetonu (całkowita objętość: 0,5 ml), w temperaturze pokojowej przez 12 godzin; 2 części żywicy epoksydowej: 1 część acetonu (całkowita objętość: 0,5 ml), w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Na koniec naciekaj tkankę w czystej żywicy epoksydowej w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.
  6. Wyjąć próbki z nośnika próbki, przenieść je do form do zatapiania i pozostawić do polimeryzacji przez 48 godzin w temperaturze 60 °C. Wyciąć poprzeczne półcienkie odcinki (300-400 nm) fragmentów nerwu wzrokowego za pomocą ultramikrotomu, zebrać i przenieść na szkiełko mikroskopowe. Zabarwić skrawki błękitem toluidynowym i zobrazować za pomocą mikroskopu optycznego przy 100-krotnym powiększeniu.
  7. W celu analizy ultrastrukturalnej należy wykonać ultracienkie przekroje (70 nm), zebrać je na miedzianych siatkach i wybarwić octanem uranylu i cytrynianem ołowiu. Zbadaj skrawki w transmisyjnym mikroskopie elektronowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmienne ilościowe są wyrażone jako średnia ± błąd standardowy średniej (SEM). Z wyjątkiem porównania dynamiki IOP między OHT a grupami kontrolnymi (Rysunek 1F), przeprowadzono analizę statystyczną przy użyciu dwukierunkowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Sidaka. Wartość p < 0,05 uznano za statystycznie istotną.

Rysunek 1 ilustruje etapy chirurgiczne modelu kauteryzacji splotu rąbkowego (LPC) w pełnym okręgu, z ważnym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kauteryzacja splotu rąbkowego (LPC) jest nowatorskim modelem postbeleczkowym, którego zaletą jest to, że jest ukierunkowana na łatwo dostępne struktury naczyniowe, które nie wymagają rozwarstwienia spojówki lub czopa17,28. W przeciwieństwie do modelu kauteryzacji żył wirowych, renomowanego modelu OHT opartego na chirurgicznym upośledzeniu drenażu żylnego naczyniówki, nie oczekuje się, że przekrwienie żylne wpłynie na wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego w modelu LP...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy naszym technikom laboratoryjnym José; Nilson dos Santos, Daianne Mandarino Torres, José Francisco Tibúrcio, Gildo Brito de Souza i Luciano Cavalcante Ferreira. Badania te zostały sfinansowane przez FAPERJ, CNPq i CAPES.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonIsofar201Używany do mikroskopii elektronowej Przygotowanie tkanek (krok 5)
Aktywna elektroda do elektroretinografiiHansol MedicalCo-Igłaze stali nierdzewnej 0,25 mm i razy; 15 mm
AnestalconNovartis Biociê ncias S/AMS-1.0068.1087Chlorowodorek proksymetakainy 0,5%
Chlorek wapniaVetec560Stosowany do przygotowania tkanek za pomocą mikroskopii elektronowej (krok 5)
Kauteryzacja Low Temp Fine Tip 10 / bxBovie Medical CorporationAA00Niskotemperaturowa kauteryzacja okulistyczna
CetaminSyntec do Brasil Ltda000200-3-000003Chlorowodorek ketaminy 10%
DAKODako North AmericaS3023Środek montażowy zapobiegający blaknięciu
DAPIThermo Fisher Scientific28718-90-3diamidyn-2-fenyloindol; niebieskie fluorescencyjne przeciwbarwienie jądrowe; emisja przy 452± 3 nm
EcofilmCrist&aaostry; lia Produtos Quí micos Farmacê uticos LtdaMS-1.0298.0487Karmeloza sodowa 0,5%
EPONŻywica Polysciences, Inc.-Żywica epoksydowa stosowana do mikroskopii elektronowej, złożona z mieszaniny czterech odczynników: Żywica Poly / Bed 812 (CAT#08791); DDSA - bezwodnik dodecenylusztynkowy (CAT#00563); NMA - Bezwodnik metylu nadic (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimetyloaminometylo)fenol (CAT#00553)
Mikroskopia elektronowaaldehydu glutarowegoSciences 16110Używany do przygotowania tkanek za pomocą mikroskopii elektronowej (krok 5)
HyabakUniã o Quí mika Farmacê utica Nacional S/AMS-8042140002Hialuronian sodu 0,15%
Icare TonolabIcare Finland OyTV02 (numer modelu)Ręczny tonometr odbicia
Przeciwciało przeciw myszom osła IgG + Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA31570Wtórny roztwór przeciwciał
Monitor LCD 23 caleSamsung Electronics Co., Ltd.S23B550Model LS23B550, do zapisu elektroretinogramu
LSM 510 MetaCarl Zeiss-Konfokalnymikroskop epifluorescencyjny
MaxifloxCristá lia Produtos Quí micos Farmacê uticos LtdaMS-1.0298.0489Ciprofloksacyna 3,5 mg / g
MEB-9400KNihon KohdenCorporation-Systemdo rejestracji elektroretinogramu
monoklonalnego mysiego IgG1 anty-Brn3aMilliporeSigmaMAB-1585Brn3a roztwór przeciwciał pierwotnych
Neuropack Manager v08.33Nihon KohdenCorporation-Oprogramowaniedo przetwarzania
sygnałów elektroretinogramuOptomotriaMechanikamózgowa-Systemdo analizy odpowiedzi optomotorycznej
Tetratlenek osmuMikroskopia elektronowa Nauki19100Używany do mikroskopii elektronowej Przygotowanie tkanek (krok 5)
Żelazocyjanek potasuMikroskopia elektronowa Nauki20150Używany do przygotowania tkanek w mikroskopii elektronowej (krok 5)
Elektrody referencyjne i uziemiające do elektroretinografiiChalgren Enterprises110-63Igły ze stali nierdzewnej 0,4 mm i razy; 37 mm
Bufor kakodylanu soduMikroskopia elektronowa Sciences12300Służy do przygotowania tkanek pod mikroskopią elektronową (krok 5)
Ster MDUniã o Quí mika Farmacê utica Nacional S/AMS-1.0497.1287Octan prednizolonu 0,12%
TerolacCristá lia Produtos Quí micos Farmacê uticos LtdaMS-1.0497.1286Ketorolac trometamol 0,5%
TerramicinaLaborató rios Pfizer LtdaMS-1.0216.0024Chlorowodorek oksytetracykliny 30 mg/g + polimyksyna B 10 000 U/g
Tono-Pen XLReichert Technologies230635Ręczny tonometr do oznaczania cyfrowego
TO-PRO-3Thermo Fisher ScientificT3605Dalekosiężne czerwono-fluorescencyjne odbarwienie jądrowe; emisja przy 661 nm
Triton X-100Sigma-Aldrich9036-19-5Niejonowy środek powierzchniowo czynny
Octan uranyluMikroskopia elektronowa Sciences22400Służy do przygotowania tkanek za pomocą mikroskopii elektronowej (krok 5)
XilazinSyntec do Brasil Ltda7899Chlorowodorek ksylazyny 2%
Carl Zeiss-Stereodo chirurgii i rozwarstwienia siatkówki
Mikroskop

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. The Pathophysiology and Treatment of Glaucoma A Review. JAMA. 311 (8), 1901-1911 (2014).
  2. Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: A systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
  3. Quaranta, L., et al. Quality of Life in Glaucoma: A Review of the Literature. Advances in Therapy. 33 (6), 959-981 (2016).
  4. Heijl, A., et al. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Archives of Ophthalmology. 120 (10), Chicago, Ill. 1268-1279 (2002).
  5. Susanna, R., De Moraes, C. G., Cioffi, G. A., Ritch, R. Why Do People (Still) Go Blind from Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 4 (2), 1(2015).
  6. Fujikawa, K., et al. VAV2 and VAV3 as candidate disease genes for spontaneous glaucoma in mice and humans. PLoS One. 5 (2), 9050(2010).
  7. Mao, M., Hedberg-Buenz, A., Koehn, D., John, S. W., Anderson, M. G. Anterior segment dysgenesis and early-onset glaucoma in nee mice with mutation of Sh3pxd2b. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2679-2688 (2011).
  8. John, S. W., et al. Essential iris atrophy, pigment dispersion, and glaucoma in DBA/2J mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (6), 951-962 (1998).
  9. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Ocular hypertension in mice with a targeted type I collagen mutation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (4), 1581-1585 (2003).
  10. Chou, T. H., Tomarev, S., Porciatti, V. Transgenic mice expressing mutated Tyr437His human myocilin develop progressive loss of retinal ganglion cell electrical responsiveness and axonopathy with normal iop. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (9), 5602-5609 (2014).
  11. vander Zypen, E. Experimental morphological study on structure and function of the filtration angel of the rat eye. Ophthalmologica. 174 (5), 285-298 (1977).
  12. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Aqueous humor dynamics in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5168-5173 (2003).
  13. Morrison, J. C., Fraunfelder, F. W., Milne, S. T., Moore, C. G. Limbal microvasculature of the rat eye. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 751-756 (1995).
  14. Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
  15. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: A paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
  16. Zhu, M. D., Cai, F. Y. Development of experimental chronic intraocular hypertension in the rabbit. Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology. 20 (3), 225-234 (1992).
  17. Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61 (3), 379-382 (1995).
  18. Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 402-410 (2002).
  19. Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
  20. Biswas, S., Wan, K. H. Review of rodent hypertensive glaucoma models. Acta Ophthalmologica. 97 (3), 331-340 (2019).
  21. Pitha, I., et al. Sustained Dorzolamide Release Prevents Axonal and Retinal Ganglion Cell Loss in a Rat Model of IOP-Glaucoma. Translational Vision Science & Technology. 7 (2), 13(2018).
  22. Grozdanic, S. D., et al. Temporary elevation of the intraocular pressure by cauterization of vortex and episcleral veins in rats causes functional deficits in the retina and optic nerve. Experimental Eye Research. 77 (1), 27-33 (2003).
  23. Lani, R., et al. A subacute model of glaucoma based on limbal plexus cautery in pigmented rats. Scientific Reports. 9 (1), 16286(2019).
  24. vander Merwe, E. L., Kidson, S. H. The three-dimensional organisation of the post-trabecular aqueous outflow pathway and limbal vasculature in the mouse. Experimental Eye Research. 125, 226-235 (2014).
  25. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  26. Sasovetz, D. Ketamine hydrochloride: an effective general anesthetic for use in electroretinography. Annals of Ophthalmology. 10 (11), 1510-1514 (1978).
  27. Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. The Journal of Comparative Neurology. 526 (11), 1749-1759 (2018).
  28. Blanco, R., et al. A Chronic Ocular-Hypertensive Rat Model induced by Injection of the Sclerosant Agent Polidocanol in the Aqueous Humor Outflow Pathway. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3209(2019).
  29. Paranhos, A., Prata, J. A., de Mello, P. A., da Silva, F. A. Post-Trabecular Glaucomas with Elevated Episcleral Venous Pressure. Mechanisms of the Glaucomas. , Humana Press. 139-157 (2008).
  30. Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. Selective Vulnerability of Specific Retinal Ganglion Cell Types and Synapses after Transient Ocular Hypertension. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of The Society for Neuroscience. 36 (35), 9240-9252 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model jaskryNadci nienie wewn trzga koweCi nienie wewn trzga koweKom rki zwojowe siatk wkiDegeneracja nerwu wzrokowegoWzorcowy elektroretinogramOdpowied optokinetycznaTransmisyjna mikroskopia elektronowa

Powiązane artykuły