Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i badania przesiewowe pod kątem różnorodności biologicznej gleby pod kątem grzybów biorących udział w degradacji opornych materiałów

5.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/63445

⸱

16 maja 2022

 ,  , 
1Laboratory of Mycology, Department of Earth and Environmental Sciences, University of Pavia

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół badania różnorodności biologicznej gleby w poszukiwaniu szczepów grzybów biorących udział w degradacji opornych materiałów. Najpierw izoluje się szczepy grzybów, które mogą rosnąć na kwasach humusowych lub lignocelulozie. Ich aktywność jest następnie testowana zarówno w testach enzymatycznych, jak i na zanieczyszczeniach, takich jak węglowodory i tworzywa sztuczne.

Streszczenie

Zanieczyszczenie środowiska jest coraz większym problemem, a identyfikacja grzybów biorących udział w procesie bioremediacji jest kluczowym zadaniem. Gleba jest gospodarzem niesamowitej różnorodności życia mikrobiologicznego i może być dobrym źródłem tych grzybów bioremediacyjnych. Prace te mają na celu poszukiwanie grzybów glebowych o potencjale bioremediacyjnym za pomocą różnych testów przesiewowych. Jako testy wzrostu wykorzystano mineralne pożywki hodowlane uzupełnione opornymi substancjami jako jedynym źródłem węgla. Najpierw rozcieńczenia gleby rozsiano na szalkach Petriego pożywką mineralną wzbogaconą kwasami humusowymi lub lignocelulozą. Rosnące kolonie grzybów wyizolowano i przetestowano na różnych podłożach, takich jak złożone mieszaniny węglowodorów (wazelina i zużyty olej silnikowy) oraz proszki różnych polimerów tworzyw sztucznych (PET, PP, PS, PUR, PVC). Jakościowe testy enzymatyczne powiązano z testami wzrostu w celu zbadania produkcji esterazy, lakkaz, peroksydaz i proteaz. Enzymy te biorą udział w głównych procesach degradacji opornego materiału, a ich konstytutywne wydzielanie przez badane szczepy grzybów może mieć potencjał do wykorzystania w bioremediacji. Wyizolowano i przetestowano ponad 100 szczepów, w wyniku których znaleziono kilka izolatów o dobrym potencjale bioremediacyjnym. Podsumowując, opisane testy przesiewowe są łatwą i tanią metodą identyfikacji szczepów grzybów o potencjale bioremediacyjnym z gleby. Ponadto możliwe jest dostosowanie testów przesiewowych dla różnych zanieczyszczeń, zgodnie z wymaganiami, poprzez dodanie innych opornych substancji do minimalnej ilości pożywek hodowlanych.

Wprowadzenie

Gleba jest podstawowym składnikiem życia na Ziemi i stanowi podstawę wielu ekosystemów. Minerały, materię organiczną i mikroorganizmy w glebie można uznać za jeden system, z bliskimi powiązaniami i interakcjami zachodzącymi między nimi. Interakcje tych związków mają istotny wpływ na procesy lądowe, jakość środowiska i zdrowie ekosystemu1. Zanieczyszczenie gleby stanowi poważny problem środowiskowy na całym świecie. Masowe, długotrwałe i nadmierne stosowanie opornych i toksycznych substancji, takich jak pestycydy, produkty ropopochodne, tworzywa sztuczne i inne chemikalia, ma poważny wpływ na ekologię gleby, a w rezultacie może zmienić mikrobiotę glebową. Zbiorowiska mikroorganizmów w glebach składają się z szerokiej gamy organizmów w różnych stanach fizjologicznych, z których większość to bakterie i grzyby. Wiele zanieczyszczeń w glebie ma średnio- i długoterminową stabilność, a ich trwałość może prowadzić do rozwoju mechanizmów adaptacyjnych, które pozwalają mikroorganizmom wykorzystywać oporne substancje jako składniki odżywcze2,3. Mikroorganizmy te mogą być zatem brane pod uwagę w technikach bioremediacji.

Bioremediacja próbuje złagodzić skutki zanieczyszczenia poprzez wykorzystanie mikroorganizmów i ich enzymów do degradacji lub przekształcania odpadów w mniej toksyczne lub nietoksyczne związki. Różne gatunki archeonów, bakterii, glonów i grzybów posiadają tę zdolność bioremediacji4. Ze względu na swoje szczególne działanie biodegradacyjne grzyby są szczególnie obiecującymi organizmami do bioremediacji. Mogą atakować różne podłoża za pomocą swojej sieci strzępek, co pozwala im penetrować matrycę glebową skuteczniej niż inne mikroorganizmy. Dodatkowo mogą dotrzeć do niedostępnych szczelin, w których zanieczyszczenia są trudne do usunięcia5, a także mogą przetrwać niski poziom wilgoci6. Co więcej, grzyby syntetyzują różne kasety niespecyficznych enzymów, zwykle w celu degradacji naturalnych substancji opornych, takich jak celuloza, lignina i kwasy humusowe. Te, które nie mają docelowego substratu, mogą być zaangażowane w degradację szerokiej gamy opornych zanieczyszczeń, takich jak węglowodory, tworzywa sztuczne i pestycydy7,8,9,10. W związku z tym, chociaż wiele gatunków grzybów zostało już zgłoszonych jako środki bioremediacji, rośnie zainteresowanie badaniem gatunków, które nie zostały jeszcze przebadane, w celu wybrania kandydatów do bioremediacji opornych substancji zanieczyszczających. Gatunki, o których już wiadomo, że mają właściwości bioremediacyjne, należą do typu Ascomycota11,12,13, Basidiomycota14,15 i Mucoromycota. Na przykład rodzaje Penicillium i Aspergillus są dobrze znane z udziału w degradacji węglowodorów alifatycznych13, różne polimery tworzyw sztucznych16,17,18, heavy metals19 i dyes20. Podobnie, badania przeprowadzone na grzybach basidiomycetes, takich jak Phanerochaete chrysosporium i Trametes versicolor, wykazały ich udział w utlenianiu opornych materiałów, takich jak węglowodory aromatyczne13 i plastics21. Innym przykładem grzybów biorących udział w procesach biodegradacji są zygomycetes Rhizopus spp., Mucor spp. i Cunninghamella spp.22,23. W szczególności Cunninghamella jest zdolna do oksydazy węglowodorów aromatycznych i jest uważana za organizm modelowy do badania detoksykacji produktów z szerokiej gamy ksenobiotyków13.

Istnieje kilka enzymów grzybowych biorących udział w głównych procesach degradacji opornych materiałów24,25, takich jak esterazy, lakkaza, peroksydaza i proteaza. Lakkazy to oksydazy zawierające miedź wytwarzane w komórce, a następnie wydzielane, które umożliwiają utlenianie różnych związków fenolowych i aromatycznych. Mogą rozkładać orto i para difenole, fenole zawierające grupy aminowe, ligninę i diaminy zawierające grupę arylową26. Peroksydazy wykorzystują nadtlenek wodoru jako mediator do degradacji ligniny i innych związków aromatycznych. Istnieje wiele różnych peroksydaz, ale te o największym potencjale degradacji substancji toksycznych to peroksydaza ligninowa i peroksydaza manganowa27.

Esterazy i proteazy należą do grupy enzymów poza- lub ektokomórkowych, które działają poza komórkami, z których pochodzą, ale nadal są z nimi związane. Enzymy te mogą katalizować hydrolizę dużych opornych cząsteczek na mniejsze. Ze względu na niską specyficzność substratową, enzymy te mogą odgrywać kluczową rolę w bioremediacji różnych zanieczyszczeń, takich jak barwniki tekstylne, ścieki uwalniane z przemysłu celulozowo-papierniczego oraz garbowania skór, produkty ropopochodne, tworzywa sztuczne i pestycydy28,29,30.

Już opublikowano szereg metod selekcji dla bioremediacyjnych szczepów grzybów. Na przykład podłoże agarowe na bazie słomy zostało użyte do badań przesiewowych pod kątem grzybów białej zgnilizny o wysokim potencjale degradacji wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA)31; a małe kawałki gnijącego drewna zostały umieszczone na agarze z ekstraktem słodowym (MEA) w celu wyizolowania grzybów gnijących w drewnie32. Jednak większość metod, które zostały już zaproponowane, wybiera bardzo specyficzne grzyby ze względu na ich interesującą aktywność. Badania te proponują szersze podejście do wyboru grzybów glebowych o szerszym zakresie działania. Metoda polega na wstępnym posiewie seryjnych rozcieńczeń próbek gleby na pożywce wzbogaconej kwasami humusowymi lub lignocelulozą zmieszaną z antybiotykami w celu wyselekcjonowania grzybów zdolnych do rozkładu tych naturalnych, opornych substancji. Kwasy humusowe i lignoceluloza są w rzeczywistości substancjami, które są niezwykle odporne na biodegradację, ponieważ mają bardzo złożoną strukturę molekularną, co pozwala im być doskonałymi wskaźnikami zdolności degradacyjnej badanych grzybów33,34. Następnie grzyby wybrane w pierwszych testach są poddawane badaniom przesiewowym w celu zidentyfikowania tych, które mogą rozkładać określone zanieczyszczenia, takie jak wazelina, zużyty olej silnikowy i tworzywa sztuczne. Na koniec przeprowadza się jakościowe testy enzymatyczne w celu wykrycia szczepów grzybów zdolnych do wytwarzania enzymów biorących udział w procesach biodegradacji substancji opornych. W tym celu przeprowadza się testy proteazy i esterazy, a kwas galusowy i gwajakol stosuje się jako wskaźniki produkcji lakazy i innych enzymów ligninolitycznych35,36. Substraty te są używane, ponieważ stwierdzono silną korelację między zdolnością grzybów do utleniania ich do postaci brązowej a posiadaniem zdolności ligninolitycznych37,38,39.

Dzięki tym protokołom możliwe jest wyizolowanie szczepów grzybów o wysokim potencjale degradacji i szerokim spektrum działania bezpośrednio z próbek gleby. Izolacja tych szczepów grzybów może pomóc w znalezieniu nowych kandydatów do celów bioremediacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wybór szczepów grzybów zdolnych do degradacji opornych materiałów z gleby

  1. Przygotowanie roztworu antybiotyku.
    1. Umieścić penicylinę (50 mg/L), streptomycynę (40 mg/L), chlorotetracyklinę (40 mg/L), neomycynę (100 mg/L) i chloramfenikol (100 mg/L) w 250 ml dejonizowanej sterylnej wody.
    2. Przed dodaniem chloramfenikolu do roztworu antybiotyku rozpuść go w 3 ml ≥99% etanolu.
    3. Umieścić roztwór antybiotyku na mieszadle magnetycznym (bez podgrzewania) z mieszadłem magnetycznym wewnątrz roztworu na 10 minut. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotowanie pożywki wzrostowej.
    1. Umieść 1 g dostępnego w handlu kwasu humusowego, 3,26 g bulionu Bushnell-Haas (BH) i 15 g agaru do 1 l wody dejonizowanej i sterylizuj w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C (agar z kwasem humusowym).
    2. Umieść agar z kwasem humusowym na szalkach Petriego pod komorą z przepływem laminarnym.
    3. Umieścić 4 g lignocelulozy, 3,26 g BH i 15 g agaru w 1 l wody dejonizowanej i sterylizować w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C (agar lignocelulozowy).
    4. Umieść agar lignocelulozowy na szalkach Petriego w komorze z przepływem laminarnym.
    5. W komorze z przepływem laminarnym, po zestaleniu się pożywek na szalkach Petriego, przenieś 1 ml roztworu antybiotyku na przygotowane płytki za pomocą sterylnej strzykawki z filtrem 0,2 μm w celu jego sterylizacji.
    6. Rozprowadź roztwór antybiotyku równomiernie na powierzchni płytki za pomocą sterylnego jednorazowego rozsiewacza komórek w kształcie litery L i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu pod komorą z przepływem laminarnym.
    7. 20 g bulionu z ekstraktu słodowego i 15 g agaru wsypać do 1 l wody dejonizowanej i sterylizować w autoklawie przez 20 min w temperaturze 121 °C (agar z ekstraktem słodowym - MEA).
    8. Umieść MEA na szalkach Petriego w komorze z przepływem laminarnym.
  3. Pobieranie próbek gleby i rozcieńczanie gleby.
    1. Pobranie próbki interesującej nas gleby na głębokości 10 cm, usuwając wszelkie rośliny, trawę i martwe liście z wierzchniej warstwy, a następnie umieść je w sterylnych workach polietylenowych.
    2. Po dotarciu do laboratorium przesiej glebę za pomocą oczek o średnicy 2 mm, usuwając wszelkie korzenie i resztki roślin.
    3. Jeżeli nie jest możliwe natychmiastowe przeprowadzenie dalszej analizy, przesiane próbki gleby należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
    4. Pracując w komorze z przepływem laminarnym, umieść 1 g przesianej gleby w sterylnej probówce o pojemności 15 ml z 10 ml sterylnej wody dejonizowanej (rozcieńczenie 1 x 10-1). Potrząsaj probówką poziomo przez 30 minut.
    5. Pod komorą z przepływem laminarnym, zanim zawiesina opadnie, pobrać 1 ml rozcieńczenia 1 x 10-1 za pomocą sterylnej pipety i przenieść go do 9 ml ślepej próby wody dejonizowanej (rozcieńczenie 1 x 10-2). Dokładnie go wymieszaj.
    6. Zanim zawiesina opadnie, pobrać 1 ml rozcieńczenia 1 x 10-2 za pomocą sterylnej pipety i przenieść go do 9 ml ślepej próby wody dejonizowanej (rozcieńczenie 1 x 10-3). Dokładnie go wymieszaj.
  4. Rozcieńczanie gleby na podłożach selektywnych.
    1. Pracując w komorze z przepływem laminarnym, zebrać 100 μl rozcieńczenia 1 x 10-3 za pomocą mikropipety ze sterylnym punktem i przenieść na humusową agarową szalkę Petriego. Zrób to dla co najmniej 4 lub 5 szalek Petriego.
    2. Rozcieńczyć równomiernie na powierzchni szalki Petriego za pomocą sterylnego jednorazowego rozsiewacza komórek w kształcie litery L.
    3. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 10-15 minut pod komorą z przepływem laminarnym.
    4. Powtórz kroki 1.4.1.-1.4.3. używając lignocelulozowych szalek Petriego.
    5. Inkubować w temperaturze 25 °C w ciemności przez maksymalnie 15 dni.
  5. Izolacja kolonii grzybów wyhodowanych z pożywek selektywnych na pożywki wzrostowe.
    1. Począwszy od 3 dni po przygotowaniu, codziennie sprawdzaj przygotowane selektywne podłoża na szalkach Petriego pod kątem wzrostu kolonii grzybów przez maksymalnie 15 dni.
    2. Sprawdź wszystkie obecne kolonie grzybów pod kątem podobieństw. W razie potrzeby przygotuj szkiełko do obserwacji pod mikroskopem świetlnym.
      UWAGA: Celem jest wyizolowanie jak największej liczby kolonii grzybów, ale konieczne jest unikanie izolowania zawsze tego samego szczepu grzyba z różnych płytek, dlatego ta kontrola jest bardzo ważna. Szukaj kolonii o różnej makromorfologii i mikromorfologii.
    3. Pod komorą z przepływem laminarnym lub przy palniku Bunsena, wyizoluj każdy wybrany szczep grzyba, delikatnie usuwając niewielką część grzybni z kolonii za pomocą sterylnej igły do zaszczepiania i przenosząc ją na nową szalkę Petriego MEA.
      UWAGA: W tej fazie bardzo ważne jest, aby zachować delikatność i precyzję, ponieważ istnieje wysokie ryzyko zanieczyszczenia innymi koloniami grzybów obecnymi w oryginalnej szalce Petriego. Jeśli na zaszczepionej płytce MEA rośnie więcej niż jeden szczep grzyba, powtórz krok 1.5.3.
    4. Inkubować w temperaturze 25 °C w ciemności przez 7 dni. Są to szczepy grzybów, które mają być dalej testowane na określonych substancjach opornych.

2. Testy wzrostu substancji opornych

  1. Test wzrostu wazeliny.
    1. Przenieść 20 ml płynnego BH (3,26 g/L BH) do fiolek o pojemności 50 ml i sterylizować je w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut.
    2. Przenieś 7 ml dejonizowanej wody do szklanych fiolek o pojemności 15 ml i dodaj kilka kawałków potłuczonego szkła nakrywkowego do każdej fiolki.
    3. Sterylizować je w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut.
    4. Pod komorą z przepływem laminarnym dodać 1 ml wazeliny do każdej fiolki o pojemności 50 ml BH za pomocą sterylnej pipety. Przechowywać niektóre fiolki, w których jako kontrola ujemna podawany jest tylko BH.
    5. Pod komorą z przepływem laminarnym usunąć grzybnię z powierzchni pożywki z płytek MEA z wybranymi szczepami grzybów (przygotowanymi w kroku 1.5.3.) za pomocą sterylnej igły i przenieść ją do szklanych fiolek o pojemności 15 ml z połamanymi szkiełkami nakrywkowymi.
    6. Mieszać każdą fiolkę w mieszalniku wirowym przez 2 minuty, pozwalając połamanym szkiełkom nakrywkowym przeciąć kostkę kolonii grzybów, tworząc zawiesinę grzybów.
    7. Zaszczepić każdą fiolkę z wazeliną 200 μl zawiesiny grzybów. Wykonaj dwie repliki dla każdego szczepu grzyba.
    8. W celu kontroli ujemnej umieścić 200 μl zawiesiny grzybów w fiolkach zawierających tylko płynny BH. Ponadto należy przechowywać kilka fiolek z wazeliną bez zaszczepiania grzybów, aby sprawdzić, czy pożywka nie jest zanieczyszczona.
    9. Inkubować fiolki w temperaturze 25 °C w ciemności i sprawdzić je po 15 dniach i 30 dniach od inokulum.
  2. Test wzrostu zużytego oleju silnikowego.
    1. Umieścić 3,26 g BH i 15 g agaru w 1 l wody dejonizowanej i sterylizować w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C (BHA).
    2. Umieść BHA na szalkach Petriego pod komorą z przepływem laminarnym.
    3. Po zastygnięciu przenieś 500 μl zużytego oleju silnikowego na szalki BHA Petriego i rozprowadź go równomiernie na powierzchni płytki za pomocą sterylnego jednorazowego rozsiewacza komórek w kształcie litery L.
    4. Zaszczepić każdą zużytą płytkę BHA oleju silnikowego każdym szczepem grzyba, zbierając grzybnię z płytek przygotowanych w kroku 1.5.3. Pracuj przy palniku Bunsena lub pod okapem z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia. Wykonaj dwie repliki dla każdego szczepu grzyba.
    5. W celu kontroli ujemnej należy zaszczepić szalki Petriego wyłącznie BHA. Co więcej, zachowaj kilka zużytych szalek Petriego BHA z olejem silnikowym bez zaszczepiania grzybów, aby sprawdzić, czy w pożywce nie ma zanieczyszczeń.
    6. Inkubować szalki Petriego w temperaturze 25 °C w ciemności i sprawdzić je po 15 dniach i 30 dniach od inokulum.
  3. Test wzrostu na tworzywach sztucznych.
    1. Przenieść 200 μl zawiesiny grzybów (kroki 2.1.5.-2.1.6.) na płytkę 96-dołkową. Wykonaj trzy powtórzenia kombinacji szczepu grzyba i tworzywa sztucznego.
    2. Do każdej studzienki z zawiesiną grzybów dodaj 10 mg innego rodzaju proszku z tworzywa sztucznego (politereftalan etylenu - PET, polichlorek winylu - PVC, polietylen o dużej gęstości - HDPE, polistyren - PS, poliuretan - PUR).
    3. W celu kontroli ujemnej, zamiast dodawać proszek z tworzywa sztucznego, dodaj 200 μl wysterylizowanego roztworu BH do studzienki z zawiesiną grzybów. Ponadto dla każdego rodzaju proszku z tworzywa sztucznego należy napełnić studzienkę 200 μl wysterylizowanego roztworu BH i 10 mg każdego pyłu z tworzywa sztucznego, aby sprawdzić, czy podłoże nie jest zanieczyszczone.
    4. Inkubować płytki mikrodołkowe w temperaturze 25 °C w ciemności i sprawdzić je po 15 dniach i 30 dniach od inokulum.

3. Jakościowe testy enzymatyczne

  1. Jakościowy test kolorymetryczny enzymów ligninolitycznych.
    1. Umieścić 27 g bulionu z dekstrozy ziemniaczanej (PD) i 15 g agaru w 1 l wody dejonizowanej i sterylizować w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C (PDA).
    2. Gdy pożywka nieco ostygnie, ale nadal jest płynna, dodać kwas galusowy (5 g/l) pod okapem z przepływem laminarnym i umieścić pożywkę na płytkach Petriego.
    3. Zaszczepić płytki PDA + kwasu galusowego każdym szczepem grzyba, zbierając grzybnię z płytek przygotowanych w kroku 1.5.3. Pracuj przy palniku Bunsena lub pod okapem z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia.
    4. Jako kontrolę negatywną należy przygotować szalki Petriego zawierające tylko PDA (bez kwasu galusowego) i zaszczepić je szczepami grzybów (po jednym na każdy szczep grzyba), a także jedną szalkę Petriego z PDA + kwasem galusowym i bez inokulacji grzybów.
    5. Inkubować szalki Petriego w temperaturze 25 °C w ciemności i sprawdzić je po 7 dniach od inokulum.
  2. Jakościowe badanie kolorymetryczne lakkazów.
    1. Umieścić 27 g PD i 15 g agaru w 1 l wody dejonizowanej i sterylizować w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C (PDA).
    2. Gdy podłoże nieco ostygnie, ale nadal będzie płynne, dodaj gwajakol (400 μl/l) pod okapem z przepływem laminarnym i umieść je na szalkach Petriego.
    3. Zaszczepić płytki PDA + gwajakol każdym szczepem grzyba, zbierając grzybnię z płytek przygotowanych w kroku 1.5.3. Pracuj przy palniku Bunsena lub pod okapem z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia.
    4. Jako kontrole negatywne, przygotuj szalki Petriego tylko z PDA (bez gwajakolu) i zaszczep je szczepami grzybów (po jednym dla każdego szczepu grzyba), a także jedną szalką Petriego z PDA + gwaiakolem i bez inokulacji grzybów.
    5. Inkubować szalki Petriego w temperaturze 25 °C w ciemności i sprawdzić je po 7 dniach od inokulum.
  3. Jakościowy test proteaz.
    1. Przygotować pożywkę TAK dodającK2HPO4 (1 g/L), KH2PO4 (0,5 g/L), MgSO4·7H2O (0,5 g/L), MnCl2·4H2O (0,001 g/L), CuCl2·2H2O (1,4 x 10-5 g/L), ZnCl2 (1,1 x 10-5 g/L), CoCl2·6H2O (2 x 10-5 g/L), Na2MoO4·2H2O (1,3 x 10-5 g/L), FeCl3·6H2O (7,5 x 10-5 g/L) i żelatyna/pepton (0,02 g/L) do wody dejonizowanej.
    2. Umieść pożywkę TAK na mieszadle magnetycznym (bez podgrzewania) z mieszadłem magnetycznym wewnątrz pożywki na 10 minut.
    3. Gdy wszystkie sole rozpuszczą się w pożywce, przenieść 5 ml roztworu do sterylnych szklanych fiolek o pojemności 20 ml i sterylizować w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C.
    4. Do kontroli ujemnej przygotować około 20 ml sterylnych szklanych fiolek z 5 ml roztworu BH i sterylizować je w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C.
    5. Pod komorą z przepływem laminarnym przenieść 200 μl zawiesiny grzybów (kroki 2.1.5.-2.1.6.) dla każdego szczepu do wysterylizowanych fiolek z pożywką YES (wykonać co najmniej 2 powtórzenia na szczep grzyba). Dla każdego szczepu grzyba dodać 200 μl tej samej zawiesiny grzyba do wysterylizowanych fiolek BH, aby uzyskać kontrolę ujemną.
    6. Inkubować fiolki w temperaturze 25 °C w ciemności przez 21 dni i sprawdzać je co 7 dni.
  4. Jakościowy test esterazy.
    1. Przygotuj pożywkę Tween 80, dodając pepton (10 g/l), NaCl (5 g/l), CaCl2 (0,1 g/l) i 10 ml Tween 80 do 1 l wody dejonizowanej.
    2. Umieść medium Tween 80 na mieszadle magnetycznym (bez podgrzewania) z mieszadłem magnetycznym wewnątrz podłoża na 10 minut.
    3. Gdy wszystko rozpuści się w pożywce, przenieść 5 ml roztworu do 20 ml sterylnych szklanych fiolek i sterylizować je w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C.
    4. Do kontroli ujemnej przygotować około 20 ml sterylnych szklanych fiolek z 5 ml roztworu BH i sterylizować je w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 121 °C.
    5. W komorze z przepływem laminarnym przenieś 200 μl zawiesiny grzybów (kroki 2.1.5.-2.1.6.) dla każdego szczepu do 80 wysterylizowanych fiolek Tween (wykonać co najmniej 2 powtórzenia na szczep grzyba). Dla każdego szczepu grzyba dodać 200 μl tej samej zawiesiny grzybów do wysterylizowanych fiolek BH w celu kontroli ujemnej.
    6. Inkubować fiolki w temperaturze 25 °C w ciemności przez 21 dni i sprawdzać je co 7 dni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Metody z wykorzystaniem pożywek selektywnych (Sekcja 1 protokołu) pozwoliły na przesiewową analizę bogatej bioróżnorodności gleby i wyłonienie grzybów o wysokim potencjale do bioremediacji. Na pożywkach z kwasem huminowym i lignocelulozą wyizolowano ponad 100 szczepów grzybów. Grzyby te produkowały enzymy uczestniczące w biodegradacji naturalnych materiałów opornych, których struktura chemiczna przypomina wiele zanieczyszczeń. Jednak szczepy grzybów wyizolowane na pożywkach selektywnych wymagały dalszej analizy. W szczeg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Bogata różnorodność biologiczna gleby jest obfitym źródłem grzybów, które posiadają liczne zdolności metaboliczne, z których niektóre mogą być potencjalnymi kandydatami do bioremediacji. Selektywne testy pożywek (sekcja 1 protokołu) są łatwymi do wykonania i skutecznymi metodami izolowania grzybów zdolnych do wzrostu na naturalnych złożonych polimerach jako ich jedynym źródle węgla. Grzyby mogą wytwarzać zewnątrzkomórkowe, niespecyficzne hydrolazy i oksydoreduktazy30 , takie jak enzymy ligninolity...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) Uniwersytetu w Pawii i profesor Solveig Tosi za umożliwienie tej pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96 płytka mikrodołkowaGreiner bio-one650185
AgarVWR84609.05
Bushnell-Haas BrothFlukaB5051
CaCl2Sigma-AldrichC5670
ChloroamfenikolEurobioGABCRL006Z
ChlortetracyklinaSigma-Aldrich
CoCl2· 6H2OSigma-AldrichC8661
CuCl2· 2H2OSigma-AldrichC3279
EtanolVWR Chemicals20821.296
FeCl3· 6H2OSigma-Aldrich236489
Filtr 0,2 i mikro; mWhatman10462200
kwas galusowySigma-AldrichG7384
Szkiełka nakrywkoweBiosigmaVBS634
Fiolki szklane 15 mlSciLabwareP35467
gwajakolSigma-AldrichG5502
Polietylen o wysokiej gęstości (HDPE)Sigma-Aldrich434272
Kwasyhumusowe Aldrich Chemistry53680
K2HPO4Sigma-AldrichP8281
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
Lignoceluloza//Sterylizowane odpady produkcyjne bioetanolu
Rozsiewacz komórek w kształcie litery LLaboindustria S.p.a21133
mieszadło magnetyczneA.C.E.F8235
Ekstrakt słodowy BulionSigma-Aldrich70146
MgSO4· 7H2OSigma-AldrichM2643
Mikropipeta 1000 μ LMikropipeta GilsonFA10006M
200  μ LGilsonFA10005M
MnCl2· 4H2OSigma-AldrichM5005
Na2MoO4· 2H2OSigma-AldrichM1651
NaClSigma-AldrichS5886
NeomycynaSigma-AldrichN0401000
Penicylina PeptonSigma-Aldrich1504489
Sigma-Aldrich83059
Politereftalan etylenu (PET)GoodfellowES306031
Szalki PetriegoLaboindustria S.p.a21050
Wazelina (płynna parafina)A.C.E.F
Bulion z dekstrozy ziemniaczanejSigma-AldrichP6685
Polistyren (PS)Sigma-Aldrich331651
Poliuretan (PUR)Sigma-AldrichGF20677923
Polichlorek winylu ( PVC)Sigma-Aldrich81388
Sterylna probówka sokołaGreiner bio-one227 261
Fiolki ze szkła sterylnego 20 mlSigma-AldrichSU860051
Punkt sterylny 1000  μ LGilsonF172511
Punkt sterylny 200  μ LGilsonF172311
Sterylne worki polietylenoweWHIRL-PAKB01018
sterylna strzykawkaRays5523CM25
StreptomycynaSigma-AldrichS-6501
Tween 80Sigma-AldrichP1754
Używany olej silnikowy//złożona mieszanina węglowodorów, dodatków do silników i metali, dostarczona przez włoską prywatną firmę
Fiolki 50 mlSigma-Aldrich33108-U
ZnCl2Sigma-AldrichZ0152
Y0001451 009661

Bibliografia

  1. Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
  2. Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S. Key fungal degradation patterns, enzymes and their applications for the removal of aliphatic hydrocarbons in polluted soils: A review. International Biodeterioration and Biodegradation. 147, (2020).
  3. Asemoloye, M. D., Ahmad, R., Jonathan, S. G. Synergistic action of rhizospheric fungi with Megathyrsus maximus root speeds up hydrocarbon degradation kinetics in oil polluted soil. Chemosphere. 187, 1-10 (2017).
  4. Abatenh, E., Gizaw, B., Tsegaye, Z., Wassie, M. The role of microorganisms in bioremediation - A review. Open Journal of Environmental Biology. 2, 038-046 (2017).
  5. Dix, N. J., Webster, J. Fungal Ecology. , Chapman & Hall. Cambridge, UK. (1995).
  6. Magan, N. Fungi in extreme environment. Environmental and Microbial Relationships. The Mycota. Esser, K., Lemke, P. A. 4, Springer. Berlin, Heidelberg. 99-114 (2007).
  7. Aranda, E. Promising approaches towards biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons with Ascomycota fungi. Current Opinion in Biotechnology. 38, 1-8 (2016).
  8. Hasan, I. F., AI-Jawhari, Role of Filamentous Fungi to Remove Petroleum Hydrocarbons from the Environment. Microbial Action on Hydrocarbons. Kumar, V., Kumar, M., Prasad, R. , Springer. Singapore. (2018).
  9. Daccò, C., et al. Trichoderma: evaluation of its degrading abilities for the bioremediation of hydrocarbon complex mixtures. Applied Sciences. 10 (9), 3152(2020).
  10. Alarcón, A., Davies, F. T., Autenrieth, R. L., Zuberer, D. A. Arbuscular mycorrhiza and petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation of petroleum-contaminated soil. International Journal of Phytoremediation. 10, 251-263 (2008).
  11. Mancera-López, M. E., et al. Bioremediation of an aged hydro-carbon-contaminated soil by a combined system of biostimulation-bioaugmentation with filamentous fungi. International Biodeterioration and Biodegradation. 61, (2008).
  12. Hatami, E., Abbaspour, A., Dorostkar, V. Phytoremediation of a petroleum-polluted soil by native plant species in Lorestan Province, Iran. Environmental Science and Pollution Research. 26, 24323-24330 (2019).
  13. Prenafeta-Boldú, F. X., De Hoog, G. S., Summerbell, R. C. Fungal communities in hydrocarbon degradation. Microbial Communities Utilizing Hydrocarbons and Lipids: Members, Metagenomics and Ecophysiology. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , Springer. Cham. 1-36 (2018).
  14. Gu, J., Ford, T., Mitton, D., Mitchell, R. Microbiological degradation of polymeric materials. Uhlig's Corrosion Handbook. , John Wiley and Sons. 421-438 (2011).
  15. Tuomela, M., Hatakka, A. Oxidative fungal enzymes for bioremediation. Comprehensive Biotechnology: Environmental and Related Biotechnologies. 6, Elsevier. 224-239 (2019).
  16. DSouza, G. C., et al. Fungal biodegradation of low-density polyethylene using consortium of Aspergillus species under controlled conditions. Heliyon. 7 (5), 07008(2021).
  17. El-Sayed, M. T., Rabie, G. H., Hamed, E. A. Biodegradation of low-density polyethylene (LDPE) using the mixed culture of Aspergillus carbonarius and A. fumigates. Environment, Development, and Sustainability. 23 (10), 14556-14584 (2021).
  18. Sepperumal, U., Markandan, M., Palraja, I. Micromorphological and chemical changes during biodegradation of polyethylene terephthalate (PET) by Penicillium sp. Journal of Microbiology and Biotechnology Research. 3 (4), 47-53 (2013).
  19. Leitão, A. L. Potential of Penicillium species in the bioremediation field. International Journal of Environmental Research and Public Health. 6 (4), 1393-1417 (2009).
  20. Chen, S. H., Ting, A. S. Y. Biosorption and biodegradation potential of triphenylmethane dyes by newly discovered Penicillium simplicissimum isolated from indoor wastewater sample. International Biodeterioration & Biodegradation. 103, 1-7 (2015).
  21. Orhan, Y., Buyukgungor, H. Enhancement of biodegradability of disposable polyethylene in controlled biological soil. International Biodeterioration and Biodegradation. 45, 49-55 (2000).
  22. Deshmukh, R., Khardenavis, A. A., Purohit, H. J. Diverse metabolic capacities of fungi for bioremediation. Indian journal of microbiology. 56 (3), 247-264 (2016).
  23. Viswanath, B., Rajesh, B., Janardhan, A., Kumar, A. P., Narasimha, G. Fungal laccases and their applications in bioremediation. Enzyme research. 2014, 163242(2014).
  24. Ali, M., Husain, Q., Ishqi, H. M. Fungal peroxidases mediated bioremediation of industrial pollutants. Fungal Bioremediation. , CRC Press. Boca Raton. (2019).
  25. Nousiainen, P., Kontro, J., Manner, H., Hatakka, A., Sipilä, J. Phenolic mediators enhance the manganese peroxidase catalyzed oxidation of recalcitrant lignin model compounds and synthetic lignin. Fungal Genetics and Biology. 72, 137-149 (2014).
  26. Srivastava, S., Kumar, M. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs): A sustainable approach. Sustainable Green Technologies for Environmental Management. , Springer. Singapore. (2019).
  27. Wei, R., Zimmermann, W. Microbial enzymes for the recycling of recalcitrant petroleum-based plastics: how far are we. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1308-1322 (2017).
  28. Matsubara, M., Lynch, J. M., De Leij, F. A. A. M. A simple screening procedure for selecting fungi with potential for use in the bioremediation of contaminated land. Enzyme and Microbial Technology. 39 (7), 1365-1372 (2006).
  29. Mann, J., et al. Screening and selection of fungi for bioremediation of olive mill wastewater. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (3), 567-571 (2010).
  30. Andlar, M., Rezić, T., Marđetko, N., Kracher, D., Ludwig, R., Šantek, B. Lignocellulose degradation: an overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18, 768-778 (2018).
  31. Goméz-Toribio, V., García-Martín, A. B., Martínez, M. J., Martínez, A. T., Guillén, F. Induction of extracellular hydroxyl radical production by white-rot fungi through quinone redox cycling. Applied and Environmental Microbiology. 75, 3944-3953 (2009).
  32. Belcarz, A., Ginalska, G., Kornillowicz-Kowalska, T. Extracellular enzyme activities of Bjerkandera adusta R59 soil strain, capable of daunomycin and humic acids degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. 68 (5), 686-694 (2005).
  33. Stevenson, F. J. Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2nd ed. , Wiley. New York. (1995).
  34. Andlar, M., et al. Lignocellulose degradation: An overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences. 18 (11), 768-778 (2018).
  35. Lee, H., et al. Biotechnological procedures to select white rot fungi for the degradation of PAHs. Journal of Microbiological Methods. 97 (1), 56-62 (2014).
  36. Batista-García, R. A., et al. Simple screening protocol for identification of potential mycoremediation tools for the elimination of polycyclic aromatic hydrocarbons and phenols from hyperalkalophile industrial effluents. Journal of Environmental Management. 198, 1-11 (2017).
  37. Shleev, S. V., et al. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes. Biochimie. 86 (9-10), (2004).
  38. Kiiskinen, L. L., Rättö, M., Kruus, K. Screening for novel laccase-producing microbes. Journal of Applied Microbiology. 97, (2004).
  39. Kumar, V. V., Rapheal, V. S. Induction and purification by three-phase partitioning of aryl alcohol oxidase (AAO) from Pleurotus ostreatus. Applied Biochemistry and Biotechnology. , 163(2011).
  40. Loredo-Treviño, A., Gutiérrez-Sánchez, G., Rodríguez-Herrera, R., Aguilar, C. N. Microbial enzymes involved in polyurethane biodegradation: a review. Journal of Polymers and the Environment. 20 (1), 258-265 (2012).
  41. Garriga, M., et al. Technological and sensorial evaluation of Lactobacillus strains as starter cultures in fermented sausages. International Journal of Food Microbiology. 32 (1-2), 173-183 (1996).
  42. Zerdani, I., Faid, M., Malki, A. Feather wastes digestion by new isolated strains Bacillus sp. In microcco. African Journal of Biotechnology. 3 (1), 67-70 (2004).
  43. Nygren, C. M., Edqvist, J., Elfstrand, M., Heller, G., Taylor, A. F. Detection of extracellular protease activity in different species and genera of ectomycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 17 (3), 241-248 (2007).
  44. Asemoloye, M. D., et al. Hydrocarbon degradation and enzyme activities of Aspergillus oryzae and Mucor irregularis isolated from Nigerian crude oil-polluted sites. Microorganisms. 8 (12), 1912(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Grzyby gleboweizolacja grzyb wpotencja bioremediacyjnydegradacja materia w trudnorozk adalnychtesty przesiewoweaktywno enzymatycznaprodukcja lakazyaktywno esterazydegradacja tworzyw sztucznychdegradacja w glowodor w
Izolacja i badania przesiewowe pod kątem różnorodności biologicznej gleby pod kątem grzybów biorących udział w degradacji opornych materiałów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.